KR102568412B1 - 실리마린 생체이용률이 증대된 밀크씨슬 추출물 제조방법 - Google Patents
실리마린 생체이용률이 증대된 밀크씨슬 추출물 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 실리마린 생체이용률이 증대된 밀크씨슬 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 밀크씨슬 추출물은 흡수가 용이하여, 실리마린 생체이용률이 우수하다.
Description
본 발명은 실리마린 생체이용률이 증대된 밀크씨슬 추출물 제조방법에 관한 것이다.
밀크씨슬(학명: Silybum marianum)은 국화과 식물로 남서유럽, 북아프리카, 아시아에서 자라며, 6월~8월에 개화하고, 1.5m 크기까지 자라는 것으로 알려져 있다.
한편, 밀크씨슬은 열매와 씨앗에 실리말린이라고 불리는 플라보노리그난 그룹을 함유하는 것으로 알려져 있는데, 연구에 따르면, 실리마린은 간세포의 세포막을 보호하고 간 기능을 개선하는 것으로 알려져 있다. 또한, 실리마린은 항산화, 항종양, 혈당강하, 항고지혈증 및 위장 보호 효능 등 다양한 약리작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.
따라서, 상기와 같이 유용한 성분인 실리마린을 밀크씨슬로부터 추출하여 생체이용률을 높히고자 하는 연구들이 진행되고 있으나, 미진한 부분이 있다. 특히, 알코올을 용매로 사용하여 밀크씨슬로부터 실리마린을 추출하는 방법이 주로 사용되고 있으나, 실리마린 함량 대비 인체 흡수율이 낮아, 낮은 생체이용률을 보이고 있다.
본 발명은 실리마린 생체이용률이 증대된 밀크씨슬 추출물 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 밀크씨슬 씨앗 껍질에, 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase), 셀룰라아제(cellulase), 베타글루카나아제(beta-glucanase), 및 자일라나아제(xylanase) 중 선택되는 어느 하나 이상의 효소를 첨가하여 반응시키는 단계 (a); 및 상기 단계 (a) 후, 에탄올을 용매로 첨가하여 추출하는 단계 (b);를 포함하는 과정으로부터 제조된 밀크씨슬 추출물을 제공한다.
한편, 본 발명의 밀크씨슬 추출물에 있어서, 상기 단계 (a)의 밀크씨슬 씨앗 껍질은 바람직하게 밀크씨슬 씨앗으로부터 배유(胚乳)를 분리시켜 수득한 것이 좋다. 이때, 배유 분리는 바람직하게 밀크씨슬 씨앗을 압착시킨 후, 탈지시켜 수행하는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 밀크씨슬 추출물에 있어서 상기 단계 (a)의 반응은 바람직하게 45~55℃에서, 3~18시간 동안 반응시키는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 밀크씨슬 추출물에 있어서 상기 단계 (b)의 추출은 바람직하게 70~90℃에서, 1~8시간 동안 추출시키는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 밀크씨슬 추출물에 있어서 상기 단계 (b)는 바람직하게 용매 추출 후, 분말화하는 과정을 더욱 포함하는 것이 좋다.
본 발명 제조방법에 따른 밀크씨슬 추출물은 흡수가 용이하여, 실리마린 생체이용률이 우수하다.
도 1은 효소추출 후, 30%(v/v) 에탄올을 사용하여 용매추출 시킨 본 발명 밀크씨슬 추출물 (KPMP-060) 또는 효소추출 없이 90%(v/v)에탄올을 사용하여 용매추출 시킨 밀크씨슬 추출물 (GPMP-070)을 쥐에게 단회 투여한 후, 얻은 실리마린 혈중농도-시간 곡선하면적을 보여주는데, 본 발명 밀크씨슬 추출물의 우수한 생체이용률을 보여준다.
도 2는 본 발명 밀크씨슬 추출물 (KPMP-060)을 쥐에게 일주일간 투여한 후, 간손상을 일으키고, 측정한 혈중 AST 농도 결과로, 본 발명 밀크씨슬 추출물의 우수한 간보호 효능을 보여준다.
도 3은 본 발명 밀크씨슬 추출물 (KPMP-060)을 쥐에게 일주일간 투여한 후, 간손상을 일으키고, 측정한 혈중 ALT 농도 결과로, 본 발명 밀크씨슬 추출물의 우수한 간보호 효능을 보여준다.
도 4는 본 발명 밀크씨슬 추출물 (KPMP-060)을 쥐에게 일주일간 투여한 후, 간손상을 일으키고, 측정한 간세포의 항산화 단백질을 측정한 결과로, 본 발명 밀크씨슬 추출물의 우수한 간보호 효능을 보여준다.
도 5는 본 발명 본 발명 밀크씨슬 추출물 (KPMP-060)을 쥐에게 일주일간 투여한 후, 간손상을 일으키고, 간세포를 염색하여 관찰한 결과로, 본 발명 밀크씨슬 추출물의 우수한 간보호 효능을 보여준다.
