DD292273A5 - Verfahren zur herstellung von heteromyelomzellinien - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Heteromyelomzellinien, die als Fusionspartner fuer Primatenzellen eingesetzt werden koennen und damit auch der Herstellung von monoklonalen Primatenantikoerpern dienen und in verschiedenen Gebieten der Biowissenschaften einschlieszlich der Medizin eingesetzt werden koennen. Das erfindungsgemaesze Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dasz Lymphozyten nichthumaner Primaten mit Mausmyelomzellen fusioniert, unbegrenzt teilungsfaehige Hybride, die Oberflaechenantigene von Primaten aufweisen, ausgewaehlt und Enzym-defekte Klone, die keine eigenen Immunglobuline produzieren selektiert werden. Die erfindungsgemaesz erhaltenen Maus-Affe-Heteromyelomzellinien D15-GF4, D15-KH5, D15-SD11 wurden am Zentralinstitut fuer Molekularbiologie unter folgenden Nummern hinterlegt: ZIM-0356, ZIM-0357 und ZIM-0355. Fuer die hinterlegten Zellinien wurde die Stabilitaet der Expression von Oberflaechenantigenen nichthumaner Primaten, des Wachstums und der HAT-Sensitivitaet fuer einen Zeitraum von mehr als 6 Monaten nachgewiesen.{Heteromyelomzellen; Maus-Affe-Zellinien; Lymphozyten; Mausmyelomzellen; Fusion; Antikoerper, monoklonale; Primatenantikoerper; Oberflaechenantigene; Klone; Enzym-defekte; Hinterlegung}
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Heteromyelomzellinien, die als Fusionspartner für Zellen von Primaten und damit unter anderem zur Herstellung monoklonaler Primatenantikörper eingesetzt werden können. Anwendungsgebiet der Erfindung sind verschiedene Gebiete der Biowissenschaften einschließlich Medizin.
Zellfusionen mit Lymphozyten nichthumaner Primaten wurden im Vergleich zu Fusionen mit Maus-, Ratten- oder Menschzellen bisher in sehr geringer Zahl durchgeführt (H.A. Stanley und R.T. Reese, Proc. Natl. Acad. Sei. 1985,82,6272; F. C. M. van Meel et al., J. Immunol. Meth. 1985,80,267; J.E. von Meurs und H.Jonker, J. Immunol. Meth. 1986,95,123; DE 3616324 A1,1986). Dies ist vor allem auf das Fehlen geeigneter Fusionspartner und der damit verbundenen Instabilität und geringen Ausbeute der Antikörperproduktion der Zellhybriden zurückzuführen.
Die wenigen Fusionen wurden bisher als Hybridisierung zwischen den Lymphozyten der nichthumanen Primaten und Myelomzellen von Mäusen durchgeführt. Die Ausbeute Antikörper produzierender Klone war hierbei, im Vergleich zu Maus-Maus-, Maus-Ratte-oder Ratte-Ratte-Fusionen sehr gering (H.A.Stanley und R.T.Reese, Proc. Natl. Acad. Sei. 1985,82,6272; F.C.M. van Meel et al., J. Immunol. Meth. 1985,80,267; J.E. van Meurs und H. Jonker, J. Immunol. Meth. 1986,95,123; DE 3616324 A1,1986).
Darüber hinaus erwiesen sich die Hybridzellen als sehr instabil und damit nicht geeignet für eine ausreichende Antikörperproduktion (J.E. van Meurs und H. Jonker, J. Immunol. Meth. 1986,95,123; DE 3616324 Al, 1986). Für verschiedene Fragestellungen auf dem Gebiet der medizinisch-biologischen Grundlagenforschung, sowie der praktischen Anwendung in den verschiedenen Zweigen der Biowissenschaften einschließlich der Medizin ist es jedoch wichtig, Antikörper von Primaten einzusetzen.
