Silymarin
ist die Bezeichnung, die einer Mischung von in Silybum marianum
gefundenen Flavanolignanen gegeben wird, die eine klinisch nachgewiesene
hepatoprotektive Wirkung gezeigt haben. Positive Resultate, die
in zahlreichen pharmakologischen, biochemischen und toxikologischen
Studien erhalten worden sind, haben Silymarin zu einer Arznei der
Wahl bei der Behandlung von Lebererkrankungen gemacht (Morazzoni,
P. und Bombardelli, E., Fitoterapia, 116(1), S. 1005, 1995). Hauptbestandteile
des Silymarins sind identifiziert worden als die Flavanolignane
Silybin, Silydianin und Silychristin, und ihre chemischen Strukturen
sind aufgeklärt
worden (Wagner, H., Diesel, P., und Seitz, M., Arzneim. Forsch.
24, S. 466, 1974; Pelter, A., Hansel, R., Tetrahedron Letters, Nr.
25, S. 2911–2916,
1968; Abraham D J, Takagi S, Wagner H, Farnsworth N R, et al, Tetrahedron
Letters, Nr. 31, S. 2675–2678,
1970; Wagner H, Cahri, M. V, Seitz M; Riess-Muarer, I, Tetrahedron
Letters, Nr. 4, S. 381–384,
1978). Der Mechanismus der hepatoprotektiven Wirkung von Silymarin
ist seiner Fähigkeit
zugeschrieben worden, als ein leistungsfähiger Abfänger freier Radikale zu fungieren,
der in der Lage ist, die peroxidativen Prozesse zu unterbrechen,
die bei Leberschädigungen
beteiligt sind, welche durch hepatotoxische Mittel, wie Alkohol,
Paracetamol und Kohlenstofftetrachlorid induziert werden (Leng,
P.E., Strange, H.A., Z. Phytotherapie 12, 162, 1991). In Anbetracht
des weitverbreiteten Gebrauchs von Alkohol, der Leberprobleme bei
Menschen verursacht, und der allgemeinen weiten Verbreitung von
Lebererkrankungen, die durch unreines Trinkwasser verursacht werden,
ist der Bedarf nach Silymarin sehr groß. Silymarin wird aus den reifen
trockenen Samen von Silybum marianum extrahiert. Über einige
Verfahren zur Isolierung von Silymarin ist berichtet worden.
Gemäß einem
Verfahren wurde die pulverisierte Droge in einem Soxhlet-Extraktor
mit Methanol oder Ethanol extrahiert, der Extrakt wurde unter reduziertem
Druck konzentriert, das Konzentrat zu einem Schlamm mit Kieselgel
gemacht und auf eine Kieselgelsäule
geladen, eluiert mit Benzol-Ethylacetat-Mischungen wachsender Polarität, die Silymarin-enthaltenden Fraktionen
wurden kombiniert und das Lösungsmittel
entfernt, der Rückstand,
aus MeOH kristallisiert, ergab 86 % reines Silybin (Schmp. 167°C – 180°C), die Stammflüssigkeit,
vollständig
getrocknet unter Vakuum, ergab eine zusätzliche gelbe Mischung von
Flavanoiden mit 58 % Reinheit als Silybin (Gupta, G.K., Raj, S.,
Rao, P.R., Research and Industry 27, S. 37 – 42, 1982). Die höchste Ausbeute
an Silymarin, über
die von diesen Auto ren berichtet wurde, war 2,46%, auf der Grundlage
des Gewichts der Samen. Dieser Prozeß beinhaltet den kostenintensiven Schritt
der Kieselgelchromatographie, der nicht wirtschaftlich ist, wenn
er auf industriellem Maßstab
verwendet wird. Ein anderer Prozeß, der gegenwärtig verwendet
wird, umfaßt
das Entfernen eines Teils des fetten Öls durch Drücken der Samen in einer Schraubpresse,
Aufbrechen der komprimierten Samenmasse, Extrahieren der gepreßten Samenmasse mit
Ethylacetat bei 75°C,
Verdampfen des Lösungsmittels,
um einen halbfesten Rückstand
zu erhalten, Entfetten des Rückstandes
durch wiederholte Flüssig-Fest-Extraktion
mit leichtem Petroleum, Auflösen des
entfetteten Rückstandes
in Methanol, Mischen der Methanollösung mit Chloroform und Wasser,
Abtrennen und Zurückbehalten
der methanolischen Schicht, Verdampfen des wäßrigen Methanols, Suspendieren
des Rückstands
in ein wenig Methanol, Ausfällen
des Silymarin-reichen Feststoffes durch Mischen mit einem Überschuß Wasser,
Zentrifugieren, Waschen und Trocknen des Niederschlags in vacuo. Die
Ausbeute an Silymarin ist 1,7%, auf der Grundlage des trockenen
Samengewichts. (Madaus, R. Klaus, G., Werner, M., U.S. Patent Nr.
