DD289560A5 - Verfahren zur herstellung von creatinamidinohydrolase - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Creatinamidinohydrolase, bei der in Position 109 der Aminosaeuresequenz des Wildtypenzyms Alanin durch Valin ersetzt ist und gegebenenfalls zusaetzlich eine oder mehrere weitere Aminosaeuren des Wildtypenzyms mutiert sind, ist stabiler als das Wildtypenzym und daher fuer Reagentien besser geeignet. Zur ihrer Herstellung bringt man nach bekannten, gentechnologischen Methoden in einem geeigneten Expressionssystem eine rekombinante DNA zur Expression, welche ein Creatinamidinohydrolasegen enthaelt, das in Position 326 des natuerlichen Gens anstelle von C das Desoxyribonukleotid T enthaelt.{Herstellungsverfahren; neue Creatinamidinohydrolase; stabiler als Wildtypenzym; Expressionssystem}
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Creatinamidinohydrolase.
Die Erfindung betrifft weiter Mutanten der Creatinamidinohydrolase, welche stabiler sind als das Wildtypenzym, und deshalb besser zur enzymatischen Bestimmung des Creatiningehalts im Serum, Plasma oder Harn geeignet sind.
Das Enzym Creatinamidinohydrolase EC 3.5.3.3. findet industriell Anwendung zur Creatininbestimmung. Es wird u. a. in der klinischen Analytik für die Diagnose von Nierenerkrankungen verwendet, bei welchen im Serum oder Urin Creatiningehalte auftreten, die von denen des gesunden Organismus abweichen. Es sind Mikroorganismen bekannt, wie beispielsweise Pseudomonas-Arten, welche unter Induktion durch Creatin in der Lage sind, Creatinamidinohydrolase in einer die Aufarbeitung lohnenden Menge herzustellen, jedoch stellen die erzielbaren Ausbeuten und die Kosten der Isolierung des Enzyms immer noch einen limitierenden Faktor für die industrielle Anwendung des Enzyms dar. Wie in der deutschen Offenlegungsschrift 3500184 beschrieben ist, ist es gelungen, das für die Creatinamidinohydrolase kodierende Gbn aus Pseudomonas putida zu isolieren und beispielsweise in das Plasmid pBR322 einzubringen. Nach Transformation jines Mikroorganismus der Gattung E. coli oder Pseudomonas putida ist es möglich, aus diesen konstitutiv Creatinamidinohydrolase zu gewinnen. Diese gentechnologische Herstellung der Creatinamidinohydrolase ist effektiver und leichter durchzuführen als die Isolierung aus einem induzierten, kein Plasmid enthaltenden Mikroorganismus. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß das daraus gewonnene Wildtypenzym nur beschränkte Detergenz- und thermische Stabilität aufweist und somit für den Einsatz im klinischen Testverfahren nicht optimal geeignet ist.
Mit der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Creatinamidinohydrolase bereitgestellt, die stabiler ist als das Wildtypenzym und daher für Reagentien lie&mr geeignet ist.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Creatinamidinohydrolase-Mutanten bereitzustellen, welche die geschilderten Nachteile des Standes der Technik nicht oder nur in geringerem Maße aufweisen. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch Creatinamidinohydrolase-Mutanten, welche die Reaktion
Creatin + H2O —»Sarcosin + Harnstoff
entsprechend dem Wildtypenzym katalysieren, und dadurch gekennzeichnet sind, daß gegenüber dem Wildtypenzym mindestens ein Aminosäureaustausch an der Position 109 stattgefunden hat. Dieser Austausch beuifft die Aminosäure Alanin, die durch Valin ersetzt wurde. Das so mutierte Enzym besitzt eine weit bessere Stabilität als das Wildtypenzym. Abgesehen von diesem Aminosäureaustausch können ohne Beeinträchtigung der enzymatischen Aktivität auch andere Mutationen auf Aminosäureebene vorliegen und dabei sogar eine noch höhere Stabilität erreicht werden. Ein bevorzugtes Enzym enthält außer dem Aminosäureaustausch an Position 109 einen weiteren Aminosäureaustausch. Weitere Gegenstände der Erfindung sind die Plasmide pBT109 und pBT119. Diese enthalten das Creatinamidinohydrolasegen des Wildtyps, wobei in beiden Plasmiden jedoch auf DNA-Ebene bereits der Aminosäureaustausch an der Position 109 des Enzyms und darüber hinaus bei pBT119 auch in einer weiteren Position, nämlich Position 355 in Form eines Wechsels von VaI nach Meth durch entsprechenden Austausch der im Wildtypgen diese Aminosäuren codierenden Tripletts festgelegt ist. Durch Sequenzierung von pBT119 wurde festgestellt, daß an Position 1063 der Sequenz im kodierenden Strang ein G durch A ersetzt ist (G —»A), so daß das Triplett GTG des Wildtyps in ATG umgewandelt ist. Ein bevorzugter Mikroorganismus der Gattung E. coli gemäß der Erfindung, E. coli, DSM 4105, enthält das Plasmid pBT109, ein weiterer bevorzugter Mikroorganismus E. coli, DSM 4106 enthält erfindungsgemäß das Plasmid pBT119. V. eitere bevorzugte Mikroorganismen sind erfindungsgemäß solche der Gattung E. coli oder Pseudomonas putida, welche konstitutiv eine Creatinamidinohydrolase, welche die genannten Mu'.ationen enthält, exprimieren.
