DE10016449A1

DE10016449A1 - Verbessertes Verfahren zur Isolierung des hepatoprotektiven Mittels Silymarin aus den Samen der Pflanze Silybum marianum

Info

Publication number: DE10016449A1
Application number: DE10016449A
Authority: DE
Inventors: Atul Prakash Kahol; Kiran Lata Singh; Sudeep Tandon; Sushil Kumar
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2000-03-29
Filing date: 2000-03-29
Publication date: 2001-10-04
Anticipated expiration: 2020-03-30
Also published as: US6309678B1; DE10016449B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Isolierung eines hepatoprotektiven Mittels, Silymarin, aus den Samen der Pflanze Silybum marianum, das umfaßt: (i) Vorkühlen der Samen auf (-)20 DEG C für 24 Stunden in einem Gefrierschrank/Kältekammer, (ii) Pulverisieren der gekühlten Samen in einer Hammermühlem die mit einem Ausgangssieb mit ungefähr 40 Mesh ausgestattet ist, (iii) Entfetten der Samen durch Extrahieren mit Hexan in einem Soxhlet-Typ-Extraktor, um die gesamte Menge fetten Öls ohne Verwendung einer Schraube zu entfernen, (iv) Extrahieren der entfetteten Samen mit Acetonitril bei 20-30 DEG C, um eine Silymarin-Fraktion zu extrahieren, (v) Einengen der empfindlichen Silymarin-Fraktion unter Vakuum in einem Dünnschichtverdampfer mit rotierenden Wischern, (vi) Rühren des Silymarin-reichen, trockenen Pulvers mit kaltem Dichlormethan bei 5 DEG C, gefolgt von einer Filtration, und Trocknen mit einer langsamen Spülung von Stickstoff-Gas, (vii) weitere Aufreinigung des Silymarins durch Suspendieren in 5-mal seinem Gewicht an Acetonitril und Ausfällen mit 8-12-mal seinem Gewicht an Wasser bei 20 DEG C, (viii) Filtern des ausgefällten Silymarins in einem geschlossenen Vakuum-Filter, der ein 1-2 mum Sieb hat, wobei der Kuchen 3-mal mit destilliertem Wasser gewaschen wird, (ix) Trocknen des Silymarin-Kuchens in einem Vakuum-Ofen, um im wesentlichen reines Silymarin zu erhalten.

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Isolierung eines hepatoprotektiven Mittels, Silymarin, aus der Pflanze Silybum marianum (L) Gaertn.

Hintergrund der Erfindung

Silymarin ist die Bezeichnung, die einer Mischung von in Silybum marianum gefundenen Flavanolignanen gegeben wird, die eine klinisch nachgewiesene hepatoprotektive Wirkung gezeigt haben. Positive Resultate, die in zahlreichen pharmakologischen, biochemischen und toxikologischen Studien erhalten worden sind, haben Silymarin zu einer Arznei der Wahl bei der Behandlung von Lebererkrankungen gemacht (Morazzoni, P. und Bombardelli, E., Fito terapia, 116 (1), S. 1005, 1995). Hauptbestandteile des Silymarins sind identifiziert worden als die Flavanolignane Silybin, Silydianin und Silychristin, und ihre chemischen Strukturen sind aufgeklärt worden (Wagner, H., Diesel, P., und Seitz, M., Arzneim. Forsch. 24, S. 466, 1974; Pelter, A., Hansel, R., Tetrahedron Letters, Nr. 25, S. 2911-2916, 1968; Abraham D J, Takagi S, Wagner H, Farnsworth N R, et al. Tetrahedron Letters, Nr. 31, S. 2675-2678, 1970; Wag ner H, Cahri, M. V, Seitz M; Riess-Muarer, I, Tetrahedron Letters, Nr. 4, S. 381-384, 1978). Der Mechanismus der hepatoprotektiven Wirkung von Silymarin ist seiner Fähigkeit zuge schrieben worden, als ein leistungsfähiger Abfänger freier Radikale zu fungieren, der in der Lage ist, die peroxidativen Prozesse zu unterbrechen, die bei Leberschädigungen beteiligt sind, welche durch hepatotoxische Mittel, wie Alkohol, Paracetamol und Kohlenstoffte trachlorid induziert werden (Leng, P. E., Strange, H. A., Z. Phytotherapie 12, 162, 1991). In Anbetracht des weitverbreiteten Gebrauchs von Alkohol, der Leberprobleme bei Menschen verursacht, und der allgemeinen weiten Verbreitung von Lebererkrankungen, die durch unrei nes Trinkwasser verursacht werden, ist der Bedarf nach Silymarin sehr groß. Silymarin wird aus den reifen trockenen Samen von Silybum marianum extrahiert. Über einige Verfahren zur Isolierung von Silymarin ist berichtet worden.