4,368,195, 11. Januar 1983).
DE 3225688 A1 offenbart
ein Verfahren zur Gewinnung von Silymarin aus Silybum marianum, bei
dem vorzerkleinerte Früchte
von Silybum marianum direkt mit einem Lösungsmittel versetzt, vermischt,
ggf. mehrfach extrahiert werden und der Extrakt eingedampft wird,
wobei der Eindampfungsrückstand
zur Abtrennung der Ölanteile
zentrifugiert oder filtriert wird.
Die
Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfaches Verfahren
zum Isolieren des hepatoprotektiven Wirkstoffes Silymarin aus den Samen
von Silybum marianum bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe ist es,
ein neues, billiges und wirtschaftliches Verfahren zur Isolierung
von Silymarin auf kommerziellem Maßstab bereitzustellen.
Zusammenfassung
der Erfindung
Entsprechend
stellt die Erfindung ein neues Verfahren bereit zur Isolierung von
Silymarin, einem hepatoprotektiven Mittel, aus den Samen von Silybum
marianum.
Detaillierte
Beschreibung
Entsprechend
stellt die Erfindung ein neues Verfahren bereit zur Isolierung von
Silymarin, einem hepatoprotektiven Mittel, aus den Samen von Silybum
marianum, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfaßt:
- (i) Kühlen
der Samen von Silybum marianum,
- (ii) Zermahlen der gekühlten
Samen zu einem feinen Pulver,
- (iii) Entfetten der pulverisierten Samen durch Extrahieren mit
einem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel,
- (iv) Extrahieren des entfetteten Samenpulvers mit Acetonitril
bei 20 – 30°C, um eine
Silymarin-enthaltende Fraktion als einen Extrakt zu erhalten,
- (v) Einengen der empfindlichen Silymarin-Fraktion,
- (vi) Rühren
des Silymarin-reichen, trockenen Pulvers mit kaltem Dichlormethan
bei 5°C,
gefolgt von Filtration und Trocknen mit einer langsamen Spülung von
Stickstoff-Gas,
- (vii) Aufreinigen von Silymarin durch Suspendieren in Acetonitril
in einer Menge, die 5-mal
seinem Gewicht entspricht, und Ausfällen durch Zugabe von destilliertem
Wasser in einer Menge, die 8 – 12-mal
seinem Gewicht entspricht, bei 20 – 30°C,
- (viii) Filtrieren des ausgefällten
Silymarins in einem geschlossenen Vakuum-Filter mit 1 – 2 μm Sieb, Waschen
des Kuchens dreimal mit destilliertem Wasser, und
- (ix) Trocknen des Silymarin-Kuchens in einem Vakuum-Ofen, um
im wesentlichen reines Silymarin zu erhalten.
In
einer Ausführungsform
werden die Samen der Pflanze Silybum marianum für 24 h bei –20°C in einem Gefrierschrank oder
einer Kältekammer
gekühlt.
In
einer Ausführung
ist das Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel
zur Entfernung von Fettsäuren Hexan.
In
einer Ausführungsform
werden die gekühlten
Samen in einer Hammermühle
pulverisiert, die mit einem Ausgangssieb mit ungefähr 40 Mesh
ausgestattet ist.
In
einer weiteren Ausführungsform
wird das fette Öl
in dem Samenpulver durch Extraktion in einem Extraktor vom Soxhlet-Typ
ohne Verwendung einer Schraube/Presse entfernt.
In
noch einer weiteren Ausführungsform
wird der Extrakt, der empfindliches Silymarin enthält, in Schritt
(iv) erhalten, konzentriert unter Verwendung eines Dünnschichtverdampfers
mit rotierenden Wischern.
In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird die Filtration der Silymarin-enthaltenden Fraktionen in einem geschlossenen
Vakuum-Filter unter der inerten Umgebung von Stickstoff-Gas durchgeführt, um
den Abbau des Produktes zu verhindern.
