EP1246943A2 - Oligonukleotide zur amplifikation und zum nachweis von bakteriellen genen für extrazelluläre alkalische metallopeptidasen (apr), neutrale metallopeptidasen (npr) und serinpeptidasen (spr) - Google Patents

Oligonukleotide zur amplifikation und zum nachweis von bakteriellen genen für extrazelluläre alkalische metallopeptidasen (apr), neutrale metallopeptidasen (npr) und serinpeptidasen (spr)

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EP1246943A2
EP1246943A2 EP01902315A EP01902315A EP1246943A2 EP 1246943 A2 EP1246943 A2 EP 1246943A2 EP 01902315 A EP01902315 A EP 01902315A EP 01902315 A EP01902315 A EP 01902315A EP 1246943 A2 EP1246943 A2 EP 1246943A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
oligonucleotides
dna
extracellular
pcr
spr
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01902315A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hans-Jürgen BACH
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Original Assignee
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH filed Critical Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Publication of EP1246943A2 publication Critical patent/EP1246943A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes

Definitions

  • the invention relates to oligonucleotides for the amplification and for the qualitative and quantitative detection of extracellular bacterial protease genes, namely extracellular alkaline metallopeptidases, extracellular neutral metallopeptidases and extracellular serine peptidases as well as methods for the detection of these extracellular bacterial peptidase genes and their amplification.
  • Bacterial extracellular peptidases are of great importance in various scientific fields. There is very different interest in these enzymes in the individual areas, which is explained below.
  • peptidases are produced biotechnologically on a large scale, since some have high thermal stability and are widely used. There is a need for new enzymes with physicochemical and biochemical properties that are adapted to new market requirements.
  • the enzymes used here e.g. subtilsin, thermolysin
  • the habitat soil for example, is probably the largest pool of different bacteria that can also produce different peptidases, because there is an enormous bacterial diversity (presumably only a very small part of the bacterial species is known and characterized so far). Access to this potential has so far been limited by the fact that bacteria have to be cultivated in such a way that the corresponding enzymes are expressed. Elaborate enzyme purifications and characterizations are then required.
  • Peptidases from pathogens are also of great importance in clinical microbiology because they represent virulence factors. Examples for this are:
  • Pseudomonas aeruginosa alkaline protease corneal inflammation, inhibition of the antiviral and immunomodulatory activity of human gamma
  • Vibrio cholerae hemaglutinin protease plays a role in cholera pathogenesis.
  • Legionella pneumophilia extracellular metalloprotease plays a role in
  • Peptide genes in potential pathogens or in infected tissue could be used in medical diagnostics.
  • oligonucleotides which can be used, inter alia, as polymers and probes, with the aid of which a wide range of different protease genes can be detected.
  • These oligonucleotides are said to be the three most important extracellular bacterial protease classes, namely the alkaline metallopeptidases, the neutral metallopeptidases and the Serine peptidases, cover and enable qualitative and quantitative detection
  • the object of the invention is achieved by the means for amplification and for the qualitative and quantitative detection of extracellular bacterial peptide genes, as well as the method characterized in the claims for specific detection and amplification of bacterial extracellular peptide genes, which are characterized in more detail in preferred embodiments of the invention the subclaims and the following description and the exemplary embodiments. It is pointed out that the following description and in particular the The following exemplary embodiments merely reproduce preferred configurations of the invention, but the invention is not restricted to these special configurations. Modifications can be made by a person skilled in the art without inventive step, without thereby deviating from the inventive concept.
  • npr neutral metallopeptidases
  • spr serine peptidases
  • Rh grassland rhizosphere soil
  • Gs garden soil
  • S arable soil (Scheyern)
  • Figure 1 A) Gel electrophoresis of PCR products obtained from soil DNA
  • oligonucleotides are thus provided as probes and primers which are designed in such a way that specific detection of extracellular bacterial peptidase genes, namely of extracellular alkaline metallopeptidases, neutral metallopeptidases and serine peptidases, and the amplification of the respective gene fragments is made possible.
  • the invention accordingly includes the following oligonucleotides and their complementary sequences and the reverse or reverse-complementary sequences and the RNA sequences derived therefrom
  • the oligonucleotides disclosed here bind specifically to the DNA and RNA of the above-mentioned peptide gene classes. This enables detection and amplification of a wide range of different protease genes and their fragments.
  • the three main extracellular bacterial protease classes are covered, and there is both qualitative and quantitative detection of these genes, for example via PCR techniques, e.g. ABI PRISM Sequence Detection System 7700, possible.
  • PCR techniques e.g. ABI PRISM Sequence Detection System 7700
  • all of these three protease classes can be amplified in a PCR run. After a "classic" PCR, the amplicon can also be detected by dot blot hybridization with the probes.
  • the probes can also be used for screening gene libraries, and it is also possible to generate a specific PCR amplification product from a complex environment, for example with bacteria from soil.
  • the invention also includes derivatives of the oligonucleotides described above.
  • “derivatives” and “modifications” are to be understood as those sequences in which one, two or three nucleotides at one or both ends of the oligonucleotides have been replaced by other nucleotides. The prerequisite here is that a specific binding to the extracellular bacterial peptide genes or their fragments is maintained, so that the object of the invention is achieved.
  • the invention also includes those oligonucleotides which are derived from those described above and in which one or two or three nucleotides have been deleted at one or both ends, although of course only those modifications are also included here in which the specific binding to the extracellular bacterial peptide genes or their fragments of the above three classes are retained. Starting from the nucleotide sequences disclosed here, the person skilled in the art can Test to determine which derivatives or modifications are suitable for special PCR and hybridization reactions and which are not.
  • the oligonucleotides of the invention can also be contained in larger DNA and RNA chains.
  • oligonucleotides according to the invention can also be varied internally, it being possible for 1 or a maximum of 2 nucleotides to be replaced by another nucleotide, the specificity for the peptidases mentioned always having to be retained.
  • a forward primer and a reverse primer are usually used in combination in the PCR reactions.
  • the probe or its complementary sequence can also function in combination with the reverse primer as a forward primer or with the forward primer as a reverse primer. Applicable combinations also result from the complementary sequences of the forward primer or the backward primer with the probe and its complementary sequence.
  • the invention also includes the RNA of the oligonucleotides and their complementary sequences.
  • the oligonucleotides described in the present invention are used in methods for the specific detection or amplification of bacterial genes or their fragments which code for extracellular alkaline metalloproteases, neutral metalloproteases and serine proteases.
  • Methods in which DNA and RNA-directed probes are used for the specific detection of a microorganism are known per se. (DNA-directed probe: Bach et al. 1999, Appl. And Environ. Microbiol .; RNA: Bach et al. 1999, J. Microbiol. Methods).
  • the person skilled in the art can use these methods known per se with the present oligonucleotides.
  • the DNA or the RNA of a sample to be examined for the presence of said bacterial genes is brought into contact with at least one of the oligonucleotides which have been described in more detail above.
  • the detection of the hybridization of the oligonucleotides with the RNA or the DNA of the sample is then carried out by PCR techniques or by hybridization reactions in order to determine the presence of specific DNA and / or to show RNA sequences. All of the disclosed oligonucleotides can also be used as primers for reverse transcription of mRNA.
  • probes and primers here also called oligonucleotides for short.
  • oligonucleotides for short.
  • These can, for example, be provided with a label, for example a radioactive label, digoxigenin, peroxidase or alkaline phosphatase label, or a fluorescent label in order to detect a specific hybridization.
  • Primers and probes can also e.g. be labeled with biotin and used for sequence-specific isolation of DNA or RNA by magnetic capture hydridization.
  • all markings are possible that do not interfere with the detection methods, for example markings that can be detected by enzymatic methods.
  • probes are e.g. PNAs in which the heterocyclic bases are bound to a protein backbone and not to a sugar-phosphate backbone.
  • Further modifications of the probes are, for example, phosphorylation, the addition of aminolinks or thiolinks.
  • Other modifications are known to the person skilled in the art and, if they do not interfere with the detection reactions according to the invention, can be introduced.
  • the oligonucleotides are bound to a matrix (reverse hybridizations), and hybridization is carried out, for example, with fluorescence-labeled DNA or a PCR amplifier.
  • matrices are microchips and mitrotiter plates.
  • oligonucleotides have been described above.
  • the invention also encompasses derivatives not separately described here, for example chemical changes to the oligonucleotides, which facilitate the detection method. Such modifications are known to the person skilled in the art and can be applied to the oligonucleotides provided according to the invention.
  • the DNA or RNA of the sample to be examined is either isolated from the sample organisms or the organisms are suitably digested or made permeable so that direct contact of the probes with the DNA and / or the RNA of the sample organisms is made possible without extensive and time-consuming cleaning procedures have to be carried out.
  • the oligonucleotides of the invention can be used in one embodiment in in-situ hybridizations and in-situ PCR
  • the hybridization of the oligonucleotides with the DNA and / or the RNA of the sample organisms takes place under stringent conditions, preferably high-stringent conditions. These conditions are explained in more detail below
  • reaction buffer and wash buffer are composed of the following functional components
  • Buffer system for adjusting and stabilizing the pH between 7 and 8 e.g. Tns / HCl
  • non-ionic, aprotic detergents e.g.
  • Components e) and f) influence the binding strengths of nucleic acid duplex molecules. Increasing the monovalent cations in the reaction or washing solution stabilizes the duplex molecules formed, while the duplex bonds are weakened with increasing content of, for example, formamide.
  • a suitable oligonucleotide concentration must be used.
  • the hybridization must take place at a suitable temperature (the higher the temperature, the weaker the binding of the hybrids).
  • Stringent hybridization and washing conditions are the reaction conditions (the right choice of the four factors), under which only duplex molecules between the ohgonucleotides and the desired target molecules (perfect hybrids) are formed or only the desired target organism is detected.
  • Oligonucleotide melting point understood.
