DD293606A5 - Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen clavibacter michiganensis subspecies michiganensis (smith) davis, gillaspie, vidaver u. harris - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikoerpern gegen den Erreger der Bakteriellen Tomatenwelke Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Ziel der Erfindung ist die Herstellung von monoklonalen Antikoerpern definierter Spezifitaet und hoher Bindungsfaehigkeit gegen Bestandteile bzw. Metaboliten dieses Erregers. Das erfindungsgemaesze Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dasz man zunaechst in an sich bekannter Weise Milzzellen von Inzuchtmaeusen, die mit Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis immunisiert wurden, mit Myelomzellen, z. B. P3 X63-Ag8.653, in der Zellkultur fusioniert, die positiven Antikoerper-produzierenden Hybridzellklone mit geeigneten Methoden, wie z. B. Enzymimmunoassays oder Immunfluoreszenz-Technik, selektiert, die Spezifitaet der Antikoerper bestimmt, die spezifischen und zur Entwicklung von Testsystemen zum Nachweis des Erregers bzw. dessen Metaboliten in biologischen Probematerialien geeigneten Hybridzellklone auswaehlt und erfindungsgemaesz zur Produktion der monoklonalen Antikoerper durch Kultivierung und nach Transplantation auf histokompatible Maeuse in der Aszitesform einsetzt. Die spezifischen und geeigneten Hybridzellklone IfP-R17-HD11 und IfP-R17-CD6, die monoklonale Antikoerper vom Isotyp IgGl bzw. IgG3 produzieren, wurden im Zentralinstitut fuer Molekularbiologie der AdW der DDR unter den Nummern ZIM-0451 und ZIM-0452 am 27. 12. 1988 hinterlegt. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Diagnose von bakteriellen Pflanzenkrankheiten.{monoklonale Antikoerper; Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis; Zellkultur; Hybridzellklone; Spezifitaet; Enzymimmunoassays; Nachweis des Erregers; biologische Probematerialien; Antikoerperproduktion; Hinterlegung; Diagnose; Pflanzenkrankheiten}

Description

Die durch die Erfindung hergestellten mAk zeichnen sich duich die spezifische Erkennung von Cm in biologischen Proben aus,

ohne mit anderen Bakterien außerhalb der Gattung Clavibacter zu reagieren. Der mAk-CM3 ist spezifisch gegen

Oberflächenantigene von Cm gerichtet, während alle übrigen mAk auch mit Stoffwechselmetaboliten von Cm reagieren. Die Antikörper CM3 und CM 5 zeichnen sich weiterhin durch gute Adsorptionseigenschaften an Plastmaterial aus, wodurch Voraussetzungen für den Aufbau von spezifischen Enzymimmunoassay^ geschaffen sind. Diese beiden mAk sind dadurch

gekennzeichnet, daß sie sich mit einem Marker (z.B. alkalischer Phosphatase) koppeln lassen und dabei ihre volle immunologische Reaktivität behalten.

Die Erfindung ermöglicht nus diesem Grunde die Entwicklung von effektiven Testbsstecks zum Nachweis von Cm bzw. dessen Metaboliten in biologischen Materialien. Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden. Ausführungsbelsplel

1. Immunisation von Mäusen der Inzuchtlinie A/J

Zur Immunisierung der Mäuse wurde ein optimales Injektionsschema erarbeitet. Vier bis sechs Wochen alte weibliche Mäuse

wurden mit einer Suspension von Cm (10'° Keime/ml) ohne Verwendung von Adjuvans im wöchentlichen Abstand i.p.

immunisiert. Es erfolgten insgesamt 4 Immunisationen mit je 0,5ml.

Am vierten, dritten und zweiten Tag vor Fusionsbeginn wurde eine intraperitoneale bzw. zuletzt intravenöse Injektion von

jeweils 0,1 ml Bakteriensuspension (Keimzahl 10¹VmI) verabreicht.

Die Zellfusion, Kultivierung, Klonifarung etc. erfolgte nach Standardmethoden entspr. KÖHLER, G. und MILSTEIN, C, Nature

256 (1975), 495-497 und GODING, J. W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practics, Academic Press, London (1983).

2. Der Nachweis Antikörper-produzierender Hybridzellen erfolgte mit einem indirekten Enzymimmunoassay (i-ELISA). Dabei wurden entweder eins Bakteriensuspension von 10°Cm/ml direkt durch Antrocknen bei 80°C oder zuerst polygonale Immunglobuline aus Ziegen- oder Kaninchenantiseren und danach Bakteriensuspension bzw. Cm-haltiger Pflanzensaft aus infizierten Tomatenpflanzen an Mikrotestplatton gebunden, anschließend erfolgte die Inkubation mit Überständen der Hybridzellklone und enzymmarkierten Anti-Maus-lgG.

