DD286821A5 - Verfahren zur herstellung der rekombinanten kapsidstruktur hbcag-hivgp41 (78-129), die das coreantigen des hepatitis b-virus mit dem an seiner oberflaeche exponierten epitop hivgp41 (78-129) darstellt - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Kapsidstruktur HBcAg-HIVgp41 (78-129), die das Coreantigen des Hepatitis B-Virus mit dem an seiner Oberflaeche exponierten Epitop HIVgp41 (78-129) darstellt. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dasz das Fragment des env-Gens vom HIV 1, bezeichnet als HIVgp41 (78-129) mit einer Laenge von 153 Basenpaaren (Bp) in den Restriktionsort Cla I des Vektorplasmids pHBc 1615 unter Bildung des rekombinanten Gens HBcAg-HIVgp41 (78-129) eingebaut wird. Den Produzentenstamm des HBcAg-HIVgp41 (78-129) erhaelt man durch Transformation von E. coli RR1-Zellen mit rekombinanter Plasmid-DNA pHIV 41-22. Dieser Produzentenstamm ermoeglicht die Herstellung der rekombinanten Kapsidstruktur HBcAg-HIVgp41 (78-129), die das Coreantigen des Hepatitis B-Virus (HBV) mit dem an seiner Oberflaeche exponierten Epitop HIVgp41 (78-129) darstellt.{Kapsid; Coreantigen; Hepatitis B-Virus; Humanes Immundefizienzvirus; Transmembranprotein; Epitop; rekombinante DNA; Gentechnik; Escherichia coli; Virusdiagnostik; Vakzine}

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung oetrifft die rekombinante Kapsidstruktur HBcAg-HIVgp41 (78-129), die das Coreantigen des Hepatitis-B-Virus mit dem an seiner Oberfläche exponierten Epitop H!Vgp41 (78-129) darstellt.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Es sind rekombinante Strukturen bekannt, welche Epitope des Transmembranproteins gp41 des HIV 1 tragen, und auf der Grundlage von bakteriellen Proteinen gewonnen werden, aber keine kapsidbildenden Fähigkeiten besitzen (1--5). Ihr Nachteil besteht in einer geringen Immunogenität, die dadurch verursacht wird, daß die eingefügten Epitope nicht ihre native Konformation besitzen. Ein weiteres Hindernis für den Einsatz solcher Protoine als Vakzine ist dor hohe Antoi! von bakteriellem Protein.

Rekombinanto Kapsidstrukturen, die Proteinepitope des HIV 1 tragen, unter anderem das gp41, sind nicht bekannt.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung bosteht darin, rokombinante Kapsidstrukturen mit hoher Immunogenität und großen Ausbeuten kostengünstig herzustellen.

Darlegung de» Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist die Gewinnung rekombinanter Kapsidstrukturen, die das Coreantigen des Hapatitis-B-Viurs (HBV) mit dem An seiner Oberfläche exponierten Epitop HIVgp 14 (78-129) darstellen, und die Schaffunß eines Produzentenstammes für solche Strukturen.

Diese Aufgabenstellung wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß im Ergebnis der Konstruktion des rekombinanten Gens HBcAg-HIVgp41 (78-129), welches die Synthese des entsprechenden Proteins kodiert, und des Expressionspiasmids pHIV 41-22 ein Produzent änstamm erhalten wird (E. coli/pHIV 41-22), der die Produktion der rekombinanten Kapsidstruktur HBcAg-HIVgp41 (78-129) mit einem Anteil von 3,3% am Gesamtprotein von E.coli sichert.

