DE10001140A1 - Oligonukleotide zur Amplifikation und zum Nachweis von bakteriellen Genen für extrazelluläre alkalische Metallopeptidasen (Apr), neutrale Metallopeptidasen (Npr) und Serinpeptidasen (Spr) - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt Oligonukleotide zum Nachweis bakterieller Gene, die für extrazelluläre alkalische Metalloproteasen, extrazelluläre neutrale Metalloproteasen und extrazelluläre Serinproteasen kodieren.

Description

Die Erfindung betrifft Oligonukleotide zur Amplifikation und zum qualitativen und quantitativen Nachweis extrazellulärer bakterieller Proteasegene, nämlich extrazellulärer alkalischer Metallopeptidasen, extrazellulärer neutraler Metallopeptidasen und extrazellulärer Serinpeptidasen sowie Verfahren zum Nachweis dieser extrazellulären bakteriellen Peptidasegene und ihre Amplifikation.

Bakterielle extrazelluläre Peptidasen sind in verschiedenen Wissenschaftsbereichen von großer Bedeutung. Dabei gibt es in den einzelnen Bereichen sehr unterschiedliches Interesse an diesen Enzymen, was im folgenden erläutert wird.

• 1. In der Waschmittelindustrie werden Peptidasen biotechnologisch in großem Maßstab hergestellt, da einige über eine hohe Thermostabilität verfügen und breite Anwendung finden. Hier gibt es einen Bedarf an neuen Enzymen mit physikochemischen und biochemischen Eigenschaften, die an neue marktwirtschaftliche Anforderungen angepaßt sind. Die Enzyme, die hier Verwendung finden (z. B. Subtilsin, Thermolysin), werden von typischen Bodenbakterien produziert. Das Habitat Boden z. B. stellt wahrscheinlich den größten Pool an unterschiedlichen Bakterien, die auch verschiedene Peptidasen produzieren können, dar, da hier eine enorme bakterielle Diversität existiert (vermutlich ist nur ein sehr geringer Teil der Bakterienspezies bisher bekannt und charakterisiert). Der Zugang zu diesem Potential wird bisher dadurch limitiert, daß Bakterien so kultiviert werden müssen, daß die entsprechenden Enzyme exprimiert werden. Aufwendige Enzymaufreinigungen und -charakterisierungen sind dann erforderlich. Hier fehlt es an einem "high-throughput" Verfahren, mit dem eine große Anzahl von Bakterien nach den verschiedenen Peptidasen gescreent werden kann, um sie dann gezielter zu untersuchen.
• 2. Im Bereich der Lebensmittelindustrie können bakterielle extrazelluläre Peptidasen für das Verderben von Lebensmitteln verantwortlich sein (z. B. Pseudomonas fluorescens in Milch, Fleisch, Fisch, Kosmetika). Die hitzeresistenten Peptidasen von psychrophilen Bakterien (die also auch bei Kühlung aktiv sind und Peptidasen bilden können) können z. B. auch nach einer Pasteurisierung noch aktiv sein. Deshalb müssen die entsprechenden Organismen für Qualitätsbeurteilungen nachgewiesen werden. Hier wäre es von Vorteil, nicht nur das Vorkommen von bestimmten Organismen, sondern gleich eine Vielzahl an Peptidase-bildenden Bakterien (und auch unbekannte) zu detektieren. Außerdem ist die Ermittlung von Bakterienzahlen über Kultivierungstechniken mit erheblichen Mängeln behaftet, weil nur die auf den entsprechenden Medien wachstumsfähigen Organismen erfaßt werden. Mit Hilfe der quantitativen PCR, für die die hier vorgestellten Oligonukleotide ebenfalls konzipiert sind, könnte ein Titer an potentiell schädlichen Bakterien in den verschiedensten Lebensmitteln unabhängig von der Kultivierbarkeit ermittelt werden.
• 3. Peptidasen von Krankheitserregern sind darüberhinaus auch in der klinischen Mikrobiologie von großer Bedeutung, da sie Virulenzfaktoren darstellen. Beispiele hierfür sind:
  Pseudomonas aeruginosa alkaline Protease: Augenhornhautentzündung, Inhibierung der antiviralen und immunomodulatorischen Aktivität von menschlichem gamma-Interferon. Vibrio cholerae Hämaglutinin Protease: spielt eine Rolle bei der Cholera-Pathogenese. Legionella pneumophilia extrazelluläre Metalloprotease: spielt eine Rolle bei der Pathogenese der Legionärskrankheit.
  Der schnelle Nachweis (und auch eine Quantifizierung) und die Identifizierung von Peptidasegenen in potentiellen Krankheitserregern oder in infiziertem Gewebe könnte in der medizinischen Diagnostik Anwendung finden.
  Für alle Bereiche, in denen bakterielle Peptidasen von Interesse sind, gilt, daß man mit einer Vielzahl an verschiedenen Bakterienspezies und unterschiedlichen Peptidasen konfrontiert ist, die nur mit einem erheblichen Aufwand nachgewiesen werden können oder nur teilweise oder garnicht erfaßt werden. Bei einem Screening auf Ebene der exprimierten Proteasen ergibt sich die Schwierigkeit, daß die entsprechende Peptidase unter den gegebenen Kulturbedingungen eventuell nicht exprimiert wird oder daß eine Identifizierung über die übliche Inhibierung nicht zu eindeutigen Ergebnissen führt.

Es sind bereits degenerierte Primer für die Detektion von verschiedenen Peptidasegenen veröffentlicht. Hier handelt es sich jedoch um spezifische Primer, die jeweils für die spezifischen Fragestellungen designed wurden. So sind z. B. pilzliche Serin-Proteasen (Jarai et al, 1994: Cloning and characterization of the pepD gene of Aspergillus niger which codes for a subtilisin-like protease. Gene 139: 51-57.) oder Lactococcus Peptidasen (Stroman P., 1992: Sequence of a gene (lap) encoding a 95.3-kDa aminopeptidase from Lactobacillus lactis ssp. Cremoris Wg2. Gene 113: 107-112.) beschrieben. Mit den genannten Primern wird nur ein kleiner spezieller Teil von Proteasegenen erfaßt. Aufgrund der Länge der Zielsequenzen sind sie nicht für eine Quantifizierung mit Hilfe der TaqMan-Technologie für die quantitative PCR geeignet, eine notwendige Sonde ist nicht vorhanden. Bei einer Patentrecherche in der NCBI Datenbank wurden keine ähnlichen PCR Systeme gefunden. Es gibt also bisher keine Lösungen dieses Problems.