Stand der Technik

Gemäß einem Verfahren wurde die pulverisierte Droge in einem Soxhlet-Extraktor mit Methanol oder Ethanol extrahiert, der Extrakt wurde unter reduziertem Druck konzentriert, das Konzentrat zu einem Schlamm mit Kieselgel gemacht und auf eine Kieselgelsäule gela den, eluiert mit Benzol-Ethylacetat-Mischungen wachsender Polarität, die Silymarin- enthaltenden Fraktionen wurden kombiniert und das Lösungsmittel entfernt, der Rückstand, aus MeOH kristallisiert, ergab 86% reines Silybin (Schmp. 167°C-180°C), die Stammflüs sigkeit, vollständig getrocknet unter Vakuum, ergab eine zusätzliche gelbe Mischung von Flavanoiden mit 58% Reinheit als Silybin (Gupta, G. K., Raj, S., Rao, P. R., Research and Industry 27, S. 37-42, 1982). Die höchste Ausbeute an Silymarin, über die von diesen Auto ren berichtet wurde, war 2,46%, auf der Grundlage des Gewichts der Samen. Dieser Prozeß beinhaltet den kostenintensiven Schritt der Kieselgelchromatographie, der nicht wirtschaftlich ist, wenn er auf industriellem Maßstab verwendet wird. Ein anderer Prozeß, der gegenwärtig verwendet wird, umfaßt das Entfernen eines Teils des fetten Öls durch Drücken der Samen in einer Schraubpresse, Aufbrechen der komprimierten Samenmasse, Extrahieren der gepreßten Samenmasse mit Ethylacetat bei 75°C, Verdampfen des Lösungsmittels, um einen halbfesten Rückstand zu erhalten, Entfetten des Rückstandes durch wiederholte Flüssig-Fest-Extraktion mit leichtem Petroleum, Auflösen des entfetteten Rückstandes in Methanol, Mischen der Methanollösung mit Chloroform und Wasser, Abtrennen und Zurückbehalten der methanoli schen Schicht, Verdampfen des wäßrigen Methanols, Suspendieren des Rückstands in ein wenig Methanol, Ausfällen des Silymarin-reichen Feststoffes durch Mischen mit einem Über schuß Wasser, Zentrifugieren, Waschen und Trocknen des Niederschlags in vacuo. Die Aus beute an Silymarin ist 1,7%, auf der Grundlage des trockenen Samengewichts. (Madaus, R. Klaus, G., Werner, M., U.S. Patent Nr. 4,368,195, 11. Januar 1983).

Aufgabe der Erfindung

Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfaches Verfahren zum Isolieren des hepatoprotektiven Wirkstoffes Silymarin aus den Samen von Silybum marianum bereitzu stellen. Eine weitere Aufgabe ist es, ein neues, billiges und wirtschaftliches Verfahren zur Isolierung von Silymarin auf kommerziellem Maßstab bereitzustellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Entsprechend stellt die Erfindung ein neues Verfahren bereit zur Isolierung von Silymarin, einem hepatoprotektiven Mittel, aus den Samen von Silybum marianum.

Detaillierte Beschreibung

Entsprechend stellt die Erfindung ein neues Verfahren bereit zur Isolierung von Silymarin, einem hepatoprotektiven Mittel, aus den Samen von Silybum marianum, wobei besagtes Ver fahren die Schritte umfaßt:

a) Kühlen der Samen von Silybum marianum,
b) Zermahlen der gekühlten Samen zu einem feinen Pulver,
c) Entfetten der pulverisierten Samen durch Extrahieren mit einem Kohlenwasserstoff- Lösungsmittel,
d) Extrahieren des entfetteten Samenpulvers mit Acetonitril bei 20-30°C, um eine Sily marin-enthaltende Fraktion als einen Extrakt zu erhalten,
e) Einengen der empfindlichen Silymarin-Fraktion,
f) Rühren des Silymarin-reichen, trockenen Pulvers mit kaltem Dichlormethan bei 5°C, gefolgt von Filtration und Trocknen mit einer langsamen Spülung von Stickstoff-Gas,
g) Aufreinigen von Silymarin durch Suspendieren in Acetonitril in einer Menge, die 5-mal seinem Gewicht entspricht, und Ausfällen durch Zugabe von destilliertem Wasser in einer Menge, die 8- bis 12-mal seinem Gewicht entspricht, bei 20-30°C,
h) Filtrieren des ausgefällten Silymarins in einem geschlossenen Vakuum-Filter mit 1-2 µm Sieb, Waschen des Kuchens dreimal mit destilliertem Wasser, und
i) Trocknen des Silymarin-Kuchens in einem Vakuum-Ofen, um im wesentlichen reines Silymarin zu erhalten.

In einer Ausführungsform werden die Samen der Pflanze Silybum marianum für 24 h bei -20°C in einem Gefrierschrank oder einer Kältekammer gekühlt.

In einer Ausführung ist das Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel zur Entfernung von Fettsäuren Hexan.

In einer Ausführungsform werden die gekühlten Samen in einer Hammermühle pulverisiert, die mit einem Ausgangssieb mit ungefähr 40 Mesh ausgestattet ist.

In einer weiteren Ausführungsform wird das fette Öl in dem Samenpulver durch Extraktion in einem Extraktor vom Soxhlet-Typ ohne Verwendung einer Schraube/Presse entfernt.

In noch einer weiteren Ausführungsform wird der Extrakt, der empfindliches Silymarin ent hält, in Schritt (iv) erhalten, konzentriert unter Verwendung eines Dünnschichtverdampfers mit rotierenden Wischern.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Filtration der Silymarin- enthaltenden Fraktionen in einem geschlossenen Vakuum-Filter unter der inerten Umgebung von Stickstoff-Gas durchgeführt, um den Abbau des Produktes zu verhindern.