3. Der Nachweis der Spezifität der mAk erfolgte durch einen indirekten Enzymimmunoassay unter Verwendung von verschiedenen Spezies bzw. Subspezies der Gattung Clavibacter sowie von Bakterien aus 10 anderen Arten und Gattungen. Entsprechend dieses Tests reagierten im i-ELISA bis auf mAk CM 6 alle anderen Antikörper nicht mit Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, jedoch spezifisch mit Cm. Keine Reaktion erfolgte mit der Unterart C, michiganensis subsp. nebraskensis sowie anderen Bakte.ienarten außerhalb der Gattrng Clavibacter. Der mAkCM7 zeigte eine Kreuzreaktion mit C. tritici. Die Prüfung der genannten mAk im Immunfluoi es/enztest erbrachte mit dsm i-ELISA übereinstimmende Reaktionsmuster.

4. Herstellung der Antikörper

Die ausgewählten Hybridzollklone wurden zur Herstellung der mAk nach den üblichen Techniken (KENNET, R. H., McKEARN, T. J. und BECHTOL, K. B., Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A new dimension in biological analysis, New York u. London 1981), eingesetzt.

5. Markierung mit alkalischer Phosphatase

Die gemäß gebräuchlicher Techniken gereinigten mAk CM1 bis CM 7 wurden nach der bekannten Methode von CLARK, M. F. und ADAMS, A. N. (J. gen. Virol. 34 [1977], 475-483) mit alkalischer Phosphatase konjugiert.

6. Die Eignung der durch die oben genannten Hybridzollklone produzierten mAk zum Aufbau von ELISA-Systemen für den Nachweis von Cm bzw. dessen Metaboliten in Probematerialien wurde überprüft. Danach eignen sich die gereinigten mAk CM 3 und CM 5 zur Adsorption an Mikrotestplatten aus Polystyrol als feste Phase. Die Antikörper konnten in einer Konzentration von 5 Mg/ml eingesetzt werden. Nach Markierung mit alkalischer Phosphatase zeigten diese beiden mAk eine unveränderte immunologische Aktivität. Die Stammkonjugate konnten im Falle von CM 3 in einer Verdünnung von 1:1000 und beim mAk CM 5 in einer Verdünnung von 1:500 im Doppelantikörper-Sandwich-ELISA eingesetzt werden. Immunologische Untersuchungen ergaben, daß die mAk CM 3 bzw. CM 5 gegen unterschiedliche Antigendeterminanten gerichtet sind. Danach reagiert der mAk CM3 nicht mit bakterienfreien Filtraten einer Cm-Suspension bzw. nicht mit einem nach KRÄMER, R., Zentralbl. Mikrobiol. 141 (1986), 327-335, gereinigten Toxinpräparat aus Cm, das ein wasserlösliches, hochmolekulares Glykopeptid darstellt und bei Tomatenschnittlingen Welkesymptome verursacht. In immunelektronenmikroskopischen Untersuchungen konnte jedoch nachgewiesen werden, daß CM 3 spezifisch an Oberflächenstrukturen der Bakterienzellwand von Cm bindet.

Alle anderen mAk, insbesondere mAk CM 5, reagieren mit bakterienfreien Filtraten bzw. mit dem Toxinpräparat aus Cm. Wird das Testsystem zum Nachweis des Erregers in Testproben so gestaltet, daß nur Cm-Oberflächenantigene erfaßt werden, dann kann mit dem mAk CM 3 als Feste-Phase-Antikörper beschichtet und mit alkalische Phosphatase markierten CM 3-Antikörpern in der löslichen Phase inkubiert werden. Dabei ist es möglich, die Inkubation von Testmaterial und Enzymkonjugat in einem Schritt durchzuführen.

Andererseits kann das Testsystem so aufgebaut werden, daß Metaboliten, wie z. B. das Welketoxin von Cm, in infizierten Tomatenpflanzen erfaßt werden. Hierfür kann beispielsweise die Mikrotestplatte mit dem mAk CM 5 beschichtet und im DAS-ELISA mit einem polyklonalen IgG-Enzym-Konjugat aus Ziegenantiserum im zweiten Schritt inkubiert werden.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung von spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen Bestandteile bzw. Metaboliten des Erregers der Bakteriellen Tomatenwelke, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cm), durch Immunisierung von Inzuchtmäusen mit Cm, Fusion ihrer Milzzellen mit Myelomz&llen, Selektion von Cm-reaktiven Hybridzellklonen, Auswahl der spezifischen und zum Aufbau von Testsystemen zum Nachweis des Erregers bzw. dessen Metaboliten in biologischen Probematerialien geeigneten Antikörper-produzierenden Zellklone und ihre Kultivierung bzw. Transplantation auf Mäuse in der Aszitesform, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung bzw. Transplantation die Hybridzellklone IfP-R 17-HD11 (ZIM-Liste 1988 = ZIM-0451) bzw. IfP-R 17-CD6 (ZIM-Liste 1988 = ZIM-0542) eingesetzt werden.