In
noch einer weiteren Ausführungsform
wird der Silymarin-Niederschlag unter Vakuum bei 40 – 45°C getrocknet,
wobei der Ofendruck bei 5 – 15
torr für
15 Stunden gehalten wird.
Die
Erfindung wird unten im einzelnen unter Bezugnahme auf die folgenden
Beispiele beschrieben, die nur zu Illustrationszwecken dargeboten
werden und nicht dahingehend interpretiert werden sollten, daß sie den
Schutzumfang der Erfindung in irgendeiner Weise beschränken.
Primär umfaßt das verbesserte
Verfahren die folgenden Vorgänge:
- 1. Kühlen
der Samen von Silybum marianum bei (–)20°C, indem sie über Nacht
in einem Gefrierschrank/Kältekammer
aufbewahrt werden.
- 2. Zermahlen der gekühlten
Samen in einer Hammermühle,
die mit einem 40 Mesh Ausgangssieb ausgestattet ist.
- 3. Extrahieren der pulverisierten Samen in einem Soxhlet-Apparat
mit einem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel,
wie etwa Hexan, um das gesamte fette Öl zu entfernen.
- 4. Perkolieren des entfetteten Samenpulvers 3-4mal mit Acetonitril
bei (20°C – 30°C) zum Abtrennen
der Silymarin-enthaltenden Fraktion, als Extrakt.
- 5. Entfernen des Acetonitrils unter Vakuum in einem Dünnschichtverdampfer
mit rotierenden Wischern, um ein Konzentrat zu erhalten, das reich an
Silymarin ist, wobei das wiedergewonnene Acetonitril dem Verfahren
wieder zugeführt
wird.
- 6. Trocknen des Konzentrats in einem gerührten Vakuum-Konzentrator vom
Chargen-Typ, um
ein Produkt halbfester Konsistenz zu erhalten, und sein weiteres
Trocknen in einem Vakuum-Ofen, um einen trockenen Rückstand
zu erhalten.
- 7. Rühren
des pulverisierten Rückstandes
in kaltem Dichlormethan (5°C)
und Filtern in einem geschlossenen Vakuum-Filter zum Entfernen von Verunreinigungen
aus dem Silymarin-reichen, festen Produkt.
- 8. Auflösen
des obigen Feststoffs in einer geringen Menge Acetonitril und Ausfällen von
Silymarin durch Zugabe von kaltem destilliertem Wasser.
- 9. Filtern des leicht gelben Niederschlags und dreimaliges Waschen
mit destilliertem Wasser.
- 10. Übertragen
des Kuchens in einen Vakuum-Ofen und Trocknen bei 40 – 45°C, wobei
der Ofendruck bei 5 – 15
torr für
15 Stunden gehalten wird.
- 11. Überprüfen der
Reinheit des erhaltenen Produkts mit dem DNPH-Verfahren unter Verwendung
eines UV-Spektrophotometers bei 490 nm (Wagner, V. H., Diesel, P.,
Saity, M., Arzneim. – Forsch,
24 (4), S. 466 – 471,
1974) und durch HPLC (Tittel und Wagner, Journal of Chromatography,
153, S. 227 – 232,
1978).
Wesentliche
Kennzeichen der Erfindung
- 1. Das Verfahren nach dem Stand der Technik hängt von
einer Schneckenpresse ab, um einen Teil des in den Samen vorhandenen
fetten Öls
zu entfernen. Das verbleibende Öl
wird in einem zweiten Schritt einer Fest-Flüssig-Extraktion entfernt, die
mit leichtem Petroleum an dem Rohextrakt ausgeführt wird, der aus einer Ethylacetat-Extraktion
der Samen bei 75°C
erhalten worden war, was dem Betrieb der Schneckenpresse folgt.
Die vorliegende Erfindung erreicht ein vollständiges Entfernen von fettem Öl in einem
einzelnen Schritt durch eine Soxhlet-Extraktion mit Hexan einer sorgfältig hergestellten
aufgebrochenen Samenmasse. Der Schritt des Kühlens der Samen auf (–)20°C vor dem
Aufbrechen in einer Hammermühle,
die mit einem 40 Mesh Ausgangssieb ausgestattet ist, ist besonders
einfallsreich, als er die Samen spröde und brüchig macht. Die Auswahl einer
Hammermühle,
die mit einem 40 Mesh Ausgangssieb ausgestattet ist, ist besonders
einfallsreich, da sie die Samen spröde und brüchig macht. Die Auswahl einer
Hammermühle,
die mit dem besonderen Sieb ausgestattet ist, ist angemessen, da
sie eine pulverisierte Samenmasse liefert, die einer wirksamen Perkolation
mit Lösungsmittel
zugänglich
ist, was vollständiges
Entfernen des fetten Öls
in nur drei Waschungen erreicht. Anders als bei dem Verfahren im
Stand der Technik ist kein mechanisches Rühren bei dieser Erfindung erforderlich,
was den Betrieb vereinfacht und Energiekosten einspart. Die Extraktion des
fetten Öls
mit einer Schneckenpresse, wie sie bei dem Verfahren im Stand der
Technik stattfindet, bringt ebenso das Problem mit sich, daß feine Samenpartikel
in das Öl
gelangen, das dann gefiltert werden muß, um das Samenmaterial zu
erhalten, die Restmenge an Öl
muß in
einem Fest-Flüssig-Extraktionsschritt
wiedergewonnen werden, der an dem Ethylacetat-Extrakt durchgeführt wird.