In noch einer weiteren Ausführungsform wird der Silymarin-Niederschlag unter Vakuum bei 40-45°C getrocknet, wobei der Ofendruck bei 5-15 torr für 15 Stunden gehalten wird.

Die Erfindung wird unten im einzelnen unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele be schrieben, die nur zu Illustrationszwecken dargeboten werden und nicht dahingehend inter pretiert werden sollten, daß sie den Schutzumfang der Erfindung in irgendeiner Weise be schränken.

Primär umfaßt das verbesserte Verfahren die folgenden Vorgänge:

1. Kühlen der Samen von Silybum marianum bei (-)20°C, indem sie über Nacht in einem Gefrierschrank/Kältekammer aufbewahrt werden.
2. Zermahlen der gekühlten Samen in einer Hammermühle, die mit einem 40 Mesh Aus gangssieb ausgestattet ist.
3. Extrahieren der pulverisierten Samen in einem Soxhlet-Apparat mit einem Kohlen wasserstoff-Lösungsmittel, wie etwa Hexan, um das gesamte fette Öl zu entfernen.
4. Perkolieren des entfetteten Samenpulvers 3- bis 4-mal mit Acetonitril bei (20°C-30°C) zum Abtrennen der Silymarin-enthaltenden Fraktion, als Extrakt.
5. Entfernen des Acetonitrils unter Vakuum in einem Dünnschichtverdampfer mit rotie renden Wischern, um ein Konzentrat zu erhalten, das reich an Silymarin ist, wobei das wiedergewonnene Acetonitril dem Verfahren wieder zugeführt wird.
6. Trocknen des Konzentrats in einem gerührten Vakuum-Konzentrator vom Chargen- Typ, um ein Produkt halbfester Konsistenz zu erhalten, und sein weiteres Trocknen in einem Vakuum-Ofen, um einen trockenen Rückstand zu erhalten.
7. Rühren des pulverisierten Rückstandes in kaltem Dichlormethan (5°C) und Filtern in einem geschlossenen Vakuum-Filter zum Entfernen von Verunreinigungen aus dem Silymarin-reichen, festen Produkt.
8. Auflösen des obigen Feststoffs in einer geringen Menge Acetonitril und Ausfällen von Silymarin durch Zugabe von kaltem destilliertem Wasser.
9. Filtern des leicht gelben Niederschlags und dreimaliges Waschen mit destilliertem Wasser.
10. Übertragen des Kuchens in einen Vakuum-Ofen und Trocknen bei 40-45°C, wobei der Ofendruck bei 5-15 torr für 15 Stunden gehalten wird.
11. Überprüfen der Reinheit des erhaltenen Produkts mit dem DNPH-Verfahren unter Verwendung eines UV-Spektrophotometers bei 490 nm (Wagner, V. H., Diesel, P., Saity, M., Arzneim.-Forsch, 24 (4), S. 466-471, 1974) und durch HPLC (Tittel und Wagner, Journal of Chromatography, 153, S. 227-232, 1978).

