DD300690A5 - Verfahren zur Herstellung eines Derivates des Transmembranproteins Gp41 deshumanen Immundeffizienzvirus 1 (Penv 474-647) in E. Coli - Google Patents

Abstract

Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß das klonierte Fragment des env-Gens des humanen Immundefizienzvirus 1 (HIV 1), das mit dem Gen für das Coatprotein des Phagen fr fusioniert wurde, durch Leserasterverschiebung verändert wird. Das dadurch entstehende rekombinante Gen PENV 474-647 kodiert ein Fusionsprotein aus 2 Aminosäuren fr-Coatprotein und den Aminosäuren 474 bis 647 des env-Präkusors des HIV 1. Den Produzentenstamm des rekombinanten Proteins PENV 474-647 erhält man durch Transformation von E. coli K 802-Zellen mit rekombinanter Plasmid-DNA pFRHIV 49-1. Dieser Produzentenstamm ermöglicht die Herstellung des rekombinanten Proteins PENV 474-647.

Description

Hierzu 1 Seite Zeichnungen Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Proteins PENV 474-647, das ein Derivat des Transme-nbranproteins gp41 des humanen Immundefizienzvirus 1 (HIVI) darstellt.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Epitope des Transmembranproteins gp41 sind auf der Grundlage bakterieller Proteine gewonnen worden: Windheuse, Wood C.Gene, 1988,64,107-119/Ulrich et al. Zeitschrift für klin. Medizin, 1990/Certa et al.EMBO J, 1986,5,3051-3056/Putney et al.Science, 1986,234,1392-1395/Motz et al. AIDS-Forschung, 1988, H1,10-17. Der Nachteil der Fusion mit bakteriellen Proteinen oder Proteinabschnitten ist oft die Reaktion mit den in humanen Seren vorhandenen Antikörpern gegen bakterielle Proteine. Fusionsproteine auf der Grundlage des Coatproteins des Phagen fr verfügen über einige Vorteile gegenüber traditionellen Hybridproteinen auf der Grundlage von bakteriellen Proteinen (Kozlovskaja, T. M., et al. Dokl. Akad. Nauk SSSR, 1986,287, 452-455)

Es ist bibher jedoch nicht geklärt, ob in humanen Seren Antikörper vorhanden sind, die gogen das fr-Coatprotein gerichtet sind.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist die Herstell ing eines rekombinanten Proteine, das immunologische Aktivitäten des Transmembranproteins gp41 dos HIV 1 besitzt.

Darstellung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung sind die Gewinnung eines rekombinanten Proteins, das immunologische Aktivitäten des Transmembranproteins gp41 des HIV 1 besitzt, und die Schaffung eines Produzontenstammes für dieses Protein. Diese Aufgabenstellung wird enindungsgemäß dadurch gelöst, daß im Ergebnis der Konstruktion des rekombinativen Gens PENV 474-647, welches die Synthese des entsprechenden Proteins kodiert, und des Expressionsplasmids pFRHIV ein Produzentenstamm E.coli (pFRHIV 49-1) erhalten wird, der die Produktion des rekombinanten Proteins PENV 474-647 sichert. Das rekombinante Plasmid pFRHIV 49-1 besteht aus folgenden Elementen:

- DNA des Plasmids pFR 7-71, einer Variante des Plasmids pFR 20, welche das Hüllproteingen des Phagen fr besitzt, bei dem im Kodon für die 2. Aminosäure ein unikaler Restriktionsort für Eco RV eingebaut wurde, und die eine Deletion im Gen für die Tetrazyklin-Resistenz besitzt,

- Fragment des HIV 1 - Genoms, kloniort im Plasmid pBH 10, welches dem Abschnitt zwischen den Restriktionsorten BgI \\_im und dem Barn ΗΙοο$2 entspricht, im Hind Ill-Ort (7718) eine Leseraster-Verschiebung besitzt und den Bereich des env-Präkursors von Aminosäure 474 bis 647 (45 C-terminale Aminosäuren des gp 120 und 129 N-terminale Aminosäuren des gp41) kodiert.