도 2는 본 발명 밀크씨슬 추출물 (KPMP-060)을 쥐에게 일주일간 투여한 후, 간손상을 일으키고, 측정한 혈중 AST 농도 결과로, 본 발명 밀크씨슬 추출물의 우수한 간보호 효능을 보여준다.
도 3은 본 발명 밀크씨슬 추출물 (KPMP-060)을 쥐에게 일주일간 투여한 후, 간손상을 일으키고, 측정한 혈중 ALT 농도 결과로, 본 발명 밀크씨슬 추출물의 우수한 간보호 효능을 보여준다.
도 4는 본 발명 밀크씨슬 추출물 (KPMP-060)을 쥐에게 일주일간 투여한 후, 간손상을 일으키고, 측정한 간세포의 항산화 단백질을 측정한 결과로, 본 발명 밀크씨슬 추출물의 우수한 간보호 효능을 보여준다.
도 5는 본 발명 본 발명 밀크씨슬 추출물 (KPMP-060)을 쥐에게 일주일간 투여한 후, 간손상을 일으키고, 간세포를 염색하여 관찰한 결과로, 본 발명 밀크씨슬 추출물의 우수한 간보호 효능을 보여준다.
본 발명은 밀크씨슬 씨앗 껍질에, 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase), 셀룰라아제(cellulase), 베타글루카나아제(beta-glucanase), 및 자일라나아제(xylanase) 중 선택되는 어느 하나 이상의 효소를 첨가하여 반응시키는 단계 (a); 및 기 단계 (a) 후, 에탄올을 용매로 첨가하여 추출하는 단계 (b);를 포함하는 과정으로부터 제조된 밀크씨슬 추출물을 제공한다.
밀크씨슬은 열매와 씨앗 껍질에 실리마린을 다량 포함하는 것으로 알려져 있으며, 실리마린은 간보호, 항산화, 항종양, 혈당강하, 항고지혈증 및 위장보호 효능 등 다양한 기능성을 지닌 것으로 알려져 있다. 따라서, 밀크씨슬로부터 유용한 실리마린을 추출하여 실리마린의 인체 흡수율을 높이기 위한 연구들이 개발되고 있으나, 높은 농도의 에탄올을 용매로 사용하여 추출시킨 실리마린 추출물의 경우, 실리마린 추출 수율은 우수하지만, 지용성을 띄어 인체 흡수율이 낮은 문제점이 있다.
하지만, 본 발명에서는 효소 추출을 통해, 낮은 농도의 에탄올을 용매로 사용하였음에도, 높은 실리마린 함량을 가지는 밀크씨슬 추출물을 제조할 수 있었다. 또한, 하기 실험예에 따르면, 효소 추출 후, 낮은 농도의 에탄올을 용매로 사용하여 추출시킨 본 발명의 밀크씨슬 추출물의 경우 수용성을 띄어 매우 높은 생체이용율을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이는 동일한 실리마린 함량의 밀크씨슬 추출물을 섭취하더라도, 본 발명의 밀크씨슬 추출물을 섭취한 경우가 더욱 우수한 기능성을 나타낼 것을 의미한다.
이하, 본 발명 밀크씨슬 추출물 제조과정에 대해 각 단계별로 세분화해서 설명하고자 한다.
<단계 (a): 밀크씨슬 씨앗 껍질과 효소를 혼합하여 반응시키는 단계>
본 단계는 밀크씨슬 씨앗 껍질 및 효소를 혼합하고 반응시키는 단계이다. 본 단계에서, 반응은 바람직하게, 45~55℃에서, 3~18시간 동안 수행하는 것이 좋다.
본 단계에서, 밀크씨슬 씨앗 껍질은, 바람직하게 밀크씨슬 씨앗으로부터 배유(胚乳)를 분리시켜 수득한 것을 사용하는 것이 좋다. 이때, 배유 분리는 다양한 물리 화학적 방법을 통해 수행할 수 있다. 이때, 바람직하게는 밀크씨슬 씨앗을 압착시킨 후, 탈지시키는 방법으로 수행하는 것이 좋은데, 탈지 방법이 비교적 간편하게 껍질을 회수할 수 있는 방법이기 때문이다. 다만, 탈지시, 배유에 포함된 일부 전분질은 탈지를 통해 제거되지 않고 껍질에 포함되어 회수될 수 있지만, 이렇게 껍질에 같이 포함되어 회수된 전분질은 본 발명의 밀크씨슬 씨앗 껍질로부터 실리마린을 추출하는데, 특별한 영향을 주는 것은 아니라서 크게 문제될 것은 없다.
