DD298424A5 - Verfahren zur gewinnung von alkalischer phosphatase aus kaelberdarm - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von alkalischer Phosphatase aus Kaelberdarm-Mukosa oder -Inhalt. Dabei wird die wasserloesliche Enzymform durch eine waeszrige 2-Phasenverteilung vom Hauptanteil der Fremdproteine und noch vorhandener Zelltruemmer getrennt und das Enzym nach einer Ionenaustausch-Chromatographie an DEAE-Cellulose durch Farbstoffligand-Affinitaetschromatographie gereinigt. Das mit einer hohen Ausbeute gewonnene Enzym besitzt die maximal erreichbare spezifische Aktivitaet und enthaelt keine stoerenden DNA-Endonukleasen und DNA-Nicking Aktivitaeten. Es ist sowohl fuer den Einsatz im Enzymimmunoassay als auch in der Gentechnik geeignet.{alkalische Phosphatase; Kaelberdarm; waeszrige 2-Phasenverteilung; Ionenaustausch-Chromatographie; Farbstoffligand-Affinitaetschromatographie; spezifische Aktivitaet; Enzymimmunoassay; Gentechnik}

Description

Anwendungsgebiete der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm-Mukosa oder -Inhalt. Das dabei gewonnene Enzympräparat eignet sich zur Anwendung in der Gentechnik, in der biochemischen Grundlagenforschung und als Marker für den Enzymimmunoassay in der biochemischen und klinisch-chemischen Analytik.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm wird wegen ihrer hohen spezifischen Aktivität und Stabilität als Marker im Enzymimmunoassay eingesetzt. Neuerdings spielt das Enzym eine wichtige Rolle in der Gentechnik, wobei das Enzym für Sequenzierungs-, Mapping-, und Fingerprint-Analysen benötigt wird. Außerdem wird alkalische Phospatase zur Dephosphorylierung verschiedener Monophosphatester und von Substraten der Proteinkinasen in der Grundlagenforschung eingesetzt.

Die meisten bekannten Verfahren zur Gewinnung des Enzyms aus Kälberdarm sind relativaufwendige Mehrschrittverfahren. Sie beinhalten nach den notwendigen Solubilisierungsschritten fraktionierte Fällungen (P. Portmann, Hoppe-Seyler's Z. Phys.

Chem., 309 [1957] 87-128), Kationaustausch-Chromatographie (P.Portmann, A. Jörg, K. Furrer, H.S.Walker, P. Leuthard,

J. F. Sudan, F. Perriard, J. F. Comment, G. Leva und J. P. Nell, Separatum, Helvetica Chim. Acta, 65 [1982] 2668-2681), Äff inKätschromatographie (M.Landt, S.C.Boltz und L. G. Butler, Biochem., 17 [1978] 915-919; EP-PS 0064378) und Immunosorptionschromatographie (DD-PS 0159993; DD-PS 0246686; EP-PS 0151320). Für die Gewinnung einer in der Gentechnik einsetzbaren alkalischen Phosphatase sind auf Grund der in den biologischen Ausgangsmaterialien vorhandenen störenden Fremdaktivitäten weitere spezielle chromatographische Schritte wie die Gelfiltration notwendig.

Fraktionierte Fällungen mittels Salz oder organischer Lösungsmittel verlangen eine Reihe von Zentrifugationsschritten. Auf Grund der verfügbaren Zentrifugen liegt der Zeitbedarf bei etwa 45 Minuten pro Trennschritt. Außerdem lassen sich Fest/ Flüssig-Trennschritte nicht kontinuierlich gestalten. Fällungen mittels organischer Lösungsmittel wirken denaturierend und stellen zusätzlich besondere Anforderungen an den Brandschutz und belasten das Abwasser.

Die meisten der beschriebenen Affinitätssorbentien sind sehr teuer, bedingen komplizierte chemische Verfahren zu ihrer Herstellung und besitzen oft eine geringe Bindungskapazität. Für die Immunosorptions-Verfahren ist die Herstellung und die Auswahl geeigneter Antikörper und deren kovalente Kopplung an das Trägermaterial notwendig. Immunoadsorptionsgele zeigen auf Grund der chemischen Natur des Liganden eine hohe Instabilität und eine deutliche Abnahme der Bindungskapazität bei mehrfachem Gebrauch. Die Desorption des Antikörper-Enzymkomplexes führt oft zur partiellen Inaktivierung der alkalischen Phosphatase.

