DD286820A5 - Verfahren zur herstellung des rekombinanten proteins hbcag delta-hivp24, das eine fusion aus den coreproteinen von hepatitis b-virus und humahem immundefizienzvirus 1 darstellt - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Proteins HBcAgd-HIVp24, das eine Fusion aus den Coreproteinen von Hepatitis B-Virus und humanem Immundefizienzvirus 1 darstellt. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dasz das Fragment des gag-Gens vom HIV 1, das 13 Aminosaeuren des p17, 231 Aminosaeuren des p24 und 74 Aminosaeuren des p15 kodiert, in das Kodon fuer die 144. Aminosaeure des HBcAg inseriert wird. Die Termination der Translation erfolgt unmittelbar hinter dem gag-Bereich an einem Stopkodon des pUC-Abschnittes. Den Produzentenstamm des HBcAgd-HIVp24 erhaelt man durch Transformation von E. coli K802-Zellen mit rekombinanter Plasmid-DNA pHIV 24-5. Dieser Produzentenstamm ermoeglicht die Herstellung des rekombinanten Proteins HBcAgd-HIVp24, das eine Fusion aus den Coreproteinen von Hepatitis B-Virus und humanem Immundefizienzvirus 1 darstellt.{Kapsid; Coreantigen; Hepatitis B-Virus; Humanes Immundefizienzvirus; Epitop; rekombinante DNA; Gentechnik; Escherichia coli; Virusdiagnostik; Vakzine}

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das rekombinante Protein HBcAgA-HIVgp24, das eine Fusion aus den Coreprotinen von Hepatitis-B-Virus und humanen Immundefizienzvirus 1 darstellt.

Charakteristik des bekennten Standes der Technik

Es sind rekombinante Strukturen bekannt, welche Epitope des Coreproteins ρ 24 des HIV 1 tragen, und auf der Grundlage von bakteriellen Proteinen gewonnen werden, entweder durch direkte Expression (1) oder in Fusion mit bakteriellen Proteinen (2). Solche Rekombinanten sind ausschließlich für diagnostische Zwecke vorgesehen, da sie nicht zur Selbstorganisation und Ausbildung der nativen Proteinstrukturen fähig sind. Daraus ergibt sich der Hauptnachteil der bekannten rekombinanten Strukturen, der in einer geringen Immunogenit&t liegt.

Ein perspektivischer Träger fremdor Antigendeterminanten ist das Coreantigen (HBcAg) des Hepatitis-B-Virus (HBV) (3), welches die Fähigkeit zur Selbstorganisation selbst bei Vorhandensein ausgedehnter Fremdinsertionenboibehält. Außerdem können die inserierten Epitope auf der Oberfläche auf der Basis des HBcAg erhaltonon Kapside exponiert werden. Aber auch bei fehlender Selbstorganisation der monomeren Untereinheiten des HBcAg zu Kapsiden, z. B. bei Einfügen langer Fremdsequenzen (100 und mehr Aminosäuren), zeichnen sich das HBcAg und seine Derivate durch hohe immunologische Aktivität aus, weil die HBcAg-Komponente in der Lage ist, die T-Zell-Immunantwort zu stimulieren (4).

Rekombinante Strukturen, die Epitope dos ρ24 vom HIV 1 tragen und zur Bildung von Kapsiden fähig sind, sowie Rekombinanten des ρ24 auf der Basis eukaryontischer Proteine sind nicht bekannt.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein rekombinantes Protein zu gewinnen, das die immunologische Aktivität sowohl des HBcAg als auch des ρ 24 vom HIV 1 besitzt und sowohl für diagnostische Zwecke als auch als potentielle Vakzine genutzt werden kann.

Darlegung dei Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist dio Gowinnung eines rekombinanten Proteins, das eine Fusion aus den Coreproteinen von Hopatitis-B-Virus und humanem Immundefizienzvirus 1 darstel't, und die Schaffung eines Produzentenstammes für dieses rekombinanlo Protein.