  • the stability of the DNA / DNA or RNA / DNA hybrids must be guaranteed even at low salt concentrations corresponding to 0.1 x SSC / 0.5% SDS. In this way, undesirable cross-reactions with other genes can be prevented.
  • the respective temperature conditions can differ depending on the selected test conditions and depending on the nucleic acid sample to be examined and must then be adapted accordingly.
  • the hybridization product can be detected, for example, by autoradiography in the case of radioactively labeled primer molecules or by fluorimetry when using fluorescence-labeled ohgonucleotides.
  • stringent conditions are listed in the examples below.
  • the person skilled in the art can adapt the conditions to the selected examination method in a manner known per se, in order to actually achieve stringent conditions and to enable a specific detection method.
  • Suitable stringency conditions can be determined, for example, using reference hybridizations.
  • Stringency conditions can be determined, for example, using reference hybridizations.
  • the oligonucleotides are used as forward and reverse primers for a PCR reaction.
  • the PCR method has the advantage that very small amounts of DNA can be detected. Depending on the material to be detected, the temperature conditions and the cycle numbers of the PCR have to be modified. The optimal reaction conditions can be determined by hand tests in a manner known per se.
  • An example of a PCR is as follows:
  • the characteristic, species-specific DNA marker fragments formed in the course of the PCR amplification by the extension of the primer sequences can be detected, for example, by gel electrophoresis or fluorimetry using fluorescence-labeled oligonucleotides. Of course, other detection methods known to the person skilled in the art can also be used.
  • RNA can also be used as a starting material in an RT-PCR.
  • the RNA is first rewritten into cDNA and then used as a template.
  • the probes are brought to hybridization with the DNA or RNA sample to be examined, stringent hybridization conditions being selected.
  • Stringent conditions must be determined empirically for the respective application. The conditions described below can serve as guidelines.
  • the DNA or RNA of the sample to be examined can be present either in the PCR reaction or RT-PCR as well as in the hybridization reaction either in extracted form or in the form of complex mixtures in which the microorganism DNA or RNA to be examined is only one forms a small fraction of the fraction of the special biological sample.
  • the cells to be examined can thus either be in a purified form or, for example, contaminated with soil components. Both in situ PCR and in situ RT-PCR can be carried out with the ohgonucleotides described here.
  • Type strains were acquired from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ). Proteolytic soil bacteria from a grassland (grassland) rhizosphere, a garden soil and a farmland were isolated, in which dilution series of soil suspensions on gelatin agar plates as in Bach et al. (1999a) were plated out. The bacterial isolates were identified on the basis of morphological and physiological characteristics according to the classification in Bergey's Handbuch der Determierbakteriologie (1984 and 1986). The methods used to characterize the bacteria are described in Starr et al. (1981).
  • the strains were classified as Pseudomonas fluorescens if they had the following characteristics: Gram-negative, mobile, rod-shaped cells, presence of cytochrome oxidase, strictly aerobic growth, no denitrification, no growth at 42 ° C, growth at 4 ° C, fluorescence only on King's B medium, presence of arginine dihydrolase.
  • the Pseudomonas fluorescens' group comprised different biotypes (indicated by different colony morphology), which were not further characterized. The identity of Pseudomonas spp. was confirmed by PCR with primers specific for Pseudomonas in the strict sense (Widmer et al. 1998).
  • Bacillus cereus and Bacillus mycoides were recognized for their typical colony morphology. Their identity was verified by examining the cell size, presence and position of spores, catalase, Voges-Proskauer reaction, anaerobic growth, growth at 50 ° C, growth in 7% NaCl and formation of nitrite from nitrate approved. Strains that did not form rhizoid colonies on agar were classified as B. cereus.
  • the strains were grown in 10 ml of nutrient broth medium (Merck, Darmstadt, Germany) at the recommended temperatures (soil isolates at 30 ° C.) with shaking at 130 rpm overnight.
  • the cell suspensions were sedimented by centrifugation at 4500 x g for 10 min at 6 ° C.
  • the sediments and supernatants were stored at -20 ° C until they were used for the extraction of genomic DNA or for enzyme inhibition tests.
  • proteolytic activity was determined according to a modified protocol by Hoppe et al. (1988) tested using Leu-MCA (L-leucine-4-mefhyl-7-coumarinylamide) as a substrate. 3,4-dichloroisocoumarin (3,4-DCI) and phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) were used as Spr-specific inhibitors, and 1,10-phenanthroline were used as inhibitors of the metalloenzymes Npr and Apr.
  • the experimental procedure for determining the proteolytic activity and the effect of the inhibitors on the enzymes are described in detail in Bach and Munch (1999). The activity in the reaction mixture without inhibitor was regarded as 100% activity.
  • DNA extraction The genomic DNA from pure bacteria cultures was obtained using standard methods for DNA extraction (Marmur 1961). DNA from arable soil (Scheyern, Southern Bavaria, Germany) was extracted and purified using the FastDNA-SPIN kit for soil (Bio 101, Vista, USA) as recommended by the manufacturer. Soil and location characteristics: HK - high-yield plot with conventional agriculture, sandy silt loam, pH value 5.6, 16.21 mg ⁇ g "1 organic C, 1.54 mg ⁇ g " 1 total N. Design of the PCR primers and probes. The nucleotide sequences of the mature peptidases were subjected to a homology search using the NCBI-BLASTN program Release 2.0.5 (with the databases GenBank, EMBL, DDBI and PDP).
  • the genes with homologous regions to either the apr gene from Pseudomonas fluorescens, the npr gene from Bacillus cereus or the spr gene from B. subtilis were obtained from the NCBI database. Alignments were carried out for each peptide class using the Genomatix dialign program (http://genomatix.gsf.de/cgi-bin/dialign/dialign.pl) (Di Align Professional, Release 2.0, not parameterizable). Target areas for the primers were selected to amplify DNA fragments of approximately 300 bp or less. The probe areas are located in the inner part of the amplicons.
  • X75070 Paenibacillus polymyxa (D00861), Lactobacillus sp. (D29673), B. stearothermophilus (Ml 1446), B. caldolyticus (U25629), B. cereus (M83910), B. thu ⁇ ngiensis (L77763), Alicyclobacususocyloc epidermis (X69957), B. thermoproteolyticus (X76986), B. amyloliquefaciens (K02497), B. brevis (X61286), Clostridium perfringens (D45904), Listeria monocytogenes (X54619), apr.
  • Pseudomonas fluorescens (ab013895) aasii (AJ007827).
  • P. aeruginosa D87921
  • Pseudomonas sp. (Y17314)
  • Erwinia chrysanthemi M60395)
  • Serratia marcescens X55521
  • Serratia sp. X04127
  • Spr. B. licheniformis S78160
  • B. amyloliquefaciens K02496)
  • B. subtilis (S51909)
  • Bacillus sp. D29736)
  • Bacillus sp. U39230.
  • PCR The amplification was carried out using the GeneAmp-PCR-System 9600 (Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut, USA) DNA from bacterial cultures, volumes of 50 ⁇ l with 50 ng mattress DNA, P ⁇ mer (each 75 pmol spr Ia or Ib / II, 50 pmol npr I / ⁇ and apr I II), 0.2 mM deoxynucleotide phosphates, 5 ⁇ l 10 x reaction buffer, 3 mM MgCl 2 and 1 U Goldstar "Red" DNA polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgium)
  • the PCR program was like follows hot start cycle at 95 ° C for 5 min, 80 ° C for 5 mm, 30 cycles at 94 ° C for 30 s, 53 ° C, 49 ° C or 43 ° C for 30 s and 72 ° C for 20 s, final extension at 72 ° C for 10 mm DNA from soil When soil DNA was used as a mattress, 2%
  • BSA was added to the reaction mixture in a final concentration of 0.3%.
  • DMSO was added when the PCR was carried out with the pomeranian apr la / TL. Since all three tests were very sensitive to For the amount of polymerase reacted, the polymerase solution was diluted in 1 x reaction buffer so that the added volume could be increased to 2 ⁇ l. 1 U was used for the amplification with spr, and 2 U were used for npr and spr.
  • the amount of MgCl 2 was 2 1.5 mM for npr and apr and 3 mM for spr
  • the PCR program corresponded to that for genomic DNA from isolates, for all three PCRs it was found that the optimal annealing temperature was 55 ° C.
  • the amplified PCR products were analyzed by gel electrophoresis with 1 , 8% agarose in TAE buffer (40 mM T ⁇ s-HCl (pH 7.6), 20 mM acetic acid, 1 mM Na 2 EDTA) analyzed
  • Hybridization The hybridizations were carried out on positively charged nylon membranes (Boeh ⁇ nger, Mannheim, Germany). For dot blot hybridizations, 4-12 ⁇ l of the PCR product was denatured and vacuum blotted in 250 ⁇ l of 0.4 N NaOH in 20 ⁇ l. The Southern transfer was carried out as described Manufacturers (Boehrmger, Mannheim, Germany) perform the snowmaking. After blotting, the DNA was fixed on the membrane by means of UV crosslinking. The hybridization with the probes NPR, APR and SPR and the chemiluminescence detection were carried out as follows Prehybridization solutions were 5% for NPR and APR and 0% for SPR.
  • proteolytic bacteria The proteolytic bacteria examined in this study are shown in Table 2. The selected type strains from which the DNA sequences of known peptidases were selected for the design of primers and probes are highlighted in bold. Some basic functional strains (E. coli, B.flrmus and P. chlor oraphis) that can liquefy gelatin have also been investigated. Representative proteolytic bacteria from a garden soil, a grassland rhizosphere soil and a field soil were isolated on gelatin-based agar medium. Under the breeding conditions used, B. cereus, B. mycoides and P. fluorescens biotypes I and II appeared to be the most common species in all three topsoil (data not shown).
  • strains S 28, Rh 9 and S 21 were not further characterized.