Da die Herstellung monoklonaler Antikörper des Menschen sehr schwierig ist, insbesondere wegen der Probleme bei der Immunisierung, erscheint die Herstellung und der Einsatz von monoklonalen Antikörpern nichthumaner Primaten als ein Weg, diese Schwierigkeiten zu umgehen
Hierbei spielt die Entwicklung von brauchbaren Fusionspartnern eine wesentliche Rolle.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung hat das Ziel, Maus-Affe-Heteromyelomzellinien herzustellen, die als Fusionspartner für nichthumane Primatenlymphozyten einsetzbar sind und die Herstellung von stabilen Hybridklonen, die monoklonale Antikörper nichthumaner Primaten in guten Ausbeuten und guter Stabilität produzieren, ermöglichen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, Maus-Affe-Heteromyelomzellinien herzustellen, die Eigenschaften beider Elternzellen in sich vereinigen, und keine eigenen Immunglobuline produzieren.
Darüber hinaus sollen diese Zellinien einen Enzymdefekt aufweisen, der bei Zellfusionsexperimenten mit diesen Zellen den Einsatz von Selektionsmedien ermöglicht.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst, indem man Lymphozyten nichthumaner Primaten mit HGPRT-defekten X63-Ag 8.653 Mausmyelomzellen oder fluoreszenzmarkierte Lymphozyten nichthumaner Primaten mit HGPRT-defekten X63-Ag8.653 Mausmyelomzellen oder Lymphozyten nichthumaner Primaten mit fluoreszenzmarkierten HGPRT-defekten X63-Ag 8.653 Mausmyelomzellen oder fluoreszenzmarkierte Lymphozyten nichthumaner Primaten mit fluoreszenzmarkierten HGPRT-defekten X63-Ag 8.653 Mausmyelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die unbegrenzt teilungsfähigen Hybridklone ausselektiert, unter diesen mittels Radioimmunbindungstest diejenigen ermittelt, die Oberflächenantigene von nichthumanen Primaten
expremieren, davon wiederum diejenigen ausselektiert, die selbst keine Immunglobuline produzieren und letztlich von diesen die 8-Azaguanin-resistenten/HAT-sensitiven als Heteromyelomzellinien etabliert.
Die Fusion und Selektion erfolgen in an sich bekannter Weise (Köhler und Milstein, Nature 256,1975,495-497) oder mit Hilfe des Fluoreszenz aktivierten Zellsorters.
Die Selektion mit Hilfe des Fluoreszenz aktivierten Zellsorters kann-wie in DD-PS 249492 beschrieben-durch Markierung beider Fusionspartner mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern und Ermittlung der Hybridklone mit Doppelfluoreszenz erfolgen. In einer modifizierten Variante werden nur die Mausmyelomzellen oder die Lymphozyten nichthumaner Primaten mit einem Fluoreszenzmarker versehen und mit den Lymphozyten nichthumaner Primaten oder den Mausmyelomzellen verschmolzen. Anschließend werden die Zellen mit Hilfe des Fluoreszenz aktivierten Zellsorters in fluoreszierende Myelom- und Hybridzellen sowie nichtfluoreszierende Primatenzellen oder in fluoreszierende Primaten- und Hybridzellen sowie nichtfluoreszierende Myelomzellen getrennt.
Danach wird, mit immunologischen Methoden, die Expression von Oberflächenantigenen nichthumaner Primaten auf den permanent wachsenden Hybridzellen untersucht, um nachzuweisen, daß die Hybridzellen Eigenschaften beider Elternzellen besitzen.
Von den Oberflächenantigen positiven Zellen werden dann in einem Festphasen-Radioimmuntest diejenigen bestimmt, die selbst keine Antikörper nichthumaner Primaten produzieren.
Die nichtproduzierenden Hybridzellen werden ausgewählt und anschließend in Anwesenheit von 8-Azaguanin (Selektion des HGPRT-Defektes) kultiviert. Die 8-Azaguanin-resistenten/HAT-sensitiven Klone werden danach in der Zellkultur weitervermehrt und in flüssigem Stickstoff eingelagert.