Wesentliche Kennzeichen der Erfindung

1. Das Verfahren nach dem Stand der Technik hängt von einer Schneckenpresse ab, um einen Teil des in den Samen vorhandenen fetten Öls zu entfernen. Das verbleibende Öl wird in einem zweiten Schritt einer Fest-Flüssig-Extraktion entfernt, die mit leichtem Petroleum an dem Rohextrakt ausgeführt wird, der aus einer Ethylacetat-Extraktion der Samen bei 75°C erhalten worden war, was dem Betrieb der Schneckenpresse folgt. Die vorliegende Erfindung erreicht ein vollständiges Entfernen von fettem Öl in einem einzelnen Schritt durch eine Soxhlet-Extraktion mit Hexan einer sorgfältig hergestell ten aufgebrochenen Samenmasse. Der Schritt des Kühlens der Samen auf (-)20°C vor dem Aufbrechen in einer Hammermühle, die mit einem 40 Mesh Ausgangssieb ausge stattet ist, ist besonders einfallsreich, als er die Samen spröde und brüchig macht. Die Auswahl einer Hammermühle, die mit einem 40 Mesh Ausgangssieb ausgestattet ist, ist besonders einfallsreich, da sie die Samen spröde und brüchig macht. Die Auswahl einer Hammermühle, die mit dem besonderen Sieb ausgestattet ist, ist angemessen, da sie eine pulverisierte Samenmasse liefert, die einer wirksamen Perkolation mit Lö sungsmittel zugänglich ist, was vollständiges Entfernen des fetten Öls in nur drei Wa schungen erreicht. Anders als bei dem Verfahren im Stand der Technik ist kein me chanisches Rühren bei dieser Erfindung erforderlich, was den Betrieb vereinfacht und Energiekosten einspart. Die Extraktion des fetten Öls mit einer Schneckenpresse, wie sie bei dem Verfahren im Stand der Technik stattfindet, bringt ebenso das Problem mit sich, daß feine Samenpartikel in das Öl gelangen, das dann gefiltert werden muß, um das Samenmaterial zu erhalten, die Restmenge an Öl muß in einem Fest-Flüssig- Extraktionsschritt wiedergewonnen werden, der an dem Ethylacetat-Extrakt durchge führt wird. Das Verfahren dieser Erfindung ist viel einfacher und wirksam, um die ge samte Menge des fetten Öls in einem einzelnen Schritt zu entfernen und spart somit wertvolle Verarbeitungszeit ein.
2. Das Verfahren im Stand der Technik beinhaltet die Extraktion von entfetteten Samen mit heißem Ethylacetat bei 75°C und eine Filtration des heißen Schlammes, um den Extrakt zu erhalten. Die vorliegende Erfindung hat Acetonitril ausgewählt, um die Silymarin-enthaltende Fraktion von der entfetteten Samenmasse bei 20°C-30°C se lektiver zu entfernen. Ein Verarbeitungsvorteil wird auf zwei Gebieten erhalten, indem bei Zimmertemperatur betrieben wird, im Vergleich zu 75°C bei dem Verfahren im Stand der Technik; (a) es ist wahrscheinlich, daß die Filtration des Schlammes, der heißes Ethylacetat enthält, bei 75°C (Sdp. Ethylacetat = 77°C) toxische Lösungsmit teldämpfe emittiert, wenn nicht spezielle Einfassungen konstruiert sind; (b) das Ver fahren dieser Erfindung ist, dadurch, daß es bei Raumtemperatur betrieben wird, ein facher und weniger gefährlich gegenüber einer Arbeitsplatzumgebung.
3. Die Verfahren im Stand der Technik beinhalten das Einengen des Silymarin-reichen Extraktes durch eine verlängerte Destillation/Evaporation bei 50°C. In Anbetracht der empfindlichen Natur von Flavolignan-Molekülen, die Silymarin ausmachen, verwen det das Verfahren dieser Erfindung einen Dünnschichtverdampfer mit rotierenden Wi schern unter Vakuum, um das Einengen der Silymarin-enthaltenden Extrakte durchzu führen. Verdampfungsapparate mit rotierendem Wischer-Dünnschicht-Design haben die Fähigkeit, eine Lösungsmittel-Verdampfung durchzuführen, indem das zu verar beitende Material für eine kurze Dauer von nur 1-3 Sekunden erhitzt wird. Dies ver meidet jede Möglichkeit des Abbaus der Silymarin-Bestandteile.
4. Das Verfahren im Stand der Technik verwendet Methanol : Wasser : Chloroform in ei nem 1 : 1 : 1-Verhältnis, um die nicht-erwünschten, Nicht-Flavanolignan-Materialien aus dem Silymarin-enthaltenden Extrakt zu entfernen, der in die Methanol-Wasser-Phase übertragen wird. Der Erhalt von Silymarin aus 50% wäßrigem Methanol unter Vakuum erfordert eine lange Zeit und einen großen Eintrag an Wärmeenergie, um die hohe latente Verdampfungswärme von Wasser zur Verfügung zu stellen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, eine Aufreinigung von Silymarin durch Wa schen des Extraktes mit kaltem Dichlormethan bei 5°C zu erreichen, das, da es einen viel geringeren Siedepunkt von 40,5°C hat, mit einem geringen Eintrag an Destillati onswärme wiedererhalten wird.

In Übereinstimmung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zielen die anfänglichen Verfahrensschritte auf die selektive Abtrennung des fetten Öls von den Samen von Silybum marianum in einem einzelnen Schritt ab durch Vorkühlung der Rohmaterialien auf (-)20°C und Durchführen des Zermahlens der kalten Samen in einer Hammermühle, die mit einem 40 Mesh Ausgangssieb ausgestattet ist, um eine pulverisierte Samenmasse optimaler Porosität und Partikelgröße zu erhalten, aus der es möglich ist, die gesamte Menge des fetten Öls durch Extraktion mit Hexan in einem Extraktor des Soxhlet-Typs zu entfernen, was ein einzigartiges Merkmal dieser Erfindung ist, und es möglich macht, die gesamte Menge des fetten Öls in nur drei Lösungsmittel-Waschungen zu entfernen, wobei jede Waschung eine Kontaktzeit von 2,5 Stunden hat. Um die Abwesenheit der Flavanolignan-Verbindungen in dem Hexan-Extrakt zu überprüfen, wurde eine TLC mit einer Probe des Hexan-Extrakts und einer Silymarin-Lösung (1 mg/ml in Methanol) durchgeführt, geladen auf eine vorbeschichtete Kieselgel-60-Mesh- Platte (Merck), die Platte zweimal in dem Lösungsmittelsystem Chloro form : Aceton : Ameisensäure (9 : 2 : 1) laufengelassen, mit 1% methanolischer Eisen(III)- Chlorid-Lösung entwickelt, mit Schwefelsäure angesäuert. Keine rotbraunen Flecken, die für Flavanolignane typisch sind, wurden auf dem Chromatogramm des Hexan-Extrakts gesehen. Fettes Öl kann aus dem Hexan-Extrakt durch einfache Destillation erhalten und das Hexan dem Prozeß wieder zugeführt werden. Das entfettete Samenbett wird von Hexan befreit durch Laufenlassen von heißem Wasser bei 75°C in der Ummantelung des Gefäßes, das das Samen pulver hält, und eine geringe Menge an Stickstoff-Gas wird simultan durch das Samenpulver bett geleitet, um es vollständig zu trocknen.