Das Verfahren dieser Erfindung ist viel einfacher und wirksam, um
die gesamte Menge des fetten Öls
in einem einzelnen Schritt zu entfernen und spart somit wertvolle
Verarbeitungszeit ein.
- 2. Das Verfahren im Stand der Technik beinhaltet die Extraktion
von entfetteten Samen mit heißem Ethylacetat
bei 75°C
und eine Filtration des heißen
Schlammes, um den Extrakt zu erhalten. Die vorliegende Erfindung
hat Acetonitril ausgewählt, um
die Silymarin-enthaltende Fraktion von der entfetteten Samenmasse
bei 20°C – 30°C selektiver
zu entfernen. Ein Verarbeitungsvorteil wird auf zwei Gebieten erhalten,
indem bei Zimmertemperatur betrieben wird, im Vergleich zu 75°C bei dem Verfahren
im Stand der Technik; (a) es ist wahrscheinlich, daß die Filtration
des Schlammes, der heißes
Ethylacetat enthält,
bei 75°C
(Sdp. Ethylacetat = 77°C)
toxische Lösungsmitteldämpfe emittiert,
wenn nicht spezielle Einfassungen konstruiert sind; (b) das Verfahren
dieser Erfindung ist, dadurch, daß es bei Raumtemperatur betrieben wird,
einfacher und weniger gefährlich
gegenüber einer
Arbeitsplatzumgebung.
- 3. Die Verfahren im Stand der Technik beinhalten das Einengen
des Silymarin-reichen Extraktes durch eine verlängerte Destillation/Evaporation bei
50°C. In
Anbetracht der empfindlichen Natur von Flavolignan-Molekülen, die
Silymarin ausmachen, verwendet das Verfahren dieser Erfindung einen
Dünnschichtverdampfer
mit rotierenden Wischern unter Vakuum, um das Einengen der Silymarin-enthaltenden
Extrakte durchzuführen.
Verdampfungsapparate mit rotierendem Wischer-Dünnschicht-Design haben die
Fähigkeit, eine
Lösungsmittel-Verdampfung
durchzuführen, indem
das zu verarbeitende Material für
eine kurze Dauer von nur 1 – 3
Sekunden erhitzt wird. Dies vermeidet jede Möglichkeit des Abbaus der Silymarin-Bestandteile.
- 4. Das Verfahren im Stand der Technik verwendet Methanol:Wasser:Chloroform
in einem 1:1:1-Verhältnis,
um die nicht-erwünschten,
Nicht-Flavanolignan-Materialien aus dem Silymarin-enthaltenden Extrakt
zu entfernen, der in die Methanol-Wasser-Phase übertragen wird. Der Erhalt von
Silymarin aus 50 % wäßrigem Methanol
unter Vakuum erfordert eine lange Zeit und einen großen Eintrag
an Wärmeenergie,
um die hohe latente Verdampfungswärme von Wasser zur Verfügung zu
stellen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist in der Lage,
eine Aufreinigung von Silymarin durch Waschen des Extraktes mit
kaltem Dichlormethan bei 5°C
zu erreichen, das, da es einen viel geringeren Siedepunkt von 40,5°C hat, mit
einem geringen Eintrag an Destillationswärme wiedererhalten wird.