Trotz des beschriebenen großen Aufwandes und der damit verbundenen hohen Kosten werden diese Verfahren mangels geeigneter Alternativlösungen zur Herstellung kommerzieller Enzympräparate angewendet (DD-PS 0159993; DD-PS 0246686).

Der Einsatz von wäßrigen 2-Phasensystemen zur Proteinanreicherung ist seit einiger Zeit bekannt. Von der Vielzahl möglicher 2-Phasensysteme haben Polyethylenglycol (PEG)/Dextran- und PEG/Salz-Systeme die größte Bedeutung erlangt. Allerdings kann nicht in jedem Fall, auch bei Optimierung aller Verteilungsparameter, eine gewünschte Phasenverteilung der Proteine erreicht werden (H. Walther, D. E. Brooks und D. Fisher (Eds.), Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems, Theory, Methods, Uses and Application in Biotechnology, [1985], Academic Press, Orlando).

Etwa seit 1972 werden verstärkt trägerimmobilisierte Textilfarbstoffe zur chromatographischen Anreicherung von Proteinen eingesetzt. Dabei wurden auch trägerfixierte Triazinfarbstoffe der allgemeinen Struktur

-N-ft

Z = reaktive Gruppe

R = sulfonierte, aromatische Ringe

zur Reinigung der alkalischen Phosphatase benutzt. Ein darauf basierendes Verfahren zur Gewinnung des Enzyms aus Kälberdarm brachte gegenüber den bereits erwähnten Lösungen bezüglich des Zeitaufwandes und der Kosten keine wesentlichen Verbesserungen (J. Kirchberger und G. Kopperschläger, Prop. Biochem., 12 [1982] 29-47 und J. Kirchberger, Dissertation zur Promotion A, 1983). Der derzeitige Erkenntnisstand auf dem Gebiet der Farbstoffiigand-Affinitätschromatographie erlaubt jedoch keine allgemeingültigen Voraussagen über die Eignung eines Farbstoffes als Ligand zur selektiven Bindung der zu gewinnenden Proteine. Deshalb müssen aus der Vielzahl der von der chemischen Industrie angebotenen Textilfarbstoffe die für den speziellen Zweck geeigneten Farbstoff-Liganden durch Screening-Methoden ausgewählt werden.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung Ist es, alkalische Phosphatase mit einer hohen spezifischen Aktivität, frei von DNA-Endonukleasen und DNA-Nicking-Aktivitäten, in großen Mengen und mit geringem Zeit- und Kostenaufwand aus Kläberdarm-Mukosa oder -Inhalt zu gewinnen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung hat die Aufgabe, für die Gewinnung alkalischer Phosphatase aus Kälber-Mukosa oder -Inhalt ein möglichst einfaches, schnelles und kostengünstiges Verfahren hoher Ausbeute zu entwickeln, wobei das dabei gewonnene Enzym eine hohe spezifische Aktivität, frei von Fremdaktivitäten, besitzt.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß aus dem Butanolextrakt von Kälberdarm-Mukosa oder -Inhalt noch vorhandene Zelltrümmer und der Hauptanteil der Fremdproteine durch eine wäßrige 2-Phasenverteilung entfernt, die PEG-haitige Oberphase einer lonenaustautsch-Chromatoyraphie an DEAE-Cellulose unterworfen und das Enzym an einem trägerimmobilisierten Farbstoff-Liganden adsorbiert sowie unter Einsatz von Phosphat spezifisch desorbiert wird. Überraschenderweise ermöglicht das erfindungsgemrße 2-Phasensystem, bestellend aus 8-10% (w/w) PEG 4000 bzw. PEG 6000,0,5-2% (w/w) Dextran (M, = 30000-70000), Puffer (vorzugsweise 1OmM Tris/HCI, pH 7,5,2 mM MgCI₂) und bis zu 75% (w/w) Butanolextrakt (50001E bzw. 1 g Protein pro 100g System), die Entfernung partikulärer Zellbestandteile und eines großen Teils der Fremdproteine in einem Schritt ohne Zentrifugation. Allerdings kann durch den Einsatz geringer Zentrifugalkräfte (3000xg) die Phasentrennung in einer Minute erfolgen. Günstig ist auch der Einsatz von Flüssig/Flüssig-Separatoren, er erlaubt eine kontinuierliche Prozeßgestaltung. Das führt zu einer bemerkenswerten Zeiteinsparung und ermöglicht die Gewinnung des Enzyms mit hoher Ausbeute.

