DD292926A5 - Verfahren zur herstellung rekombinanter proteine hbcag-hivp24del 1-3, die antigene eigenschaften des coreproteins p24 des humanen immundefizienzvirus 1 (hiv 1) und hbe-aktivitaet besitzen - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Proteine HBcAgD-HIVp24 del 1-3, die antigene Eigenschaften des Coreproteins des humanen Immundefizienzvirus 1 (HIV 1) und HBe-Aktivitaet besitzen. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dasz Fragmente des gag-Gens des HIV 1, die 12 Aminosaeuren des p17 und 177, 88 oder 78 N-terminale Aminosaeuren des p24 kodieren, in das Kodon fuer die 144. Aminosaeure des HBgAg inseriert werden. Die Produzentenstaemme der rekombinanten Proteine HBcAgD-HIVp24 del 1-3 erhaelt man durch Transformation von E. coli K802-Zellen mit den rekombinanten Plasmid-DNAs pHIV 24 del 1-3. Diese Produzentenstaemme ermoeglichen die Herstellung der rekombinanten Proteine HBcAgD-HIVp24 del 1-3, die die antigenen Eigenschaften des Coreproteins p24 des HIV 1 und HBe-Antigenitaet besitzen.{Kapsid; Coreantigen; Hepatitis B-Virus; humanes Immundefizienzvirus 1; Epitop; rekombinante DNA; Gentechnik; Escherichia coli; Virusdiagnostik; Vakzine}

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft rekombinante Proteine HBcAgA-HIVp24del 1-3, die antigene Eigenschaften des Coreproteins p24 des humanen Immundefizienzvirus 1 (HIV1) und HBe-Aktivität besitzen.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Antigenderivate des Coreproteins ρ24 des humanen Immundefizienzvirus 1 (HIV 1) sind auf der Basis von bakteriellen Proteinen gewonnen worden, entweder durch direkte Expression (Motz, M., et al. AIDS-Forschung, 1988, H. 1,10-17) oder in Fusion mit kurzen Abschnitten bakterieller Proteine (Ghrayeb, J., et al. DNA, 1986, 5,93-99).

Diese Antigenderivate sind ausschließlich für diagnostische Zwecke eingesetzt worden, da sie nicht zut Selbstorganisation und Ausbildung der nativen Proteinstrukturen fähig sind.

Das in E.coli expremierte Coreantigen (HBcAg) des Hepatitis B-Virus ist fähig zur Selbstorganisation selbst bei Vorliegen größerer Fremdinsertionen (Borisova, G. P., et al. Dokl. Akad. Nauk SSSR, 1988,298,1474-1478). Aber auch bei fehlender Selbstorganisation zeichnen sich HBcAg und seine Derivate aufgrund der Stimulierung derT-Zell-lmmunantwort (Milich, D.R., Immunology Today, 1988,9,380-386), durch hohe immunologische Aktivität aus.

Es ist ein rekombinantes Protein HBcAgA-HIVp24 beschrieben worden, das aus 144N-terminalen Aminosäuren des HBcAg und 318 Aminosäuren des gag-Präkursors (12 Aminosäuren ρ 17,231 Aminosäuren p24,74 Aminosäuren ρ 15) des HIV 1 besteht.

Dieses rekombinante Protein wird durch das Plasmid pHIV 24-5 kodiert und in E.coli K802 (pHIV 24-5) expremiert.

Fusionsproteine aus HBcAg und ρ24 des HIVI, die die Antigenität des ρ24 und HBe-Aktivität besitzen, sind bisher nicht beschrieben worden.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, rekombinante Proteine mit hoher Immunogenität und großen Ausbeuten herzustellen.

Darstellung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist die Gewinnung rekombinanter Proteine, die antigene Eigenschaften des Coreproteins p24 des HIV1 und HBe-Aktivität besitzen und die Schaffung eines Produzentenstammes für solche Proteine.

Diese Aufgabenstellung wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß im Ergebnis der Konstruktion der rekombinanten Gene HBcAgA-HIVp 24del 1-3, welche die Synthese der entsprechenden Proteine kodieren, und der Expressionsplasmide pHIV 24 de!

1-3 Produzentenstämme E.coli (pHIV 24del 1-3) erhalten werden, die die Produktion der rekombinanten Proteine HBcAgA-HIVp24del 1-3 sichern.