Der nächste Schritt der vorliegenden Erfindung umfaßt die Perkolation der entfetteten Samen mit Acetonitril-Lösungsmittel bei Temperatur (20°C-30°C), um die Flavanolignan- Verbindungen zusammen mit einigen Verunreinigungen selektiv zu extrahieren. Acetonitril ist als ein Lösungsmittel gewählt worden, das eine Polarität hat, die um weniges höher als Ethylacetat, aber geringer als Methanol ist. Eine Extraktion mit Acetonitril der entfetteten Samen bei Zimmertemperatur ist wirksamer bei der Extraktion der Flavanolignane. Dieser Schritt der Erfindung vermeidet das Kochen von Rohmaterial, wie es mit Ethylacetat in Ver fahren im Stand der Technik gemacht wird, erzielt jedoch höhere Ausbeuten an Silymarin. Der empfindlichen Silymarin-Fraktion wird zusätzlicher Schutz durch Verwendung eines Dünnschicht-Verdampfungsapparates mit rotierenden Wischern zum Einengen des Silymarin- Extrakts in Acetonitril verliehen. Diese Art von Verdampfungsapparat exponiert das zugege bene Material einer mit heißem Wasser erhitzten Verdampfungs-Oberfläche für eine Dauer im Bereich von nur 1-3 Sekunden. Die nicht-flavanoiden Verunreinigungen, die zusammen mit Silymarin extrahiert werden, werden durch Rühren des Trockenextraktes zweimal mit dreimal der Menge an kaltem Dichlormethan bei 5°C entfernt. Die Verwendung kalten Dichlor methans für diesen Aufreinigungsschritt minimiert den Verlust dieses flüchtigen Lösungs mittels und minimiert ebenso den Verlust an Silymarin, das in kaltem Dichlormethan wenig löslich ist. Die gefilterte Silymarin-Mischung wird in einem Vakuum-Ofen bei 45°C getrock net und in 5-mal ihrem Gewicht Acetonitril suspendiert. Destilliertes Wasser bei Zimmertem peratur, 8- bis 12-mal das Gewicht von Silymarin wird jetzt mit dem Inhalt vermischt, um einen leicht gelben Niederschlag zu ergeben, der gefiltert und mit mehr Wasser gewaschen wird. Wir haben gefunden, daß ein geschlossener Vakuum-Filter vom Büchner-Typ, der mit einem 1-2 µm Filterschichtsieb ausgestattet ist, ziemlich geeignet für diesen Betrieb ist. Der gefil terte und gewaschene Kuchen wird in einem Vakuum-Ofen-Trog pulverisiert und bei 45°C-50°C bei 8-10 torr absolutem Druck für ungefähr 16-20 Stunden pulverisiert. Die Produkt reinheit wird durch das DNPH-Verfahren unter Verwendung eines UV-Spektrophotometers bei 490 nm bestimmt (Wagner, V. H., Diesel, P., Saity, M., Arzneim.-Forsch, 24 (4), S. 466-471, 1974). Eine HPLC-Analyse des Produkts wird durchgeführt, um genauere Information über die Silymarin-Bestandteile zu bekommen (Tittel, G. und Wagner, H., Journal of Chro matography, 153: 227-232, 1978). Durch Befolgen des Verfahrens dieser Erfindung wird ein Silymarin von 79% erhalten. Die Ausbeute an Silymarin, auf der Grundlage des trocke nen Samengewichts, ist im Bereich zwischen 3,4 bis 4,0%.

Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren zur Isolierung von Silyma rin aus den Samen von Silybum marianum bereit, das umfaßt: (i) Kühlen der Samen auf (-)20°C in einem Gefrierschrank/einer Kältekammer, (ii) Pulverisieren der gekühlten Samen unter Verwendung einer Hammermühle, die mit einem 40 Mesh Ausgangssieb ausgestattet ist, (iii) Entfetten des pulverisierten Samens durch Extrahieren mit Hexan in einem Soxhlet- Extraktor, um die Gesamtmenge an fettem Öl zu entfernen, ohne eine Schneckenpresse zu verwenden, (iv) Extrahieren des entfetteten Samenpulvers mit Acetonitril bei 20°C bis 30°C, um eine Silymarin-Fraktion zu erhalten, (v) Einengen der empfindlichen Silymarin-Fraktion unter Vakuum in einem Dünnschicht-Verdampfungsapparat mit rotierenden Wischern, um ein Silymarin-Konzentrat zu erhalten, (vi) Rühren des getrockneten Silymarin-reichen Pulvers mit kaltem Dichlormethan bei 5°C, gefolgt von Filtern und Trocknen des aufgereinigten Silymarins, Trocknen des Materials unter einer Stickstoff-Atmosphäre (vii) weiterhin Aufrei nigen von Silymarin durch Suspendieren mit 5-mal seinem Gewicht an Acetonitril und Aus fällen mit 8- bis 12-mal seinem Gewicht an Wasser bei 20-30°C, (viii) Filtern des ausgefällten Silymarins in einem geschlossenen Vakuum-Filter mit einer 1-2 µm Filterschicht und Wa schen des Kuchens dreimal mit Wasser, (ix) Trocknen des Silymarin-Kuchens in einem Va kuum-Ofen, um im wesentlichen reines Silymarin zu erhalten.