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Oligonukleotide bereitzustellen, die u. a. als Primer und Sonden einsetzbar sind, mit deren Hilfe eine breite Palette an unterschiedlichen Proteasegenen detektierbar ist. Diese Oligonukleotide sollen die drei wichtigsten extrazellulären bakteriellen Proteaseklassen, nämlich die alkalischen Metallopeptidasen, die neutralen Metallopeptidasen und die Serinpeptidasen, abdecken und eine qualitative und quantitative Detektion ermöglichen.

Die Aufgabe der Erfindung wird durch die im Anspruch 1 näher gekennzeichneten Mittel zur Amplifikation und zum qualitativen und quantitativen Nachweis extrazellulärer bakterieller Peptidasegene sowie durch das in den Ansprüchen näher charakterisierte Verfahren zum spezifischen Nachweis und zur Amplifikation bakterieller extrazellulärer Peptidasegene gelöst. Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie der nachfolgenden Beschreibung und den Ausführungsbeispielen. Es wird darauf hingewiesen, daß die nachfolgende Beschreibung und insbesondere die nachfolgender Ausführungsbeispiele lediglich bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung wiedergeben, die Erfindung jedoch nicht auf diese speziellen Ausgestaltungen beschränkt ist. Abwandlungen können vom Fachmann ohne erfinderisches Zutun vorgenommen werden, ohne hierdurch von Erfindungsgedanken abzuweichen.

Die Erfindung wird nachfolgend auch anhand von zwei Tabellen sowie einer Figur nähe beschrieben. Diese zeigen:

Tabelle 1

Oligonukleotide, die als Primer und Sonden für eine spezifische Amplifikation und Detektion von Genen für alkaline Metallopeptidasen (apr), neutrale Metallopeptidasen (npr) und Serinpeptidasen (spr) verwandt wurden.

Tabelle 2

Charakterisierung der ausgeschiedenen Peptidasen und der Peptidasegene vor Typstämmen und bakteriellen Bodenisolaten.
Rh = Grünland-Rhizosphärenboden
Gs = Gartenerde
S = Ackerboden (Scheyern)

Tabelle 2

Stamm

Fig. 1A) Gelelektrophorese von PCR-Produkten die aus Boden DNA erhalten wurden, mit den Primers spezifisch für Gene für bakterielle Serinpeptidasen (spr), neutrale Metallopeptidasen (npr) und alkaline Metallopeptidasen (apr). 2% der aus 1 g Boden extrahierten DNA wurde als Template eingesetzt. DNA Längenstandard (Spur 1 and 8), Amplifikationsprodukt mit den Primern sprIa/sprII mit DNA (Spur 2) und ohne DNA (Spur 3), Amplifikationsprodukt mit den Primern nprI/nprII mit DNA (Spur 4) und ohne DNA (Spur 5), Amplifikationsprodukt mit den Primern aprI/aprII mit DNA (Spur 6) und ohne DNA (Spur 7).

Fig. 1B) Southern blot Hybridisierung der Genfragmente von spr, npr, apr mit den DIG-markierten Sonden SPR (B1), NPR (B2) und APR (B3).

Erfindungsgemäß werden somit Oligonukleotide als Sonden und Primer bereitgestellt, die so gestaltet sind, daß ein spezifischer Nachweis extrazellulärer bakterieller Peptidasegene, nämlich von extrazellulären alkalischen Metallopeptidasen, neutralen Metallopeptidasen und Serinpeptidasen, sowie die Amplifikation der jeweiligen Genfragmente ermöglicht wird. Die Erfindung umfaßt demnach die nachfolgenden Oligonukleotide sowie ihre komplementären Sequenzen und die reversen oder revers-komplementären Sequenzen sowie die hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen:

• a) für extrazelluläre alkalische Metallopeptidasen:
  
• b) für extrazelluläre neutrale Metallopeptidasen:
  
• c) für extrazelluläre Serinpeptidasen:
  

Die hier offenbarten Oligonukleotide binden spezifisch an die DNA und RNA der oben genannten Peptidasegen-Klassen. Hierdurch wird eine Detektion und Amplifikation einer breiten Palette unterschiedlichster Proteasegene und ihrer Fragmente ermöglicht. Die drei wichtigsten extrazellulären bakteriellen Proteaseklassen werden abgedeckt, und es ist sowohl ein qualitativer als auch quantitativer Nachweis dieser Gene, beispielsweise über PCR- Techniken, z. B. ABI PRISM Sequence Detection System 7700, möglich. Mit den erfindungsgemäß bereitgestellten Nukleotidsequenzen können in einem PCR Lauf alle dieser drei Proteasenklassen amplifiziert werden. Nach einer "klassischen" PCR kann das Amplicon auch über eine Dot-Blot-Hybridisierung mit den Sonden nachgewiesen werden. Die Sonden können auch für ein Screening von Genbibliotheken verwendet werden, und es ist auch möglich, aus einer komplexen Umgebung, beispielsweise bei Bakterien aus Boden, ein spezifisches PCR-Amplifikationsprodukt zu generieren.

Erfindungsgemäß umfaßt werden auch Derivate der oben beschriebenen Oligonukleotide. Unter "Derivate" und "Abwandlungen" sind erfindungsgemäß solche Sequenzen zu verstehen, bei denen ein, zwei oder drei Nukleotide an einem oder an beiden Enden der Oligonukleotide durch andere Nukleotide ersetzt wurden. Voraussetzung hierbei ist immer, daß eine spezifische Bindung an die extrazellulären bakteriellen Peptidasegene oder ihre Fragmente beibehalten wird, so daß die Aufgabe der Erfindung gelöst wird. Unter die Erfindung fallen auch solche Oligonukleotide, die sich von den oben beschriebenen ableiten und bei denen an einem oder beiden Enden ein oder zwei oder drei Nukleotide deletiert sind, wobei auch hier selbstverständlich nur solche Abwandlungen umfaßt werden, bei denen die spezifische Bindung an die extrazellulären bakteriellen Peptidasegene oder ihre Fragmente der oben genannten drei Klassen beibehalten bleibt. Ausgehend von den hier offenbarten Nukleotidsequenzen kann der Fachmann durch Austesten feststellen, welche Derivate bzw. Abwandlungen zu speziellen PCR- und Hybridisierungsreaktionen geeignet sind und welche nicht. Die Oligonukleotide der Erfindung können auch in größeren DNA- und RNA-Ketten enthalten sein.

Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Oligonukleotide werden in Verfahren zum spezifischen Nachweis oder zur Amplifikation bakterieller Gene oder ihrer Fragmente eingesetzt, die für extrazelluläre alkalische Metalloproteasen, neutrale Metalloproteasen und Serinproteasen kodieren. Verfahren, bei denen DNA und RNA gerichtete Sonden zum spezifischen Nachweis eines Mikroorganismus eingesetzt werden, sind an sich bekannt. (DNA gerichtete Sonde: Bach et al. 1999, Appl. and Environ. Microbiol.; RNA: Bach et al. 1999, J. Microbiol. Methods). Der Fachmann kann diese an sich bekannten Verfahren mit den vorliegenden Oligonukleotiden zur Anwendung bringen. Hierbei wird die DNA oder die RNA einer auf die Anwesenheit der genannten bakteriellen Gene zu untersuchenden Probe mit zumindest einem der Oligonukleotide, die vorstehend näher beschrieben wurden, in Kontakt gebracht. Anschließend erfolgt der Nachweis über die Hybridisierung der Oligonukleotide mit der RNA oder der DNA der Probe durch PCR-Techniken oder durch Hybridisierungsreaktionen, um das Vorliegen spezifischer DNA und/oder RNA-Sequenzen aufzuzeigen. Alle offenbarten Oligonukleotide sind auch als Primer für eine reverse Transkription von mRNA einsetzbar.

Erfindungsgemäß sind vielfältige Abwandlungen möglich, um die Sonden und Primer, hier je kurz auch Oligonukleotide genannt, einzusetzen. Diese können beispielsweise mit einer Markierung versehen werden, beispielsweise einer radioaktiven Markierung, Digoxigenin-, Peroxidase- oder Alkalische-Phosphatase-Markierung, oder einer fluoreszierenden Markierung, um eine spezifische Hybridisierung nachzuweisen. Primer und Sonden können auch z. B. mit Biotin markiert werden und für eine sequenzspezifische Isolierung von DNA oder RNA durch Magnetic-capture-hydridization eingesetzt werden.

Weitere Abwandlungen bzw. Derivatisierungen der Sonden sind z. B. PNAs, bei denen die heterozyklischen Basen an ein Protein-Rückgrat und nicht an ein Zucker-Phosphat-Rückgrat gebunden sind.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die Oligonukleotide an eine Matrix gebunden (reverse Hybridisierungen), und es wird mit beispielsweise fluoreszenzmarkierter DNA oder einem PCR-Amplifikator hybridisiert. Beispiele für derartige Matrices sind Mikrochips und Mitrotiterplatten.

Vorstehend wurden bestimmte Derivatisierungen der Oligonukleotide beschrieben. Von der Erfindung umfaßt werden auch hier nicht gesondert beschriebene Derivate, beispielsweise chemische Änderungen an den Oligonukleotiden, die das Nachweisverfahren erleichtern. Derartige Abwandlungen sind dem Fachmann bekannt, und sie können auf die erfindungs­ gemäß bereitgestellten Oligonukleotide angewandt werden.

Die DNA oder RNA der zu untersuchenden Probe wird entweder aus den Probenorganismen isoliert oder die Organismen werden in geeigneter Weise aufgeschlossen oder durchlässig gemacht, so daß ein direkter Kontakt der Sonden mit der DNA und/oder der RNA der Probenorganismen ermöglicht wird, ohne daß vorher umfangreiche und zeitraubende Reinigungsprozeduren durchgeführt werden müssen. Die Oligonukleotide der Erfindung sind in einer Ausgestaltungsform bei in situ Hybridisierungen und in situ PCR einsetzbar.

Die Hybridisierung der Oligonukleotide mit der DNA und/oder der RNA der Probenorganismen erfolgt unter stringenten Bedingungen, bevorzugt hoch-stringenten Bedingungen. Diese Bedingungen werden nachfolgend näher ausgeführt.

Bei der Hybridisierung sind Reaktionspuffer und Waschpuffer aus folgenden funktionellen Komponenten zusammengesetzt:

• a) Puffersystem zur Einstellung und Stabilisierung des pH-Wertes zwischen 7 und 8 (z. B Tris/HCl)
• b) Wasser als 'Lösungsmittel'
• c) Eventuell Chelatbildner, die bei niedrigen Konzentrationen monovalenter Kationen den Einfluß zweiwertiger Kationen (z. B. Ca²⁺), die als Verunreinigung in Chemikalien enthalten sein können, verhindern. Wird insbesondere im Waschpuffer eingesetzt.
• d) Detergenz zur Erniedrigung der Oberflächenspannung von wäßrigen Lösungen
• e) Nichtionische, aprotische Detergenzien (z. B. Formamid) schwächen die Bindungsenergie von Nukleinsäure-Duplexmolekülen.
• f) Salz (funktionelle Einheit sind Kationen, die die negativen Ladungen der Nukleinsäure- Phosphatgruppen neutralisieren und dadurch die Duplexbildung von zwei einzelsträngigen Nukleinsäuren erleichtern (z. B. Na⁺ in NaCl).

Vier Faktoren haben Einfluß auf das Zustandekommen von spezifischen Hybriden aus den Oligonukleotiden und Zielmolekül:

Die Komponenten e) und f) beeinflussen die Bindungsstärken von Nukleinsäure- Duplexmolekülen. Erhöhung der monovalenten Kationen in der Reaktions- bzw. Waschlösung stabilisiert die gebildeten Duplexmoleküle, während mit zunehmendem Gehalt an z. B. Formamid die Duplexbindungen geschwächt werden.

Eine geeignete Oligonukleotidkonzentration muß eingesetzt werden. Die Hybridisierung muß bei geeigneter Temperatur stattfinden (je höher die Temperatur, um so schwächer die Bindung der Hybride).

Unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen versteht man die Reaktionsbedingungen (die richtige Wahl der vier Faktoren), unter denen nur noch Duplexmoleküle zwischen Oligonukleotiden und gewünschten Zielmolekülen (perfekte Hybride) entstehen bzw. nur noch der gewünschte Zielorganismus nachgewiesen wird.

Unter stringenten Reaktionsbedingungen wird beispielsweise eine Hybridisierungstemperatur von ca. 5-10°C unter dem jeweiligen Oligonukleotidschmelzpunkt verstanden. Die Stabilität der DNA/DNA oder RNA/DNA-Hybriden muß selbst bei niedrigen Salzkonzentrationen entsprechend 0,1 × SSC/0,5% SDS gewährleistet sein. Auf diese Weise kann der Ablauf unerwünschter Kreuzreaktionen mit anderen Genen verhindert werden. Die jeweiligen Temperaturbedingungen können jedoch in Abhängigkeit von den gewählten Versuchsbedingungen und in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Nukleinsäure-Probe unterschiedlich sein und müssen dann entsprechend angepaßt werden. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts kann beispielsweise durch Autoradiographie im Falle radioaktiv markierter Primermoleküle oder durch Fluorimetrie bei Verwendung von Fluoreszenz­ markierten Oligonukleotiden erfolgen.

Weitere Beispiele für stringente Bedingungen sind in den nachfolgenden Beispielen aufgeführt. Der Fachmann kann in an sich bekannter Weise die Bedingungen an das gewählte Untersuchungsverfahren anpassen, um tatsächlich stringente Bedingungen zu erzielen und ein spezifisches Nachweisverfahren zu ermöglichen. Geeignete Stringenzbedingungen lassen sich beispielsweise anhand von Referenzhybridisierungen ermitteln.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Oligonukleotide als Vorwärts- und Rückwärts-Primer für eine PCR-Reaktion eingesetzt.

Das PCR-Verfahren hat den Vorteil, daß sehr kleine DNA-Mengen nachweisbar sind. In Abhängigkeit von dem nachzuweisenden Material sind die Temperaturbedingungen und die Zykluszahlen der PCR abzuwandeln. Die optimalen Reaktionsbedingungen können durch Handversuche in an sich bekannter Weise ermittelt werden. Ein Beispiel für eine PCR ist wie folgt:

• - Denaturierung der zu untersuchenden DNA-Probe bei 94°C mindestens 3 Minuten lang;
• - Bindung der als Primer fungierenden Oligonukleotide 1 Minute lang bei 60°C an die beiden komplementären Einzelstränge der zu untersuchenden DNA;
• - zweiminütige Verlängerungsreaktion der einzelnen Primer entlang der DNA-Matrize bei 72°C durch Verknüpfung von Desoxyribonukleosidtriphosphaten mittels einer thermostabilen DNA-Polymerase;
• - 30 bis 40 Reaktionszyklen jeweils bestehend aus: DNA-Denaturierung bei 94°C (30 Sekunden lang), gefolgt von Primerbindung bei 60°C (1 Minute lang), und Primerverlängerung bei 72°C (2 Minuten lang);
• - Endreaktion zur Auffüllung der beiden 3'-Enden am Reaktionsprodukt bei 72°C (ca. 5-8 Minuten lang).

Die im Verlauf der PCR-Amplifikation durch die Verlängerung der Primersequenzen entstandenen, charakteristischen, spezies-spezifischen DNA-Markerfragmente können beispielsweise gel-elektrophoretisch oder fluorimetrisch unter Verwendung fluoreszenz­ markierter Oligonukleotide nachgewiesen werden. Selbstverständlich sind auch andere, dem Fachmann bekannte Nachweisverfahren einsetzbar.

In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung werden die Sonden mit der zu untersuchenden DNA- oder RNA-Probe zur Hybridisierung gebracht, wobei stringente Hybridisierungsbedingungen gewählt werden. Stringente Bedingungen müssen für die jeweilige Anwendung empirisch ermittelt werden. Die nachfolgend beschriebenen Bedingungen können als Anhaltspunkte dienen.

Die DNA oder RNA der zu untersuchenden Probe kann sowohl bei der PCR-Reaktion bzw. RT-PCR als auch bei der Hybridisierungsreaktion entweder in extrahierter Form vorliegen oder in Form von komplexen Gemischen, bei denen die zu untersuchende Mikroorganismus- DNA oder RNA nur einen sehr Meinen Anteil an der Fraktion der speziellen biologischen Probe bildet. Die zu untersuchenden Zellen können somit entweder in gereinigter Form vorliegen oder beispielsweise verunreinigt mit Bodenbestandteilen. Sowohl in situ PCR oder in situ RT-PCR sind mit den hier beschriebenen Oligonukleotiden durchführbar.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von konkreten Beispielen beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht hierauf beschränkt.

Material und Verfahren Stämme und Zuchtbedingungen

Typstämme wurden von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) erworben. Proteolytische Bodenbakterien aus einer Grasland (Grünland)- Rhizosphäre, einem Gartenboden und einem Ackerland wurden isoliert, in dem Verdünnungsreihen von Bodensuspensionen auf Gelatineagarplatten wie in Bach et al. (1999a) beschrieben ausplattiert wurden. Die Bakterienisolate wurden anhand morphologischer und physiologischer Merkmale gemäß der Klassifikation in Bergey's Handbuch der Bestimmungsbakteriologie (1984 und 1986) identifiziert. Die zur Charakterisierung der Bakterien verwendeten Verfahren sind in Starr et al. (1981) beschrieben. Die Stämme wurden als Pseudomonas fluorescens klassifiziert, wenn sie die folgenden Merkmale aufwiesen: Gram-negative, bewegliche, stäbchenförmige Zellen, Vorliegen von Cytochromoxidase, strikt aerobes Wachstum, keine Denitrifizierung, kein Wachstum bei 42°C, Wachstum bei 4°C, Fluoreszenz nur auf King's-B-Medium, Vorliegen von Arginindihydrolase. Die Pseudomonas fluorescens-Gruppe umfasste verschiedene Biotypen (angezeigt durch unterschiedliche Koloniemorphologie), die nicht weiter charakterisiert wurden. Die Identität von Pseudomonas spp. wurde durch PCR mit für Pseudomonas im strengen Sinne spezifischen Primern bestätigt (Widmer et al. 1998). Gram- negative, unbewegliche Stäbchen mit Cytochromoxidase und Bildung gelber, Flexirubin enthaltender Kolonien (Reichenbach et al. 1981) wurden als dem Flavobacterium-Cytophaga- Komplex zugehörig betrachtet. Die Einordnung dieser Stämme in diese Gruppe wurde durch Hybridisierung mit der 16S-rRNA-spezifischen Sonde (CF319a) für Bakterien der Abteilung Cytophaga-Flavobacter-Bacteroides bestätigt (Manz et al. 1996). Die Stämme S 51 und Gs 61 wiesen identische Koloniemorphologie auf.