Die rekombinanten Plasmide pHIV 24del 1-3, deren Konstruktiohsschema in Fig. 1 dargestellt ist, bestehen aus folgenden Elementen:

- DNA des Plasmids pHBc5, einer Variante des Plasmids pHBc3, welche das Gen des HBcAg mit einem optimierten Initiationsbereich für die Translation enthält, und ein deletiertes Gen des HBcAg, dem die Sequenz für die 30C-terminalen Aminosäuren des HBcAg fehlt und das im Kodon für die 144. Aminosäure einen unikalen Restriktionsort für die Restriktase Eco Rl hat, der für den Einbau von Fremdabschnitten in diesem Bereich vorgesehen ist, besitzt; Länge 6700Bp

- Fragmente das Monierten HIV 1-Genoms pBH 10, die den Abschnitten zwischen den Restriktionsorten Pvu H₆₉, und Hind lll₁₂ee (del 1), Pvu H₆₉₁ und SPhI₉₉₁ (del 2), Pvu Il₆9i und Pst I₈₆₁ (del3) entsprechen und die Aminosäuren 121 bis 132 des ρ 17 sowie die Aminosäuren 1 bis 177 (delD, 1 bis 88 (del2) bzw. 1 bis 78 (del3) des ρ24 kodieren.

Die Größe der Plasmide beträgt 7,5/7,2/7,1 kBp.

Die DNAs der rekombinanten Plasmide pHIVp24 del 1-3 enthalten die Gene

- Gen HBcAgA-HIVp24 del 1-3, die die Synthese der Endprodukte gewährleisten,

- Gen bla, welches eine Ampizillin-Resistenz verleiht.

Die Gene HBcAgA-HIVp24 del 1-3 stehen unter Kontrolle eines Tandempromotors Ρ₍,_Ρ.

Die Plasmide pHIVp24 del 1-3 werden nach Zugabe von Chloramphenikol ins Medium nicht-konjugativ amplifiziert.

Das Wesen der Konstruktion der Plasmide pHIV24 del 1-3 besteht darin, daß das Pvu Ileai-Bgl Ili^o-Fragment des gag-Gens vom HIV 1, kloniert im Plasmid pHIV 24-5 durch Spaltung mit den Restriktasen Hind III (del 1), Sph I (del 2) bzw. Pst I (del 3) verkürzt wird und in den entstandenen Plasmiden 12 C-terminale Aminosäuren des ρ 17 und unterschiedlich lange Abschnitte des HIV1-Coreproteinsp24 kodiert werden (del 1: AS 1-177; del2:1-88; del3:1-78).

Die Produzentenstämme der rekombinanten Proteine HBcAgA-HIVp24 del 1-3 erhält man durch Transformation von E.coli K802-Zellen mit den rekombinanten Plasmid-DNAs pHIV24 del 1-3.

Morphologische Merkmale: gram-negative stäbchenförmige Zellen, Kulturmerkmale: Zellen wachsen auf üblichen Nährmedien, bilden Kolonien mittlerer Größe,

Physiko-biochemische Merkmale: optimale Kultivierungstemperatur 37"C, pH-Optimum 7,0-7,4. Als Kohlenstoffquelle werden Kohlenwasserstoffe, als Stickstoffquelle sowohl Mineralsalze ais auch organische Verbindungen in Form von Pepton, Trypton und Aminosäuren eingesetzt.

Antibiotika-Resistenz: resistent gegen Ampizillin, bedingt durch das Vorhandensein des Plasmids. Die Anwesenheit von Plasmid-DNA im Zellstamm wird durch Kontrolle der Ampizillin-Resistenz bestätigt, außerdem durch die Gewinnung und Analyse von Plasmid-DNA.

Die Zellstämme sind in der Kollektion des Zentralmuseums industrieller Mikroorganismen der UdSSR unter den Nummern WKPM W5241, W5242, W5243 (del 1,2,3) deponiert.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher dargestellt werden. Die zugehörigen Abbildungen zeigen

Fig. 1: Konstruktionsschema der erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmid-DNAs pHIV24 del 1-3 Fig. 2: Bestimmung der immunologischen Aktivität der rekombinanten Proteine HBcAg A-HIVp 24del 1-3 mittels Immunoblotting.