  • subtilis for which neutral metallopeptidases (Npr) have been described, were clear inhibited by 1 mM 1, 10-phenathroline. Some inhibition with 3,4-DCI and PMSF was observed, but the enzymes could be assigned to the class of metallopeptidases. This was also the case for B.flrmus and the soil isolates Bacillus sp. AO, the Flavobacterium cytophaga strains and the unidentified strains S 28, Rh 9 and S 21, whose peptidase type was unknown. In the case of the expected alkaline metallopeptidases (Apr) from Pseudomonas fluorescens, P.
  • licheniformis could not be detected.
  • the inhibition patterns suggest the presence of metallopeptidases, which are also described for these species with the exception of B. licheniformis.
  • Only the secreted peptidases from E. coli and P. chlororaphis were inhibited by 3,4-DCI and only weakly by 1 mM and 10 mM 1, 10-phenanthroline and are apparently Spr.
  • the proteolytic activity in the supernatants of Bacillus I, K and L was strongly inhibited by 3,4-DCI and PMSF, but also by 1, 10-phenanthroline. None of the peptidases of the other soil isolates could be clearly assigned to the Spr class.
  • coli and Pseudomonas chlororaphis whose peptidases were both inhibited by an agent specific for the serine type, had npr and ⁇ r genes, respectively.
  • Dot blot or Southern blot hybridization of the amplicons generated with the corresponding DIG-labeled oligonucleotide probes APR, NPR or SPR showed that each probe was specific for the corresponding gene and that all amplified gene fragments were detected (Table 2).
  • npr gene could be identified by means of PCR with the primers npr I / II and subsequent dot blot hybridization with the probe NPR.
  • the _ypr gene was PCR for 17 different strains, mostly Bacillus species (B. cereus, B. mycoides, Bacillus sp. A, B, C, D, E, F, G, I, J, K, L, M, N) and the Flavobacterium cytophaga avenues were amplified and detected with the SPR probe.
  • Bacillus species B. cereus, B. mycoides, Bacillus sp. A, B, C, D, E, F, G, I, J, K, L, M, N
  • the results for the B. cereus and B. mycoides isolates were not consistent since spr genes were not detected in the Gs 28, S3, S4 strains; different forward primers and different annealing temperatures had to be used for the other strains to generate the expected amplicons.
  • the SPR probe specifically hybridized to these gene fragments.
  • the amplicons of the Flavobacterium cytophaga species did not hybridize to the probe. The presence of this gene
  • the apr gene was only detected in the P. fluorescens biotypes from all three sites and in the Flavobacterium cytophaga strains from the arable land and the garden soil. None of the peptide genes could be detected in the coryneform strain S 21.
  • the primers and probes described here are suitable for the identification of peptide genes in a broad spectrum of proteolytic soil bacteria. Applying all three primer pairs and probes to each isolate revealed the existence of previously unknown genes and the presence of several different genes in most isolates. Detection of peptide genes in soil. The oligonucleotides were used to detect the npr, spr and ⁇ /? R gene fragments from total DNA isolated from the soil. All three genes npr, spr and apr could be amplified from soil DNA and were detected with the corresponding probes, as shown by Southern blot hybridization (FIG. 1, B l-3).
  • oligonucleotides presented according to the invention represent a possibility of detecting a representative proportion of proteolytic soil bacteria. Furthermore it could be shown that these oligonucleotides are suitable for the detection of previously unknown and even some different peptidase genes in almost all bacterial proteolytic soil isolates.
  • the probes are also suitable, for example, for a sequence-specific extraction of MRNA.
  • MRNA a sequence-specific extraction of MRNA.
  • subtilisin J gene from Bacillus stearothermophilus and its expression in Bacillus subtilis.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt Oligonukleotide zum Nachweisbakterieller Gene, die für extrazelluläre alkalische Metalloproteasen, extrazelluläre neutrale Metalloproteasen und extrazelluläre Serinproteasen kodieren.

Description

Oligonukleotide zur Amplifikation und zum Nachweis von bakteriellen Genen für extrazelluläre alkalische Metallopeptidasen (Apr), neutrale Metallopeptidasen (Npr) und
Serinpeptidasen (Spr)
Die Erfindung betrifft Oligonukleotide zur Amplifikation und zum qualitativen und quantitativen Nachweis extrazellulärer bakterieller Proteasegene, nämlich extrazellulärer alkalischer Metallopeptidasen, extrazellulärer neutraler Metallopeptidasen und extrazellulärer Serinpeptidasen sowie Verfahren zum Nachweis dieser extrazellulären bakteriellen Peptidasegene und ihre Amplifikation.
Bakterielle extrazelluläre Peptidasen sind in verschiedenen Wissenschaftsbereichen von großer Bedeutung. Dabei gibt es in den einzelnen Bereichen sehr unterschiedliches Interesse an diesen Enzymen, was im folgenden erläutert wird.
1. In der Waschmittelindustrie werden Peptidasen biotechnologisch in großem Maßstab hergestellt, da einige über eine hohe Thermostabilität verfügen und breite Anwendung finden. Hier gibt es einen Bedarf an neuen Enzymen mit physikochemischen und biochemischen Eigenschaften, die an neue marktwirtschaftliche Anforderungen angepaßt sind. Die Enzyme, die hier Verwendung finden (z.B. Subtilsin, Thermolysin), werden von typischen Bodenbakterien produziert. Das Habitat Boden z.B. stellt wahrscheinlich den größten Pool an unterschiedlichen Bakterien, die auch verschiedene Peptidasen produzieren können, dar, da hier eine enorme bakterielle Diversität existiert (vermutlich ist nur ein sehr geringer Teil der Bakterienspezies bisher bekannt und charakterisiert). Der Zugang zu diesem Potential wird bisher dadurch limitiert, daß Bakterien so kultiviert werden müssen, daß die entsprechenden Enzyme exprimiert werden. Aufwendige Enzymaufreinigungen und Charakterisierungen sind dann erforderlich. Hier fehlt es an einem „ high-throughput" Verfahren, mit dem eine große Anzahl von Bakterien nach den verschiedenen Peptidasen gescreent werden kann, um sie dann gezielter zu untersuchen. 2. Im Bereich der Lebensmittelindustrie können bakterielle extrazelluläre Peptidasen für das Verderben von Lebensmitteln verantwortlich sein (z.B. Pseudomonas fluorescens in Milch, Fleisch, Fisch, Kosmetika). Die hitzeresistenten Peptidasen von psychrophilen Bakterien (die also auch bei Kühlung aktiv sind und Peptidasen bilden können) können z.B. auch nach einer Pasteurisierung noch aktiv sein. Deshalb müssen die entsprechenden Organismen für Qualitätsbeurteilungen nachgewiesen werden. Hier wäre es von Vorteil, nicht nur das Vorkommen von bestimmten Organismen, sondern gleich eine Vielzahl an Peptidase-bildenden Bakterien (und auch unbekannte) zu detektieren. Außerdem ist die Ermittlung von Bakterienzahlen über Kultivierungstechniken mit erheblichen Mängeln behaftet, weil nur die auf den entsprechenden Medien wachstumsfähigen Organismen erfaßt werden. Mit Hilfe der quantitativen PCR, für die die hier vorgestellten Oligonukleotide ebenfalls konzipiert sind, könnte ein Titer an potentiell schädlichen Bakterien in den verschiedensten Lebensmitteln unabhängig von der Kultivierbarkeit ermittelt werden.
3. Peptidasen von Krankheitserregern sind darüberhinaus auch in der klinischen Mikrobiologie von großer Bedeutung, da sie Virulenzfaktoren darstellen. Beispiele hierfür sind:
Pseudomonas aeruginosa alkaline Protease: Augenhornhautentzündung, Inhibierung der antiviralen und immunomodulatorischen Aktivität von menschlichem gamma-
Interferon.
Vibrio cholerae Hämaglutinin Protease: spielt eine Rolle bei der Cholera-Pathogenese.
Legionella pneumophilia extrazelluläre Metalloprotease: spielt eine Rolle bei der
Pathogenese der Legionärskrankheit.
Der schnelle Nachweis (und auch eine Quantifizierung) und die Identifizierung von
Peptidasegenen in potentiellen Krankheitserregern oder in infiziertem Gewebe könnte in der medizinischen Diagnostik Anwendung finden.
Für alle Bereiche, in denen bakterielle Peptidasen von Interesse sind, gilt, daß man mit einer Vielzahl an verschiedenen Bakterienspezies und unterschiedlichen Peptidasen konfrontiert ist, die nur mit einem erheblichen Aufwand nachgewiesen werden können oder nur teilweise oder garnicht erfaßt werden Bei einem Screening auf Ebene der expπmierten Proteasen ergibt sich die Schwierigkeit, daß die entsprechende Peptidase unter den gegebenen Kulturbedingungen eventuell nicht expπmiert wird oder daß eine Identifizierung über die übliche Inhibierung nicht zu eindeutigen Ergebnissen fuhrt
Es sind bereits degenerierte Pπmer für die Detektion von verschiedenen Peptidasegenen vei offent cht Hier handelt es sich jedoch um spezifische Primer, die jeweils für die spezifischen Fragestellungen designed wurden So sind z B pilzliche Seπn-Proteasen (Jarai et al, 1994 Clonmg and characteπzation of the pepD gene of Aspergillus niger which codes for a subtilism-like protease Gene 139 51-57 ) oder Lactococcus Peptidasen (Stroman P , 1992 Sequence of a gene (lap) encodmg a 95 3-kDa aminopeptidase from Lactobacillus lactis ssp Cremoπs Wg2 Gene 1 13 107-1 12 ) beschπeben Mit den genannten Pπmera wird nur ein kleiner spezieller Teil von Proteasegenen erfaßt Aufgrund der Lange der Zielsequenzen sind sie nicht für eine Quantifizierung mit Hilfe der TaqMan- Technologie für die quantitative PCR geeignet, eine notwendige Sonde ist nicht vorhanden Bei einer Patentrecherche in der NCBI Datenbank wurden keine ähnlichen PCR Systeme gefunden Es gibt also bisher keine Losungen dieses Problems
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Oligonukleotide bereitzustellen, die u a als Pπmer und Sonden einsetzbar sind, mit deren Hilfe eine breite Palette an unterschiedlichen Proteasegenen detektierbar ist Diese Oligonukleotide sollen die drei wichtigsten extrazellularen bakteπellen Proteaseklassen, nämlich die alkalischen Metallopeptidasen, die neutralen Metallopeptidasen und die Serinpeptidasen, abdecken und eine qualitative und quantitative Detektion ermöglichen
Die Aufgabe der Erfindung wird durch die im Anspruch 1 naher gekennzeichneten Mittel zur Amplifikation und zum qualitativen und quantitativen Nachweis extrazellularer bakterieller Peptidasegene sowie durch das in den Ansprüchen naher charakteπsierte Verfahren zum spezifischen Nachweis und zur Amplifikation bakterieller extrazellularei Peptidasegene gelost Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteranspruchen sowie der nachfolgenden Beschreibung und den Ausfuhrungsbeispielen Es wird darauf hingewiesen, daß die nachfolgende Beschreibung und insbesondere die nachfolgenden Ausführungsbeispiele lediglich bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung wiedergeben, die Erfindung jedoch nicht auf diese speziellen Ausgestaltungen beschränkt ist. Abwandlungen können vom Fachmann ohne erfinderisches Zutun vorgenommen werden, ohne hierdurch vom Erfindungsgedanken abzuweichen.