본 단계에서, 상기 효소는 바람직하게 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase), 셀룰라아제(cellulase), 베타글루카나아제(beta-glucanase), 및 자일라나아제(xylanase) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 혼합시키는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, 상기 기재한 효소들을 모두 사용하는 것이 좋으며, 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase)를 포함하는 Pectinex®Ultra SP-L 제품 (효소 활성: 3300 PGNU/g) 23~99, 셀룰라아제(cellulase)를 포함하는 Celluclast® 1.5 L 제품 (효소 활성: 700 EGU/g) 19~66, 셀룰라아제(cellulase)를 포함하는 ROHAMENT® CL 제품 (효소 활성: 15000 ECU/g) 1~6, 자일라나아제(xylanase) 및 베타글루카나아제(beta-glucanase)를 포함하는 Ultraflo® Max 제품 (베타글루카나아제 효소 활성: 700 EGU/g, 자일라나아제 효소 활성: 250 FXU/g) 1~6, 베타글루카나아제(beta-glucanase)를 포함하는 Viscozyme® L 제품 (효소활성: 100 FBG/g) 19~66의 무게 비율로 첨가하는 것이 더욱 좋다. 하기 실시예에 따르면, 밀크씨슬 씨앗 껍질에 상기 비율로 효소들을 넣고 반응시킴으로써, 높은 함량의 실리마린을 포함하면서도 생체 이용률이 높은 밀크씨슬 추출물을 제조할 수 있었다.
한편, 상기 기재한 셀룰라아제(cellulase)는 셀룰로오스를 가수분해하는 효소이다. 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase)는 펙틴산을 가수분해하는 효소이다. 베타글루카나아제(beta-glucanase)는 베타글루칸을 가수분해하는 효소이다. 자일라나아제(xylanase)는 자일란을 가수분해하는 효소이다.
<단계 (b): 용매 추출 단계>
본 단계는 에탄올을 용매로 사용하여 추출시키는 단계이다.
본 단계에서, 에탄올은 10~90%(v/v)의 에탄올을 사용하여 추출시킬 수 있는데, 바람직하게 20~50%(v/v)의 에탄올을 사용하는 것이 좋다. 하기 실험예에 따르면, 상기 단계 (a) 후, 20~50%(v/v)의 에탄올을 사용하여 추출시킨 밀크씨슬 추출물의 경우, 실리마린 생체이용율이 우수하다.
본 단계는 바람직하게 70~90℃에서, 1~8시간 동안 수행하는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 밀크씨슬 추출물 제조방법은, 상기 단계 (b) 후, 분말화시키는 과정을 더욱 포함하는 것이 좋다. 분말화를 통해 본 발명 밀크씨슬 추출물의 보관적성 및 사용적성을 향상시킬 수 있다.
한편, 상기 분말화시키는 과정은 일 예로, 동결건조를 통해 분말화시키는 것일 수 있는데, 바람직하게 동결건조 전, 여과 과정 및 농축 과정을 더욱 포함하는 것이 좋다. 여과 과정을 통해 불필요한 고형분을 제거시킬 수 있으며, 농축 과정을 통해 수분을 제거하여 분말화 과정에 도움을 줄 수 있을 뿐만 아니라, 에탄올을 제거하여 용매 잔류 문제를 해결할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 또는 실험예에만 한정되는 것은 아니고 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 본 발명의 밀크씨슬 추출물 제조]
본 실시예에서는 하기와 같이 본 발명의 밀크씨슬 추출물을 제조하였다.
밀크씨쓸 씨앗의 껍질과 배유 (胚乳, 내부 속살)를 분리시킨 후, 회수한 밀크씨슬 씨앗 껍질 11.5 g, 하기 표 1의 효소 및 정제수를 혼합하여 68.9g의 혼합액을 제조하였다.
| 효소명 | 기능 | 제품명 | 제조사 | 효소 활성 | 효소 첨가량 | |
| 1 | 폴리갈락투로나아제 | 세포벽의 구성 성분인 펙테이트 및 기타 갈락투로난에서 (1,4)-알파-디-갈락토시듀론 결합을 가수분해 | Pectinex®Ultra SP-L | novozymes | 3300 PGNU/g | 0.33g |
| 2 | 셀룰라아제 | 셀룰로오스 및 기타 베타-D 글루칸에서 (1,4)-베타-디-글루코시드 결합을 내부에서 가수분해 | Celluclast® 1.5 L | novozymes | 700 EGU/g | 0.33g |
| 비전분 다당류를 가수분해 | ROHAMENT® CL | AB Enzymes | 15000 ECU/g | 0.33g | ||
| 3 | 베타글루카나아제 | 베타-디-글루칸에서 (1,3) 또는 (1,4) 결합을 내부에서 가수분해 | Ultraflo® Max | novozymes | 700 EGU/g | 0.01g |
| Viscozyme® L | novozymes | 100 FBG/g | 0.33g | |||
| 4 | 자일라나아제 | 자일란에서 (1,4)-베타-디-자일로시드 결합을 내부에서 가수분해 | Ultraflo® Max | novozymes | 250 FXU/g | 0.01g |
상기 제조한 혼합액을 50℃의 온도에서 14시간 동안 1차 반응시켰다. 이후 30%(v/v) 에탄올 31.1 g을 첨가한 후, 80℃의 온도에서 4시간 동안 환류추출하며 2차 반응시켰다. 2차 반응시킨 혼합물을 25 μm의 필터로 여과시켰고, 그 통과액을 농축기를 통해 농축시켜 알코올과 수분을 제거시켰다. 이후 동결건조를 통해 본 발명의 밀크씨슬 추출물을 제조하였다.
