DD292928A5 - Verfahren zur herstellung des rekombinanten proteins frcp-pres2+adw das eine fusion aus coatprotein des phagen fr und dem pres2-bereich des hepatitis b-virus, subtyp adw, darstellt - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Proteins frCP-preS2/adw, das eine Fusion aus dem Coatprotein des Phagen fr und dem preS2-Bereich des Hepatitis B-Virus, Subtyp adw, darstellt. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dasz das Fragment des S-Gens des Hepatitis B-Virus (HBV), Subtyp adw, das die Aminosaeuren 4-55 der preS2-Region und 9 N-terminale Aminosaeuren des HBsAg kodiert, in das Kodon fuer die 2. Aminosaeure des Coatproteins vom Phagen fr unter Bildung des rekombinanten Gens frCP-preS2/adw eingebaut wird. Den Produzentenstamm des rekombinanten Proteins frCP-preS2/adw erhaelt man durch Transformation von E. coli K802-Zellen mit rekombinanter Plasmid-DNA pFRd58. Dieser Produzentenstamm ermoeglicht die Herstellung des rekombinanten Proteins frCP-preS2/adw.{Kapsid; Coatprotein; Phage fr; Hepatitis B-Virus; preS2-Region; Epitop; rekombinante DNA; Gentechnik; Escherichia coli; Virusdiagnostik; Vakzine}

Description

Hierzu 1 Seite Zeichnung

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das rekombinante Protein frCP-preS2/adw, das eine Fusion aus dem Coatprotein des Phagen fr und dem preS2-Bereich des Hepatitis B-Virus, Subtyp adw, darstellt.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die preS-Region des Hepatitis B-Virus hat eine große Bedeutung bei der Induktion der Immunantwort:

Neurath, A. R., Kent, S. B. H.: In Advances in virus research (ed. K. Maramorosh et al.) 1988, Vol. 34, p. 65, Academic press, Orlando, Florida.

Bei der Entwicklung alternativer Diagnostika und Vakzinen mit Hilfe gentechnisch hergestellter Proteine oder Strukturen muß deshalb unter anderem die preS2-Region des HBV einschließen.

Fusionsproteine auf der Grundlage des Coatproteins des Phagen fr verfügen über eine Reihe von Vorteilen gegenüber traditionellen Hybridproteinen auf der Grundlage von ß-Galaktosidase, ß-Laktamase, Chloramphenikolazetyltransferase usw.

(Kozlovskaja,T.M.,etal. Dokl.Akad.NaukSSSR, 1986,287,452-455).

Die Expression von Fusionsproteinen aus Coatprotein des Phagen fr und Fremdantigendeterminanten kann zur Bildung Kapsidähnlicher Strukturen in E.coli führen, die sich in Morphologie und Durchmesser nicht von nativen Kapsiden unterscheiden (Kozlovskaja, T.M., et al. Molek. Biol., 1988,22,731-740).

Selbst bei fehlender Selbstorganisation zeichnen sich das Coatprotein und seine Derivate durch eine hohe Immunogenität aus.

Das Vorhandensein von Sei en, die gegen verschiedene Formen des Coatproteins gerichtet sind, bieten gute Möglichkeiten für die Reinigung von fr-Coatprotein-Fusionen.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist die Herstellung eines rekombinanten Proteins, das immunologische Aktivitäten des fr-Coatproteins •und des preS2 des HBV, Subtyp adw, besitzt.

Darstellung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist die Gewinnung eines rekombinanten Proteins, das die immunologischen Aktivitäten von fr-Coatprotein und preS2 des HBV, Subtyp adw, besitzt, und die Schaffung eines Produzentenstammes für dieses Protein. Diese Aufgabenstellung wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß im Ergebnis der Konstruktion des rekombinanten Gens ffCP-p ?S2/adw, welches die Synthese des entsprechenden Proteins kodiert, und des Expressionsplasmids pFRd58 ein Produzentenstamm E.coli (pFRd58) erhalten wird, der die Produktion des rekombinanten Proteins frCP-preS2/adw sichert.

Das rekombinante Plasmid pFRd58, dessen Konstruktionsschema in Fig. 1 dargestellt ist, besteht aus folgenden Elementen:

- DNA des Plasmids pFR 7-71, einer Variante des Plasmids pFR20 welches das vollständige Hüllproteingen des Phagen fr besitzt, bei dem im Kodon für die 2. Aminosäure ein unikaler Restriktionsort für Asu Il eingebaut wurde, und die eine Deletion im Gen für die Tetrazyklin-Resistenz besitzt, Länge 5279Bp

- Fragment des HBV-Genoms, Subtyp adw, Moniert im Plasmid pAE 10, welches dem Abschnitt zwischen den Restriktionsorten Eco Rl₀ und Eco 1301,so entspricht und den Bereich des preS2 von Aminosäure 4 bis 55 sowie 9 N-terminale Aminosäuren des

HBsAg kodiert (Länge 180Bp)

Die Größe des Plasmids beträgt 5459Bp

Die DNA des rekombinanten Plasmids pFRd 58 enthält die Gene:

- Gen frCP-preS2/adw, das die Synthese des Endprodukts gewährleistet,

- Gen bla, welches eine Ampizillin-Resistenz verleiht.