Die Erfindung wird nachfolgend auch anhand von zwei Tabellen sowie einer Figur näher beschrieben. Diese zeigen:
Tabelle 1 Oligonukleotide, die als Primer und Sonden für eine spezifische
Amplifikation und Detektion von Genen für alkaline Metallopeptidasen
(apr), neutrale Metallopeptidasen (npr) und Serinpeptidasen (spr) verwandt wurden.
* Position im apr Gen von Pseudomonas fluorescens NCBI ABO 13895, im npr Gen von Bacillus cereus NCBI M38910 und im spr Gen von B. subtilis NCBI S51909.
Tabelle 2 Charakterisierung der ausgeschiedenen Peptidasen und der Peptidasegene von Typstämmen und bakteriellen Bodenisolaten. Rh = Grünland-Rhizosphärenboden Gs = Gartenerde S = Ackerboden (Scheyern)
1) DNA Sequenz wurde in den multiple alignments berücksichtigt
2) Amplifikation fand nur bei einer Annealingtemperatur von 49 °C statt
3) Amplifikation fand nur bei einer Annealingtemperatur von 43 °C statt * Schwaches dot blot Hybridisierungssignal
Figur 1 A) Gelelektrophorese von PCR-Produkten, die aus Boden-DNA erhalten
wurden, mit den Primern spezifisch für Gene für bakterielle Serinpeptidasen
(spr), neutrale Metallopeptidasen (npr) und alkaline Metallopeptidasen
(apr). 2% der aus 1 g Boden extrahierten DNA wurde als Template eingesetzt DNA Längenstandard (Spur 1 and 8), Amplifikationsprodukt mit
den Primern sprla/sprll mit DNA (Spur 2) und ohne DNA (Spur 3),
Amplifikationsprodukt mit den Primem nprl/nprll mit DNA (Spur 4) und
ohne DNA (Spur 5), Amplifikationsprodukt mit den Primern aprl/aprll mit
DNA (Spur 6) und ohne DNA (Spur 7)
B) Southern Blot Hybridisierung der Genfragmente von spr, npr, apr mit
den DIG-markierten Sonden SPR (Bl), NPR (B2) und APR (B3)
Erfindungsgemäß werden somit Oligonukleotide als Sonden und Primer bereitgestellt, die so gestaltet sind, daß ein spezifischer Nachweis extrazellulärer bakterieller Peptidasegene, nämlich von extrazellulären alkalischen Metallopeptidasen, neutralen Metallopeptidasen und Serinpeptidasen, sowie die Amplifikation der jeweiligen Genfragmente ermöglicht wird. Die Erfindung umfaßt demnach die nachfolgenden Oligonukleotide sowie ihre komplementären Sequenzen und die reversen oder revers -komplementären Sequenzen sowie die hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzem
a) für extrazelluläre alkalische Metallopeptidasen:
FP apr I 5'-TAYGGBTTCAAYTCCAAYAC-3'
APR 5'-ARCCVGAGAARTCVARGGTRTC-3'
RP apr II 5*-VGCGATSGAMACRTTRCC-3'
b) für extrazelluläre neutrale Metallopeptidasen.
FP npr I 5'-GTDGAYGCHCAYTAYTAYGC-3' NPR 5'-TAHAYCATYTGNKADCCRTTCCA-3'
RP npr II 5'-ACMGCATGBGTYADYTCATG-3" c) für extrazelluläre Serinpeptidasen:
FP spr I 5'-ATGSAYRTTRYYAAYATGAG-3' SPR 5--TTGAHRTYDYKGCWCCWGGY-3'
RP spr π 5'-GWGWHGCCATNGAYGTWC-3'
Die hier offenbarten Oligonukleotide binden spezifisch an die DNA und RNA der oben genannten Peptidasegen-Klassen. Hierdurch wird eine Detektion und Amplifikation einer breiten Palette unterschiedlichster Proteasegene und ihrer Fragmente ermöglicht. Die drei wichtigsten extrazellulären bakteriellen Proteaseklassen werden abgedeckt, und es ist sowohl ein qualitativer als auch quantitativer Nachweis dieser Gene, beispielsweise über PCR-Techniken, z.B. ABI PRISM Sequence Detection System 7700, möglich. Mit den erfindungsgemäß bereitgestellten Nukleotidsequenzen können in einem PCR Lauf alle dieser drei Proteasenklassen amplifiziert werden. Nach einer "klassischen" PCR kann das Amplicon auch über eine Dot-Blot-Hybridisierung mit den Sonden nachgewiesen werden. Die Sonden können auch für ein Screening von Genbibliotheken verwendet werden, und es ist auch möglich, aus einer komplexen Umgebung, beispielsweise bei Bakterien aus Boden, ein spezifisches PCR-Amplifikationsprodukt zu generieren.
Erfindungsgemäß umfaßt werden auch Derivate der oben beschriebenen Oligonukleotide. Unter "Derivate" und "Abwandlungen" sind erfindungs gemäß solche Sequenzen zu verstehen, bei denen ein, zwei oder drei Nukleotide an einem oder an beiden Enden der Oligonukleotide durch andere Nukleotide ersetzt wurden. Voraussetzung hierbei ist immer, daß eine spezifische Bindung an die extrazellulären bakteriellen Peptidasegene oder ihre Fragmente beibehalten wird, so daß die Aufgabe der Erfindung gelöst wird. Unter die Erfindung fallen auch solche Oligonukleotide, die sich von den oben beschriebenen ableiten und bei denen an einem oder beiden Enden ein oder zwei oder drei Nukleotide deletiert sind, wobei auch hier selbstverständlich nur solche Abwandlungen umfaßt werden, bei denen die spezifische Bindung an die extrazellulären bakteriellen Peptidasegene oder ihre Fragmente der oben genannten drei Klassen beibehalten bleibt. Ausgehend von den hier offenbarten Nukleotidsequenzen kann der Fachmann durch Austesten feststellen, welche Derivate bzw. Abwandlungen zu speziellen PCR- und Hybridisierungsreaktionen geeignet sind und welche nicht. Die Oligonukleotide der Erfindung können auch in größeren DNA- und RNA-Ketten enthalten sein.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können auch im Innern variiert werden, wobei 1 , maximal 2 Nukleotide durch ein anderes Nukleotid ersetzt sein können, wobei immer die Spezfität zu den genannten Peptidasen beibehalten bleiben muß.
Bei den PCR-Reaktionen werden üblicher Weise ein Vorwärtsprimer und ein Rückwärtsprimer in Kombination eingesetzt. Die Sonde bzw. ihre komplementäre Sequenz kann aber auch in Kombination mit dem Rückwärtsprimer als Vorwärtsprimer fungieren oder mit dem Vorwärtsprimer als Rückwärtsprimer. Anwendbare Kombinationen ergeben sich auch aus den komplementären Sequenzen der Vorwärtsprimer bzw. der Rückwärtsprimer mit der Sonde und ihrer komplementären Sequenz.
Die Erfindung umfaßt auch die RNA der Oligonukleotide und ihrer komplementären Sequenzen.
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Oligonukleotide werden in Verfahren zum spezifischen Nachweis oder zur Amplifikation bakterieller Gene oder ihrer Fragmente eingesetzt, die für extrazelluläre alkalische Metalloproteasen, neutrale Metalloproteasen und Serinproteasen kodieren. Verfahren, bei denen DNA und RNA gerichtete Sonden zum spezifischen Nachweis eines Mikroorganismus eingesetzt werden, sind an sich bekannt. (DNA gerichtete Sonde: Bach et al. 1999, Appl. and Environ. Microbiol.; RNA: Bach et al. 1999, J. Microbiol. Methods). Der Fachmann kann diese an sich bekannten Verfahren mit den vorliegenden Oligonukleotiden zur Anwendung bringen. Hierbei wird die DNA oder die RNA einer auf die Anwesenheit der genannten bakteriellen Gene zu untersuchenden Probe mit zumindest einem der Oligonukleotide, die vorstehend näher beschrieben wurden, in Kontakt gebracht. Anschließend erfolgt der Nachweis über die Hybridisierung der Oligonukleotide mit der RNA oder der DNA der Probe durch PCR- Techniken oder durch Hybridisierungsreaktionen, um das Vorliegen spezifischer DNA und/oder RNA-Sequenzen aufzuzeigen. Alle offenbarten Oligonukleotide sind auch als Primer für eine reverse Transkription von mRNA einsetzbar.