[실험예 1: 본 발명 밀크씨슬 추출물의 실리마린(silymarin) 함량 분석]
본 실험예에서는 상기 제조한 본 발명 밀크씨슬 추출물의 유용성분인 실리마린(silymarin) 함량을 분석하고자 했다.
Silymarin 6종(Silychristin, Silydianin, Silybin A, Silybin B, Isosilybin A, Isosilybin B) 각 2 mg을 메탄올(Methanol) 2ml와 혼합하여 표준용액으로 사용하고, 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 통해 하기 표 2의 결과를 얻을 수 있었다. 한편, 비교를 위해 상기 실시예 1의 제조방법을 사용하되, 효소처리 없이 30%(v/v) 에탄올을 90%(v/v) 에탄올로 대체하고, 에탄올 추출 시 85℃에서 3시간 동안 3회 반복하여 추출시킨 밀크씨슬 추출물 (대조군 1), 상기 실시예 1의 제조방법을 사용하되, 30%(v/v) 에탄올을 증류수로 대체하여 추출한 밀크씨슬 추출물 (대조군 2) 및 상기 실시예 1의 제조방법을 사용하되, 셀룰라아제(cellulase; 제품명: ROHAMENT® CL), 베타글루카나아제(β-glucanase; 제품명: Ultraflo®Max), 자일라나아제(xylanase; 제품명: Ultraflo®Max)를 사용하지 않고, 총 3종의 효소 제품만 사용하여 제조한 밀크씨슬 추출물 (대조군 3)을 대조군으로 사용하였다. 한편, 대조군 3의 경우 실리마린 총합계만을 측정하였다.
| 번호 | 성분명 | 실시예 1 (mg/g) |
대조군 1 (mg/g) |
대조군 2 (mg/g) |
대조군 3* (mg/g) |
| 1 | silychristin | 25.97 | 132.94 | 6.32 | |
| 2 | silydianin | 26.17 | 38.34 | 6.00 | |
| 3 | silybin (A+B) | 41.63 | 289.88 | 10.57 | |
| 4 | isosilybin (A+B) | 24.38 | 98.54 | 3.18 | |
| 총 합계 | 118.15 | 559.7 | 26.08 | 68.89* |
상기 표 2를 보면, 본 발명의 실시예 1을 통해 제조한 밀크씨슬 추출물의 경우 118.15 mg/g의 실리마린을 함유하는 것을 확인할 수 있으며, 효소를 사용함에 따라 실리마린 함량이 증가한 것을 확인할 수 있다.
[실험예 2: 본 발명 밀크씨슬 추출물의 실리마린(silymarin)의 혈중 약물 농도 확인 실험]
본 실험예에서는 본 발명 밀크씨슬 추출물의 우수한 생체이용률을 확인하고자 했다. 이를 위해, 암, 수 Sprague-Dawley rat를 이용하여 상기 제조한 대조군 1 밀크씨슬 추출물과 본 발명의 밀크씨슬 추출물의 시간에 따른 혈중 실리마린 농도를 비교하였다.
2) 혈액시료의 채취 방법
- 실험물질의 제조
대조군 1 밀크씨슬 추출물의 경우, 밀크씨슬 추출물 0.7g (실리마린 390 mg 함유)을 측량한 후, 조제용기에 부형제인 3차 멸균 증류수를 첨가하여 10 mL/kg의 투여액량으로 현탁시켰다.
본 발명의 밀크씨슬 추출물 3.3 g (실리마린 390 mg 함유)을 측량한 후, 조제용기에 부형제인 3차 멸균 증류수를 첨가하여 20 mL/kg의 투여액량으로 현탁시켰다. 본 발명의 밀크씨슬 추출물의 경우 대조군 1 밀크씨슬 추출물 보다 고형분 함량이 높아 20 mL/kg의 투여액량으로 현탁한 것이다. 다만, 투여하는 실리마린의 함량은 동일하다.
- 실험동물 구성
실험동물로서 수컷 SD Rat(6 주령, 180-200 g, 오리엔트바이오, 가평센터)와 암컷 SD Rat(6 주령, 130-150 g, 오리엔트바이오, 가평센터)를 사용하였고, 시험 기간 동안 케이지에서 자유롭게 물과 사료(LabDiet 5053, Nutri Int, USA)에 접근하도록 사육하였다. 온도는 22±3℃, 습도는 50±20%, 12 시간의 light/dark cycle을 유지한 상태로 실험 전 약 1주의 적응기를 거친 후 실험에 사용하였다.