In Übereinstimmung
mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zielen die anfänglichen
Verfahrensschritte auf die selektive Abtrennung des fetten Öls von den
Samen von Silybum marianum in einem einzelnen Schritt ab durch Vorkühlung der
Rohmaterialen auf (–)20°C und Durchführen des
Zermahlens der kalten Samen in einer Hammermühle, die mit einem 40 Mesh
Ausgangssieb ausgestattet ist, um eine pulverisierte Samenmasse
optimaler Porosität
und Partikelgröße zu erhalten,
aus der es möglich
ist, die gesamte Menge des fetten Öls durch Extraktion mit Hexan
in einem Extraktor des Soxhlet-Typs zu entfernen, was ein einzigartiges
Merkmal dieser Erfindung ist, und es möglich macht, die gesamte Menge
des fetten Öls
in nur drei Lösungsmittel-Waschungen
zu entfernen, wobei jede Waschung eine Kontaktzeit von 2,5 Stunden
hat. Um die Abwesenheit der Flavanolignan-Verbindungen in dem Hexan-Extrakt
zu überprüfen, wurde
eine TLC mit einer Probe des Hexan-Extrakts und einer Silymarin-Lösung (1
mg/ml in Methanol) durchgeführt,
geladen auf eine vorbeschichtete Kieselgel-60-Mesh-Platte (Merck), die
Platte zweimal in dem Lösungsmittelsystem
Chloroform:Aceton:Ameisensäure
(9:2:1) laufengelassen, mit 1 % methanolischer Eisen(III)Chlorid-Lösung entwickelt,
mit Schwefelsäure
angesäuert.
Keine rotbraunen Flecken, die für
Flavanolignane typisch sind, wurden auf dem Chromatogramm des Hexan-Extrakts
gesehen. Fettes Öl
kann aus dem Hexan-Extrakt durch einfache Destillation erhalten und
das Hexan dem Prozeß wieder
zugeführt
werden. Das entfettete Samenbett wird von Hexan befreit durch Laufenlassen
von heißem
Wasser bei 75°C
in der Ummantelung des Gefäßes, das
das Samenpulver hält,
und eine geringe Menge an Stickstoff-Gas wird simultan durch das
Samenpulverbett geleitet, um es vollständig zu trocknen.
Der
nächste
Schritt der vorliegenden Erfindung umfaßt die Perkolation der entfetteten
Samen mit Acetonitril-Lösungsmittel
bei Temperatur (20°C – 30°C), um die
Flavanolignan-Verbindungen
zusammen mit einigen Verunreinigungen selektiv zu extrahieren. Acetonitril
ist als ein Lösungsmittel
gewählt worden,
das eine Polarität
hat, die um weniges höher als
Ethylacetat, aber geringer als Methanol ist. Eine Extraktion mit
Acetonitril der entfetteten Samen bei Zimmertemperatur ist wirksamer
bei der Extraktion der Flavanolignane. Dieser Schritt der Erfindung
vermeidet das Kochen von Rohmaterial, wie es mit Ethylacetat in
Verfahren im Stand der Technik gemacht wird, erzielt jedoch höhere Ausbeuten
an Silymarin. Der empfindlichen Silymarin-Fraktion wird zusätzlicher
Schutz durch Verwendung eines Dünnschicht-Verdampfungsapparates
mit rotierenden Wischern zum Einengen des Silymarin-Extrakts in Acetonitril
verliehen. Diese Art von Verdampfungsapparat exponiert das zugegebene
Material einer mit heißem
Wasser erhitzten Verdampfungs-Oberfläche für eine Dauer im Bereich von
nur 1 – 3
Sekunden. Die nicht-flavanoiden Verunreinigungen, die zusammen mit
Silymarin extrahiert werden, werden durch Rühren des Trockenextraktes zweimal
mit dreimal der Menge an kaltem Dichlormethan bei 5°C entfernt.
Die Verwendung kalten Dichlormethans für diesen Aufreinigungsschritt
minimiert den Verlust dieses flüchtigen
Lösungsmittels
und minimiert ebenso den Verlust an Silymarin, das in kaltem Dichlormethan
wenig löslich
ist. Die gefilterte Silymarin-Mischung wird in einem Vakuum-Ofen
bei 45°C
getrocknet und in 5-mal ihrem Gewicht Acetonitril suspendiert. Destilliertes
Wasser bei Zimmertemperatur, 8 – 12-mal
das Gewicht von Silymarin wird jetzt mit dem Inhalt vermischt, um
einen leicht gelben Niederschlag zu ergeben, der gefiltert und mit
mehr Wasser gewaschen wird. Wir haben gefunden, daß ein geschlossener Vakuum-Filter
vom Büchner-Typ,
der mit einem 1 – 2 μm Filterschichtsieb
ausgestattet ist. ziemlich geeignet für diesen Betrieb ist. Der gefilterte
und gewaschene Kuchen wird in einem Vakuum-Ofen-Trog pulverisiert
und bei 45°C – 50°C bei 8 – 10 torr
absolutem Druck für
ungefähr
16 – 20
Stunden pulverisiert. Die Produktreinheit wird durch das DNPH-Verfahren
unter Verwendung eines UV-Spektrophotometers bei 490 nm bestimmt
(Wagner, V. H., Diesel, P., Saity, M., Arzneim-Forsch, 24(4), S.