Erfindungsgemäß sind vielfältige Abwandlungen möglich, um die Sonden und Primer , hier je kurz auch Oligonukleotide genannt, einzusetzen. Diese können beispielsweise mit einer Markierung versehen werden, beispielsweise einer radioaktiven Markierung, Digoxigenin-, Peroxidase- oder Alkalische- Phosphatase-Markierung, oder einer fluoreszierenden Markierung, um eine spezifische Hybridisierung nachzuweisen. Primer und Sonden können auch z.B. mit Biotin markiert werden und für eine sequenzspezifische Isolierung von DNA oder RNA durch Magnetic-capture-hydridization eingesetzt werden. Selbstverständlich sind alle Markierungen möglich, die mit den Nachweisverfahren nicht interferieren, also beispielsweise Markierungen, die durch enzymatische Verfahren nachweisbar sind.
Weitere Abwandlungen bzw. Derivatisierungen der Sonden sind z.B. PNAs, bei denen die heterozyklischen Basen an ein Protein-Rückgrat und nicht an ein Zucker-Phosphat- Rückgrat gebunden sind. Weitere Modifikationen der Sonden sind beispielsweise Phosphorylierungen, das Anfügen von Aminolinkern oder von Thiolinkern. Andere Modifikationen sind dem Fachmann bekannt und können, falls sie die erfindungsgemäßen Nachweisreaktionen nicht stören, eingefügt werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die Oligonukleotide an eine Matrix gebunden (reverse Hybridisierungen), und es wird mit beispielsweise ftuoreszenzmarkierter DNA oder einem PCR-Amplifikator hybridisiert. Beispiele für derartige Matrices sind Mikrochips und Mitrotiterplatten.
Vorstehend wurden bestimmte Derivatisierungen der Oligonukleotide beschrieben. Von der Erfindung umfaßt werden auch hier nicht gesondert beschriebene Derivate, beispielsweise chemische Änderungen an den Oligonukleotiden, die das Nachweisverfahren erleichtern. Derartige Abwandlungen sind dem Fachmann bekannt, und sie können auf die erfindungsgemäß bereitgestellten Oligonukleotide angewandt werden. Die DNA oder RNA der zu untersuchenden Probe wird entweder aus den Probenorganismen isoliert oder die Organismen werden in geeigneter Weise aufgeschlossen oder durchlassig gemacht, so daß ein direkter Kontakt der Sonden mit der DNA und/oder der RNA der Probenorganismen ermöglicht wird, ohne daß vorher umfangreiche und zeitraubende Reinigungsprozeduren durchgeführt werden müssen Die Oligonukleotide der Erfindung sind in einer Aus gestaltungs form bei in situ Hybridisierungen und m situ PCR einsetzbar
Die Hybndisierung der Oligonukleotide mit der DNA und/oder der RNA der Probenorganismen erfolgt unter strmgenten Bedingungen, bevorzugt hoch-stnngenten Bedingungen Diese Bedingungen werden nachfolgend naher ausgeführt
Bei der Hybndisierung sind Reaktionspuffer und Waschpuffer aus folgenden funktionellen Komponenten zusammengesetzt
a) Puffersystem zur Einstellung und Stabilisierung des pH-Wertes zwischen 7 und 8 (z B Tns/HCl) b) Wasser als 'Lösungsmittel' c) Eventuell Chelatbildner, die bei niedrigen Konzentrationen monovalenter Kationen den Einfluß zweiwertiger Kationen (z B Ca2+), die als Verunreinigung in Chemikalien enthalten sein können, verhindern Wird insbesondere im Waschpuffer eingesetzt d) Detergenz zur Erniedrigung der Oberflachenspannung von waßπgen Losungen e) Nichtiomsche, aprotische Detergenzien (z B Formamid) schwachen die Bindungsenergie von Nuklemsaure-Duplexmolekulen f) Salz (funktionelle Einheit sind Kationen, die die negativen Ladungen der Nukleinsaure - Phosphatgruppen neutralisieren und dadurch die Duplexbildung von zwei einzelstrangigen Nukleinsäuren erleichtern (z B Na+ in NaCl)
Viei Faktoren haben Einfluß auf das Zustandekommen von spezifischen Hybriden aus den Ohgonukleotiden und Zielmolekul Die Komponenten e) und f) beeinflussen die Bindungsstärken von Nukleinsäure- Duplexmolekülen. Erhöhung der monovalenten Kationen in der Reaktions- bzw. Waschlösung stabilisiert die gebildeten Duplexmoleküle, während mit zunehmendem Gehalt an z.B. Formamid die Duplexbindungen geschwächt werden.
Eine geeignete Oligonukleotidkonzentration muß eingesetzt werden. Die Hybridisierung muß bei geeigneter Temperatur stattfinden (je höher die Temperatur, um so schwächer die Bindung der Hybride).
Unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen versteht man die Reaktionsbedingungen (die richtige Wahl der vier Faktoren), unter denen nur noch Duplexmoleküle zwischen Ohgonukleotiden und gewünschten Zielmolekülen (perfekte Hybride) entstehen bzw. nur noch der gewünschte Zielorganismus nachgewiesen wird.
Unter stringenten Reaktionsbedingungen wird beispielsweise eine Hybridisierungstemperatur von ca. 5-10°C unter dem jeweiligen
Oligonukleotidschmelzpunkt verstanden. Die Stabilität der DNA/DNA oder RNA/DNA- Hybriden muß selbst bei niedrigen Salzkonzentrationen entsprechend 0,1 x SSC/0,5% SDS gewährleistet sein. Auf diese Weise kann der Ablauf unerwünschter Kreuzreaktionen mit anderen Genen verhindert werden. Die jeweiligen Temperaturbedingungen können jedoch in Abhängigkeit von den gewählten Versuchsbedingungen und in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Nukleinsäure-Probe unterschiedlich sein und müssen dann entsprechend angepaßt werden. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts kann beispielsweise durch Autoradi ographie im Falle radioaktiv markierter Primermoleküle oder durch Fluorimetrie bei Verwendung von Fluoreszenz-markierten Ohgonukleotiden erfolgen.
Weitere Beispiele für stringente Bedingungen sind in den nachfolgenden Beispielen aufgeführt. Der Fachmann kann in an sich bekannter Weise die Bedingungen an das gewählte Untersuchungsverfahren anpassen, um tatsächlich stringente Bedingungen zu erzielen und ein spezifisches Nachweisverfahren zu ermöglichen. Geeignete Stringenzbedingungen lassen sich beispielsweise anhand von Referenzhybridisierungen ermitteln. Stringenzbedingungen lassen sich beispielsweise anhand von Referenzhybridisierungen ermitteln.
Es ist bekannt, daß nicht allein die Temperatur für die Stringenz entscheident ist. Nach der Formel Tm=81,5+16,6*(loglO[Na+]+0,41 *(%G+C)-675/n, wobei n die Anzahl der Basen darstellt, ist die optimale Temperatur entscheidend vom Salzgehalt und vom Oligo (G+C) abhängig. Außerdem erhöht die Zugabe von Formamid die Stringenz bei gleicher Temperatur. Die Definition und die Auswahl von hochstringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise wird hier hingewiesen auf Cornel Mühlhardt „Der Experimentator: Molekularbiologie", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Jena, Lübeck, Ulm, 1999, 2000.
In einer weiteren Aus ührungs form der Erfindung werden die Oligonukleotide als Vorwärts- und Rückwärts-Primer für eine PCR-Reaktion eingesetzt.
Das PCR- Verfahren hat den Vorteil, daß sehr kleine DNA-Mengen nachweisbar sind. In Abhängigkeit von dem nachzuweisenden Material sind die Temperaturbedingungen und die Zykluszahlen der PCR abzuwandeln. Die optimalen Reaktionsbedingungen können durch Handversuche in an sich bekannter Weise ermittelt werden. Ein Beispiel für eine PCR ist wie folgt:
Denaturierung der zu untersuchenden DNA-Probe bei 94°C mindestens 3 Minuten lang;
Bindung der als Primer fungierenden Oligonukleotide 1 Minute lang bei 60°C an die beiden komplementären Einzelstränge der zu untersuchenden DNA; zweiminütige Verlängerungsreaktion der einzelnen Primer entlang der DNA-Matrize bei 72°C durch Verknüpfung von Desoxyribonukleosidtriphosphaten mittels einer thermostabilen DNA-Polymerase;
30 bis 40 Reaktionszyklen jeweils bestehend aus: DNA-Denaturierung bei 94°C (30
Sekunden lang), gefolgt von Primerbindung bei 60°C (1 Minute lang), und
Primerverlängerung bei 72°C (2 Minuten lang); Endreaktion zur Auffüllung der beiden 3 '-Enden am Reaktionsprodukt bei 72°C (ca. 5- 8 Minuten lang).
Die im Verlauf der PCR-Amplifikation durch die Verlängerung der Primersequenzen entstandenen, charakteristischen, spezies-spezifischen DNA-Markerfragmente können beispielsweise gel-elektrophoretisch oder fluorimetrisch unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Oligonukleotide nachgewiesen werden. Selbstverständlich sind auch andere, dem Fachmann bekannte Nachweisverfahren einsetzbar.
Auch RNA kann im Rahmen einer RT-PCR als Ausgangsmaterial eingesetzt werden. Hierzu wird die RNA zunächst in cDNA umgeschrieben und diese anschließend als Template verwendet.
In einer alternativen Aus führungs form der Erfindung werden die Sonden mit der zu untersuchenden DNA- oder RNA-Probe zur Hybridisierung gebracht, wobei stringente Hybridisierungsbedingungen gewählt werden. Stringente Bedingungen müssen für die jeweilige Anwendung empirisch ermittelt werden. Die nachfolgend beschriebenen Bedingungen können als Anhaltspunkte dienen.