Das rokombinante Plasmid pHIV 41-22, dessen Konstruktionsteilen^ in Fig. 1 dargestollt ist, besteht aus folgenden Elementen:

- DNA des Plasmids pHBc 1615 (6), einer Varianto des Plasmids pHBc 3, welche das Gen des HBcAg mit einom optimierten Initiations!.: er eich für dio Translation enthält (7), und ein mutiortes Gen des HBcAg, o'as einen Polylinker-E in schub im Kodon für die 144ste Aminosäure hat, der für de,ι Einbau von Fremdabschnitten in diesem Bereich vorgesehen ist, besitzt; Länge 6900Bp

- Fragment des HIV 1 -Genoms, isoliert aus dem Plasmid pBH 10 (8), welches dem Abschnitt zwischen den Restriktionsorten Sau 3A_;Mi und Hind III,;,, entspricht und den Bareich des gp-11 (78-129) kodiert (Länge 153Bp)

Die Größe dns Plasmids beträgt 7000Bp, das Molekulargewicht 4,48MD

Die DNA des rekombinanten Plasmdis pHIV 41-22 enthält die Gene:

- Gen HBcAg-HIVgp41 (78-129), das die Synthese des Endprodukts gewährleistet,

- gen b!a, welches eine Ampizillin-Resistenz verleiht.

Das Gen HBcAg-HIVgp41 (78-129) steht unter Kontrolle eines Tjndemprornotors P„_p. Das Plasmid pHIV 41-22 wird nach Zugabe von Chloramphenicol ins Medium nicht-konjugativ amplif iziert. Das Wesen der Konstruktion des Plasmide pHIV 41-22 besteht darin, daß das Fragment des env-Gens vom HIV 1, bezeichnet als HIVgp4i (78-129), mit einer Länge von 153Bp in den Restriktionsort CIaI des Vektorplasmids pHBc 1615 unter Bildung des

rekombinanten Gens HbcAg-HIVgp41 (78-129) eingebaut wird.

Den ProduzGritenstamm des HBcAg-HIVgp41 (78-129) erhält man durch Transformation von E. coli RR1 -Zellen mit

rekombinanter Plasmid-DNA pHIV 41-22.

Morphologische Merkmale: gram-negative stäbchenförmige Zellen, Kulturmerkmale: Zellen wachsen auf üblichen Nährmedien, bilden Kolonien mittlerer Größe, Physiko-biochemische Merkmale: optimale Kultivierungstemperatur 37"C, pH-Optimum 7,0-7,4. Als Kohlenstoffquelle

werden Kohlenwasserstoffe, als Stickstoffquelle sowohl Mineralsaize a!s auch organisch j Verbindungen in Form von Pepton, Trypton und Aminosäuren eingesetzt.

Antibiotika-Resistenz: resistant gegen Ampizillin, bedingt durch das Vorhandensein des Plasmids. Die

Anwesenheit von Plasmid-DNA im Zellstamm wird durch Kontrolle der Ampizillin· Resistenz bestätigt, außerdem d-jrch die Gewinnung und Analyse von Plasmid-DNA.

Der Zellstamm ist in der Kollektion des Zentralmuseums industrioller Mikroorganismen der UdSSR unter der Nummer WKPM W 4972 deponiert.

AusfuhrunQsbelsplel

Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher dargestellt werden. Die dazugehörigen Abbildungen zeigen

Fig. 1: Konstruktionsschema der erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmid-DNA pHIV 41-22 Fig. 2: Elektronenmikroskopischc Aufnahme des erfindungsgemäßen Kapsids

Die Realisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in 2 Verfahrensschritten:

1. Konstruktion rekombinanter Plasmid-DNA pHIV 41-22:

2pg des Plasmids pHBc 1615, nach Standardmethoden gewonnen, spaltet man mit 4 Einheiten der Restriktase CIa I in 25μΙ der

Lösung A (1OmM Tris-HCI, pH 7,5; 5OmM NaCI und 1OmM MgCI₂) eine Stunde bei 37⁰C. Die Restriktase inaktiviert man

15 Minuten bei 65"C. Das Auffüllen der überhängenden Enden erfolgt in 100μΙ der Lösung B (5OmM Tris-HCI, pH 7,5; 1OmM

MgCI₂), 1OmM DTT, 25mM NaCI durch Zugabe von je 100μΜ dATP, dCTP, dTTP und dGTP sowie 5 Einheiten DNA-Polymerase

nach E.coli (Klenow-Fragment) im Laufo einer Stunde bei 12 ⁰C. Nach Reinigen im Agarosegel (auf DE-81 Papier), nach bekannter

Methode, wird die DNA in 20μΙ H₂O gelöst (DNA I).