Die bei der erfindungsgemäßen Herstellung erhaltenen Heteromyelomzellinien D15-GF4, D15-KH5 und D 15-SD11, die Primaten- und Mauszellcharakteristika aufweisen und selbst keine Immunglobuline produzieren, wurden im Zentralinstitut für Molekularbiologie unter folgenden Nummern hinterlegt: ZIM-0356, ZIM-0357 und ZIM-0355.
Für die erfindungsgemäß erzeugten Zellinien wurde die Stabilität der Expression von Oberflächenantigenen nichthumaner Primaten, des Wachstums und der HAT-Sensitivität für einen Zeitraum von mehr als 6 Monaten nachgewiesen.
Die erfindungsgemäß erzeugten Heteromyelomzellinien sind als Fusionspartner für unterschiedliche Primatenlymphozyten einsetzbar und ermöglichen die Herstellung von stabilen Hybridklonen, die monoklonale Primaten-Antikörper in guten Ausbeuten produzieren.
Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel erläutert werden, ohne sie dadurch einzuschränken.
Ausführungsbeispiel -
1. Herstellung der Hybride, durch Fusion von Lymphknotenzellen eines Rhesusaffenweibchens (Macaca mulata) mit X63-Ag 8.635 Mausmyelomzellen. Fusion, Kultivierung, Klonierung etc. in Anlehnung an die Arbeit von G. Köhler und C. Milstein, Nature 1975,256,495. Die Myelomzellinie X63-Ag 8.653 wurde von J. F. Kearney et al., J. Immunol. 1979,123,1547, entwickelt.
2. Die erhaltenen Klone wurden, mit Hilfe eines Mausantiserums, im Radioimmunbindungstest auf das Vorhandensein von Primatenantigenen untersucht. Das Serum wurde durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit der humanen Leukämiezellinie Reh (C.Rosenfeld et al., Eur. J. Cancer 1977,13,377) erhalten. Nach Absorption mit X63-Ag8.653 Mausmyelomzellen reagierte dieses Serum nur noch mit Zellen von Primaten, nicht jedoch mit Mauszellen. Die Bindung dieses Mausserums an die Zellen wurde mit radioaktiv (125J) markiertem Anti-Maus-Immunglobulin nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tab. 1: Nachweis von Oberflächenantigenen nichthumaner Primate auf Heteromyelomzellinien mit einem Radioimmunbindungstest
| Klon | Bindung von: | Ma-NS | Ma-Anti-Leukämie |
| PBS/NKS | 1:1000 | 1:1000 | |
| 603 | 570 | ||
| X63-Ag 8.653 | 280 | 631 | 15350 |
| D15-GF4 | 480 | 215 | 12728 |
| D15-SD11 | 205 | 576 | 15972 |
| D 15-KH 5 | 908 | ||
Radioimmunbindungstest:
0,5-1 x 105Zellen werden mit je 100μΙ phosphatgepufferter Kochsalzlösung + 10% neonatalem Kälberserum (PBS/NKS), Mausnormalserum (Ma-NS) 1:1 000 verdünnt in PBS/NKS oder mit Maus-Anti-Leukämie Antiserum (Ma-Anti-Leukämie) 1:1 000 verdünnt in PBS/NKS inkubiert. Das Anti-Leukämie Antiserum wurde gegen Zellen der menschlichen Leukämiezellinie Reh hergestellt. Ma-NS und Ma-Anti-Leukämie wurden vorher mit X63-Ag8.653 Mausmyelomzellen absorbiert. Anschließend erfolgt eine Inkubation mit radioaktiv (125J) markiertem Anti-Maus-Immunglobulin. Werte als counts per minute = cpm.
Die Ergebnisse dieser Tests zeigen, daß die Hybridzellen Primatenantigene exprimieren und damit neben Eigenschaften der Mauselternzellen (unbegrenzte Teilungsfähigkeit) auch Eigenschaften der Primatenzellen aufweisen.