Die Realisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in 4 Verfahrensschritten:

1. Konstruktion rekombinanter Plasmid-DNA pHIV24 del 1

2 μg des Plasmids pHIV 24-5, nach Standardmethoden gewonnen, spaltet man mit 10 Einheiten der Restriktase Hind III in 20 μΙ der Lösung A (1OmM Tris-HCI, pH 7,5; 5OmM NaCI; 1OmM MgCI₂) 16 Stunden bei 37"C. Die Restriktase inaktiviert man 15 Minuten bei 65⁰C. Die überhängenden Enden der gespaltenen Plasmid-DNA werden in 20μΙ der Lösung B (5OmM Tris-HCI, pH 7,5; 1OmM MgCI₂; 1OmM DTT; 25mM NaCI) durch Zugabe von je 100μΜ dATP, dCTP, dTTP und dGTP sowie 5 Einheiten DNA-Polymerase aus E.coli (Klenow-Fragment) im Laufe einer Stunde bei Raumtemperatur aufgefüllt. Die DNA rezirkularisiert man mit Hilfe von 10 Einheiten T₄-DNA-Ligase in 10μΙ der Lösung B bei Zugabe von 1 mM ATP im Laufe von 12 Stunden bei 4°C. Zum Reaktionsgemisch werden 100μΙ E.coli RR1-Zellen, die vorher mit 10OmM CaCI₂ behandelt worden waren (Endkonzentration 5 χ 10⁹ Zellen/ml), zugegeben, um die rekombinanten Plasmid-DNAs zu transformieren. Die Auswahl der Klone erfolgt mit Hilfe der Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA, die im Schnellverfahren isoliert worden war. Das Plasmid mit dem erwarteten Restriktionsspaltmuster erhält die Bezeichnung pHIV24 del 1. Figur 1 zeigt das Konstruktionsschema dieses Plasmids.

2. Konstruktion rekombinanter Plasmid-DNA pHIV24 del2

3μg des Plasmids pHIV24-5, nach Standardmethoden gewonnen, spaltet man mit 1,5 Einheiten der Restriktase Sphl in 50μΙ der Lösung A(IOmM Tris-HCI, pH 7,5; 5OmM NaCI; 1OmM MgCI₂) bei 37⁰C und entnimmt nach 10,20,30,45 und 60 Minuten Proben (je 10μΙ), die man in Trockeneis sofort einfriert. Die Analyse von je 5 μΙ der Proben im 1 %igen Agarosegel zeigt eine unvollständige Spaltung. Von der Probe, die nach 45 Minuten entnommen wurde, werden 3μΙ mit Hilfe von 10 Einheiten T₄-DNA-Ligase in 10μΙ der Lösung B bei Zugabe von 1 mM ATP im Laufe von 12 Stunden bei 4⁰C rezirkularisiert.

Zum Reaktionspemisch werden 100μΙ kompetente E.coli RR 1-Zellen zugegeben, um die rekombinanten Plasmid-DNAs zu transformieren.

Von 6 Platten werden die Kolonien (ca. 10000 insgesamt) in M9-Medium abgeschwemmt und die DNA präpariert. Dieses DNA-Gemisch wird bei 37⁰C16 Stunden mit 20 Einheiten Apa I gespalten und erneut in kompetente RR 1-Zellen transformiert. Die Auswahl der Klone erfolgt mit Hilfe der Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA, die im Schnellverfahren isoliert worden war. Das Plasmid mit dem erwarteten Restriktionsspaltmuster erhält die Bezeichnung pHIV24 del 2. Figur 1 zeigt das Konstruktionsschema dieses Plasmids.

3. Konstruktion rekombinanter Plasmld-DNA pHIV24 del3

2pg des Plasmids pHIV 24-5, nach Standardmethoden gewonnen, spaltet man mit 10 Einheiten der Restrlktase Pst I In 20μΙ der Lösung A (1OmM Tris-HCI, pH 7,5; 5OmM NaCI; 1OmM MgCI₂) 16 Stunden bei 37⁰C. Die Restriktase inaktiviert man 15 Minuten bei 65⁰C. Die DNA rezirkularisiert man mit Hilfe von 10 Einheiten T₄-DNA-Ligase in 10μΙ der Lösung B bei Zugabe von 1 mM ATP im Laufe von 12 Stunden be! 4°C.

Zum Reaktionsgemisch werden 100μ1 E.coli RR1-Zellen, die vorher mit 10OmM CaCI₂ behandelt worden waren (Endkonzentration 5 x 10⁹ Zellen/ml), zugegeben, um die rekombinanten Plasmid-DNAs zu transformieren. Die Auswahl der Klone erfolgt mit Hilfe der Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA, die im Schnellverfahren isoliert worden war. Das Plasmid mit dem erwarteten Restriktionsspaltmuster erhält die Bezeichnung pHIV24 del3A. Figur 1 zeigt das Konstruktionsschema dieses Plasmids.