Diu Herstellung der erfindungsgemäßen mutierten Enzyme erfolgt, indem man nach an sich bekannten gentechnologischen Methoden eine rekombinante DNA in einem «jeeigneten Expressionssyst ,m zur Expression bringt, welche ein Creatinamidinohydrolasegen enthält, welches die Sequenz des Wildtypgens im wesentlichen aufweist, aber mindestens in Position 326 des natürlichen Gens anstelle des Desoxyribonukleotids C ein T enthält. Vorzugsweise wird ein Gen exprimiort, bei dem außerdem an weiteren Positionen eine Base ausgetauscht wurde. Besonders bevorzugt liegt in Position 1063 anstelle von G ein A vor.
Bevorzugt wird als rekombinante DNA eines der Plasmide pBT109, DSM4108P oder pBT119, DSM4107P exprimiert. Als rekombinante DNA kann aber auch jegliche rekombinante DNA verwendet werden, welche die in der DE 35 00184 A1 offenbarte DNA-Sequenz für das Wildtypenzym, oder ein nach dem genetischen Code für die gleiche Aminosäuresequenz kodierendes Äquivalent davon enthält, wobei jedoch an der Position 326 des natürlichen Gens anstelle von C das Desoxyribonukleotid T enthalten ist. In einer solchen rekombinanten DNA kann zusätzlich ein weiterer Basenaustausch, der zu einer weiteren Aminosäuremutation im Enzym führt, enthalten sein. Vorzugsweise ist dabei in Position 1063G gegen A ausgetauscht. Als Expressionssystem wird ein Mikroorganismus der Gattung E. coii oder Pseudomonas putida bevorzugt. ;itsonders bevorzugt verwendet man den Mikroorganismus E. coli ED 8654, DSM 2102 oder Pseudomonas putida, DSM 2106. Weitere erfindungsgemäße Herstellungsverfahren sind durch das Züchten der bevorzugten Mikroorganismen E. coli, DSM 4105 und C. coli, DSM 4106 gekennzeichnet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen, mutierten Creatinamidinohydrolasen, welche stabiler als das Wildtypenzym sind, zur Bestimmung des Creatiningehalts im Serum, Plasma oder Harn. Untersuchungen der in der DE 3500184 A1 beschriebenen, klonierten Creatinamidinohydrolase haben ergeben, daß das Enzym den geschwindigkeitsbestirr menden Schritt in der Reaktionsabfolge
Creatinamidino-Creatin + H2O —— »Sarcosin + Harnstoff
katalysiert. Eine Steigerung der Geschwindigkeit des Substratumsatzes ist unter den als optimal erarbeiteten Bedingungen durch Erhöhung der Enzymmenge nicht zu erzielen. Unter Testbedingungen zur Bestimmung des Creatiningehalts im Serum, Plasma oder Harn bei 370C weist das Enzym eine beschränkte Stabilität auf, was zu einer Verringerung des Substratumsatzes bei deroben erwähnten Temperaturführt. Die erfindungsgemäße Creatinamidinohydrolase, die eine Mutation der Aminosäure 109 des Wildtypenzyms von Alanin in Valin enthält, hat im Vergleich, unter verschiedenen Testbedingungen (Detergenzzusatz), bei ungefähr gleicher Ausgangsenzymaktivität bereits eine stark erhöhte Detergenzstabilitä», wie die in Tabelle I wiedergegebenen Vergleichsversuchsergebnisse zeigen. Das Temperaturverh'alten unter optimalen Bedingungen wird in Tab. Il dargestellt.