Diese Aufgabenstellung wird erfindungsc^mäß dadurch gelöst, daß im Ergebnis der Konstruktion des rekombinanten Gens HßcAgA-HIVp24, welches die Synthese ties entsprechenden Proteins kodiert, und des Expressionsplasmids pHIV 24-5 oin Pfoduzentenstamm E. coli (pHIV 24-5) erhalten wird, der die Produktion des rekombinanten Proteins HBcAgA-HIVp24 sichert. Das rekombinante Plasmid pHIV 24-5. dessen Konstruktionsschema in Fig. 1 dargestellt ist, besteht aus folgenden Elementen: - DNA des Plasmids pHBc 5 (3), einer Variante des Plasmids pHBc 3, welche das Gen des HBcAg mit einem optimierten Initiationsbereich für die Translation enthält (5), und ein deletiertes HBcAg-Gen, dem die Sequenz für die 39 C-terminalen Aminosäuren des HBcAg fehlt und das im Kodon für die 144. Aminosäure einen unikalen Restriktionsort für die Restriktase Eco Rl besitzt; Länge6700Bp

- Fragment des HIV1-Genoms, isoliert aus dem Plasmid pBH 10 (6), welches dem Abschnitt zwischen den Restriktionsorten Pvu II_MI und Dgl H₁₄₄₀ entspricht und einen Bereich des gag-Gens umfaßt, der 13 Aminosäuren des ρ 17,231 Aminosäuren des ρ24 und 74 Aminosäuren des ρ 15 kodiert; Länge 949 Bp

- Fragment des Piasmidi pUC 19, welches dem Abschnitt zwischen den Restriktionsorten Bam Hl₄₁₇ und Pvu H₆₂₈ entspricht und ein Stopkodon im gleichen Leserahmen wie die gag-Proteinabschnitte besitzt; Länge 211 Bp

Die Größe des Plasmids beträgt 7900Bp (Molekulargewicht 5,06MD). Die DNA des rekombinanten Plasmids pHIV 24-5 enthält die Gene:

- Gen HBcAgA-HIVp 24, das die Synthese des Endprodukts gewährleistet;

- Gen bla, welches eine Ampizillin-Resistenz verleiht.

Das Gen HBcAgA-HIVp24 steht unter Kontrolle eines Tandempromotors P„_p. Das Plasmid pHIV 24-5 wird nach Zugabe von Chloramphenikol ins Medium nlcht-konjugativ amplifiziert. Das Wesen der Konstruktion des Plasmids pHIV 24-5 besteht darin, daß ein Pvu Il-Fragment des Plasmids plNG 3, das den Genomabschnitt des HIV 1 zwischen den Restriktionsorten Pvu ΙΙ_Μι und BgI ΙΙι_Μ0 und ein Barn HU^-Pvu ll_iJe-Fragmont des Plasmids pUC 19 enthält, in den Restriktionsort Eco Rl des Vektorplasmids pHBc 5 untor Bildung des rekombinanten Gens HBcAgA-HIVgp24 inseriert wird, das ein Protein aus 144 Aminosäuren HBcAg, 13 Aminosäuren ρ 17,231 Aminosäuren ρ24 und

74 Aminosäuren p16 kodiert.

Den Produzentenstamm des HBcAgA-HIVgp24 erhält man durch Transformation von E. coli K802-Zellen mit rekombinanter Plasmid-DNApHIV24-5. Morphologische Merkmale: gram-negative stäbchenförmige Zellen, Kulturmerkmale: Zellen wachsen auf üblichen Nährmedien, bilden Kolonien mittlerer Größe, Physiko-biochemische Merkmale: optimale Kultivierungstemperatur 37 ⁰C, pH-Optimum 7,0-7,4. Als Kohlenstoffquolle werden

Kohlenwasserstoffe, als Stickstoffquelle sowohl Mineralsalze als auch organische Verbindungen in Form von Pepion, Trypton und Aminosäuren eingesetzt.

Antibiotika-Resistenz: resistent gegen Ampizillin, bedingt durch das Vorhandensein des Plasmids. Die

Anwesenheit von Plasmid-DNA im Zellstamm wird durch Kontrolle der Ampizillin-Resistenz bestätigt, außerdem durch die Gewinnung und Analyse von Plasmid-DNA.

Der Zellstamm ist in dar Kollektion des Zentralmuseums industrieller Mikroorganismen der UdSSR unter der Nummer WKPMW4970deponieit.