466 – 471, 1974).
Eine HPLC-Analyse des Produkts wird durchgeführt, um genauere Information über die
Silymarin-Bestandteile zu bekommen (Tittel, G. und Wagner, H., Journal
of Chromatography, 153 : 227 – 232, 1978).
Durch Befolgen des Verfahrens dieser Erfindung wird ein Silymarin
von 79 % erhalten. Die Ausbeute an Silymarin, auf der Grundlage
des trockenen Samengewichts, ist im Bereich zwischen 3,4 bis 4,0 %.
Entsprechend
stellt die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren zur Isolierung
von Silymarin aus den Samen von Silybum marianum bereit, das umfaßt: (i)
Kühlen
der Samen auf (–)20°C in einem Gefrierschrank/einer
Kältekammer,
(ii) Pulverisieren der gekühlten
Samen unter Verwendung einer Hammermühle, die mit einem 40 Mesh
Ausgangssieb ausgestattet ist, (iii) Entfetten des pulverisierten
Samens durch Extrahieren mit Hexan in einem Soxhlet-Extraktor, um die
Gesamtmenge an fettem Öl
zu entfernen, ohne eine Schneckenpresse zu verwenden, (iv) Extrahieren
des entfetteten Samenpulvers mit Acetonitril bei 20°C bis 30°C, um eine
Silymarin-Fraktion zu erhalten, (v) Einengen der empfindlichen Silymarin-Fraktion
unter Vakuum in einem Dünnschicht-Verdampfungsapparat
mit rotierenden Wischern, um ein Silymarin-Konzentrat zu erhalten, (vi)
Rühren
des getrockneten Silymarin-reichen Pulvers mit kaltem Dichlormethan
bei 5°C,
gefolgt von Filtern und Trocknen des aufgereinigten Silymarins, Trocknen
des Materials unter einer Stickstoff-Atmosphäre (vii) weiterhin Aufreinigen
von Silymarin durch Suspendieren mit 5-mal seinem Gewicht an Acetonitril
und Ausfällen
mit 8 – 12-mal
seinem Gewicht an Wasser bei 20 – 30°C, (viii) Filtern des ausgefällten Silymarins
in einem geschlossenen Vakuum-Filter mit einer 1 – 2 μm Filterschicht
und Waschen des Kuchens dreimal mit Wasser, (ix) Trocknen des Silymarin-Kuchens
in einem Vakuum-Ofen, um im wesentlichen reines Silymarin zu erhalten.
In
einer Ausführungsform
der Erfindung werden die vorgekühlten
Samen in einer Hammermühle aufgebrochen,
die mit einem 40 Mesh Ausgangssieb ausgestattet ist.
In
noch einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird die Gesamtmenge an fettem Öl in den Samen in einem einzelnen
Schritt durch Extraktion mit Hexan in einem Extraktor vom Soxhlet-Typ
ohne die Verwendung einer Schneckenpresse entfernt.
In
noch einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird Acetonitril verwendet, um die Silymarin-Fraktion
selektiv aus den entfetteten Samen zu extrahieren.
In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird die Extraktion des Silymarins unter Verwendung
des Lösungsmittels
bei 20°C – 30°C und unter
Vermeidung der Verwendung heißer
Lösungsmittel
nahe dem Siedepunkt durchgeführt,
was toxische Dämpfe
emittiert.