또한, 일반증상 및 체중 증가에 이상이 없는 쥐를 대상으로 실시하였으며, 평균체중에 가까운 동물을 선발하여 각 군 평균체중이 균등하도록 무작위로 군 당 6마리로 분리하여 실험하였다.
- 투여방법
쥐에 시험물질을 투여하기 전 음수를 제외하고 12 시간 이상 절식을 실시한 후 일회용 주사기를 이용하여 시험물질을 위내 강제투여를 실시하였다. 대조군 1 밀크씨슬 추출물의 투여액량은 10 mL/kg으로, 본 발명의 밀크씨슬 추출물의 투여액량은 20 mL/kg으로 하고, 개체별 투여액량은 당일 측정한 체중을 기준으로 산출하여 단회 위 내에 강제 경구투여 하였다. 시험 물질 투여 1.5 시간 후에 식이를 공급하였다.
- 혈액시료의 채취
각 군의 모든 개체에 대하여 투여 후 채혈 시간마다 경정맥에서 헤파린 나트륨 (Sodium Heparin) (100 IU/mL)이 들어간 일회용 주사기 (1 mL 26G, 한국백신, KOR)를 이용하여 약 200 uL 이상의 혈액을 채혈하였다. 채혈시간은 투여 전 0 시간, 0.083, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 3, 5, 8, 12, 24 시간으로 총 12회 채혈을 실시하였다. 채혈한 혈액은 즉시 12,000 rpm 에서 5 분간 원심분리하여 혈장을 분리한 뒤, -80℃에서 보관하였다가 전처리 전에 실온에서 해동 후 분석에 사용하였다.
- 혈액시료의 전처리
해동한 혈장 50 μL에 100% 메탄올 (IS: naringenin 40 ng/mL 포함) 450 μL를 가하였다. 이후 vortex-mixing (2,500 rpm, 5 min)하고 10분간 원심분리 (14,000 rpm, 10 min)하였다. 상층액 1 μL를 LC-MS/MS에 주입하여 실리마린 함량을 분석하였다.
- 기기 분석 조건
UPLC 기기: 1290 Series LC system (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)
컬럼: Waters HSS T3 (1.8 um, 2.1 * 50 mm)
컬럼 온도: 35℃
유속: 0.2 mL/min
주입량: 1.0 μL
분석시간: 16.0분
| Time (min) | A solution (%) | B solution (%) |
| 0.0 | 60 | 40 |
| 8.0 | 52 | 48 |
| 12.0 | 50 | 50 |
| 13.0 | 10 | 90 |
| 14.0 | 10 | 90 |
| 15.0 | 60 | 40 |
MS/MS 기기: 6470 mass spectrometer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)
| Compound | MRM transtion (m/z) | Fragment energy(eV) | Collision energy(eV) | Retention time(min) |
| Silychristin | 481→125/325 | 125 | 30/20 | 3.3 |
| Silydianin | 481→151/179 | 125 | 32/22 | 4.1 |
| Silybin A | 481→125/301 | 135 | 30/20 | 7.3 |
| Silybin B | 481→301/125 | 135 | 16/26 | 8.2 |
| Isosilybin A | 481→125/453 | 125 | 30/16 | 10.1 |
| Isosilybin B | 481→125/453 | 115 | 30/16 | 10.7 |
| Naringenin (IS) | 271→151/119 | 175 | 16/30 | 7.1 |
3) 혈액시료 분석 결과
상기 기재한 실험방법을 통해 혈액시료를 얻고, 실리마린 혈중 농도 데이터를 얻었다 (표 5~8).