3. Nachfolgend wurden die Klone ausselektiert, die selbst keine Antikörper produzieren. Hierzu wurde mit einem Festphasen-Radioimmuntest, in Anlehnung an beschriebene Methoden (B.Micheeletal., J. Immunol. Meth. 1981,46,41) dielg-Produktion der erhaltenen Klone bestimmt. Für den Test wird Anti-Human Ig an PVC (Tablettenfolie) gebunden, danach erfolgt eine Inkubation mit dem Kulturüberstand und anschließend mit radioaktiv (125 J) markiertem Anti-Human Ig. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tab. 2: Festphasen-Radioimmuntestzum Nachweis derspontanen Antikörperproduktion verschiedener Heteromyelomzellinien
KÜ LY D15-GF4 D 15-SD11 D 15-KH 5 PBS/NKS
Bdg.125J
Anti-Humanlg - 28566 2484 1713 2281 . 2879
Festphasen-Radioimmuntest:
Kulturüberstände (KÜ) von Rhesusaffenlymphozyten (LY), von verschiedenen Heteromyelomzellinien (D 15-) bzw. phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 10% neonatalem Kälberserum (PBS/NKS) wurden mit PVC-Folie, an die Anti-Human-Ig gebunden ist, inkubiert. Anschließend wurde die Bindung von Antikörpern mit radioaktiv (125 J) markiertem Anti-Human-Ig nachgewiesen. Werte als counts per minute = cpm.
Wie aus den Ergebnissen ersichtlich ist, produzieren die Heteromyelomzellklone keine eigenen Immunglobuline.
4. Die Selektion HGPRT-defekter Klone (und damit in HAT-Medium nicht wachsender Zellen) wurde durch Kultivierung in Gegenwart von 8-Azaguanin entsprechend der Standardmethode (J.W. Littlefield, Science 1964,145,709) durchgeführt. Der Nachweis des HGPRT-Defektes wurde für die Klone D15-GF4, D15-KH5 und D 15-SD11 durch ihr Absterben in HAT-Medium nachgewiesen.
5. Die Stabilität der Expression von Oberflächenantigenen nichthumaner Primaten, des Wachstums und der HAT-Sensitivität wurde für die Heteromyelomzellklone D15-GF4, D15-KH5 und D 15-SD11 (hinterlegt am Zentralinstitut für Molekularbiologie unter der Nummer ZIM-0356, ZIM-0357 und ZIM-0355) für einen Zeitraum von mehr als 6 Monaten nachgewiesen.
Claims (2)
- Patentansprüche:1. Verfahren zur Herstellung von Heteromyelomzellinien durch Fusion von Lymphozyten nichthumaner Primaten mit Mausmyelomzellen, gekennzeichnet dadurch, daß man gegebenenfalls fluoreszenzmarkierte Lymphozyten nichthumaner Primaten mit gegebenenfalls fluoreszenzmarkierten HGPRT-defekten X63-Ag 8.653 Mausmyelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die unbegrenzt teilungsfähigen Hybridklone ausselektiert, unter diesen mittels Radioimmunbindungstest diejenigen ermittelt, die Oberflächenantigene von nichthumanen Primaten expremieren, davon wiederum diejenigen ausselektiert, die selbst keine Immunglobuline produzieren und letztlich von diesen die 8-Azaguanin-resistenten/HAT-sensitiven Klone als Heteromyelomzellinien etabliert.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Heteromyelomzellinien, die Oberflächenantigene von nichthumanen Primaten expremieren, selbst keine Immunglobuline produzieren und 8-Azaguanin-resistent/HAT-sensitiv sind, die Maus-Affe-Heteromyelomzellinien D15-GF4, D 15-KH 5 und D 15-SD11 (hinterlegt im Zentralinstitut für Molekularbiologie unter den Nummern ZIM-0356, ZIM-0357 und ZIM-0355) erhalten werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD32476789A DD292273A5 (de) | 1989-01-02 | 1989-01-02 | Verfahren zur herstellung von heteromyelomzellinien |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (1)
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|---|---|
| DD292273A5 true DD292273A5 (de) | 1991-07-25 |
Family
ID=5606434
Family Applications (1)
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD292273A5 (de) |
-
1989
- 1989-01-02 DD DD32476789A patent/DD292273A5/de unknown
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