Die DNA oder RNA der zu untersuchenden Probe kann sowohl bei der PCR-Reaktion bzw. RT-PCR als auch bei der Hybridisierungsreaktion entweder in extrahierter Form vorliegen oder in Form von komplexen Gemischen, bei denen die zu untersuchende Mikroorganismus-DNA oder RNA nur einen sehr kleinen Anteil an der Fraktion der speziellen biologischen Probe bildet. Die zu untersuchenden Zellen können somit entweder in gereinigter Form vorliegen oder beispielsweise verunreinigt mit Bodenbestandteilen. Sowohl in situ PCR oder in situ RT-PCR sind mit den hier beschriebenen Ohgonukleotiden durchführbar.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von konkreten Beispielen beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht hierauf beschränkt. Material und Verfahren Stämme und Zuchtbedingungen
Typstämme wurden von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) erworben. Proteolytische Bodenbakterien aus einer Grasland (Grünland) - Rhizosphäre, einem Gartenboden und einem Ackerland wurden isoliert, in dem Verdünnungsreihen von Bodensuspensionen auf Gelatineagarplatten wie in Bach et al. ( 1999a) beschrieben ausplattiert wurden. Die Bakterienisolate wurden anhand morphologischer und physiologischer Merkmale gemäß der Klassifikation in Bergey's Handbuch der Bestimmungsbakteriologie (1984 und 1986) identifiziert. Die zur Charakterisierung der Bakterien verwendeten Verfahren sind in Starr et al. (1981) beschrieben. Die Stämme wurden als Pseudomonas fluorescens klassifiziert, wenn sie die folgenden Merkmale aufwiesen: Gram-negative, bewegliche, stäbchenförmige Zellen, Vorliegen von Cytochromoxidase, strikt aerobes Wachstum, keine Denitrifizierung, kein Wachstum bei 42°C, Wachstum bei 4°C, Fluoreszenz nur auf King's-B-Medium, Vorliegen von Arginindihydrolase. Die Pseudomonas fluorescens '-Gruppe umfasste verschiedene Biotypen (angezeigt durch unterschiedliche Koloniemorphologie), die nicht weiter charakterisiert wurden. Die Identität von Pseudomonas spp. wurde durch PCR mit für Pseudomonas im strengen Sinne spezifischen Primem bestätigt (Widmer et al. 1998). Gram-negative, unbewegliche Stäbchen mit Cytochromoxidase und Bildung gelber, Flexirubin enthaltender Kolonien (Reichenbach et al. 1981) wurden als dem Flavobacterium-Cytophaga-Koπφlex zugehörig betrachtet. Die Einordnung dieser Stämme in diese Gruppe wurde durch Hybridisierung mit der 16S-rRNA-spezifischen Sonde (CF319a) für Bakterien der Abteilung Cytophaga-Flavobacter-Bacteroides bestätigt (Manz et al. 1996). Die Stämme S 51 und Gs 61 wiesen identische Koloniemorphologie auf.
Bacillus cereus und Bacillus mycoides wurden aufgrund ihrer typischen Koloniemorphologie erkannt. Ihre Identität wurde durch Untersuchung der Zellgröße, des Vorliegens und der Position von Sporen, Katalase, Voges-Proskauer-Reaktion, anaerobem Wachstum, Wachstum bei 50°C, Wachstum in 7% NaCl und Bildung von Nitrit aus Nitrat bestätigt. Stämme, die auf Agar keine rhizoiden Kolonien bildeten, wurden als B. cereus klassifiziert.
Bacillus spp. anders als B. cereus und B. mycoides wurden hinsichtlich der Bildung von
Endosporen getestet und nicht weiter klassifiziert. Verschiedene Koloniemorphologien sind durch unterschiedliche Buchstaben von A-O vermerkt.
Die Stämme wurden in 10 ml Nutrient-Broth-Medium (Merck, Darmstadt, Deutschland) bei den empfohlenen Temperaturen (Bodenisolate bei 30°C) unter Schütteln bei 130 U/min über Nacht gezüchtet. Die Zellsuspensionen wurden mittels Zentrifugation bei 4500 x g für 10 min bei 6°C sedimentiert. Die Sedimente und Überstände wurden bei -20°C gelagert, bis sie zur Extraktion genomischer DNA bzw. für Enzyminhibitionstests verwendet wurden.
Enzymtest. Die proteolytische Aktivität wurde gemäß einem modifizierten Protokoll von Hoppe et al. (1988) unter Verwendung von Leu-MCA (L-Leucin-4-mefhyl-7- cumarinylamid) als Substrat getestet. 3,4-Dichloroisocoumarin (3,4-DCI) und Phenylmefhylsulfonylfluorid (PMSF) wurden als Spr-spezifische Inhibitoren verwendet, und 1 , 10-Phenanthrolin wurden als Inhibitor der Metalloenzyme Npr und Apr verwendet. Das experimentelle Verfahren zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität und die Wirkung der Inhibitoren auf die Enzyme sind eingehend in Bach und Munch (1999) beschrieben. Die Aktivität im Reaktionsgemisch ohne Inhibitor wurde als 100%» Aktivität angesehen.
Extraktion von DNA. Die genomische DNA von Bakterienreinkulturen wurde mittels Standardverfahren zur DNA-Extraktion gewonnen (Marmur 1961). DNA aus einem Ackerboden (Scheyern, Südbayern, Deutschland) wurde unter Verwendung des FastDNA- SPIN-Kits für Boden (Bio 101, Vista, USA) wie von Hersteller empfohlen extrahiert und gereinigt. Boden- und Standortmerkmale: HK - ertragreiche Parzelle mit herkömmlichem Ackerbau, sandiger Schlufflehm, pH- Wert 5,6, 16,21 mg ■ g"1 organischer C, 1,54 mg ■ g"1 Gesamt-N. Gestaltung der PCR-Primer und Sonden. Die Nukleotidsequenzen der reifen Peptidasen wurden einer Homologiesuche unter Verwendung des NCBI-BLASTN-Programms Release 2.0.5 (mit den Batenbanken GenBank, EMBL, DDBI und PDP), unterworfen. Die Gene mit homologen Bereichen zu entweder dem apr-Gen von Pseudomonas fluorescens, dem npr-Gen von Bacillus cereus oder dem spr-Gen von B. subtilis wurden aus der NCBI- Datenbank erhalten. Für jede Peptidaseklasse wurden Alignments unter Verwendung des Genomatix-Dialign-Programms (http://genomatix.gsf.de/cgi-bin/dialign/dialign.pl) (Di Align Professional, Release 2.0, nicht parametrierbar), durchgeführt. Zielbereiche für die Primer wurden so ausgewählt, dass DNA-Fragmente von etwa 300 bp oder weniger amplifiziert werden. Die Sondenbereiche befinden sich im inneren Teil der Amplicons. Ein Vergleich der gewählten degenerierten Oligonukleotide mit bekannten DNA- Sequenzen unter Verwendung des Genomatix-Matinspector-Programms ((http://genomatix.gsf.de/cgi-bin/matinspector/matinspector.pl) (Matiusspector public domain 2.2; ILIPAC SEARCH, 2 Fehlpaarungen erlaubt), ergab, dass das Nachweissystem für bakterielle Peptidasegene spezifisch ist und Pilz-Peptidasegene nicht erkennt. Die Oligonukleotide sind in der Tabelle 1 beschrieben. Die folgenden Sequenzen wurden für die Gestaltung der Sonde berücksichtigt: npr: B. megaterium (X75070), Paenibacillus polymyxa (D00861), Lactobacillus sp. (D29673), B. stearothermophilus (Ml 1446), B. caldolyticus (U25629), B. cereus (M83910), B. thuήngiensis (L77763), Alicyclobacillus acidocaldarius (U07824), Staphylococcus epidermis (X69957), B. thermoproteolyticus (X76986), B. amyloliquefaciens (K02497), B. brevis (X61286), Clostridium perfringens (D45904), Listeria monocytogenes (X54619), apr. Pseudomonas fluorescens (ab013895), P. tolaasii (AJ007827). P. aeruginosa (D87921), Pseudomonas sp. (Y17314), Erwinia chrysanthemi (M60395), Serratia marcescens (X55521), Serratia sp. (X04127), spr. B. licheniformis (S78160), B. amyloliquefaciens (K02496), B. subtilis (S51909), Bacillus sp. (D29736), Bacillus sp. (U39230).