| Time(h) | Silychristin | Silydianin | Silybin A | Silybin B | Isosilybin A | Isosilybin B |
| 0 | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
| 0.083 | 3.93±1.87 | ND | 57.22±29.04 | 62.64±47.03 | 39.91±18.93 | 41.24±21.79 |
| 0.25 | 6.45±2.03 | ND | 66.59±22.14 | 53.26±15.37 | 47.03±13.75 | 44.59±17.87 |
| 0.5 | 7.38±0.83 | ND | 65.45±6.53 | 71.73±52.82 | 47.51±11.60 | 44.66±18.22 |
| 0.75 | 8.10±3.12 | ND | 63.27±31.05 | 64.45±47.94 | 45.72±22.37 | 40.96±20.71 |
| 1 | 6.24±3.30 | ND | 47.04±23.08 | 42.93±26.58 | 34.97±17.71 | 31.13±16.68 |
| 1.5 | 4.66±0.92 | ND | 21.36±10.53 | 14.97±6.82 | 16.89±8.25 | 14.19±7.72 |
| 3 | 0.26±00 | ND | 1.80±1.03 | 1.46±0.51 | 1.47±0.94 | 0.94±0.74 |
| 5 | ND | ND | 0.76±00 | ND | ND | ND |
| 8 | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
| 12 | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
| 24 | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
| Time(h) | Silychristin | Silydianin | Silybin A | Silybin B | Isosilybin A | Isosilybin B |
| 0 | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
| 0.083 | 3.88±2.16 | ND | 50.85±25.88 | 50.74±24.97 | 45.86±20.85 | 46.29±20.66 |
| 0.25 | 10.07±3.13 | ND | 72.60±20.10 | 75.21±18.36 | 67.49±16.19 | 67.35±20.12 |
| 0.5 | 12.31±3.06 | ND | 80.14±11.94 | 80.65±12.06 | 74.27±5.93 | 72.02±9.99 |
| 0.75 | 12.26±1.00 | ND | 85.33±14.67 | 82.53±12.36 | 78.53±13.26 | 76.43±15.81 |
| 1 | 10.05±1.88 | ND | 72.88±15.10 | 70.45±13.88 | 66.59±9.43 | 63.69±7.54 |
| 1.5 | 5.87±2.30 | ND | 33.72±23.55 | 29.66±20.44 | 30.04±19.99 | 26.77±18.56 |
| 3 | ND | ND | 1.52±0.31 | 1.12±0.36 | 1.11±0.27 | 1.66±0.27 |
| 5 | ND | ND | ND | 0.96±0.14 | 0.87±0.03 | 0.95±0.37 |
| 8 | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
| 12 | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
| 24 | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
| Time(h) | Silychristin | Silydianin | Silybin A | Silybin B | Isosilybin A | Isosilybin B |
| 0 | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
| 0.083 | ND | ND | 1.29±0.95 | 2.20±1.83 | 5.65±3.75 | 3.83±2.69 |
| 0.25 | ND | ND | 3.17±2.05 | 5.58±3.40 | 15.61±11.74 | 11.50±8.77 |
| 0.5 | ND | ND | 4.10±1.95 | 7.46±3.38 | 21.48±13.56 | 16.17±10.48 |
| 0.75 | ND | ND | 4.11±1.12 | 8.10±2.20 | 21.76±7.85 | 15.33±6.39 |
| 1 | ND | ND | 4.20±0.91 | 7.96±1.64 | 21.35±7.25 | 14.92±6.42 |
| 1.5 | ND | ND | 2.65±1.11 | 5.38±2.47 | 13.23±5.81 | 8.71±4.34 |
| 3 | ND | ND | 1.26±0.55 | 2.62±1.82 | 4.57±3.16 | 3.05±2.06 |
| 5 | ND | ND | ND | ND | 1.57±0.28 | 1.40±0.15 |
| 8 | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
| 12 | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
| 24 | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
| Time(h) | Silychristin | Silydianin | Silybin A | Silybin B | Isosilybin A | Isosilybin B |
| 0 | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
| 0.083 | 6.77±5.76 | ND | 5.29±6.42 | 11.63±17.29 | 26.84±38.67 | 22.48±34.18 |
| 0.25 | 10.03±5.12 | ND | 10.06±7.46 | 22.59±17.77 | 52.95±46.07 | 45.20±14.01 |
| 0.5 | 8.21±2.30 | ND | 7.39±3.08 | 16.39±8.28 | 42.04±25.56 | 32.83±22.22 |
| 0.75 | 6.86±0.93 | ND | 6.27±1.61 | 13.19±4.18 | 35.98±17.04 | 28.13±16.12 |
| 1 | 6.53±0.21 | ND | 5.45±2.15 | 12.51±5.41 | 32.14±18.34 | 24.61±16.81 |
| 1.5 | 4.74±1.56 | ND | 2.55±1.07 | 6.16±2.91 | 15.02±7.92 | 10.96±6.54 |
| 3 | 1.39±00 | ND | 0.51±00 | 0.73±0.29 | 1.67±0.66 | 1.42±0.42 |
| 5 | 0.57±00 | ND | ND | ND | 1.16±0.57 | 1.25±0.49 |
| 8 | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
| 12 | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
| 24 | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
상기 표 5~8을 보면, 본 발명의 밀크씨슬 추출물과 대조군 1 밀크씨슬 추출물을 동일한 실리마림 함량으로 투여하였음에도, 본 발명의 밀크씨슬 추출물을 투여한 경우가 더욱 높은 실리마린 혈중 농도를 보이는 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명 밀크씨슬 추출물이, 100% 에탄올을 사용하여 추출시킨 밀크씨슬 추출물보다, 더욱 높은 실리마린 흡수율을 보이는 것을 의미한다.