In einer Ausführungsform der Erfindung werden die vorgekühlten Samen in einer Hammer mühle aufgebrochen, die mit einem 40 Mesh Ausgangssieb ausgestattet ist.

In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Gesamtmenge an fettem Öl in den Samen in einem einzelnen Schritt durch Extraktion mit Hexan in einem Extraktor vom Soxhlet-Typ ohne die Verwendung einer Schneckenpresse entfernt.

In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird Acetonitril verwendet, um die Silymarin-Fraktion selektiv aus den entfetteten Samen zu extrahieren.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Extraktion des Silymarins unter Verwendung des Lösungsmittels bei 20°C-30°C und unter Vermeidung der Verwendung heißer Lösungsmittel nahe dem Siedepunkt durchgeführt, was toxische Dämpfe emittiert.

Beispiel 1

100 g Silybum marianum Samen wurden in einem Gefrierschrank, eingestellt auf (-)20°C, für 24 Stunden aufbewahrt. Die kalten Samen wurden in einem Mikro-Pulverisier-Apparat unter Verwendung eines 40 Mesh Ausgangssiebs pulverisiert. Das pulverisierte Material wurde in einen Glas-Soxhlet-Apparat geladen. Das pulverisierte Samenbett wurde zwischen zwei Baumwollschichten von je einem halben Inch eingefaßt ("sandwiched"). 600 ml Hexan wur den in den Destillierblasenkolben aufgenommen und über einem Wasserbad erhitzt, um das Lösungsmittel zum Kochen zu bringen und die Zirkulation des Lösungsmittels durch das Sa menbett zu beginnen. Der Soxhlet-Apparat wurde auf diese Weise kontinuierlich für 6 Stun den betrieben, um die Samen vollständig zu entfetten. Entfettetes Samenpulver wurde in einen Vakuum-Ofen übertragen und bei 45°C, 10 torr absolutem Druck für 4 Stunden getrocknet. Der Hexan-Extrakt wurde destilliert, um 32,5 g eines bleichgelben fetten Öls zu erhalten. Das entfettete trockene Samenpulver wurde in einen 1 Liter Rundkolben übertragen und mit 400 ml Acetonitril bei 25°C für 3 Stunden mazeriert. Der Inhalt wurde in einem Glas Büchner- Trichter gefiltert, um das Samenmaterial von dem Extrakt zu trennen. Diese Tätigkeit wurde dreimal wiederholt unter Verwendung von 300 ml Lösungsmittel in jeder der aufeinanderfol genden zwei Extraktionen, um eine Gesamtmenge von 890 ml Extrakt zu erhalten. Der Ex trakt wurde in einem Vakuum-Rotationsverdampfer bei einer Temperatur von 50°C destilliert, um einen trockenen Rückstand zu erhalten. Dieser bleichgelbe Rückstand wurde mit 15 ml Dichlormethan bei 5°C für 10 Minuten gerührt, gefolgt von einer Filtration in einem Büchner- Trichter mit G-3-gesinterter Platte. Weitere 10 ml kaltes Dichlormethan (5°C) wurden ver wendet, um den Filterkuchen in dem Büchner-Trichter zu waschen. Das feste Material in dem Büchner-Trichter, das angereichertes Silymarin umfaßte, wurde in einem Vakuum-Ofen ge trocknet (45°C, 10 torr). Das getrocknete Material wurde durch Rühren mit 20 ml Acetonitril bei Zimmertemperatur suspendiert. 48 ml destilliertes Wasser wurden der Suspension zuge geben, um das Silymarin auszufällen. Der Inhalt wurde in einem Büchner-Trichter gefiltert, und der Kuchen wurde mit 200 ml destilliertem Wasser gewaschen. Der Kuchen wurde dann in einem Vakuum-Ofen bei 45°C bei 5-10 torr für 15-20 Stunden getrocknet. Das Endge wicht des erhaltenen Silymarins: 4,21 g; Ausbeute, auf der Grundlage des Trockensamenge wichts: 4,2%; Reinheit, mit DNPH-Verfahren: 79%.