| Zeit | Creatinpmidinohydrolase- | Vergleich | Wildtyp | Creatinamidinohydrolase-Mutante | gemäß Erfindung | 100%) | Testbedingungen | |
| (Minuten) | (DE3500184A1) | (Aktivität | (Aminosäure 109 = VaI) | (Aktivität | 100%) | |||
| (DSM 3143) | (Restaktivität | (DSM4105) | (Restaktivität = | 91%) | ||||
| (Restaktivität | (Restaktivität = | 83%) | ||||||
| O | 3,3 U/ml | (Rostaktivität | = 100%) | 3,0 U/ml | (Restaktivität = | 100%) | Testmixi aus | |
| I | 1b | 1,9 U/ml | (Aktivität | = 59%) | 3,0 U/ml | (Aktivität | 91 %) | Testkombination |
| 30 | 0,6 U/ml | (Restaktivität | = 18%) | 2,7 U/ml | (Restaktivität = | 91 %) | „Creatinin-PAP" | |
| 60 | 0,2 U/ml | (Rostaktivität | 6%) | 2,5 U/ml | (Restaktivität = | 71 %) | (BMNr.839434) | |
| 0 | 3,3 U/ml | (Restaktivität | = 100%) | 3,0 U/ml | (Restaktivität = | in125mmol/l | ||
| Il | 15 | 0,7 U/ml | = 21 %) | 2,7 U/ml | Phosphatpuffer | |||
| 30 | 0,0 U/ml | 0%) | 2,7 U/ml | + Datergenz | ||||
| 60 | 0,0 U/ml | 0%) | 2,1 U/ml |
Die Enzyme wurden unter den in der Tabelle angegebenen Bedingungen inkubiert und anschließend eine Enzymbestimmung unter Verwendung der Testkombination „Harnstoff (BM Best.-Nr. 124770) durchgeführt.
Enzymbestimmung unter optimalen Bedingungen bei verschiedenen Temperaturen Testbedingungen: 20mmol/l Phosphat-Puffer, pH 8,0
1. = Creatinamidinohydrolase-Wildtyp: 1,05mg Protein/ml (8,0U/mg)
2. = Creatinamidinohydrolase-Mutar.te: 1,10 mg Protein/ml (8,7 U/mg) (Aminosäure 109 = VaI)
| Creatinase | Restaktivität in % (Inkubation in min) | 6u | 120 | 2. (DSM 4105) | 60 | 120 | |
| Temp. | 1.(DSM 3143) | 86 | 80 | 34 | 96 | 90 | |
| 30 | 36 | 13 | 100 | 73 | 63 | ||
| 370C | 100 | 0,4 | 0 | 84 | 2 | 0 | |
| 420C | 57 | - | - | 42 | - | - | |
| 470C | 1 | 3 | |||||
| 52°C | 0 | ||||||
zum Wildtypenzym (Beispiel 1, Tabelle III).
Medium
0,4% Glucose10")mmo!/l Phosphat-Puffer
ausE.coli 15 30 45 60 min
(kodierendes Plasmid) (% der Ausgangsaktivität)
'DSM 3143 (pBT2a-1 DSM 3148 P) 69 Ü 39 27
ausE.coli
(kodierendes Plasmid) Km,mmol/I
Die stabile Creatinamidinohydrolasemutante aus dem Mikroorganismus E. coli, DSM 4105, der das Plasmid pBT 109 enthält, wurde aus einer 100-l-Fermentation, wie in der DE 3500184A1 beschrieben, isoliert. Es wurden 121g Protein mit einer spezifischen Aktivität von 10,4U/mg erhalten. Dies entspricht einer Ausbeute von 63%.
I0 30 50
ATGCAAATGCCCAAGACGCTCCGCATCCGTAACGGCGACAAGGTTCGCTCCACCTTCTCC MetGlnMetProLysThrLeiiArglleArgAsnGlyAspLysyalArgSerThrPheSer
70 90 II0
6CCCAGGAATACGCCAATCGCCAAGCCAGGCTGCGCGCCCACCTGGCGGCGGAGAACATc AlaGlnGluTyrAlaAsnArgGlnAlaArgLeuArgAlaHisLeuAlaAlaGluAsnlIe
I30 I50 I70
GACGCCGCGATCTTCACCTCGTACCACAACATCAACTACTACTCCGACTTCCTCTACTGC AspAlaAlallePheThrSerTyrHisAsnlleAsnTyrTyrSerAspPheLeuTyrCys
I90 2I0 230
TCCTTCGGCCGCCCCTACGCGTTGGTGGTGACCCAGGACGACGTCATCAGCATCAGCGCC SerPheGlyArgProTyrAlaLeuValUalThrGlnAspAspVallleSerlleSerAla
250 270 290
AACATCGACGGCGGCCAGCCGTGGCGCCGCACCGTCGGCACCGACAACATCGTCTACACC AsnlleAspGlyGlyGlnProTrpArgArgThrValGlyThrAspAünlleyalTyrThr
3I0 330 350
gagtggcagcgcgataactacttcgtcgccatccagcaggcgttgccgaaggcccgccgc AspTrpGlnArgAspAsnTyrPheyalAlalleGlnGlnAlaLeuProLysAlaArgArg
370 390 4I0