Das Gen frCP-preS2/adw steht unter Kontrolle eines Promotors P,_lp. Das Plasmid pFRd 58 wird nach Zugabe von Chloramphenikol ins Medium nicht-konjugativ amplifiziert. Das Wesen der Konstruktion des Plasmids pFRd58 besteht darin, daß das 180Bp lange Fragment des S-Gens vom HBV (Subtyp

adw), das die Aminosäuren 4-55 des preS2 und 9 N-terminale Aminosäuren des HBsAg kodiert, in das Kodon für die

2. Aminosäure des Coatproteins des Phagen fr unter Bildung des rekombinanten Gens frCP-preS2/adw eingebaut wird.

Den Produzentenstamm des rekombinanten Proteins frCP-preS2/adw erhält man durch Transformation von E. coli K802-Zellen

mit rekombinantsr Plasmid-DNA pFRd 58.

Morphologische Merkmale: gram-negative stäbchenförmige Zellen, Kulturmerkmale: Zellen wachsen auf übliche Nährmedien, bilden Kolonien mittlerer Größe, Physiko-biochemische Merkmale: optimale Kultivierungstemperatur 37⁰C, p-Optimum 7,0-7,4. Als Kohlenstoffquelle werden Kohlenwasserstoffe, als Stickstoffquelle sowohl Mineralsalze als auch organische Verbindungen in Form von Pepton, Trypton

und Aminosäuren eingesetzt.

Antibiotika-Resistenz: resistant gegen Ampizillin, bedingt durch das Vorhandensein des Plasmids. Die Anwesenheit von Plasmid-DNA im Zellstamm wird durch Kontrolle der Ampizillin-Resistenz bestätigt, außerdem durch die Gewinnung und Analyse von Plasmid-DNA. Der Zellstamm ist in der Kollektion des Zentralmuseums industrieller Mikroorganismen der UdSSR unter der Nummer WKPM W 5238 deponiert. Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher dargestellt werden. Die dazugehörige Abbildung zeigt

Fig. 1: Konstruktionsschema der erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmid-DNA pFRd 58. Die Realisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in 2 VerfahrensscMtten:

1. Konstruktion rekombinanter Plasmid-DNA pFRd58

2 μg des Plasmids pFR7-71, nach Standardmethoden gewonnen, spaltet man mit 3 Einheiten der Restriktase Asu Il in 25μΙ der

Lösung A (1 OmM Tris-HCf, pH 7,5; 5OmIvI NaCI; 10mM MgCI₂) 2 Stunden bei 37⁰C. Die Restriktase inaktiviert man 15 Minuten bei

65⁰C. Die linearisierte Plasmid-DNA isoliert man aus einem 0,8%igen Agarosegel und resuspendiert sie in 20μΙ H₂O (DNAI).

20pg des Plasmids pAEIOspaltet man mit 50 Einheiten der Restriktase Eco Rl und 50 Einheiten der Restriktase Eco 1301 in 100 μΙder Lösung A16 Stunden bei 37⁰C. Nach Inkubation wird das Fragmentgemisch auf ein 2%iges Agarosegel aufgetragen und das

Fragment mit einer Länge von 180Bp, nach bekannten Methoden aus dem Gel eluiert. Das Fragment wird in 2ΟμΙ H₂O

resuspendiert (DNA2).

Die Charakterisierung des erfindungsgemäßen rekombinanten Proteins wird wie folgt vorgenommen: Bestimmung der Syntheserate des Fusionsproteins frCP-preS2/adw mittels radialer Immundiffusion (RID) Den Titer des rekombinanten Proteins frCP-preS 2/adw bestimmt man mit Hilfe der radialen Immundiffusion nach Ouchterlony. Dafür bereitet man eine Verdünnungsreihe der Zellaufschlüsse, die mit Hilfe eines Puffers nach Laemmli erfolgte. Als Standard

verwendet man gereinigtes Coatprotein des Phagen fr aus rekombinanten Bakterien (1 mg/ml). Die Ergebnisse der Titration derfrCP-Aktivität mittels RID sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Synthese von frCP-preS 2/adw in E. coli K802-Zellen, die rekombinante Plasmid-DNA pFRd58 tragen Stamm OD₆₆O Titer im RID Protein frCP Ertrag des

mg/ml mg/ml Produkts (%)

E.COÜK802

(pFRd58) 4,0 1:256 20,0 1,0 5,0

Bestimmung der preS2- und Coatprotein-Aktivität mittels Immunoblotting

Für das Immunoblotting resuspendiert man die Zellen (6mg) in 100μΙ Probenpuffer nach Laemmli, der 2% SDS und 2% Mercaptoäthanol enthält, und lysiert durch 2minütiges Erhitzen im kochenden Wasserbad. Die erhaltenen Lysate (2-4mg/ml Protein)trägtmanaufeinGradienteripolyacrylamidgel(12-23%)auf(Größe150mm x 150mm x 0,75 mm). Die Elektrophorese wird 15 Stunden bei einer Stromstärke von 7 mA durchgeführt.