Überraschenderweise konnte durch die oben beschriebene Vorgehensweise eine Reihe von Sequenzen ermittelt werden, die spezifisch bakterielle Gene erkennen, die für extrazelluläre alkalische Metalloproteasen, extrazelluläre neutrale Metalloproteasen und extrazelluläre Serinproteasen kodieren, die auch in hoch komplexen Gemischen, beispielsweise Boden, einen spezifischen Nachweis ermöglichen. Der Einsatz einer Vielzahl spezifischer Pπmer, der bisher durchgeführt wurde, ist somit nicht mehr notwendig
PCR Die Amplifikation erfolgte mit dem GeneAmp-PCR-System 9600 (Perkin Eimer, Norwalk, Connecticut, USA) DNA aus Baktenenkulturen Volumina von 50 μl mit 50 ng Matnzen-DNA, Pπmer (jeweils 75 pmol spr Ia oder Ib/II, 50 pmol npr I/π und apr I II), 0,2 mM Desoxynukleotidtπphosphate, 5 μl 10 x Reaktionspuffer, 3 mM MgCl2 und 1 U Goldstar "Red"-DNA-Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) Das PCR-Programm war wie folgt Heißer Startzyklus bei 95°C für 5 min, 80°C für 5 mm, 30 Zyklen bei 94°C für 30 s, 53°C, 49°C oder 43°C für 30 s und 72°C für 20 s, abschließende Verlängerung bei 72°C für 10 mm DNA aus Boden Wenn Boden-DNA als Matnze verwendet wurde, wurden 2% der aus 1 g Boden isolierten DNA zugefugt 75 pmol der Pπmer spr Ia/II und npr I/II und 50 pmol apr I/II wurden verwendet BSA wurde zum Reaktionsgemisch in einer Endkonzentration von 0,3% gegeben DMSO wurde zugegeben, wenn die PCR mit den Pnmern apr la/TL durchgeführt wurde Da alle drei Tests sehr empfindlich auf die Polymerasemenge reagierten, wurde die Polymeraselosung in 1 x Reaktionspuffer verdünnt, damit das zugegebene Volumen auf 2 μl vergrößert werden konnte 1 U wurde für die Amplifikation mit spr eingesetzt, und 2 U wurden jeweils für npr und spr eingesetzt Die Menge an MgCl2 betrug 1,5 mM für npr und apr und 3 mM für spr Das PCR-Programm entsprach demjenigen für genomische DNA aus Isolaten, für alle drei PCRs wurde gefunden, dass die optimale Annealingtemperatur 55°C war Die amplifizierten PCR-Produkte wurden mittels Gelelektrophorese mit 1,8% Agarose in TAE-Puffer (40 mM Tπs-HCl (pH- Wert 7,6), 20 mM Essigsaure, 1 mM Na2 EDTA) analysiert
Hybridisierung Die Hybridisierungen erfolgten auf positiv geladenen Nylon-Membranen (Boehπnger, Mannheim, Deutschland) Für Dotblot-Hybπdisierungen wurden 4-12 μl des PCR-Produkts 20 mm in 250 μl 0,4 N NaOH denatuπert und vakuumgeblottet Der Southern-Transfer wurde wie vom Hersteller (Boehrmger, Mannheim, Deutschland) beschneben durchgeführt Nach dem Blotten wurde die DNA mittels UV-Vemetzung auf der Membran fixiert Die Hybndisierung mit den Sonden NPR, APR und SPR und der Chemilumineszenznachweis erfolgten wie folgt Die Formamidkonzentrationen m der Vorhybridisierungslösung waren 5% für NPR und APR und 0% für SPR. Vorhybridisierung in 5 x SSC; 1 % N-Lauroylsarcosin; 0,02% SDS; 1% Blockierungsreagenz und Formamid 1 ,5 Std. bei 45°C. Hybridisierung mit 10 pmol/ml 5'- DIG-markierter Sonde in Vorhybridisierungslösung für 2,5 Std. bei 45°C. Das Waschen erfolgte 2 x 5 min mit 2 x SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur und 2 x 15 min in 0,5 x SSC, 0,1% SDS bei 45°C. Der Nachweis erfolgte unter Verwendung des DIG- Lumineszenz-Nachweis-Kits (Boehringer, Mannheim, Deutschland) wie vom Hersteller empfohlen.
Ergebnisse
Proteolytische Bakterien. Die in dieser Studie untersuchten proteolytischen Bakterien sind in der Tabelle 2 dargestellt. Die ausgewählten Typstämme, aus denen die DNA- Sequenzen bekannter Peptidasen für die Gestaltung von Primern und Sonden ausgewählt wurden, sind fett hervorgehoben. Einige Grundfunktionsstämme (E. coli, B.flrmus und P. chlor oraphis), die Gelatine verflüssigen können, wurden ebenfalls untersucht. Repräsentative proteolytische Bakterien aus einem Gartenboden, einem Grünland- Rhizosphärenboden und einem Ackerboden wurden auf Agarmedium auf Gelatinebasis isoliert. Unter den angewendeten Zuchtbedingungen schienen die B. cereus, B. mycoides und P. fluorescens -Biotypen I und II die häufigsten Arten in allen drei Oberböden zu sein (Daten nicht gezeigt). Die anderen Stämme wurden nicht bis zur Art identifiziert, wurden aber meist der Gattung Bacillus und einige der Flavobacterium-Cytophaga-Gnφpe zugeordnet. Die meisten Arten wurden in jedem Oberboden gefunden. Die Stämme S 28, Rh 9 und S 21 wurden nicht weiter charakterisiert.
Εnzymexpression. Ein Enzyminhibitionstest wurde zum Nachweis und zur Identifizierung der ausgeschiedenen Peptidasen im zellfreien Medium reiner Kulturen der proteolytischen Bakterien verwendet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 dargestellt. Das Substrat Leu-MCA (L-Leucin-4-methyl-7-cumarinylamid) eignete sich zur Demonstration der Peptidaseaktivität in den Kulturüberständen aller in dieser Studie untersuchter Stämme mit Ausnahme von B. caldolyticus. 3,4-Dichloroisocoumarin (3,4- DCI) und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), die als spezifische Inhibitoren für Peptidasen vom Serintyp angesehen werden, und 1 ,10-Phenanthrolin, das spezifisch Metallopeptidasen hemmt, wurden zugegeben, um die Art der ausgeschiedenen Peptidasen zu identifizieren.
Die gereinigte Bezugs-Serinpeptidase Spr aus B. licheniformis (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) wurde eindeutig durch 3,4-DCI und PMSF und nicht durch 1,10- Phenanthrolin gehemmt, wohingegen die neutrale Metallopeptidase Npr aus B. polymyxa (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) durch 1 , 10-Phenanthrolin gehemmt und nur schwach durch 3,4-DCI und PMSF beeinträchtigt wurde. Die proteolytische Aktivität in den Überständen von B. cereus, B. thuringiensis , B. megaterium, B. stearothermophilus, Paenibacillus polymyxa, B. amyloliquefaciens, B. mycoides und B. subtilis, für die neutrale Metallopeptidasen (Npr) beschrieben sind, wurden eindeutig durch 1 mM 1 ,10- Phenathrolin gehemmt. Es wurde zwar etwas Hemmung mit 3,4-DCI und PMSF beobachtet, aber die Enzyme konnten der Klasse der Metallopeptidasen zugeordnet werden. Dies wurde auch für B.flrmus und die Bodenisolate Bacillus sp. A-O, die Flavobacterium-Cytophaga-Stämme und die nicht identifizierten Stämme S 28, Rh 9 und S 21, deren Peptidasetyp unbekannt war, gefunden. Bei den erwarteten alkalischen Metallopeptidasen (Apr) von Pseudomonas fluorescens, P. aeruginosa, Serratia marcescens und Erwinia chrysanthemi sind die Inhibitionsmuster zweideutig, da eine erhebliche Hemmung mit dem für den Serintyp spezifischen Inhibitor 3,4-DCI erfolgte (z. B. 73%> bei P. fluorescens). Eine Konzentration von 10 mM 1 , 10-Phenanthrolin war für eine etwa 90%>ige Hemmung nötig. Die verglichen mit den neutralen Metallopeptidasen schwache Hemmung dieser Peptidaseklasse durch 1 mM 1 , 10-Phenanthrolin ist durchgängig und klassifiziert diese Enzyme in eine gesonderte Gruppe unter den untersuchten Proben. Die erwarteten Peptidasen vom Serintyp (Spr) aus B. stearothermophilus , B. amyloliquefaciens, B. subtilis und B. licheniformis konnten nicht nachgewiesen werden. Die Inhibitionsmuster legen das Vorliegen von Metallopeptidasen nahe, die mit Ausnahme von B. licheniformis ebenfalls für diese Arten beschrieben sind. Nur die ausgeschiedenen Peptidasen aus E. coli und P. chlororaphis wurden durch 3,4- DCI und nur schwach durch 1 mM und 10 mM 1 , 10-Phenanthrolin gehemmt und sind anscheinend Spr. Die proteolytische Aktivität in den Überständen von Bacillus I, K und L wurde stark durch 3,4-DCI und PMSF, aber auch durch 1 , 10-Phenanthrolin gehemmt. Keine der Peptidasen der anderen Bodenisolate konnte eindeutig der Spr-Klasse zugeordnet werden.
Validierung der ausgewählten Oligonukleotide zum Nachweis von Genfragmenten von spr, npr und spr durch PCR und Sondenhybridisierung. Die entwickelten Primerpaare und DIG-markierten Oligonukleotidsonden wurden zum PCR-Nachweis und anschließende Dotblot-Hybridisierung eingesetzt, um das proteolytische Potential der Bakterien auf genetischer Ebene zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengefasst. Für alle der multiplen Alignments unterworfenen Typstämme, ausgenommen npr von B. amyloliquefaciens, wurden die entsprechenden Genfragmente (apr. 194 bp, npr. 233 bp oder spr: 319 bp) durch PCR erzeugt und durch die entsprechenden Sonden APR, NPR und SPR spezifisch nachgewiesen. Die Annealingtemperatur von 53°C war zur Herstellung eines einzelnen spezifischen Amplicons der erwarteten Länge bei den meisten dieser Gene in allen drei PCR- Reaktionen geeignet. Wurde die Annealingtemperatur auf 49 oder 43 °C gesenkt, was zu mehreren weiteren unspezifischen Banden (in Tabelle 2 mit Sternchen markiert) führte, wurden weitere Gene nachgewiesen. Die PCR-Produkte von B. cereus und B. thuringiensis mit den Primern spr Ia π waren auf dem Agarosegel nach Ethidiumbromidfärbung nicht sichtbar, aber nach Southern-Blot-Hybridisierung mit der SPR-Sonde konnte eine Bande der erwarteten Länge identifiziert werden (Daten nicht gezeigt). Das spr-Gen von B. megaterium konnte nur amplifiziert werden, wenn der Vorwärts -Primer spr la durch spr Ib ersetzt wurde, was eine Bande von 486 bp Länge erzeugte. Auch in B. subtilis und B. licheniformis wurden Gene für Npr gefunden. Das beschriebene _ypr-Gen von B- stearothermophilus (Jang et al. 1992) war nicht nachweisbar, wenn diese PCR- Bedingungen angewendet wurden. Es wurde gezeigt, dass E. coli und Pseudomonas chlororaphis , deren Peptidasen beide durch ein für den Serintyp spezifisches Mittel inhibiert wurden, npr- bzw. α r-Gene besaßen. Die Dotblot- oder Southern-Blot- Hybridisierung der erzeugten Amplicons mit den entsprechenden DIG-markierten Oligonukleotidsonden APR, NPR oder SPR zeigte, dass jede Sonde für das entsprechende Gen spezifisch war und dass alle amplifizierten Genfragmente nachgewiesen wurden (Tabelle 2). Anwendung der Oligonukleotidsätze zur Identifizierung von Peptidasegenen aus bakteriellen Bodenisolaten.