100
g Silybum marianum Samen wurden in einem Gefrierschrank, eingestellt
auf (–)20°C, für 24 Stunden
aufbewahrt. Die kalten Samen wurden in einem Mikro-Pulverisier-Apparat
unter Verwendung eines 40 Mesh Ausgangssiebs pulverisiert. Das pulverisierte
Material wurde in einen Glas-Soxhlet-Apparat geladen. Das pulverisierte
Samenbett wurde zwischen zwei Baumwollschichten von je einem halben Inch
eingefaßt
(„sandwiched"). 600 ml Hexan wurden in
den Destillierblasenkolben aufgenommen und über einem Wasserbad erhitzt,
um das Lösungsmittel zum
Kochen zu bringen und die Zirkulation des Lösungsmittels durch das Samenbett
zu beginnen. Der Soxhlet-Apparat wurde auf diese Weise kontinuierlich
für 6 Stunden
betrieben, um die Samen vollständig
zu entfetten. Entfettetes Samenpulver wurde in einen Vakuum-Ofen übertragen
und bei 45°C,
10 torr absolutem Druck für
4 Stunden getrocknet. Der Hexan-Extrakt wurde destilliert, um 32,5
g eines bleichgelben fetten Öls
zu erhalten. Das entfettete trockene Samenpulver wurde in einen
1 Liter Rundkolben übertragen
und mit 400 ml Acetonitril bei 25°C
für 3 Stunden
mazeriert. Der Inhalt wurde in einem Glas Büchner-Trichter gefiltert, um das Samenmaterial von
dem Extrakt zu trennen. Diese Tätigkeit
wurde dreimal wiederholt unter Verwendung von 300 ml Lösungsmittel
in jeder der aufeinanderfolgenden zwei Extraktionen, um eine Gesamtmenge
von 890 ml Extrakt zu erhalten. Der Extrakt wurde in einem Vakuum-Rotationsverdampfer
bei einer Temperatur von 50°C
destilliert, um einen trockenen Rückstand zu erhalten. Dieser
bleichgelbe Rückstand
wurde mit 15 ml Dichlormethan bei 5°C für 10 Minuten gerührt, gefolgt
von einer Filtration in einem Büchner-Trichter mit G-3-gesinterter
Platte. Weitere 10 ml kaltes Dichlormethan (5°C) wurden verwendet, um den
Filterkuchen in dem Büchner-Trichter
zu waschen. Das feste Material in dem Büchner-Trichter, das angereichertes
Silymarin umfaßte,
wurde in einem Vakuum-Ofen ge trocknet (45°C, 10 torr). Das getrocknete Material
wurde durch Rühren
mit 20 ml Acetonitril bei Zimmertemperatur suspendiert. 48 ml destilliertes Wasser
wurden der Suspension zugegeben, um das Silymarin auszufällen. Der
Inhalt wurde in einem Büchner-Trichter
gefiltert, und der Kuchen wurde mit 200 ml destilliertem Wasser
gewaschen. Der Kuchen wurde dann in einem Vakuum-Ofen bei 45°C bei 5 – 10 torr
für 15 – 20 Stunden
getrocknet. Das Endgewicht des erhaltenen Silymarins: 4,21 g; Ausbeute, auf
der Grundlage des Trockensamengewichts: 4,2 %; Reinheit, mit DNPH-Verfahren:
79 %.
Derselbe
Prozeß wurde
auf halbtechnischem Versuchsanlagen-Maßstab unter Verwendung von
40 kg Silybum marianum Samen durchgeführt, aber unter Verwendung
einer halbtechnischen Versuchsanlagen-Ausstattung aus rostfreiem
Stahl, wie folgt:
Die Samen wurden über Nacht auf (–)20°C in einem Gefrierschrank
gekühlt,
pulverisiert auf (–)40
Mesh in einer Hammermühle
und dem Arzneidrogenhalter der halbtechnischen Soxhlet-Versuchsanlage aus rostfreiem
Stahl zugegeben. 200 Liter Hexan wurden in den Arzneiddrogenhalter
gepumpt, um die pulverisierten Samen vollständig einzutauchen. Nach einer Kontaktzeit
von 2,5 Stunden wurde der Extrakt in den Destillierblasenkessel
abgelassen (Vol. des Extrakts: 165 1). Dampf bei 10 psig Liniendruck
wurde in die Umhüllung
des Destillierblasenkessels gelassen, um das Hexan zu destillieren.
Das Stammventil wurde so reguliert, daß es eine Durchflußrate von
70 – 80
Liter/Stunde an kondensiertem Hexan beibehält, wie angezeigt durch den
Durchflußmesser,
wobei das Hexan auf die Samenbettoberfläche in dem Arzneidrogenhalter
gesprüht
wird. Nachdem des Niveau des Lösungsmittels
in dem Arzneidrogenhalter ein Niveau von 2" oberhalb des Samenbettes erreichte, wurde
der Dampfluß gestoppt,
um eine Kontaktzeit von 2,5 Stunden für die zweite Waschung zu ermöglichen.
Die dritte Waschung wurde unter Befolgung derselben Prozedur wie
oben durchgeführt.