Ausfuhrungsbeispiel Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher dargestellt werden. Die dazugehörige Figur 1 zeigt das Konstruktionsschema der erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmid-DNA pHIV 24-5. Die Realisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in 2 Verfahrensschritten:

1. Konstruktion rekombinanter Plasmid-DNA pHIV 24-5

2pg dos Plasmids pHBc 5, nach Standardmethoden gewonnen, spaltet man mit 5 Einheiten der Restriktase Eco Rl in 25 μΙ der

Lösung A (10OmM Tris-HCI, pH 7,5; 1OmM MgCI₂; 5OmM NaCI) eine Stunde bei 37⁰C. Die Restriktase inaktiviert man 15 Minuten

bei 65^CC. Das Auffüllen der überhängenden Enden erfolgt in ΙΟΟμΙ der Lösung B (5OmM Tris-HCI, pH 7,5; 1OmM MgCI₂; 1OmM

DTT; 25mM NaCI; jeweils 100μΜ dATP, dCTP, dGTP, dTTP und 5 Einheiten DNA-Polymerase aus E. coli/Klenow-Fragment) im Laufe einer Stunde bei 12°C. Nach Reinigen im Agarosogel, mittels bekannter Methode, wird die DNA in 20μΙ H₂O gelöst

20pg des Plasmids plNG 3, welches das Fragment Sac I₂₂₄-BgI Hie«) des HiV 1-Genoms trägt, werden mit 50 Einheiten der

Restriktase Pvu Il in ΙΟΟμΙ der Lösung C (1OmM Tris-HCI, pH 7,5; 5OmM NaCI; 1OmM MgCI₂) im Laufe von 2 Stunden bei 37°C

gespalten und das Fragmentgemisch auf ein 1,5%iges Agarosogel aufgetragen. Das Pvu Il-Fragment mit einer Länge von1159Bp (Molekulargewicht 0,74MD), das das komplette ρ24 mit flankierenden Sequenzen kodiert, extrahiert man aus dem

Agarosegel in leichtschmelzender Agarose nach bekannter Methode (DNA2).

0,25|jg DNA 1 und 0,1 pgDNA2 verbindet man mit Hilfe von Ti-DNA-Ligase in 10μΙ der Lösung D (5OmM Tris-HCI, pH 7,5; 1OmM

MgCI₂; 1OmM DTT; 50μΜ ATP und 10 Einheiten T₄-DNA-Ligase) innerhalb von 12 Stunden bei 4⁰C. Zum Reaktionsgemisch worden 100μΙ Zellen E. coli RR1, die vorhor mit 10OmM CaCI₂ bohandelt worden waren

(Endkonzentration 5x10' Zollen/ml), zugegeben, um dio rekombinanten Plasmid-DNAs zu transformieren.

Die Auswahl der Klone erfolgt mit Hilfe der Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA, die im Schnellverfahren isoliert worden war. Das Plasmid mit dem erwarteten Restriktionsspaltmustor erhält dio Bezeichnung pHIV 24-5 (Figur 1).

2. Transformation de» erflndungsgemfißen Plasmids In einen Prodyzontenstamm

Don Produzenttnstamm erhalt man durch Transformation von E. coli K802 mit dom rekombinanten Plasmid pHIV 24-5. Die Zellen worden in M9-Medium mit Zusatz von 10g/l Kasaminsäuron, 2g/l Glukose und 0,02g/l Ampizillin bis zu einor optischen Dichte von OD_e«o 4-5 kultiviert. Die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und im vierfachen Volumen eines Puffers lysiert, der 0.05M Tris-HCI, pH 8,0,0,15M NaCI, 0,1%Triton X 100,0,005MEDTAund 2mg/ml Lysozym enthält. Nach30minütiger Inkubation bei 4^CC werden die Zellen einem dreimaligen Frieren/Tauen ausgeseit. Anschließend werden Desoxyribonukleaso und MgCI₂ bis iu Endkonzentrationen von 70μg/ml bzw. 1OmM zugegeben und bei 4^CC nochmals 30 Minuten inkubiert. Das Lysnt wird zentrifugiert (1000Ox g; 4^CC) und das Pellet in einem Puffer aus G2,5mM Tris-HCI, pH 7,8; 2% SPS und 2% ß-Mercaptoäthanol resuspendiert