한편, 상기 표 5~8을 바탕으로, 약동학적 파라미터를 계산하였다 (표 9~12).
| Parameter | Silychristin | Silydianin | Silybin A | Silybin B | Isosilybin A | Isosilybin B |
| AUC0-t(ng· h/mL) |
8.02±2.80 | ND | 86.07±22.14 | 85.21±42.35 | 38.95±11.09 | 61.99±25.34 |
| AUC0-∞(ng· h/mL) |
10.89±3.88 | ND | 87.44±21.21 | 86.30±41.62 | 42.46±11.50 | 63.61±26.19 |
| Cmax (ng/mL) | 9.46±1.82 | ND | 84.42±20.00 | 85.59±47.65 | 24.83±12.05 | 55.22±18.19 |
| Tmax(h) | 0.55±0.27 | ND | 0.47±0.30 | 0.47±0.27 | 0.88±0.38 | 0.43±0.34 |
| T1/2(h) | 0.52±0.15 | ND | 0.40±0.03 | 0.42±0.18 | 0.84±0.27 | 0.47±0.16 |
| Parameter | Silychristin | Silydianin | Silybin A | Silybin B | Isosilybin A | Isosilybin B |
| AUC0-t(ng· h/mL) |
12.61±3.67 | ND | 113.21±26.51 | 108.35±21.33 | 100.90±19.62 | 108.75±24.45 |
| AUC0-∞(ng· h/mL) |
24.70±7.81 | ND | 108.30±25.26 | 108.56±21.23 | 103.17±17.82 | 110.35±23.20 |
| Cmax (ng/mL) | 13.22±2.40 | ND | 90.37±11.35 | 88.38±12.41 | 82.76±10.45 | 82.59±12.94 |
| Tmax(h) | 0.67±0.13 | ND | 0.63±0.26 | 0.58±0.20 | 0.63±0.26 | 0.63±0.26 |
| T1/2(h) | 1.04±0.62 | ND | 0.80±0.80 | 0.34±0.03 | 0.40.±0.10 | 0.45±0.11 |
| Parameter | Silychristin | Silydianin | Silybin A | Silybin B | Isosilybin A | Isosilybin B |
| AUC0-t(ng· h/mL) |
ND | ND | 6.86±1.91 | 13.89±2.44 | 63.12±20.65 | 28.17±11.36 |
| AUC0-∞(ng· h/mL) |
ND | ND | 9.76±3.35 | 19.70±11.04 | 64.31±20.41 | 31.67±10.60 |
| Cmax (ng/mL) | ND | ND | 4.88±1.71 | 9.26±2.84 | 59.39±14.59 | 18.02±9.64 |
| Tmax(h) | ND | ND | 0.75±0.32 | 0.88±0.38 | 0.47±0.30 | 0.79±0.40 |
| T1/2(h) | ND | ND | 1.16±0.59 | 1.14±0.62 | 0.39±0.04 | 0.83±0.75 |
| Parameter | Silychristin | Silydianin | Silybin A | Silybin B | Isosilybin A | Isosilybin B |
| AUC0-t(ng· h/mL) |
10.26±2.31 | ND | 8.84±3.53 | 21.12±10.76 | 59.60±33.09 | 46.45±30.36 |
| AUC0-∞(ng· h/mL) |
24.02±17.66 | ND | 11.44±4.43 | 23.48±10.70 | 61.19±32.48 | 47.67±30.46 |
| Cmax (ng/mL) | 10.46±3.96 | ND | 11.10±6.66 | 25.20±15.81 | 60.21±42.94 | 51.38±38.63 |
| Tmax(h) | 0.45±0.21 | ND | 0.46±0.25 | 0.46±0.29 | 0.42±0.20 | 0.42±0.20 |
| T1/2(h) | 1.76±1.60 | ND | 0.71±0.13 | 0.48±0.09 | 0.74±0.58 | 0.57±0.11 |
한편, 상기 표 9~12를 바탕으로, 혈중농도-시간 곡선하면적 (AUC0-∞)을 비교하였다 (도 1).
도 1을 보면, 본 발명의 밀크씨슬 추출물 (KPMP-060)과 대조군 1 밀크씨슬 추출물 (GPMP-070)이 동일한 함량으로 실리마린을 함유하고 있음에도, 본 발명의 밀크씨슬 추출물이 더욱 높은 혈중농도-시간 곡선하면적 (AUC0-∞)을 보이는 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명 밀크씨슬 추출물이, 100% 에탄올을 사용하여 추출시킨 밀크씨슬 추출물보다, 더욱 높은 생체이용율을 보이는 것을 의미한다.
[실험예 3: 본 발명 밀크씨슬 추출물의 간손상 방지능 평가]
본 실험예에서는 본 발명 밀크씨슬 추출물의 간손상 방지능을 평가하고자 했다.
이를 위해 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명 밀크씨슬 추출물을 쥐에게 일주일간 경구투여 한 뒤, T-BHP(Tert-Butyl hydroperoxide)를 투여하여 간손상을 유도시켰다.
이후 isoflurane을 이용해 충분히 마취 한 뒤, 마취가 유지되는 상태에서 개복하고, 간조직을 채취하였다. 복대동맥에서는 전혈을 얻은 후, tube(BD SST tube, Vacutainer blood collection tube, BD)에 담아 혈청을 분리하고, 간수치 측정(AST 측정, ALT 측정)에 사용하였다.