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen das pflanzenpathogene Bakterium Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (im folgenden mit Cm abgekürzt). Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Diagnose der Bakteriellen Tomatenwelke im Rahmen von Gewächshaus- und Feldprüfungen (einschließlich Erregernachweis in flüssigen Nährmedien von NFT-Anlagen), die Züchtung und Selektion von resistenten Pflanzensorten sowie der Nachweis im Saatgut.

   Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

   Die bakteriell bedingte Tomatenwelke, die durch Cm verursacht wird, kann bei Tomaten zu schweren Verlusten führen. Diese Gefahr besteht insbesondere dann, wenn Produktionsmethoden wie die Nährfilmtechnik eingesetzt werden. Wünschenswert wäre neben einer sicheren Diagnose in Tomatenpflanzen der Erregernachweis im Nährmedium sowie in kontaminiertem Saatgut. Für den Nachweis von Cm in Tomatensamen wurde der Immunfluoreszenz-Test (IFT) in Kombination mit einem Biotest vorgeschlagen (VAN VAERENBERGH, J. P.C. und CHAUVEAU, J.F., Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 17 [1987], 131-138). Über eine Identifizierung von Cm anhand seiner Stoffwechselmetaboliten, bei der polygonale Antiseren verwendet wurden, berichteten BRAGARD u.a. (Meded, Fac. Landbouwwet. Rijksuniv. Gent 52/3b (1987], 1081-1087). Diese polyklonalen Antiseren zeigten im enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) starke Kreuzreaktionen mit verschiedenen anderen Clavibacterarten, die auch mit anderen serologischen Techniken gefunden werden können (RILEY, I.T., Intern. J. Syst. Bacteriology 35 [1987], 153-159). Insgesamt wenig aussichtsreich erscheint eine Differenzierung auf dem Subspeziesniveau unter Verwendung von polyklonalen Antiseren zu sein. Eine Lösung des Problems könnte die Herstellung geeigneter monoklonaler Antikörper (im weiteren mit mAk abgekürzt) darstellen. Über die Herstellung von mAk gegen Clavibacterarten wurde in der Literatur bisher nur im Falle von Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus berichtet (DE BOER, S. H. und WIECZOREK, A., Phytopathology 74 [1984], 1431-1434 sowie MAGEE, W. E., BECK, C. F. und RISTOW, S. S., Hybridoma 5 [1986], 231-235). Über Produktion und Einsatz von mAk gegen Cm zum Erregernachweis wurde bisher nicht berichtet.

   Ziel der Erfindung

   Die Erfindung hat das Ziel, mAk mit hoher Bir.dungsfähigkeit und verbesserter Spezifität in guten Ausbeuten herzustellen. Diese mAk sollen für den Aufbau eines Testsystems zum Nachweis von Cm bzw. dessen Bestandteile, wie extrazelluläre Proteine, Kohlenhydrate, Toxine u.a., geeignet sein.

   Darlegung des Wesens der Erfindung

   Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise zunächst Milzzellen von Mäusen, z. B. der Mausinzuc.Ulinien BALB/c oder A/J, die zuvor mit Rohsuspensionen der Bakterienart Clavibacter michiganunsis subsp. michiganensis Stamm 3.1.4. immunisiert wurden, mit P3 X63-Ag 8.653 oder anderen Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die fusionierten Zellen in Gewebekulturplatten aussät, mit Hilfe eines Selektionsmediums die Hybridzellen selektiert, mit geeigneten Enzymimmunoassays jene Hybridomzellklone nachweist, die Antikörper gegen Cm bzw. dessen Bestandteile produzierer., \e spezifisch reagierenden Hybridzellen auswählt, weitervermehrt, Moniert und ggf. nach Lagerung in flüssigem Stickstoff erfindungsgemäß zur Produktion der mAk durch Kultivierung oder nach Transplantation auf histokompatible Mäuse in der Aszitesform einsetzt.

   Die für die erfindungsgemäße Antikörperproduktion eingesetzten Hybridzellklone wurden im Zentralinstitut für Molekularbiologie der AdW der DDR unter folgenden Nummern hinterlegt (Datum der Hinterlegung: 27.12.1988):

   ZIM-0451: IfP-R 17-HD11 produziert mAk CM5 (IgG 1)
   ZIM-0452: IfP-R 17-CD6 produziert mAk CM3 (IgG3)
   ZIM-0453: IfP-R 17-HF7 produziert mAk CM6 (IgM)
   ZIM-0454. fP-R 17-BH7 produziert mAk CM2 (IgM)
   ZIM-0455: IfP-R 17-HG8 produziert mAk CM 7 (IgM)
   ZIM-0456:lfP-R17-BF11 produziert mAk CM1 (IgM)
   ZIM-0457:lfP-R17-HC6 produziert mAk CM4 (IgM)