Beispiel 2

Derselbe Prozeß wurde auf halbtechnischem Versuchsanlagen-Maßstab unter Verwendung von 40 kg Silybum marianum Samen durchgeführt, aber unter Verwendung einer halbtechni schen Versuchsanlagen-Ausstattung aus rostfreiem Stahl, wie folgt:
Die Samen wurden über Nacht auf (-)20°C in einem Gefrierschrank gekühlt, pulverisiert auf (-)40 Mesh in einer Hammermühle und dem Arzneidrogenhalter der halbtechnischen Soxhlet- Versuchsanlage aus rostfreiem Stahl zugegeben. 200 Liter Hexan wurden in den Arzneiddro genhalter gepumpt, um die pulverisierten Samen vollständig einzutauchen. Nach einer Kon taktzeit von 2,5 Stunden wurde der Extrakt in den Destillierblasenkessel abgelassen (Vol. des Extrakts: 165 l). Dampf bei 10 psig Liniendruck wurde in die Umhüllung des Destillierbla senkessels gelassen, um das Hexan zu destillieren. Das Stammventil wurde so reguliert, daß es eine Durchflußrate von 70-80 Liter/Stunde an kondensiertem Hexan beibehält, wie ange zeigt durch den Durchflußmesser, wobei das Hexan auf die Samenbettoberfläche in dem Arz neidrogenhalter gesprüht wird. Nachdem des Niveau des Lösungsmittels in dem Arzneidro genhalter ein Niveau von 2" oberhalb des Samenbettes erreichte, wurde der Dampffluß ge stoppt, um eine Kontaktzeit von 2,5 Stunden für die zweite Waschung zu ermöglichen. Die dritte Waschung wurde unter Befolgung derselben Prozedur wie oben durchgeführt. Ein fettes Öl wurde aus dem Extrakt durch Destillieren des Hexans gewonnen, um 12,4 kg des Öls zu erhalten (Ausbeute des fetten Öls 31%). Das restliche Hexan aus dem Samenbett wurde ge wonnen durch Einführen von heißem Wasser bei 75°C in der Umhüllung des Arzneidrogen halters. Die vollständige Entfernung des Hexans aus dem Samenbett wurde sichergestellt, indem langsam mit trockenem Stickstoff-Gas durch den Arzneidrogenhalter simultan für 20 Minuten gespült wurde. 180 Liter Acetonitril bei 27°C wurden als nächstes in den Arzneidro genhalter gepumpt, um die trockenen, entfetteten Samen vollständig einzutauchen. Eine Kontaktzeit von 2,5 Stunden wurde zugelassen. Der Extrakt wurde abgelassen und in einen rostfreien Stahl-Dünnschichtverdampfer mit rotierenden Wischern durch einen Rotameter bei einer Durchflußrate von 40 Litern/Stunde gepumpt, wobei der Teflon-Wischer bei 290 UpM rotierte, und heißes Wasser in der Verdampfer-Umhüllung bei 50°C zirkulierte. Das System wurde unter Vakuum von 8-10 torr mit einer Vakuumpumpe gehalten. Wiedergewonnenes Acetonitril wurde für die zweite und dritte Waschung verwendet. Zwei weitere Extraktionen des entfetteten Samenpulvers wurden unter Befolgung derselben Prozedur durchgeführt. Das Gesamtvolumen des konzentrierten Extraktes, das in dem Konzentrat-Empfänger des Dünn schichtverdampfers mit rotierenden Wischern von den drei Extrakten gesammelt wurde, war 62 Liter. Um eine weitere Anreicherung der Silymarin-Verbindungen in diesem Extrakt zu erreichen, wurde er in einen Glas-umwandeten Vakuumverdampfer vom Chargen-Typ über tragen, der mit einem Ankerrührer ausgestattet war. Heißes Wasser bei 50°C wurde in der Umwandung des Gefäßes zirkuliert, und der Vakuum-Konzentrator bei 8-10 torr mit einer Rührerrotation bei 98 UpM gehalten. Das Lösungsmittel von dem Extrakt wurde verdampft, um eine halbfeste Konsistenz des Produktes zu erhalten. Es wurde in einen rostfreien Stahl- Trog abgelassen, der sofort in einen Vakuum-Ofen übertragen wurde (45°C, 8-10 torr) zur vollständigen Trocknung. Der bleichgelbe Feststoff, der aus dem Vakuum-Ofen erhalten wur de, wurde pulverisiert und mit 6 Litern vorgekühltem Dichlormethan bei 5°C in einem ge rührten Reaktor aus rostfreiem Stahl für 5-10 Minuten gerührt. Der Inhalt wurde in einen geschlossenen Vakuum-Filter aus rostfreiem Stahl übertragen, um Dichlormethan zu entfer nen. Der Filterkuchen wurde ein weiteres Mal mit kaltem Dichlormethan gewaschen und durch Aufrechterhalten einer langsamen Spülung trockenen Stickstoff-Gases in der Kuchen kammer getrocknet. Der trockene Feststoff wurde mit 8 Litern Acetonitril bei Zimmertempe ratur in einem rostfreien Stahl-Reaktionsgefäß gerührt, um eine Suspension zu bilden. 20 Li ter destilliertes Wasser wurden der Suspension zugegeben, um einen leichtgelben Nieder schlag von Silymarin zu erhalten. Der Schlamm wurde zu dem rostfreien Stahl-Vakuum-Filter gepumpt, der mit einem 1-2 Micron-Sieb ausgestattet war, um das reine Silymarin abzutren nen. Der Kuchen wurde zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und in dem Vakuum- Ofen bei 45°C und 5-10 torr absolutem Druck für 16-20 Stunden getrocknet. Endgewicht von Silymarin: 1,36 kg. Ausbeute auf der Basis der trockenen Samen: 3,4%. Reinheit des Silymarins mit dem DNPH-Verfahren: 77,5%. Das Produkt wurde in einem luftdichten Be hälter gelagert, um Kontakt mit Licht und Luft zu verhindern.