2\ig des Plasmids pHIV24 del3A, nachStandardmethoden gewonnen, spaltet man mit 10 Einheiten der Restriktase Hindlll in 20μΙ der Lösung A (1OmM Tris-HCI, pH 7,5; 5OmM NaCI; 1OmM MgCI₂) 16 Stunden bei 37⁰C. Die Restriktase inaktiviert man 15 Minuten bei 65°C. Die überhängenden Enden der gespalteten Plasmid-DNA werden in 20 μΙ der Lösung B (50 mM Tris-HCI, pH 7,5; 1OmM MgCI₂; 1OmM DTT; 25mM NaCI) durch Zugabe von je 100μΜ dATP, dCTP, dTTP und dGTP sowie 5 Einheiten DNA-Polymerase aus E.coli (Klenow-Fragment) im Laufe einer Stunde bei Raumtemperatur aufgefüllt. Die DNA rezirkularisiert man mit Hilfe von 10 Einheiten T₄-DNA-Ligase in 10μΙ der Lösung B bei Zugabe von 1mM ATP im Laufe von 12 Stunden bei 4⁰C. Zum Reaktionsgemisch werden 100μΙ E.coli RFt 1-Zellen, die vorher mit 10OmM CaCI₂ behandelt worden waren (Endkonzentration 5 χ 10⁹ Zellen/ml), zugegeben, um die rekombinanton Plasmid-DNAs zu transformieren. Die Auswahl der Klone erfolgt mit Hilfe der Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA, die im Schnellverfahren isoliert worden war. Das Plasmid mit dem erwarteten Restriktionsspaltmuster erhält die Bezeichnung pHIV24 de!3. Figur 1 zeigt das Konstruktionsschema dieses Plasmids.

4. Transformation der erfindungsgemäßen Plasmide in einen Produzentenstamm

Die Produzentenstämme erhält man durch Transformation von E.coli K802 mit den rekombinanten Plasmiden pHIV24 del 1-3. Die Zellen werden in M9-Medium mit Zusatz von 10g/l Kasaminsäuren, 2g/l Glukose und 0,02g/l Ampizillin bis zu einer optischen Dichte von OD₆W 4-5 kultiviert. Die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und im dreifachen Volumen eines Puffers lysiert, der 0,05 M Tris-HCI, pH 8,0; 0,15 M NaCI; 0,1 % Triton X100; 0,005 M EDTA und 3 mg/ml Lysozym enthält. Nach 30minütiger Inkubation bei 4°C werden die Zellen einem dreimaligen Frieren/Tauen ausgesetzt. Anschließend werden Desoxybribonuklease und MgCI₂ bis zu Endkonzentrationen von 20pg/ml bzw. 1OmM zugegeben und bis 4°C nochmals 30 Minuten inkubiert. Das Lysat wird 30 Sekunden mit Ultraschall behandelt und dann zentrifugiert (1000Ox g, 4⁰C). Die Charakterisierung der erfindungsgemäßen rekombinanten Kapsidstruktur wird wie folgt vorgenommen: Bestimmung der HBcAg- und HBeAg-Aktivität mittels radialer Immundiffusion (RID) Die HBcAg- und HBeAg-Titer bestimmt man mit Hilfe der radialen Immundiffusion nach Ouchterlony. Dafür bereitet man eine Verdünnungsreihe |1:2",nä1| des Zellysats und titriert gegen humane Antiseren, die sowohl Antikörper gegen HBcAg als auch HBeAg besitzen. Als Standard verwendet man gereinigtes HBcAg aus rekombinanten Bakterien (1 mg/ml) und Standard-HBeAg des Menschen. Die Ergebnisse zeigen, daß die Proteine HBcAgA-HIVp24 del 1-3 HBcAg-Aktivität besitzen. Die Ergebnisse der Titration sind in der Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

HBcAg-Aktivität der in E.coli K802 synthetisierten Proteine HBcAgA-HIVp24 del 1-3, die von den rekombinanten Plasmid-DNAs pHIV24 del 1-3 kodiert werden

Stamm OD₆₆O Titer im RID Protein HBcAg Ertrag des

mg/ml mg/ml Produkts (%)