Die DNA des rekombinanten Plasmids pFRHIV 49-1 enthält die Gene:

- Gen PENV 474-647, das die Synthese des Endproduktes gewährleistet,

- Gen bla, welches eine Ampizillin-Resistanz verleiht.

Das Gen 474-647 steht unter Kontrolle eines Promotors P,_p(. Das Plaemld pFRHIV 49-1 wird nach Zugabe von Chloramphenlkcl

ins Medium nichtkonjugativ amplifiziert.

Das Wesen der Konstruktion des Plasmids pFRHIV 49-1 besteht darin, daß das im Pl&smid pFRHIV 12-50 eingebaute Fragment

des env-Gens vom HIV 1 durch Leserasterverschiebung verändert wird. Das dadurch entstehende rekombinanto Gen PENV 474-647 kodiert ein Fusionsprotein aus 2 Aminosäuren (r-Coatprotein und den Aminosäuren 474 bis 647 des env-Präkursors Jes

Den Produzentenstamm des rekombinaten Proteins PENV474-647 erhält man durch Transformation von E coil K 802-Zellen nit

rekombinanter Plasmid-DNA pFRHIV 49-1.

Morphologische Merkmale: gram-negative stäbchenförmigo Zellen, Kulturmerkmale: Zellen wachsen auf üblichen Nährmedien, bilden Kolonien mittlerer Größe, Physikobiochemische Merkmale: optimale Kultiverungstemperatur 37⁰C, pH-Optimum 7,0-7,4. Als Kohlenstoffquelle werden Kohlenwasserstoffe, als Stickstoffquelle sowohl Mineralsalze und Aminosäuren eingesetzt. Antibiotika-Resistenz: resistent gegen Ampizillin, bedingt durch das Vorhandensein des Plasmids. Die Anwesenheit von Plasmid-DNA im Zellstamm wird durch Kontrolle der Ampizillin-Resistenz bestätigt, außerdem durch die Gewinnung und Analyse von Plasmid-DNA. Der Zellstamm ist in der Kollektion des Zentralmuseums industrieller Mikroorganismen der UdSSR unter der Nummer WKPM W-5244 deponiert. Ausfuhrungsbeispiel

Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispielnäher dargestellt worden. Die dazugehörige Abbildung zeigt

Fig. 1: Bestimmung der gp41-Aktivität mittels Immunoblotting. Die Realisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in 2 Verfahrensschritten:

1. Konstruktion rekombinanter Plasmid-DNA pFRHIV 49-1

2 μρ des Plasmids pFRHIV 12-50, nach Standardmethoden gewonnen, spaltet man mit 10 Einheiten der Restriktase Hind III in 20μΙ der Lösung A (1OmM Tris-HCI, pH 7,5; 5OmM NaCI; 1OmM MgCI₂) 16 Stunden bei 37⁰C. Die Restriktase inaktiviert man 15 Minuten bei65°C. Die überhängenden Enden dor gespalteten Plasmid-DNA werden in 20μΙ der Lösung B (5OmM Tris-HCI, pH 7,5; 1OmM MgCI₂; 1OmM DTT; 25mM NaCI) durch Zugabe von jo 100Mm dATP, dCTP, dTTP und dGTP sowie 5 Einheiten

DNA-Polymerase aus E. coli (Klenow-Fragment) im Laufe einer Stunde bei Raumtemperatur aufgefüllt. Die DNA rezirkularisiert

man mit Hilfe von 10 Einheiten T₄-DNA-L)gase in 10μΙ der Lösung B bei Zugabe von 1 mM A7P im Laufe von 12 Stunden bei 4⁰C.

Zum Reaktionsgemisch werden ΙΟΟμΙ E.coli RR1-Zollen, die vorher mit 10OmM CaCI₂ behnndelt worden waren

(Endkonzentration 5 χ 10* Zellen/ml), zugegeben, um die rekombinanten Plasmid-DNA zu transformieren.