Wäßrige 2-Phasensysteme sind generell durch eine hohe Kapazität gekennzeichnet. Durch das hier eingesetzte System können beispielsweiseunter Verbrauch von 200g PEG 4000 und 10g Dextran M70 1000000IE bzw. 10g Protein aufgearbeitet werden. In der Literatur publizierte Kostenanalysen zeigen, daß der Einsatz von wäßrigen 2-Phasensystemen zur Enzymextraktion als erster, Schritt gegenüber Fest/Flüssig-Separationen in jedem Fall kostengünstiger ist.

Die PEG-haltige Oberphase des 2-Phasensystems wird nach einer Verdünnung mit destilliertem Wasser (mindestens im Verhältnis 1:3) unmittelbar mit der DEAE-Cellulose in Puffer, vorzugsweise 1OmM Tris/HCI, pH8,0,2 mM MgCI₂, gerührt. Die Bindung des Enzyms an DEAE-Cellulose wird durch in der Lösung enthaltenes PEG nicht beeinflußt, so daß Dialyse-Schritte entfallen und die lonenaustausch-Chromatographie im Batch-Verfahren bei erneuter Zeiteinsparung durchgeführt werden kann. Nach der Entfernung des bei der lonenaustausch-Chromatographie nicht gebundenen Proteins durch Waschen der DEAE-Cellulose mit Puffer, vorzugsweise 1OmM Tris/HCI, pH8,0,2 mM MgCI₂, erfolgt die Desorption des Enzyms durch Erhöhung der lonenstärke, vorzugsweise 5OmM NaCI in 1OmM Tris/HCI, pH 8,0,2mM MgCI₂.

Die Adsorption des Enzyms erfolgt danach an einem trägerimmobilisierten Farbstoff-Liganden, wobei der Farbstoff-Ligand kovalent an wasserunlösliche, hydrophile Trägermaterialien, vorzugsweise Sepharose, gekoppelt wird. Aus einer Vielzahl (41) getesteter Farbstoffe wurden Liganden der allgemeinen Struktur

i-HN ψ tyti MH-i—R

Z = reaktive Gruppe R = sulfonierte, aromatische Ringe

davon insbesondere Reactive Blue 171 (International Colour Index, 1975), als besonders geeignet ermittelt. Überraschenderweise konnten die bisher für die Af finitätschromatographie der alkalischen Phosphatase eingesetzten Farbstoffe die mit dem erfindungsgemäß eingesetzten Liganden erzielten Parameter (Bindungskapazität, Selektivität) nicht erreichen. Reactive Blue 171 -Sepharose läßt sich ohne größeren präparativen Aufwand kostengünstig herstellen, ist trotz häufigen Gebrauchs über Jahre stabil, läßt sich einfach regenerieren und zeigt keine Abnahme der Bindungskapazität. Das Waschen dor mit alkalischer Phosphatase beladenen Reactive Blue 171-Sepharose zur Entfernung eines Teils des bei der Farbstoffligand-Affinitätschromatographie gebundenen Fremdproteins durch Erhöhung der lonenstärke (vorzugsweise

7OmM NaCI) des Chromatcgraphio-Puffers (vorzugsweise 1OmM Tris/HCI, pH7,5,2mM MgCI₂) erhöht die spezifische Aktivitätdes Enzyms wesentlich. Der Einsatz von Kaliumphosphat (vorzugsweise 2-SmM in 1OmM Tris/HCI, pH7,5,2 mM MgCI₂) erlaubtdie kostengünstige aber spezifische Elution des Enzyms mit hoher Ausbeute und spezifischer Aktivität.