E.COÜK802	4,0	1:2	30,0	0,16	0,5
(pHIV24del1)
E. coli K 802	4,0	1:2	30,0	0,16	0,5
(pHIV24del2)
E.COÜK802	4,0	1:128	30,0	10	33
(pHIV24del3)

Bestimmung der immunologischen Aktivität der rekombinanten Proteine HBcAg A-HIVp 24 del 1-3 mittels Immunoblotting Für das Immunoblotting resuspendiert man die Zellen (6mg) in 100μΙ Probenpuffer nach Laemmli, der 2% SDS und 2% Mercaptoäthanol enthält, und lysiert durch 2minütiges Erhitzen im kochenden Wasserbad. Die erhaltenen Lysate (2-4mg/ml Protein)trägtmanaufeinGradientenpolyacrylamidgel(12-23%)auf(Größe150mm χ 150mm χ 0,75 mm). Die Elektrophorese wird 15 Stunden bei einer Stromstärke von 7 mA durchgeführt.

Nach der Elektrophorese überträgt man die Proteine auf Nitrozellulose HAWP (12). Die Filter werden mit den murinen monoklonalen ai li-p24-Antikörpern 4/1/1 bzw. 13/5 (Verdünnungen von 1:200 in TBS-Puffer: 5OmM Tris-HCI, pH 7,5; 15OmM NaCI; 0,1 % Triton X100 + 1 % BSA) 15 Stunden bei 20⁰C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in TBS-Puffer inkubiert man die Filter 2 Stunden bei 20°C mit dem Peroxidase-markierten Konjugat der Antikörper gegen Maus-Immunglobulin (Verdünnung 1:200 in TBS-Puffer + 1 % BSA). Die Filter spült man mit TBS-Puffer (3-5x) und entwickelt mit Diaminobenzidin. Im Parallelansatz inkubiert man die Filter mit dem monoklonalen Antikörper 14E11 (anti-HBc) in einer Verdünnung von 1:50 15 Stunden bei 20°C, wäscht wie oben beschrieben, und inkubiert mit dem Peroxidase-Konjugat des Proteins A von S.aureus (Verdünnung 1:500) 2 Stunden bei 20⁰C. Nach Inkubation werden die Filter mit TBS-Puffer gewaschen (3-5x) und mit Diaminobenzidin entwickelt.

Die Zellysate der Produzentenstämme weisen dabei das Auftreten spezifischer Färbungszonen auf, welche Proteinen mit Molekulargewichten von 34,6/25,7/24,8kD (Länge 333,247,239 Aminosäuren) entsprechen, was in Übereinstimmung mit dem Konstruktionsschema in Figur 1 steht. Die Kontrollysate von E. coli K802-Zellen (pHBc3) weisen solche Zonen nicht auf.

Claims (3)

1. Patentansprüche:

   1. Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Proteine HBcAgA-HIVp24 del 1-3, die antigene Eigenschaften des Coreproteins ρ 24 des HIV 1 und HBe-Aktivität besitzen, dadurch gekennzeichnet, daß die 39C-terminalen Aminosäuren des HBcAg durch unterschiedlich lange Sequenzen des HIV1-p24 ersetzt sind.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinanten Plasmid-DNAs pHJV24 del 1-3, bestehend aus

   - derDNAdesPlasmidspHBc5 mit einer Länge von 6700Bp, die das Gen bla, das die Ampizillin-Resistenz vermittelt, und das HBc-Gen, unter Kontrolle eines Tandempromotors P_trp, enthält, und

   - den Fragmenten des gag-Gcns des HIV 1, die den Sequenzen zwischen den Restriktionsorten Pvu N₆₉₁ und Hind IN₁₂₅₆ (del 1), Sph I₉₉₁ (del2) bzw. Pst I₉₆₁ (del 3) entsprechen und 12C-terminale Aminosäurendes ρ 17 und unterschiedlich lange N-terminale Abschnitte des p24 (del 1: Aminosäuren 1-177; del 2: 1-88 bzw. del3: 1-78) kodieren und im Restriktionsort Eco Rider DNA des Plasmids pHBc5 eingebaut sind,

   die Synthese der rekombinanten Proteine HBcAgA-HIVp24 dol 1-3 ermöglichen.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Produzentenstämme der Proteine HBcAgA-HIVp24 del 1-3 durch Transformation von E.coli K802-Zellen mit den rekombinanten Plasmid-DNAs pHIV24 del 1-3 erhält.