Die Auswahl der Klone erfolgt mit Hilfe der Restriktionsanalyse der Piasmid-DNA, die im Schnellverfahren isoliert worden war. Das Plasmid mit dem erwarteten Restriktionsspaltmuster erhält die Bezeichnung pFRHIV 49-1.

2.Transformation des erfindungsgemäßen Plasmids in einen Produzentenstamm

Den Produzentenstamm erhält man durch Transformation von E.coli K802 mit dem rekombinanten Plasmid pFRHIV 49-1. Die Zellen werden im M9-Medium mit dem Zusatz von 10g/l Kasaminsäuren, 2g/l Glukose und 0,02 g/l Ampizillin bis zu einer

optischen Dichte von OD₆₆₀ 4-5 kultiviert.

Die Charakterisierung des erfindungsgemäßen rokombinanten Proteins wird wie folgt vorgenommen: Bestimmung der gp41 -Aktivität mittels Immunoblotting Für das Immunoblotting resuspendiert man die Zellen (6mg) in 100μΙ Probenpuffer nach Laemmli, der 2% SDS und

2 % Mercaptoäthanol enthält, und lysiert durch 2minütiges Erhitzen im kochenden Wasserbad. Die erhaltenen Lysate (2-4 mg/ml

Protein) trägt man auf ein Gradientenpolyacrylamidgel (12-23%) auf (Größe 150 χ 150 x 0,75 mm). Die Elektrophorese wird

15 Stunden bei einer Stromstärke von 7mA durchgeführt. Nach der Elektrophorese überträgt man die Proteine auf Nitrozellulose

HAWP (10). Die Filter werden mit dem humanen monoklonalen Antikörper 3D6 in einer Verdünnung von 1:500 in TBS-Puffer

(50mMTris-Hni,pH7,5;150mMNaCI;'0,1%Triton x 100) + 1% BSA15 Stunden bei 20"C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in TDS-Puffer inkubiert man die Filter 2 Stunden bei 2O⁰C mit dem peroxidasemarkierten Konjugat der Antikörper gegen humanes Immunglobulin (Verdünnung 1:16). Die Filter spült man mit TBS-Puffer (3-5X) und entwickelt mit Diaminobenzidin.

Die Zellysate des Produzentenstammes weisen dabei das Auftreten spezifischer Färbungszonen auf, welche einem Protein mit

einem Molekulargewicht von etwa 18,1 kD (Länge etwa 176 Aminosäuren) entsprechen. Die Kontrolly sato von E.coli K 802-Zellen weisen solche Zonen nicht auf.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Proteins PENV 474-647, dadurch gekennzeichnet, daß der mit dem fr-Coatproteingen fusionierte env-GenabschnKt des HIV 1 durch Leserasterverschiebung so verändert wird, daß das expreminrbare Protein aus 2 N-terminalen Aminosäuren des fr-Coatproteins und den Aminosäuren 474 bis 647 des env-Präkursors des HIV 1 besteht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante Plasmid-DNA pFRHIV 49-1, bestehend aus

- der DNAdes Plasmids pFR 7-71, die das Gen bla, das die Ampizillin-Resistenz vermittelt, und das fr-Coatproteingen, unter Kontrolle eines Promotors P_up enthält, und

- dem Fragment des HIV 1 Genoms BH10, welches dem Abschnitt zwischen den Restriktionsorten BgI II7198 und Barn Hl«^ entspricht, Im Hind HI-Ort (7718) eine Leseraster-Verschiebung besitzt und don Bereich des env-Präkursors von Aminosäure 474-647 (45 C-terminale Aminosäuren des gp120 und 1Γ9 N-terminale Aminosäuren des gp41) kodiert,

die Synthese des rekombinanten Proteins PENV 474-647 ermöglicht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Produzentenstamm des PENV 474-647 durch Transformation von E. coli K 802-Zellen mit rekombinanter Plasmid-DNA pFRHIV 49-1 erhält.