1) 혈청 AST 분석 결과
혈청에 존재하는 AST를 분석한 결과 (도 2), 밀크씨슬 추출물 투여 없이 T-BHP 만을 투여한 음성대조군(Negative control)은 정상대조군(Normal control)과 비교하여 혈청 AST가 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 밀크씨슬 추출물을 일주일간 경구투여 한 뒤, T-BHP를 투여하여 간손상을 유도한 실험군의 경우, 음성대조군 보다 혈청 AST 수치가 낮은 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 밀크씨슬 추출물이 우수한 간손상 방지능이 있음을 의미한다.
2) 혈청 ALT 분석 결과
혈청에 존재하는 ALT를 분석한 결과 (도 3), 밀크씨슬 추출물 투여 없이 T-BHP 만을 투여한 음성대조군(Negative control)은 정상대조군(Normal control)과 비교하여 혈청 ALT가 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 밀크씨슬 추출물을 일주일간 경구투여 한 뒤, T-BHP를 투여하여 간손상을 유도한 실험군의 경우, 음성대조군 보다 혈청 ALT 수치가 낮은 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 밀크씨슬 추출물이 우수한 간손상 방지능이 있음을 의미한다.
3) 간조직 항산화 단백질 분석
채취한 간조직에서 단백질을 분리하고, 항산화 단백질을 측정하였다 (도 4). 이를 통해 음성대조군(Negative control)은 정상대조군(Normal control)과 비교하여 항산화 단백질(GST, CAT, SOD)의 단백질 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 밀크씨슬 추출물을 일주일간 경구투여 한 뒤, T-BHP를 투여하여 간손상을 유도한 실험군의 경우는 항산화 단백질의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 밀크씨슬 추출물이 간의 항산화스트레스 개선능을 향상시켜줄 수 있음을 의미한다.
4) 간조식 변화 관찰
채취한 간조직을 H&E(헤마톡실린-에오신)로 염색하여 확인한 결과 (도 5), 음성대조군(Negative control)은 정상대조군(Normal control)과 비교하여 간세포의 소실이 나타난 것을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 밀크씨슬 추출물을 일주일간 경구투여 한 뒤, T-BHP를 투여하여 간손상을 유도한 실험군의 경우, 음성대조군 보다 간세포 소실이 덜 나타난 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 밀크씨슬 추출물이 우수한 간손상 방지능이 있음을 의미한다.
Claims (6)
- 탈지된 밀크씨슬 씨앗에, 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase), 셀룰라아제(cellulase), 베타글루카나아제(beta-glucanase), 및 자일라나아제(xylanase)를 첨가하여 반응시키는 단계 (a); 및
상기 단계 (a) 후, 20~50%(v/v)의 에탄올을 용매로 첨가하여 추출하는 단계 (b);를 포함하는 과정으로부터 제조된 밀크씨슬 추출물.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (a)의 탈지된 밀크씨슬 씨앗은,
밀크씨슬 씨앗으로부터 배유(胚乳)를 분리시켜 수득한 것을 특징으로 하는 밀크씨슬 추출물.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (a)의 탈지된 밀크씨슬 씨앗은,
밀크씨슬 씨앗을 압착시킨 후, 탈지시킨 것을 특징으로 하는 밀크씨슬 추출물.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (a)의 반응은,
45~55℃에서, 3~18시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 밀크씨슬 추출물.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (b)의 추출은,
70~90℃에서, 1~8시간 동안 추출시키는 것을 특징으로 하는 밀크씨슬 추출물.
- 탈지된 밀크씨슬 씨앗에, 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase), 셀룰라아제(cellulase), 베타글루카나아제(beta-glucanase), 및 자일라나아제(xylanase)를 첨가하여 반응시키는 단계 (a); 및
상기 단계 (a) 후, 20~50%(v/v)의 에탄올을 용매로 첨가하여 추출하는 단계 (b);를 포함하는 것을 특징으로 하는 밀크씨슬 추출물의 제조방법.
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|---|---|
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-
2022
- 2022-05-18 KR KR1020220061035A patent/KR102568412B1/ko active IP Right Grant
- 2022-05-27 WO PCT/KR2022/007583 patent/WO2023224158A1/ko unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10016449A1 (de) * | 2000-03-29 | 2001-10-04 | Council Scient Ind Res | Verbessertes Verfahren zur Isolierung des hepatoprotektiven Mittels Silymarin aus den Samen der Pflanze Silybum marianum |
| KR20160115461A (ko) * | 2015-03-27 | 2016-10-06 | 전라남도 | 큰엉겅퀴로부터 실리마린의 고효율 추출하는 방법 |
| KR20200057006A (ko) | 2017-09-22 | 2020-05-25 | 유로메드, 에스.에이. | 밀크씨슬 추출물의 향상된 용해도 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Liu et al., Optimisation of enzyme assisted extraction of silybin from the seeds of Silybum marianum by Box-Behnken experimental design. Phytochemical Analysis. 2009, Vol. 20, pp. 475-483 1부.* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023224158A1 (ko) | 2023-11-23 |
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