Die Charakterisierung des effindungsgemäßen rekümbinanten Proteins wird wie folgt vorgenommen:

Bestimmung der Immunologischen Aktivität des rekombinanten Proteins HBcAgA-HIV ρ24 mittels Immunoblottlng Für das Immunoblotting resuspendiert man die Zellen (6mg) In 100μΙ Probenpuffer nach Laemmli, der 2% SOS und 2% ß-MercaptoSthanol enthält, und lysiert durch 2mlnütiges Erhitzen im kochenden Wasserbad. Die erhaltenen Lysate (2-4 mg/ml Protein)trägtmanaufeinGradienten-Polyacrylamidgel(12-23%)auf(Größe150mm χ 150mm x 0,75mm). Die Elektrophorese wird 15 Minuten bei einer Stromstärke von 7 mA durchgeführt.

Nach der Elektrophorese überträgt man die Proteine auf Nitrozellulose HAWP. Die Filter werden mit dem murinen monoklonalen anti-p24-Antikörper4/1/1 in Verdünnung von 1:500 inTBS-Puffer(5bmMTris-HCI,pH7,8; 15OmM NaCI, 0,1 %Triton X100) mit 1 % BSA15 Stunden bei 20°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in TBS-Puffer inkubiert man die Filter 2 Stunden bei 2O⁰C mit dem Peroxidase-Konjugat der Antikörper gegen Maus-Immunglobulin (Verdünnung 1:500). Im Parallelansatz inkubiert man die Filter mit dem monoklonalen Antikörper 14 EII (anti-HBc) in einer Verdünnung von 1:5015 Stunden bei 2O⁰C, wäscht wie oben beschrieben, und inkubiert mit dem Peroxidase-Konjugat des Proteins A von S. aureus 2 Stunden bei 2O⁰C. Nach Inkubation mit den Peroxidase-Konjugaten werden die Filter in beiden Ansätzen mit TBS-Puffer (3-5mal) gewaschen und mit Diaminobenzidin entwickelt.

Die Zellysate des Produzentenstammes weisen dabei das Auftreten spezifischer Färbungszonen auf, welche einem Protein mit einem Molekulargewicht von 49kD (oder einer Länge von 462 Aminosäuren) entsprechen, was in Übereinstimmung mit dem Konstruktionsschema in Figur 1 steht. Die Kontrollysate von E. coli K802-Zellen (pHBc 3) weisen solche Zonen nicht auf.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Proteins HBcAgA-HIVp2,das eine Fusion aus den Coreproteinen von Hepatitis-B-Virus und humanem Immundefizienzvirus 1 darstellt, ladurch gekennzeichnet, daß in der 144. Aminosäure des HBcAg ein gag-Abschnitt eingebaut ist, der 13 Aminosäuren ρ 17,231 Aminosäuren p24und 74 Aminosäuren ρ 15 umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante Plasmid-DNA pHIV 24-5 mit einer Größe von 7900Bp (Molekulargewicht 5,06 MD), bestehend aus

- der DNA des Plasmids pHBc 5 mit einer Länge von 6700Bp, die das Gen bla, das die Ampizillin-Resistenz vermittelt, und das HBc-Gen, das nur die 144N-termina!en Aminosäuren des HBcAg kodiert und unter Kontrolle eines Tandempromotors P_trp, steht, enthält,

- dem Fragment des HIV 1-Genoms, isoliert aus pBH 10, das der Sequenz zwischen den Restriktionsorten Pvu H₆₉₁ und BgI ll_1Mo mit einer Länge von 949Bp entspricht, und

- dem Fragment des Plasmids pUC 19, das der Sequenz zwischen den Restriktionsorten Bam Hl₄₁₇ und Pvu II₆28 mit einer Länge von 211 Bp entspricht,

die Synthese des rekombinanten Proteins HBcAgA-HIVgp 24 ermöglicht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, df -"urch gekennzeichnet, daß man den Produzentenstamm des HBcAgA-HIVp24 durch Transformation von E. coli K802-Zellen mit rekombinanter Plasmid-DNA pHIV 24-5 erhält.