20pü des Plasmids pSS 3,8, welches das Fragment SaI I««-Sac I₉₁₅₃ des HIV 1-Genoms trägt, werden mit 50 Einheiten der

Restriktase BgI Il in 100μΙ der Lösung BdOmM Tris-HCI, pH 7,5; 1OmM MgCI₂) im Laufe von 2 Stunde bei 37⁰C gespalten und das Fragmentgemisch auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen. Das Fragment BgI M₇₁₉₁-OgI II_M29 mit dem Molekulargewicht von

0,51 MD (Größe 1430 Bp) extrahiert man aus dem Agarosegel in leichtschmelzender Agarose (DNA 2).

5pgDNA 2 spaltet man mit 10 Einheiton Sau 3 A und 10 Einheiton Hind III in 20 pider Lösung Aim Laufo von 2 Stunden bei 37⁰C.

Das Fragment Sau 3 A_76W-Hind Ill^n trennt man auf leichtschmelzender Agorose und füllt die überhängenden Enden, wie oben

beschrieben, auf (DNA 3).

0,^g DNA 1 und 0,05μΙ DNA 3 verbindet man mit Hilfe von 10 Einheiten T«-DNA-Ligase in 10μΙ der Lösung B bei Zugabo von1OmM DTT und 60μΜ ATP bei einer Inkubationszeit von 12 Stunden bei 4°C.

Zum Reaktionsgemisch werden 100μΙ Zellen E. coli RR1, die vorher mit 10OmMCaCI₂ behandelt worden waren

(Endkonzentration 5x10" Zollon/ml), zugegeben, um die rekombinierten Plasmid-DNAs zu transformieren.

Die Auswahl der Klone erfolgt mit Hilfe der Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA, die im Schnellverfahren isoliert worden war. Das Plasmid mit dem erwarteten Restriktionsspaltmuster erhält die Bezeichnung pHIV 41-22. Figur 1 zeigt das Konstruktionsschema dieses Plasmids.

2. Transformation (Jos erfindungsgemäßen Plasmids in einen Produzentenstamm:

Den Produzentenstarnm erhält man durch Transformation von E. coli RR1 mit dem rekombinanten Plasmid pHIV 41-22. Die Zellen werden in M9-Medium mit Zusatz von 10g/l Kasaminsäuren, 2g/l Glukose und 0,02g/l Ampizillin bis zu einer optischen Dichte von OD₆Jo 4-5 kultiviert. Die Zellen werden durch Zentrifugalion gesammelt und im dreifachen Volumen eines Puffers Iy siort, der 0,05 M Tris-HCI, pH 8,0,0,15 M NaCI, 0,1 % Triton X 100,0,005 M EDTA und 3 mg/ml Lysozym enthält. Nach 30minütiger Inkubation bei 4^CC werden die Zellen einem dreimaligen Frieren/Tauen ausgesetzt. Anschließend werden Desoxyribonukleaso und MgCI₂ bis zu Endkonzentrationen von 20pg/ml bzw. 1OmM zugegeben und bei 4⁰C nochmals 30 Minuten inkubiert. Das Lyset wird 30 Sekundon mit Ultraschall behandelt und dann zentrifugiert (1000Ox g, 4⁰C). Das rekombinante Protein HBcAg-HIVcp41 (78-129) wird wie folgt gereinigt:

Das Lysat wird mit Ammoniumsulfat fraktioniert. HßcAgHIVgp41 (78-129) wird durch 30% Sättigung mit Ammoniumsulfat gefallt. Das Pellet wird gesammelt und gelöst in 0,04 M Natriumphosphat, pH 8,0, 0,15 M NaCI, 0,1 % Triton X 100, bis zu einer Endkonzentration des Proteins von 25-50 mg/ml. 6-7 ml dieser Lösung trägt msn auf eine Sepharose CI<1B-Säule (2,1 χ 75cm) auf, die mit dem gleichen Puffer (nur ohne Triton X 100) ausgeglichen wurde. Die Fraktionen mit HBcAg-Atkivität (siehe unten) sammelt man und verwendet s^;o sofort oder nach Konzentrierung durch nochmalige Fällung mit 50% Ammoniumsulfat.