Ein fettes Öl
wurde aus dem Extrakt durch Destillieren des Hexans gewonnen, um
12,4 kg des Öls
zu erhalten (Ausbeute des fetten Öls 31 %). Das restliche Hexan aus
dem Samenbett wurde gewonnen durch Einführen von heißem Wasser
bei 75°C
in der Umhüllung des
Arzneidrogen halters. Die vollständige
Entfernung des Hexans aus dem Samenbett wurde sichergestellt, indem
langsam mit trockenem Stickstoff-Gas durch den Arzneidrogenhalter
simultan für
20 Minuten gespült
wurde. 180 Liter Acetonitril bei 27°C wurden als nächstes in
den Arzneidrogenhalter gepumpt, um die trockenen, entfetteten Samen
vollständig
einzutauchen. Eine Kontaktzeit von 2,5 Stunden wurde zugelassen.
Der Extrakt wurde abgelassen und in einen rostfreien Stahl-Dünnschichtverdampfer
mit rotierenden Wischern durch einen Rotameter bei einer Durchflußrate von
40 Litern/Stunde gepumpt, wobei der Teflon-Wischer bei 290 UpM rotierte,
und heißes
Wasser in der Verdampfer-Umhüllung
bei 50°C
zirkulierte. Das System wurde unter Vakuum von 8 – 10 torr
mit einer Vakuumpumpe gehalten. Wiedergewonnenes Acetonitril wurde
für die zweite
und dritte Waschung verwendet. Zwei weitere Extraktionen des entfetteten
Samenpulvers wurden unter Befolgung derselben Prozedur durchgeführt. Das
Gesamtvolumen des konzentrierten Extraktes, das in dem Konzentrat-Empfänger des
Dünnschichtverdampfers
mit rotierenden Wischern von den drei Extrakten gesammelt wurde,
war 62 Liter. Um eine weitere Anreicherung der Silymarin-Verbindungen
in diesem Extrakt zu erreichen, wurde er in einen Glas-umwandeten
Vakuumverdampfer vom Chargen-Typ übertragen, der mit einem Ankerrührer ausgestattet
war. Heißes
Wasser bei 50°C
wurde in der Umwandung des Gefäßes zirkuliert,
und der Vakuum-Konzentrator bei 8 – 10 torr mit einer Rührerrotation
bei 98 UpM gehalten. Das Lösungsmittel
von dem Extrakt wurde verdampft, um eine halbfeste Konsistenz des
Produktes zu erhalten. Es wurde in einen rostfreien Stahl-Trog abgelassen,
der sofort in einen Vakuum-Ofen übertragen
wurde (45°C,
8 – 10 torr)
zur vollständigen
Trocknung. Der bleichgelbe Feststoff, der aus dem Vakuum-Ofen erhalten
wurde, wurde pulverisiert und mit 6 Litern vorgekühltem Dichlormethan
bei 5°C
in einem gerührten
Reaktor aus rostfreiem Stahl für
5 – 10
Minuten gerührt.
Der Inhalt wurde in einen geschlossenen Vakuum-Filter aus rostfreiem
Stahl übertragen,
um Dichlormethan zu entfernen. Der Filterkuchen wurde ein weiteres
Mal mit kaltem Dichlormethan gewaschen und durch Aufrechterhalten
einer langsamen Spülung
trockenen Stickstoff-Gases in der Kuchenkammer getrocknet. Der trockene
Feststoff wurde mit 8 Litern Acetonitril bei Zimmertemperatur in
einem rostfreien Stahl-Reaktionsgefäß gerührt, um eine Suspension zu
bilden. 20 Liter destilliertes Wasser wurden der Suspension zugegeben,
um einen leichtgelben Niederschlag von Silymarin zu erhalten. Der
Schlamm wurde zu dem rostfreien Stahl-Vakuum-Filter gepumpt, der
mit einem 1 – 2
Micron-Sieb ausgestattet war, um das reine Silymarin abzutrennen.
Der Kuchen wurde zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und
in dem Vakuum-Ofen
bei 45°C
und 5 – 10
torr absolutem Druck für
16 – 20
Stunden getrocknet. Endgewicht von Silymarin: 1,36 kg. Ausbeute
auf der Basis der trockenen Samen: 3,4 %. Reinheit des Silymarins
mit dem DNPH-Verfahren: 77,5 %. Das Produkt wurde in einem luftdichten
Behälter
gelagert, um Kontakt mit Licht und Luft zu verhindern.