Bacillus cereus und Bacillus mycoides wurden aufgrund ihrer typischen Koloniemorphologie erkannt. Ihre Identität wurde durch Untersuchung der Zellgröße, des Vorliegens und der Position von Sporen, Katalase, Voges-Proskauer-Reaktion, anaerobem Wachstum, Wachstum bei 50°C, Wachstum in 7% NaCl und Bildung von Nitrit aus Nitrat bestätigt. Stämme, die auf Agar keine rhizoiden Kolonien bildeten, wurden als B. cereus klassifiziert.

Bacillus spp. anders als B. cereus und B. mycoides wurden hinsichtlich der Bildung von Endosporen getestet und nicht weiter klassifiziert. Verschiedene Koloniemorphologien sind durch unterschiedliche Buchstaben von A-O vermerkt.

Die Stämme wurden in 10 ml Nutrient-Broth-Medium (Merck, Darmstadt, Deutschland) bei den empfohlenen Temperaturen (Bodenisolate bei 30°C) unter Schütteln bei 130 U/min über Nacht gezüchtet. Die Zellsuspensionen wurden mittels Zentrifugation bei 4500 × g für 10 min bei 6°C sedimentiert. Die Sedimente und Überstände wurden bei -20°C gelagert, bis sie zur Extraktion genomischer DNA bzw. für Enzyminhibitionstests verwendet wurden.

Enzymtest

Die proteolytische Aktivität wurde gemäß einem modifizierten Protokoll von Hoppe et al. (1988) unter Verwendung von Leu-MCA (L-Leucin-4-methyl-7-cumarinylamid) als Substrat getestet. 3,4-Dichloroisocoumarin (3,4-DCI) und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) wurden als Spr-spezifische Inhibitoren verwendet, und 1,10-Phenanthrolin wurden als Inhibitor der Metalloenzyme Npr und Apr verwendet. Das experimentelle Verfahren zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität und die Wirkung der Inhibitoren auf die Enzyme sind eingehend in Bach und Munch (1999) beschrieben. Die Aktivität im Reaktionsgemisch ohne Inhibitor wurde als 100% Aktivität angesehen.

Extraktion von DNA

Die genomische DNA von Bakterienreinkulturen wurde mittels Standardverfahren zur DNA-Extraktion gewonnen (Marmur 1961). DNA aus einem Ackerboden (Scheyern, Südbayern, Deutschland) wurde unter Verwendung des FastDNA- SPIN-Kits für Boden (Bio 101, Vista, USA) wie von Hersteller empfohlen extrahiert und gereinigt. Boden- und Standortmerkmale: HK - ertragreiche Parzelle mit herkömmlichem Ackerbau, sandiger Schlufflehm, pH-Wert 5,6, 16,21 mg.g^-1 organischer C, 1,54 mg.g^-1 Gesamt-N.

Gestaltung der PCR-Primer und Sonden

Die Nukleotidsequenzen der reifen Peptidasen wurden einer Homologiesuche unter Verwendung des NCBI-BLASTIN-Programms unterworfen. Die Gene mit homologen Bereichen zu entweder dem apr-Gen von Pseudomonas fluorescens, dem npr-Gen von Bacillus cereus oder dem spr-Gen von B. subtilis wurden aus der NCBI-Datenbank erhalten. Für jede Peptidaseklasse wurden Alignments unter Verwendung des Genomatix-Dialign-Programms (http://genomatix.gsf.de/cgi-bin/dialign/dialign.pl) durchgeführt. Zielbereiche für die Primer wurden so ausgewählt, dass DNA-Fragmente von etwa 300 bp oder weniger amplifiziert werden. Die Sondenbereiche befinden sich im inneren Teil der Amplicons. Ein Vergleich der gewählten degenerierten Oligonukleotide mit bekannten DNA-Sequenzen unter Verwendung des Genomatix-Matinspector-Programms ((http://genomatix.gsf.de/cgi- bin/matinspector/matinspector.pl) ergab, dass das Nachweissystem für bakterielle Peptidasegene spezifisch ist und Pilz-Peptidasegene nicht erkennt. Die Oligonukleotide sind in der Tabelle 1 beschrieben. Die folgenden Sequenzen wurden für die Gestaltung der Sonde berücksichtigt: npr: B. megaterium (X75070), Paenibacillus polymyxa (D00861), Lactobacillus sp. (D29673), B. stearothermophilus (M11446), B. caldolyticus (U25629), B. cereus (M83910), B. thuringiensis (L77763), Alicyclobacillus acidocaldarius (U07824), Staphylococcus epidermis (X69957), B. thermoproteolyticus (X76986), B. amyloliquefaciens (K02497), B. brevis (X61286), Clostridium perfringens (D45904), Listeria monocytogenes (X54619), apr: Pseudomonas fluorescens (ab013895), P. tolaasii (AJ007827). P. aeruginosa (D87921), Pseudomonas sp. (Y17314), Erwinia chrysanthemi (M60395), Serratia marcescens (X55521), Serratia sp. (X04127), spr: B. licheniformis (S78160), B. amyloliquefaciens (K02496), B. subtilis (S51909), Bacillus sp. (D29736), Bacillus sp. (U39230).

Überraschenderweise konnte durch die oben beschriebene Vorgehensweise eine Reihe von Sequenzen ermittelt werden, die spezifisch bakterielle Gene erkennen, die für extrazelluläre alkalische Metalloproteasen, extrazelluläre neutrale Metalloproteasen und extrazelluläre Serinproteasen kodieren, die auch in hoch komplexen Gemischen, beispielsweise Boden, einen spezifischen Nachweis ermöglichen. Der Einsatz einer Vielzahl spezifischer Primer, der bisher durchgeführt wurde, ist somit nicht mehr notwendig.