Die Charakterisierung der erfindungsgemäßen rekombinanten Kapsidstruktur wird wie folgt vorgenommen: Bestimmung der HBcAg-AktlvKIt mitte's radialer Immundlffiision (RID) Den HBcAg-Titer bestimmt man mit Hilfe der radialen Immundiffusion nach Ouchterlony. Dafür bereitet man eine Verdünnungereihe (1:2", η 2: DdesZellysats und titiert gegen anti-HBc-Antikörpei des Menschen. Als Standard verwendet man gereinigten HBcAg aus rekombinanten Bakterien (1 mg/ml). Die Ergebnisse der Titration dar HBcAg-Aktivität mittels RID sind in der Tabelle 1 aufgeführt.

Teb.l .

Synthese von HBcAg-HIVgp41 (78-129) in E. coli RR1 -Zellen, die rekombinante Plasrr.id-DNA pHIV 41-22 tragen Stamm OD_SM Titer im Protein HBcAg Ertrag des RID mg/ml mg/ml Produkts (%)

E. coli RR1 4,0 1:32 15,0 0,5 3,3

(pHIV41-22)

Bestimmung der gp41-Aktlvltit mittels Immunoblottlng Für das Immunoblotling resuspendiert man die Zellen (6mg) in ΙΟΟμΙ Probenpuffer nach Laemmli, der 2% SDS und 2%

ß-Mercaptoäthanol enthält, und lyslert durch 2minütiges Erhitzen im kochenden Wasserbad. Die erhaltenen Lysate (2-4 mg/ml

Protein)trägtmanaufeinGradienten-Polyacrylamidgel(12-18%)auf(Größe150 χ 150 χ 0,75mm). Die Elektrophorese wird 15 Stunden bei einer Stromstärke von 7 mA durchgeführt. Nach der Elektrophorese überträgt man die Proteine auf Nitrozellulose HAWP. Die Filter werden mit dem humanen

monoklonalen Antikörper 3D6 (antigp41) in einer Verdünnung von 1:500 in TBS-Puffer (5OmM Tris-HCI, pH 7,8,15OmM NaCI,0,1 % Triton X 100,1 % BSA) 15 Stunden bei 20°C ink<;biert. Nach dreimaligem Waschen in TBS-Puffer inkubiert man die Filter 2

Stunden bei 20⁰C mit dem Peroxidase-markierter Konjugat der Antikörper gegen humanes Immunglbulin (Verdünnung 1:16). Die Filter spült men mit TBS-Puffer (3-5x) und entwickelt mit Diäminobonzidin. Die Zellysate des Produzentenstammes weisen dabei das Auftreten spezifischer Färbungszonen auf, welche einem Protein mit

einem Molekulargewicht von 25,5kD (Länge 241 Aminosäuren) entsprechen, was in Übereinstimmung mit dem

Konstruktionsschema in Figur 1 steht. Die Kontrollysate von E. coli-K802-Zellen (pHBc 3) weisen solche Zonen nicht auf. Elektronenmikroskopische Charakterisierung rekombinariter Kapsidstrukturen H8cAg-HIVgp41 (78-129) Die elektronenmikroskopische Charakterisierung rekombinanter Kapsidstrukturen HßcAg-HIVgp41 (78-129) wird wie folgt

vorgenommen:

Die Präparate des gereinigten Proteins HBcAg-HIVgp41 (78-129) (siehe oben) werden mittols Negativ-Kontrastierung unter Verwendung von 1 % Uranilacetat gewonnen und im Elektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 8OkV und

einor 400000fachen Vergrößerung untersucht. Das Protein HBcAg-HIVgp41 (78-129) bildot Kapside mit einem Durchmesser von25nm(Fig.2).