Für jedes untersuchte Bodenisolat, ausgenommen S 21, konnten Genfragmente mindestens einer Peptidaseklasse nachgewiesen werden. In 17 der 22 verschiedenen Spezies (B. cereus, B. mycoides, Bacillus A, B, C, D, E, F, G, H, L, M, N und O, die Flavobacterium- Cytophaga-Stämme und die unidentifizierten Stämme S 28 und Rh 9) konnte das npr-Gen mittels PCR mit den Primern npr I/II und anschließende Dotblot-Hybridisierung mit der Sonde NPR identifiziert werden.
Das _ypr-Gen wurde mittels PCR für 17 verschiedene Stämme, meist Bacillus- Arten (B. cereus, B. mycoides, Bacillus sp. A, B, C, D, E, F, G, I, J, K, L, M, N) und die Flavobacterium-Cytophaga-Avten amplifiziert und mit der SPR-Sonde nachgewiesen. Die Ergebnisse für die B. cereus- und B. mycoides -Isolate waren nicht konsistent, da spr-Gene nicht bei den Stämmen Gs 28, S3, S4 nachgewiesen wurden; bei den anderen Stämmen mussten unterschiedliche Vorwärts -Primer und verschiedene Annealingtemperaturen zur Erzeugung der erwarteten Amplicons eingesetzt werden. Die SPR-Sonde hybridisierte spezifisch mit diesen Genfragmenten. Die Amplicons der Flavobacterium-Cytophaga- Arten hybridisierten nicht mit der Sonde. Das Vorliegen dieses Gens wurde daher durch PCR mit dem zweiten Vorwärts-Primer spr Ib, der eine Fragmentgröße von 486 bp festlegt, bestätigt.
Das apr-Gen wurde nur bei den P. fluorescens-Biotypen von allen drei Standorten und bei den Flavobacterium-Cytophaga-Stämmen aus dem Ackerland und dem Gartenboden nachgewiesen. Keines der Peptidasegene konnte bei dem coryneformen Stamm S 21 nachgewiesen werden.
Die hier beschriebenen Primer und Sonden eignen sich zur Identifizierung von Peptidasegenen in einem breiten Spektrum proteolytischer Bodenbakterien. Die Anwendung aller drei Primerpaare und Sonden auf jedes Isolat enthüllte die Existenz zuvor unbekannter Gene und das Vorliegen mehrerer verschiedener Gene in den meisten Isolaten. Nachweis von Peptidasegenen in Boden. Die Oligonukleotide wurden zum Nachweis der npr-, spr- und α/?r-Genfragmente von aus Boden isolierter Gesamt-DNA eingesetzt. Alle drei Gene npr, spr und apr konnten aus Boden-DNA amplifiziert werden und wurden mit den entsprechenden Sonden nachgewiesen, wie durch Southern-Blot-Hybridisierung gezeigt (Fig. 1, B l-3). Eine Anzahl von 35 Zyklen war ausreichend für den Erhalt klar sichtbarer Banden auf einem Agarosegel nach Ethidiumbromidfärbung. Bei allen drei PCR-Sätzen wurde gefunden, dass eine Annealingtemperatur von 55°C hinsichtlich der Produktausbeute und der Spezifϊtät des PCR-Produktes optimal war.
Die erfindungsgemäß vorgestellten Oligonukleotide stellen eine Möglichkeit dar, einen repräsentativen Anteil proteolytischer Bodenbakterien nachzuweisen. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß diese Oligonukleotide sich zum Nachweis vorher unbekannter und sogar einiger verschiedner Peptidasegene in fast allen bakteriellen proteolytischen Bodenisolaten eignen.
Die Sonden eignen sich beispielsweise auch für eine Sequenzspezifische Extraktion von MRNA. Hierdurch können wertvolle Informationen über das Peptidase spezifische genetische Potential von im Boden vorkommenden Bakterien speziell über den Stickstoff- Turnover erhalten werden.
Mit Hilfe der hier vorgestellten Oligonukleotide ist auch auch Screening nach neuen Peptidasen mit neuen und verbesserten Eigenschaften und das Screening nach neuen proteolytischen Bakterien möglich. Der Nachweis auch nicht kultivierbarer proteolytischer Organismen wird durch die hier offenbarten Oligonukleotide ebenfalls ermöglicht. Literaturliste
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Claims

PATENTANSPRÜCHE
Mittel zur Amplifikation und zum qualitativen und quantitativen Nachweis von extrazellularen baktenellen Peptidasegenen, dadurch gekennzeichnet, daß es zumindest eines der nachfolgenden Oligonukleotide sowie Oligonukleotide mit komplementärer Sequenz, und oder Ohgonukleotidpaare hiervon sowie die hiervon abgeleiteten RNAs oder Denvate hiervon umfaßt, die je spezifisch an die für extrazellulare alkalische Metallopeptidasen, extrazellulare neutrale Metallopeptidasen oder extrazellulare Seπnpeptidasen kodierenden Gene oder Genfragmente oder deren RNA binden
a) für extrazellulare alkalische Metallopeptidasen
FP apr I 5'-TAYGGBTTCAAYTCCAAYAC-3'
APR 5'-ARCCVGAGAARTCVARGGTRTC-3'
RP apr II 5'-VGCGATSGAMACRTTRCC-3*
b) für extrazellulare neutrale Metallopeptidasen
FP npr I 5'-GTDGAYGCHCAYTAYTAYGC-3' NPR 5'-TAHAYCATYTGNKADCCRTTCCA-3'
RP npr II 5*-ACMGCATGBGTYADYTCATG-3'
c) für extrazellulare Serinpeptidasen
FP spr I 5'-ATGSAYRTTRYYAAYATGAG-3' SPR 5'-TTGAHRTYDYKGCWCCWGGY-3*
RP spr II 5'-GWGWHGCCATNGAYGTWC-3' Mittel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß ein, zwei oder drei der Nukleotide an einem oder beiden Enden der Oligonukleotide durch ein anderes Nukleotid ersetzt sind oder ein, zwei oder drei Nukleotide an einen oder beiden Enden der Oligonukleotide deletiert sind, oder ein oder zwei Nukleotide im Innern durch ein anderes Nukleotid ersetzt sind, wobei je die spezifische Bindung beibehalten bleibt
Mittel nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden oder die Primer eine Markierung aufweisen
Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung eine radioaktive Markierung, Fluoreszenzmarkierung, Biotinmarkierung, Digoxigeninmarkierung, Peroxidasemarkierung oder durch Alkalische-Phosphatase-nachweisbare-Markierung ist
Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es an eine Festphasenmatrix gebunden vorliegt
Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide durch eine Phosphoryherung, einen Aminolinker oder einen Thiolinker modifiziert vorliegen
Mittel nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, daß die Basen an PNA gebunden vorliegen
8. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß er zumindest eines der Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche aufweist.
9. Festphasenmatrix, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest eine der Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche in einer an die Matrix gebundenen Form aufweist.
10. Verfahren zum spezifischen Nachweis oder zur Amplifikation von bakteriellen extrazellulären Peptidasegenen mit den nachfolgenden Schritten:
Inkontaktbringen der DNA oder der RNA einer zu untersuchenden Probe mit zumindest einem der Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche 1 - 7; und - Nachweis der Hybridisierung der Oligonukleotide mit der RNA oder DNA der Probe, um das Vorliegen von bakteriellen extrazellulären Peptidasegen-DNA- und/oder RNA-Sequenzen aufzuzeigen.
1 1. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide als Primer in PCR- Verfahren oder als Sonden in Hybridisierungs verfahren eingesetzt werden.
12. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß entweder
a) die zu untersuchende DNA in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Kontakt gebracht wird mit den als Primer fungierenden Ohgonukleotiden nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche und im Verlauf der PCR-Amplifikation durch Verlängerung der Primers equenzen ein charakteristisches DNA-Markerfragment entsteht und dieses Fragment nachgewiesen wird; oder b) zumindest eine der Sonden mit der zu untersuchenden DNA oder RNA zur Hybridisierung gebracht wird und das Produkt dieser Hybridisierungsreaktion nachgewiesen wird.
13. Verfahren nach Anspruch 10. 11 oder 12 dadurch gekennzeichnet, daß das Inkontaktbringen unter stringenten Bedingungen erfolgt.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß unter stringenten Reaktionsbedingungen die Hybridisierungstemperatur 5 - 10°C unter dem Oligonukleotidschmelzpunkt liegt.
15. Verfahren nach Anspruch 13 , dadurch gekennzeichnet, daß die stringenten Bedingungen wie folgt definiert sind: PCR: Annealingtemperatur 43 - 62°C Hybridisierimg: 45- 60°C
16. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA oder RNA in isolierter Form eingesetzt wird oder im biologischen Material in für die Hybridisierungsreaktion zugänglicher Form vorliegend eingesetzt wird oder zusammen mit kontaminierenden Materialien vorliegend eingesetzt wird
17. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß a) die zu untersuchende DNA denaturiert wird, um Einzelstränge zu erhalten; b) die als Primer fungierenden Oligonukleotide an die komplementären Einzelstränge der zu untersuchenden DNA gebunden werden; c) die Oligonukleotide mittels einer DNA-Polymerase verlängert werden; d) die Hitze-Denaturierungs-Oligonukleotid-Bindungs- und Verlängerungszyklen wiederholt werden, um eine nachweisbare Menge des PCR- Produkts zu erhalten; und e) das erhaltene PCR-Produkt nachgewiesen wird.
18. Verwendung eines Oligonukleotids nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Amplifikation und zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von bakteriellen Genen für extrazelluläre alkalische Metallopeptidasen, neutrale Metallopeptidasen und Serinpeptidasen.
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