Die Aufbewahrung des gereinigten Enzyms erfolgt beispielsweise in 30 mM Triethanolamin/HCI, pH 7,5,3 M NaCI, 1mM MgCI₂,

0,1 mM ZnCI₂ oder in 85% gesättigter Amoniumsulfat-Lösung bei 4⁰C. Die Gesamtausbeute des Verfahrens liegt deutlich überden in der Literatur angegebenen Ausbeuten von 40%. Die spezifische Aktivität der gewonnenen alkalischen Phosphataseentspricht der maximal erreichbaren.

(Ms erfindungsgemäße Verfahren kann für die Gewinnung der alkalischen Phosphatase aus Kälberdarm-Mukosa aber auch-lihalt eingesetzt werden. Die Anwendung des Verfahrens ist ohne aufwendige Prozeßoptimierung auch im technologischen

Maßstab möglich. Überraschenderweise lassen sich im Anwendungsrahmen im Enzympräparat keine DNA-Endonukleasen und DrVA-Nicking-Aktivitäten nachweisen. Die in der Literatur beschriebenen zusätzlichen speziellen Verfahrensschritte zur Herstellung eines solchen Präparates können deshalb eingespart werden. Die erfindungsgemäß gewonnene alkalische Phosphatase eignet sich auf Grund der besonders hohen Reinheit vor allem zur Anwendung in der Gentechnik, in der biochemischen Grundlagenforschung sowie als Marker für den Enzymimmunoassay in der

biochemischen und klinisch-chemischen Analytik.

Ausführungsbeispiel Verfahren zur Gewinnung der alkalischen Phosphatase aus Kälberdarm-Mukosa Aus Kälberdünndarm (Duodenum oder oberes Jejunum) wird die Mukosa herausgeschabt und nach dem Homogenisieren in

1OmM Tris/HCI, pH7,5,2 mM MgCI₂ (Puffer A) mit n-Butanol (Endkonzentration 35Vol.-%) 14h bei 4°C gerührt. Die wäßrige

Phase des Butanolextraktes wird unter Rühren bei 4°C mit festem PEG 4000 und entsprechenden Anteilen aus Stammlösungen

vor Dextran M70 und 20OmM Tris/HCI, pH7,5,4OmM MgCI₂ versetzt und 30 Minuten gerührt. Die Endzusammensetzung des2-Phasensystems beträgt 10Gew.-% PEG 4000,0,5Gew.-% Dextran M70,75Gew.-%Butanolextrakt (10g Protein/kg System) und1OmM Tris/HCI, pH7,5,2 mM MgCI₂. Die Phasentrennung erfolgt durch Zentrifugation bei 3000xg innerhalb von 5 Minuten.

Die PEG-haltige Oberphase wird 1:3 mit dest. Wasser verdünnt und mit DEAE-Cellulose, die mit 1OmM Tris/HCI, pH8,0,2mM MgCI₂ (Puffer B) äquilibriert wurde, gerührt. Für 100000IE benötigt man 900g (Feuchtgewicht) DEAE-Cellulose. Nach Auswaschen des nichtgebundenen Proteins mit Puffer B wird die alkalische Phosphatase durch Waschen der DEAE-Cellulose mit Puffer B, der zusätzlich 5OmM NaCI enthält, eluiert. Nach Dialyse gegen Puffer A wird die Enzymlösung mit Reactive Blue 171 -Sepharose 4B versetzt und nichtgebundenes Protein

mit Puffer A ausgewaschen. Danach wird die Reactive Blue 171-Sepharose 4B mit Puffer A, der zusätzlich 7OmM NaCI enthält,gewaschen, bis kein Protein im Eluat mehr nachweisbar ist (E₂₈o„m < 0,02). Nach Entfernung des NaCI durch Waschen mit

Puffer A wird das Enzym mittels 5mM Kaliumphosphat in Puffer A eluiert und mittels Dialyse gegen eine Lösung aus 3OmM Triethanolamin, 3M NaCI, 1 mM MgCI₂,0,1 mM ZnCI₂ oder durch eine Ammoniumsulfatfällung (85% Sättigung) bei 4°C

stabilisiert.