Bestimmung der gp41-Aktlvltlt in de? Kapkidstruktur HBcAg-HIVgp41 (78-129) mittels ELISA

Als Festphase für die Immunreaktionon dient eine Mikrotierplntte aus Polystyrol mit 96 Vertiefungen. Das gereinigte HBcAg-HIVgp41 (78-129) (siehe oben) verdünnt man bis zu einer Konzentration von iOpg/ml in 5OmM NaHCOj-Na₂CO], pH 9,5 und pipot'.ert in alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte jeweils 100μΙ. Nach einer Inkubation von 16 Stunden bei 37⁰C wird die Lösung aus den Vertiefungen entfernt und die Mikrotiterplatte getrocknet. In die Vertiefungen der Platte füllt man den humanen monoklonalen Antikörper 3D6 (anti-gp41; siehe oben) in einer Verdünnung von 1:5000 in TBS-Pulfer. Nach 2stündiger Inkubation boi 37⁰C wird die Mikrotiterplatte 5-6mal mit Aqua dest. abgospült. Anschließend werden je 100μΙ Konjugat dor Moerrettich-Peroxidaso mit dem S. aureus-Protein A (Verdünnung 1:5000) aufgetragen. Nach einer Stunde wird die Mikrotiterplatte gewaschen und die Farbreaktion durchgeführt. In die Vertiefungen füllt man jeweils ΙΟΟμΙ einer Lösung aus 0,25% Orthophenyldiamin-2HCI in 0,1 M Natriumeitrat, pH 5,0 und 0,02% HjOj und inkubiert 30 Minuten boi 20°C. Die Reaktion stoppt man durch Zugabe von ΙΟΟμΙ 0,1 NHCI. Das Auftreten einer Braunfärbung zeigt das Vorhandensein der gp<51-Aktivität. Für die quantitative Bestimmung der Aktivität mißt man die optische Dichto boi 492 nm (Tab. 2). Das Fehlen einer Reaktion in dor Negativkontrollo (HBcAg) zeugt von der spezifischen Bindung der anti-gp41-Antikörper mit den rekombinanten Kapsidstrukturon HBcAg-HIVgp41 (78-129) (Tab.2).

Tab. 2

Immunologische Reaktivität rekombinanter Antigene im ELISA

Gebundenes Antigen	Immunologisch Reaktivität rekombinierter Antigene (OD4i2/ml)	humanes anti-HBc
	anli-gp41(3D6)	1,315 0,93£
HBcAg-HIVgp41 (78-129) HBcAg (Kontrolle)	0,393 0,018

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Kapsidstruktur HBcAg-HIVgp41 (70-129), die das Coreantigen des Hepatitis-B-Virus mit dem an seiner Oberfläche exponierten Epitop HIVgp41 (78-129) darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß in der 144.Aminosäure des HBcAg die Sequenz desEpitopsHIVgp41 (78-129) mit einer Länge von 51 Aminosäuren (153 Basenpaare) eingebaut ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante Plasmid-DNA pHIV 41-22 mit einer Größe von 7000Bp (Molekulargewicht 4,48 MD), bestehend aus

- tier DNA des PlasmidspHBc 1615 mit einer Länge von 6900 Bp, die das Gen bla, das die Ampizillin-Resistenz vermittelt, und das HBc-Gen, unter Kontrolle eines Tandempromotors P„_p, enthält, und

- dem Fragment des HIV 1-Genoms, das der Sequenz zwischen den Restriktionsorten Sau 3 A₇₅₆S und Hind IH₇₇I₈ mit einer Länge von 153 Bp entspricht und den Bereich desgp 41 von der 78. bis zur 129. Aminosäure kodiert und im Restriktionsort CIa I der DNA des Plasmids pHBc 1615 eingebaut ist,

die Synthese der rekombinanten Kapsidstruktur HBcAg-HIVgp41 (78-129) ermöglicht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Produzentenstamm des HBcAg-HIVgp41 (78-129) durch Transformation von E.coli RR 1-Zellen mit rekombinater Plasmid-DNA pHIV 41-22 erhält.