PCR

Die Amplifikation erfolgte mit dem GeneAmp-PCR-System 9600 (Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut, USA). DNA aus Bakterienkulturen: Volumina von 50 µl mit 50 ng Matrizen-DNA, Primer (jeweils 75 pmol spr Ia oder Ib/II; 50 pmol npr I/II und apr I/II), 0,2 mM Desoxynukleotidtriphosphate, 5 µl 10 × Reaktionspuffer, 3 mM MgCl₂ und 1 U Goldstar "Red"-DNA-Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien). Das PCR-Programm war wie folgt: Heißer Startzyklus bei 95°C für 5 mm, 80°C für 5 min; 30 Zyklen bei 94°C für 30 s, 53°C, 49°C oder 43°C für 30 s und 72°C für 20 s; abschließende Verlängerung bei 72°C für 10 min. DNA aus Boden: Wenn Boden-DNA als Matrize verwendet wurde, wurden 2% der aus 1 g Boden isolierten DNA zugefügt. 75 pmol der Primer spr Ia/II und npr I/II und 50 pmol apr I/II wurden verwendet. BSA wurde zum Reaktionsgemisch in einer Endkonzentration von 0,3% gegeben. DMSO wurde zugegeben, wenn die PCR mit den Primern apr Ia/II durchgeführt wurde. Da alle drei Tests sehr empfindlich auf die Polymerasemenge reagierten, wurde die Polymeraselösung in 1 × Reaktionspuffer verdünnt, damit das zugegebene Volumen auf 2 µl vergrößert werden konnte. 1 U wurde für die Amplifikation mit spr eingesetzt, und 2 U wurden jeweils für npr und spr eingesetzt. Die Menge an MgCl₂ betrug 1,5 mM für npr und apr und 3 mM für spr. Das PCR-Programm entsprach demjenigen für genomische DNA aus Isolaten; für alle drei PCRs wurde gefunden, dass die optimale Annealingtemperatur 55°C war.

Die amplifizierten PCR-Produkte wurden mittels Gelelektrophorese mit 1,8% Agarose in TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat (pH-Wert 7,6); 1 mM EDTA) analysiert.

Hybridisierung

Die Hybridisierungen erfolgten auf positiv geladenen Nylon-Membranen (Boehringer, Mannheim, Deutschland). Für Dotblot-Hybridisierungen wurden 4-12 µl des PCR-Produkts 20 min in 250 µl 0,4 N NaOH denaturiert und vakuumgeblottet. Der Southern- Transfer wurde wie vom Hersteller (Boehringer, Mannheim, Deutschland) beschrieben durchgeführt. Nach dem Blotten wurde die DNA mittels UV-Vernetzung auf der Membran fixiert. Die Hybridisierung mit den Sonden NPR, APR und SPR und der Chemilumineszenznachweis erfolgten wie folgt: Die Formamidkonzentrationen in der Vorhybridisierungslösung waren 5% für NPR und APR und 0% für SPR. Vorhybridisierung in 5 × SSC; 1% N-Lauroylsarcosin; 0,02% SDS; 1% Blockierungsreagenz und Formamid 1,5 Std. bei 45°C. Hybridisierung mit 10 pmol/ml 5'-DIG-markierter Sonde in Vorhybridisierungslösung für 2,5 Std. bei 45°C. Das Waschen erfolgte 2 × 5 min mit 2 × SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur und 2 × 15 min in 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 45°C. Der Nachweis erfolgte unter Verwendung des DIG-Lumineszenz-Nachweis-Kits (Boehringer, Mannheim, Deutschland) wie vom Hersteller empfohlen.

Ergebnisse Proteolytische Bakterien

Die in dieser Studie untersuchten proteolytischen Bakterien sind in der Tabelle 2 dargestellt. Die ausgewählten Typstämme, aus denen die DNA-Sequenzen bekannter Peptidasen für die Gestaltung von Primern und Sonden ausgewählt wurden, sind fett hervorgehoben. Einige Grundfunktionsstämme (E. coli, B. firmus und P. chlororaphis), die Gelatine verflüssigen können, wurden ebenfalls untersucht. Repräsentative proteolytische Bakterien aus einem Gartenboden, einem Grünland-Rhizosphärenboden und einem Ackerboden wurden auf Agarmedium auf Gelatinebasis isoliert. Unter den angewendeten Zuchtbedingungen schienen die B. cereus, B. mycoides und P. fluorescens-Biotypen I und II die häufigsten Arten in allen drei Oberböden zu sein (Daten nicht gezeigt). Die anderen Stämme wurden nicht bis zur Art identifiziert, wurden aber meist der Gattung Bacillus und einige der Flavobacterium-Cytophaga-Gruppe zugeordnet. Die meisten Arten wurden in jedem Oberboden gefunden. Die Stämme S 28, Rh 9 und S 21 wurden nicht weiter charakterisiert.