0,05pg DNA2 und 0,1 μg DNAI werden gemischt und die überhängenden Enden in 2ΟμΙ der Lösung B (5OmM Tris-HCI, pH 7,5; 1OmM MgCI₂; 1OmM DTT; 25mM NaCI) durch Zugabe von je 100μΜ daTP, dCTP, dTTP und dGTP sowie 5 Einheiten DNA-Polymerase aus E.coli (Klenow-Fragment) im Laufe von 20 Minuten bei Raumtemperatur aufgefüllt. Die DNAs verbindet man mit Hilfe von 10 Einheiten T₄-DNA-Ligase in 10μΙ der Lösung B bei Zugabe von 1 mM ATP im Laufe von 12 Stunden bei 4°C. Zum Reaktionsgemisch werden ΊΟΟμΙ E.coli RR1-Zellen, die vorher mit 10OmM CaCI₂ behandelt worden waren (Endkonzentration 5x 10' Zellen/ml), zugegeben, um die rekombinanten Plasmid-DNAs zu transformieren. Die Auswahl der Klone erfolgt mit Hilfe der Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA, die im Schnellverfahren isoliert worden war. Das Plasmid mit dem erwarteten Restriktionsspaltmuster erhält die Bezeichnung pFRd 58. Figur 1 zeigt das Konstruktionsschema dieses Plasmids.

2. Transformation des erfindungsgemäßen Plasmids in einen Produzentenstamm Den Produzentenstamm erhält man durch Transformation von E. coli K802 mit dem rekombinanten Plasmid pFRd 58. Die Zellen werden in M9-Medium mit Zusatz von 10g/l Kasaminsäure, 2g/l Glukose und 0,02 g/l Ampizillin bis zu einer optischen Dichte von OD₆₆₀ 4-5 kultiviert.

Nach der Elektrophorese überträgt man die Proteine auf Nitrozellulose HAWP. Die Filter werden mit dem murinen monoklonalen Antikörper MAb E in einer Verdünnung von 1:500 in TBS-Puffer (5OmM Tris-HCI, pH 7,8; 15OmM NaCI; 0,1 % Triton X100 + 1 %

BSA) 1B Stunden bei 2O°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in TBS-Puffer inkubiert man die Filter 2 Stunden bei 2O⁰C mit

dem Peroxidase-markierten Konjugat der Antikörper gegen Maus-Immunglobulin (Verdünnung 1:200). Die Filter spült man mit TBS-Puffer (3-5 x) und entwickelt mit Diaminobenzidin.

Im Parallelansatz inkubiert man die Filter mit anti-frCP-Antikörpern vom Kaninchen in einer Verdünnung von 1:200 in TBS-Puffer (+1 % BSA) 15 Stunden bei 2O⁰C. Nach zweimaligem Waschen mit TBS-Puffer inkubiert man die Filter 2 Stunden mit Peroxidase-Konjugat des Proteins A von S. aureus.

Die Zellysate des Produzentenstammes weisen dabei das Auftreten spezifischer Färbungszonen auf, welche einem Protein mit

einem Molekulargewicht von 19,8kD (Länge 190 Aminosäuren) entsprechen, was in Übereinstimmung mit dem Konstruktionsschema in Figur 1 steht. Die Kontrollysate von E. coli K802-Zellen weisen solche Zonen nicht auf.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Proteins frCP-preS2/adw, das eine Fusion aus Coatprotein des Phagen fr und der preS2-Region (4.-55. Aminosäure) und 9 N-terminalen Aminosäuren des HBsAg des HBV, Subtyp adw, darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß in der . 2. Aminosäure des Coatproteins des Phagen fr die preS2-Region (4.-55. Aminosäure) und 9 N-terminale Aminosäuren des HBsAg inseriert sind, und das rekombinante Protein die antigenen Eigenschaften beider Proteine besitzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante Plasmid-DNA pFRd58 mit einer Größe von 5459Bp, bestehend aus

- der DNA des Plasmids pFR7-71 mit einer Länge von 5279Bp, die das Gen bla, das die Ampizillin-Resistenz vermittelt, und das vollständige fr-Coatproteingen, unter Kontrolle eines Promotors P_trp enthält, und

— dem Fragment des HBV-Genoms, Subtyp adw, das der Sequenz zwischen den Restriktionsorten Eco Rl₀ und Eco 1301^0 mit einer Länge von 180Bp entspricht und die preS2-Region (4.-55. Aminosäure) und 9N-terminale Aminosäuren des HBsAg kodiert, die Synthese des rekombinanten Proteins frCP-preS2/adw ermöglicht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Produzentenstamm des frCP-preS2/adw durch Transformation von E.coli K802-Zellen mit rekombinanter Plasmid-DNA pFRd 58 erhält.