Das Enzym besitzt eine spezifische Aktivität von 2200IE/mg (25°C, p-Nitrophenylphosphat, 1 M Diethanolamin, 1 mM MgCI₂,

pH9,8). Die Gesamtausbeute des Verfahrens beträgt 60%. Das Enzympräparat enthält keine störenden DNA-Endonukleasen und

DNA-Nicking-Aktivitäten. Der Gehalt an Phosphodiesterase I (EC 3.1.4.1.) ist kleiner 0,01 %. Eine Übersicht der in den einzelnen Präparationsschritten erzielten Ergebnisse ist in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1 Verfahrensschema zur Gewinnung alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm

Reinigungsschritt	spezifische	Ausbeute	Anreicherung
	Aktivität
	(IE/mg)	(%)	(n-fach)
Rutanolextrakt	5	100	1
2-Phasenverteilung	10	88	2
DEAE-Cellulose	100	68	20
Blue171-Sepharose	2200	60	440

Claims (10)

1. Verfahren zur Gewinnung von alkalischer Phosphataso aus Kälberdarm-Mukosa oder -Inhalt, dadurch gekennzeichnet, daß aus deren ßutanolextrakt noch vorhandene Zelltrümmer und der Hauptanteil der Fremdproteine durch wäßrige 2-Phasenverteilung entfernt, die PEG-haltige Oberphase einer lonenaustausch-Chromatographie an DEAE-Cellulose unterworfen und das Enzym an einem trägerämmobilisierten Farbstoff-Liganden adsorbiert und unter Einsatz von Phosphat spezifisch desorbiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei der wäßrigen 2-Phasenverteilung das 2-Phasensystem aus PEG 4000 bzw. PEG 6000, vorzugsweise 8-10%; w/w, Dextran M_r = 30000-70000, vorzugsweise 0,5-2%; w/w, Puffer, vorzugsweise 1OmM Tris/HCI, pH 7,5, 2mM MgCI₂, und bis zu 75%; w/w, Butanolextrakt(5000IE bzw. 1g Protein pro 100g System) besteht.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Abtrennen der Oberphase des 2-Phasensystems kontinuierlich durch eine Zonalzentrifugation oder einen Flüssig/ Flüssig-Separator erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für die lonenaustausch-Chromatographie die PEG-haltige Oberphase des 2-Phasensystems ohne Dialyse nach einer Verdünnung mit destilliertem Wasser mindestens im Verhältnis 1:3 unmittelbar mit der DEAE-Cellulose in Puffer, vorzugsweise 1OmM Tris/HCI, pH 8,0,2 mM MgCI₂, gerührt wird.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß nach dar Entfernung des bei der lonenaustausch-Chromatographie nicht gebundenen Proteins durch Waschen der DEAE-Cellulose mit Puffer, vorzugsweise 1OmM Tris/HCI, pH8,0,2 mM MgCI₂, die Desorption des Enzyms durch Erhöhung der lonenstärke, vorzugsweise 5OmM NaCI in 1OmM Tris/HCI, pH 8,0, 2mM MgCI₂ erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Farbstoffligand-Affinitätschromatographie Liganden der allgemeinen Formel:

OH NH₁

^Vn=n^YVN=n

Z = reaktive Gruppe

R = sulfonierte, aromatische Ringe

vorzugsweise der Ligand Reaktive Blue 171 (International Colour Index 1975) eingesetzt werden.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff-Ligand kovalent an wasserunlösliche, hydrophile Trägermaterialien, vorzugsweise Sepharose, gekoppelt wird.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1,6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil des bei der Farbstoffligand-Affinitätschromatographie gebundenen Fremdproteins durch Erhöhung der lonenstärke, vorzugsweise 7OmM NaCI, des Chromatographie-Puffers, vorzugsweise 1OmM Tris/HCI, pH 7,5,2 mM MgCI₂, entfernt wird.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym spezifisch mit Kaliumphosphat, vorzugsweise 2-5mM in 1OmM Tris/HCI, pH7,5,2mM MgCI₂, eluiert wird.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das gereinigte Enzym in 30mM Triethanolamin/HCI, pH7,5,3M NaCI, 1 mM MgCI₂,0,1 M ZnCI₂ oder in 85% gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung bei 4⁰C aufbewahrt wird.