Enzymexpression

Ein Enzyminhibitionstest wurde zum Nachweis und zur Identifizierung der ausgeschiedenen Peptidasen im zellfreien Medium reiner Kulturen der proteolytischen Bakterien verwendet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 dargestellt. Das Substrat Leu-MCA (L-Leucin-4-methyl-7-cumarinylamid) eignete sich zur Demonstration der Peptidaseaktivität in den Kulturüberständen aller in dieser Studie untersuchter Stämme mit Ausnahme von B. caldolyticus. 3,4-Dichloroisocoumarin (3,4-DCI) und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), die als spezifische Inhibitoren für Peptidasen vom Serintyp angesehen werden, und 1,10-Phenanthrolin, das spezifisch Metallopeptidasen hemmt, wurden zugegeben, um die Art der ausgeschiedenen Peptidasen zu identifizieren. Die gereinigte Bezugs-Serinpeptidase Spr aus B. licheniformis (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) wurde eindeutig durch 3,4-DCI und PMSF und nicht durch 1,10-Phenanthrolin gehemmt, wohingegen die neutrale Metallopeptidase Npr aus B. polymyxa (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) durch 1,10-Phenanthrolin gehemmt und nur schwach durch 3,4- DCI und PMSF beeinträchtigt wurde. Die proteolytische Aktivität in den Überständen von B. cereus, B. thuringiensis, B. megaterium, B. stearothermophilus, Paenibacillus polymyxa, B. amyloliquefaciens, B. mycoides und B. subtilis, für die neutrale Metallopeptidasen (Npr) beschrieben sind, wurden eindeutig durch 1 mM 1,10-Phenathrolin gehemmt. Es wurde zwar etwas Hemmung mit 3,4-DCI und PMSF beobachtet, aber die Enzyme konnten der Masse der Metallopeptidasen zugeordnet werden. Dies wurde auch für B. firmus und die Bodenisolate Bacillus sp. A-O, die Flavobacterium-Cytophaga-Stämme und die nicht identifizierten Stämme S 28, Rh 9 und S 21, deren Peptidasetyp unbekannt war, gefunden. Bei den erwarteten alkalischen Metallopeptidasen (Apr) von Pseudomonas fluorescens, P. aeruginosa, Serratia marcescens und Erwinia chrysanthemi sind die Inhibitionsmuster zweideutig, da eine erhebliche Hemmung mit dem ihr den Serintyp spezifischen Inhibitor 3,4-DCI erfolgte (z. B. 73% bei P. fluorescens). Eine Konzentration von 10 mM 1,10-Phenanthrolin war für eine etwa 90%ige Hemmung nötig. Die verglichen mit den neutralen Metallopeptidasen schwache Hemmung dieser Peptidaseklasse durch 1 mM 1,10-Phenanthrolin ist durchgängig und klassifiziert diese Enzyme in eine gesonderte Gruppe unter den untersuchten Proben. Die erwarteten Peptidasen vom Serintyp (Spr) aus B. stearothermophilus, B. amyloliquefaciens, B. subtilis und B. licheniformis konnten nicht nachgewiesen werden. Die Inhibitionsmuster legen das Vorliegen von Metallopeptidasen nahe, die mit Ausnahme von B. licheniformis ebenfalls für diese Arten beschrieben sind. Nur die ausgeschiedenen Peptidasen aus E. coli und P. chlororaphis wurden durch 3,4-DCI und nur schwach durch 1 mM und 10 mM 1,10- Phenanthrolin gehemmt und sind anscheinend Spr. Die proteolytische Aktivität in den Überständen von Bacillus I, K und L wurde stark durch 3,4-DCI und PMSF, aber auch durch 1,10-Phenanthrolin gehemmt. Keine der Peptidasen der anderen Bodenisolate konnte eindeutig der Spr-Klasse zugeordnet werden.

Validierung der ausgewählten Oligonukleotide zum Nachweis von Genfragmenten von spr, npr und spr durch PCR und Sondenhybridisierung

Die entwickelten Primerpaare und DIG-markierten Oligonukleotidsonden wurden zum PCR-Nachweis und anschließende Dotblot-Hybridisierung eingesetzt, um das proteolytische Potential der Bakterien auf genetischer Ebene zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengefasst. Für alle der multiplen Alignments unterworfenen Typstämme, ausgenommen npr von B. amyloliquefaciens, wurden die entsprechenden Genfragmente (apr: 194 bp, npr: 233 bp oder spr: 319 bp) durch PCR erzeugt und durch die entsprechenden Sonden APR, NPR und SPR spezifisch nachgewiesen. Die Annealingtemperatur von 53°C war zur Herstellung eines einzelnen spezifischen Amplicons der erwarteten Länge bei den meisten dieser Gene in allen drei PCR-Reaktionen geeignet. Wurde die Annealingtemperatur auf 49 oder 43°C gesenkt, was zu mehreren weiteren unspezifischen Banden (in Tabelle 2 mit Sternchen markiert) führte, wurden weitere Gene nachgewiesen. Die PCR-Produkte von B. cereus und B. thuringiensis mit den Primern spr Ia/II waren auf dem Agarosegel nach Ethidiumbromidfärbung nicht sichtbar, aber nach Southern-Blot-Hybridisierung mit der SPR- Sonde konnte eine Bande der erwarteten Länge identifiziert werden (Daten nicht gezeigt). Das spr-Gen von B. megaterium konnte nur amplifiziert werden, wenn der Vorwärts-Primer spr Ia durch spr Ib ersetzt wurde, was eine Bande von 486 bp Länge erzeugte. Auch in B. subtilis und B. licheniformis wurden Gene für Npr gefunden. Das beschriebene spr-Gen von B- stearothermophilus (Jang et al. 1992) war nicht nachweisbar, wenn diese PCR-Bedingungen angewendet wurden. Es wurde gezeigt, dass E. coli und Pseudomonas chlororaphis, deren Peptidasen beide durch ein für den Serintyp spezifisches Mittel inhibiert wurden, npr- bzw. apr-Gene besaßen. Die Dotblot- oder Southern-Blot-Hybridisierung der erzeugten Amplicons mit den entsprechenden DIG-markierten Oligonukleotidsonden APR, NPR oder SPR zeigte, dass jede Sonde für das entsprechende Gen spezifisch war und dass alle amplifizierten Genfragmente nachgewiesen wurden (Tabelle 2).

Anwendung der Oligonukleotidsätze zur Identifizierung von Peptidasegenen aus bakteriellen Bodenisolaten

Für jedes untersuchte Bodenisolat, ausgenommen S 21, konnten Genfragmente mindestens einer Peptidaseklasse nachgewiesen werden. In 17 der 22 verschiedenen Spezies (B. cereus, B. mycoides, Bacillus A, B, C, D, E, F, G, H, L, M, N und O, die Flavobacterium-Cytophaga- Stämme und die unidentifizierten Stämme S 28 und Rh 9) konnte das npr-Gen mittels PCR mit den Primern npr I/II und anschließende Dotblot-Hybridisierung mit der Sonde NPR identifiziert werden.