Das vorliegende Verfahren zur Isolierung von Silymarin ist sehr wirtschaftlich und beinhaltet keine toxischen oder kostspieligen Reagentien. Dieses Verfahren kann auf kommerziellem Maßstab ausgebeutet werden, im Gegensatz zu bekannten Verfahren. Das vorliegende Ver fahren stellt eine reine Form von Silymarin bereit, die nicht einer weiteren Aufreinigungsbe handlung unterzogen werden muß. Zusätzlich können die verschiedenen Lösungsmittel, die verwendet werden, dem Verfahren wieder zugeführt/im Verfahren wiederverwendet werden.

Claims

1. Ein Verfahren zur Isolierung von Silymarin, einem hepatoprotektiven Mittel, aus den Samen von Silybum marianum, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfaßt:

a) Kühlen der Samen von Silybum marianum,
b) Zermahlen der gekühlten Samen zu einem feinen Pulver,
c) Entfetten der pulverisierten Samen durch Extrahieren mit einem Kohlenwasserstoff- Lösungsmittel,
d) Extrahieren des entfetteten Samenpulvers mit Acetonitril bei 20-30°C, um eine Sily marin-enthaltende Fraktion als einen Extrakt zu erhalten,
e) Einengen der empfindlichen Silymarin-Fraktion,
f) Rühren des Silymarin-reichen, trockenen Pulvers mit kaltem Dichlormethan bei 5°C, gefolgt von Filtration und Trocknen mit einer langsamen Spülung von Stickstoff-Gas,
g) Aufreinigung von Silymarin durch Suspendieren in Acetonitril in einer Menge, die 5-mal seinem Gewicht entspricht, und Ausfällen durch Zugabe von destilliertem Wasser in einer Menge, die 8- bis 12-mal seinem Gewicht entspricht, bei 20-30°C,
h) Filtern des ausgefällten Silymarins in einem geschlossenen Vakuum-Filter mit 1-2 µm Sieb, Waschen des Kuchens dreimal mit destilliertem Wasser, und
i) Trocknen des Silymarin-Kuchens in einem Vakuum-Ofen, um im wesentlichen reines Silymarin zu erhalten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Samen der Pflanze Silybum marianum für 24 h bei -20°C in einem Gefrierschrank oder einer Kältekammer gekühlt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel zum Ent fernen von Fettsäuren Hexan ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die gekühlten Samen in einer Hammermühle pulverisiert werden, die mit einem Ausgangssieb mit ungefähr 40 Mesh ausgestattet ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das fette Öl in dem Samenpulver durch Extraktion in einem Extraktor vom Soxhlet-Typ ohne Verwendung einer Schraube/Presse ent fernt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Extrakt, der empfindliches Silymarin enthält, erhalten in Schritt (iv), unter Verwendung eines Dünnschichtverdampfers mit rotie renden Wischern konzentriert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Filtration der Silymarin-enthaltenden Frak tionen in einem geschlossenen Vakuum-Filter unter der inerten Umgebung von Stick stoff-Gas durchgeführt wird, um den Abbau des Produktes zu verhindern.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Silymarin-Niederschlag unter Vakuum bei 40-45°C getrocknet wird, wobei der Ofendruck bei 5-15 torr für 15 Stunden gehalten wird.

9. Verfahren zum Extrahieren des hepatoprotektiven Mittels Silymarin aus den Samen von Silybum marianum (L) Gaertn, wobei besagtes Verfahren umfaßt:

a) Kühlen der Samen von Silybum marianum bei (-)20°C, indem sie über Nacht in einem Gefrierschrank/einer Kältekammer aufbewahrt werden,
b) Zermahlen der gekühlten Samen in einer Hammermühle, die mit einem 40 Mesh Ausgangssieb ausgestattet ist,
c) Extrahieren der pulverisierten Samen in einem Soxhlet-Apparat mit einem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, wie etwa Hexan, um das gesamte fette Öl zu entfernen,
d) Perkolieren des entfetteten Samenpulvers 3-4-mal mit Acetonitril bei (20°C-30°C) zum Abtrennen der Silymarin-enthaltenden Fraktion, als Extrakt,
e) Entfernen des Acetonitrils unter Vakuum in einem Dünnschichtverdampfer mit rotierenden Wischern, um ein Konzentrat, reich an Silymarin, zu erhalten, wo bei das wiedergewonnene Acetonitril dem Verfahren wieder zugeführt wird,
f) Trocknen des Konzentrats in einem gerührten Vakuum-Konzentrator vom Chargen-Typ, um ein Produkt halbfester Konsistenz zu erhalten, und sein wei teres Trocknen in einem Vakuum-Ofen, um einen trockenen Rückstand zu er halten,
g) Rühren des pulverisierten Rückstandes in kaltem Dichlormethan (5°C) und Filtern in einem geschlossenen Vakuum-Filter zum Entfernen der Verunreini gungen aus dem Silymarin-reichen, festen Produkt,
h) Auflösen des obigen Feststoffs in einer geringen Menge Acetonitril und Aus fällen von Silymarin durch Zugabe von kaltem destilliertem Wasser,
i) Filtern des leicht gelben Niederschlags und dreimaliges Waschen mit destil liertem Wasser, und
j) Übertragen des Kuchens in einen Vakuum-Ofen und Trocknen bei 40-45°C, wobei der Ofendruck bei 5-15 torr für 15 Stunden gehalten wird, und dadurch Erhalt von reinem Silymarin.