Das spr-Gen wurde mittels PCR für 17 verschiedene Stämme, meist Bacillus-Arten (B. cereus, B. mycoides, Bacillus sp. A, B, C, D, E, F, G, I, J, K, L, M, N) und die Flavobacterium-Cytophaga-Arten amplifiziert und mit der SPR-Sonde nachgewiesen. Die Ergebnisse für die B. cereus- und B. mycoides-Isolate waren nicht konsistent, da spr-Gene nicht bei den Stämmen Gs 28, S3, S4 nachgewiesen wurden; bei den anderen Stämmen mussten unterschiedliche Vorwärts-Primer und verschiedene Annealingtemperaturen zur Erzeugung der erwarteten Amplicons eingesetzt werden. Die SPR-Sonde hybridisierte spezifisch mit diesen Genfragmenten. Die Amplicons der Flavobacterium-Cytophaga-Arten hybridisierten nicht mit der Sonde. Das Vorliegen dieses Gens wurde daher durch PCR mit dem zweiten Vorwärts-Primer spr Ib, der eine Fragmentgröße von 486 bp festlegt, bestätigt. Das apr-Gen wurde nur bei den P. fluorescens-Biotypen von allen drei Standorten und bei den Flavobacterium-Cytophaga-Stämmen aus dem Ackerland und dem Gartenboden nachgewiesen. Keines der Peptidasegene konnte bei dem coryneformen Stamm S 21 nachgewiesen werden.

Die hier beschriebenen Primer und Sonden eignen sich zur Identifizierung von Peptidasegenen in einem breiten Spektrum proteolytischer Bodenbakterien. Die Anwendung aller drei Primerpaare und Sonden auf jedes Isolat enthüllte die Existenz zuvor unbekannter Gene und das Vorliegen mehrerer verschiedener Gene in den meisten Isolaten.

Nachweis von Peptidasegenen in Boden. Die Oligonukleotide wurden zum Nachweis der npr-, spr- und apr-Genfragmente von aus Boden isolierter Gesamt-DNA eingesetzt. Alle drei Gene npr, spr und apr konnten aus Boden-DNA amplifiziert werden und wurden mit den entsprechenden Sonden nachgewiesen, wie durch Southern-Blot-Hybridisierung gezeigt (Fig. 1, B1-3). Eine Anzahl von 35 Zyklen war ausreichend für den Erhalt klar sichtbarer Banden auf einem Agarosegel nach Ethidiumbromidfärbung. Bei allen drei PCR-Sätzen wurde gefunden, dass eine Annealingtemperatur von 55°C hinsichtlich der Produktausbeute und der Spezifität des PCR-Produktes optimal war.

Literaturliste

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims (17)

1. Mittel zur Amplifikation und zum qualitativen und quantitativen Nachweis von extrazellulären bakteriellen Peptidasegenen, dadurch gekennzeichnet, daß es zumindest eines der nachfolgenden Oligonukleotide sowie ihre komplementäre Sequenz oder die reverse oder revers-komplementäre Sequenz sowie die hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen oder Derivate hiervon umfaßt, die je spezifisch an die für extrazelluläre alkalische Metallopeptidasen, extrazelluläre neutrale Metallopeptidasen oder extrazelluläre Serinpeptidasen kodierenden Gene oder Genfragmente binden:

• a) für extrazelluläre alkalische Metallopeptidasen:
  
• b) für extrazelluläre neutrale Metallopeptidasen:
  
• c) für extrazelluläre Serinpeptidasen:
  

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein, zwei oder drei der Nukleotide an einem oder beiden Enden der Oligonukleotide durch ein anderes Nukleotid ersetzt sind oder ein, zwei oder drei Nukleotide an einen oder beiden Enden der Oligonukleotide deletiert sind, wobei je die spezifische Bindung beibehalten bleibt.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden oder die Primer eine Markierung aufweisen.

4. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung eine radioaktive Markierung, Fluoreszenzmarkierung, Biotinmarkierung, Digoxigeninmarkierung, Peroxidasemarkierung oder Alkalische- Phosphatase-Markierung ist.

5. Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es an eine Festphasenmatrix gebunden vorliegt.

6. Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide chemisch modifiziert vorliegen.

7. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die heterozyklischen Basen an ein Protein-Rückgrat gebunden vorliegen.

8. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß er zumindest eines der Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche aufweist.

9. Festphasenmatrix, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest eine der Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche in einer an die Matrix gebundenen Form aufweist.

10. Verfahren zum spezifischen Nachweis oder zur Amplifikation von bakteriellen extrazellulären Peptidasegenen mit den nachfolgenden Schritten:

• - Inkontaktbringen der DNA oder der RNA einer zu untersuchenden Probe mit zumindest einem der Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche 1-7 und
• - Nachweis der Hybridisierung der Oligonukleotide mit der RNA oder DNA der Probe, um das Vorliegen von bakteriellen extrazellulären Peptidasegen-DNA- und/oder RNA-Sequenzen aufzuzeigen.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide als Primer in PCR-Verfahren oder als Sonden in Hybridisierungsverfahren eingesetzt werden.

12. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß entweder

• a) die zu untersuchende DNA in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Kontakt gebracht wird mit einem der Primer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche und im Verlauf der PCR-Amplifikation durch Verlängerung der Primersequenzen ein charakteristisches DNA- Markerfragment entsteht und dieses Fragment nachgewiesen wird; oder
• b) zumindest eine der Sonden mit der zu untersuchenden DNA oder RNA zur Hybridisierung gebracht wird und das Produkt dieser Hybridisierungsreak­ tion nachgewiesen wird.

13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkontaktbringen unter stringenten Bedingungen erfolgt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die stringenten Bedingungen wie folgt definiert sind: PCR:
Annealingtemperatur: 43-62°C
Hybridisierung: 40-60°C

15. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA oder RNA in isolierter Form eingesetzt wird oder im biologischen Material in für die Hybridisierungsreaktion zugänglicher Form vorliegend eingesetzt wird oder zusammen mit kontaminierenden Materialien vorliegend eingesetzt wird.

16. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) die zu untersuchende DNA denaturiert wird, um Einzelstränge zu erhalten;
• b) das Oligonukleotid an den komplementären Einzelstrang der zu untersuchenden DNA gebunden wird;
• c) das Oligonukleotid mittels einer DNA-Polymerase verlängert wird;
• d) die Hitze-Denaturierungs-Oligonukleotid-Bindungs- und Verlängerungszyklen wiederholt werden, um eine nachweisbare Menge des PCR- Produkts zu erhalten; und
• e) das erhaltene PCR-Produkt nachgewiesen wird.

17. Verwendung eines Oligonukleotids nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Amplifikation und zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von bakteriellen Genen für extrazelluläre alkalische Metallopeptidasen, neutrale Metallopeptidasen und Serinpeptidasen.