ATCGGCATCGAACATGACCACCTGAACCTGCAGAACCGCGACAAGCTGGCCGCGCGCTAT IIeGIyIIeGIuHisAspHisLeuAsnLeuGlnAsnArgAspLysLeuAlaAlaArgTyr
430 450 470
CCGGACGCCGAGCTGGTGGACGTGGCCGCCGCCTGCATGCGTATGCGCATGATCAAATCC ProAspAlaGluLeuValAspUalAlaAlaAlaCysMetArgMetArgMetlleLysSer
490 5I0 530
GCCGAAGAGCACGTGATGATCCGCCACGGCGCGCGCATCGCCGACATCGGTGGTGCGGCG AIaG)u&luHisUalMetIleArgHisGlyAlaArglleAlaAspIIeGIyGIyAIaAIa
550 570 590
GTGGTCGAAGCCCTGGGCGACCAGGTACCGGAATACGAAGTGGCGCTGCATGCCACCCAG ValUaiGluAlaLeuGlyAspGlnllalProGluTyrGluValAlaLeuHisAlaThrGln
610 630 650
GCCATGGTCCGCGCCATTGCCGATACCTTCGAGGACGTGGAGCTGATGGATACCTGGACC AlaMetValArgAlalleAlaAspThrPheGluAspValGluLeuMetAspThrTrpThr
670 690 710
TGGTTCCAGTCCGGCATCAACACCGACGGCGCGCACAACCCGGTGACCACCCGCAAGGTG TrpPheGlnSerGlylleAsnThrAspGlyAlaHisAsnProValThrThrArgLysyal
730 750 770
AACAAGGGCGACATCCTCAGCCTCAACTGCTTCCCGATGATCGCCGGCTACTACACCGCG AsnLysGlyAspIleLeuSerLeuAsnCysPheProMetIIeAIaGlyTyrTyrThrAla
790 810 830
mGAGCGCACCCTGTTCCTCGACCACTGCTCGGACGACCACCTGCGTCTGTGGCAGGTC LeuGluArgThrLeuPheLeuAspHisCysSerAspAapHisLeuArgLeuTrpGlnVal
850 870 890
AACGTCGAGGTGCATGAAGCCGGCCTGAAGCTGATCAAGCCCGGTGCGCGTTGCAGCGAT AsnValGluUalHisGluAlaGlyLeuLyaLeuIleLysProGlyAlaArgCysSerAsp
910 930 950
ATCGCCCGCGAGCTGAACGAGATCTTCCTCAAGCACGACGTGCTGCAGTACCGCACCTTC IleAlaArgGluLeuAsnGluIlePheLeuLysHisAspyalLeuGlnTyrArgThrPhe
970 990 1010
GGCTACGGCCACTCCTTCGGCACGCTCAGCCACTACTACGGCCGCGAGGCCGGGTTGGAA GlyTyrGlyHisSerPheGlyThrLeuSerHisTyrTyrGlyArgGluAlaGlyLeuGlu
1030 1050 1070
CTGCGCGAGGACATCGACACCGTGCTGGAGCCGGGCATGGTGGTGTCGATGGAGCCGATG LeuArgGluAsoIleAspThrUalLeuGluProGlyMetValValSerMetGluProMet
1090 1110 1130
ATCATGCTGCCGGAAGGCCTGCCGGGCGCCGGTGGCTATCGCGAGCACGACATCCTGATC IleMetLeuProGluGlyLeuProGlyAlaGlyGlyTyrArgGluHisAspIleLeuIle
1150 1170 1190
6TCAACGAGAACGGTGCCGAGAACATCACCAAGTTCCCCTACGGCCCGGAGAAAaACATC ValAsnGluAsnGlyAlaGluAsnlleThrLysPheProTyrGlyProGluLysAsnlle
1210
ATCCGCAAATGA IleArgLysEnd
Claims (12)
1. Verfahren zur Herstellung einer neuen Creatinamidinohydrolase, welche die Reaktion
Crea'in + H2O -» Sarcosin + Harnstoff
katalysiert, dadurch gekennzeichnet, daß man nach bekannten, gentechnologischen Methoden in einem geeigneten Expressionssystom eine rekombinante DNA zur Expression bringt, welche ein Creatinamidinohydrolasegen enthält, das in Position 326 des natürlichen Gens anstelle von C das Oesoxyribonukleotid T enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als rekombinante DNA das Plasmid pBT109, DSM4108Pexprimiert.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine rekombinante DNA, welche die in Fig. 1 dargestellte Sequenz oder ein nach dem genetischen Code für die gleiche Aminosäuresequenz kodierendes Äquivalent davon enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man nach bekannten gentechnologischen Methoden in einem geeigneten Expressionssystem eine rekombinante DNA zur Expression bringt, welche ein Creatinamidinohydrolasegen enthält, welches zusätzlich zu der Mutation der Base C in T an der Position 326 des natürlichen Gens eine weitere Mutation enthält, die einen weiteren Aminosäureaustausch im Enzym bewirkt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein rekombinantes Creatinamidinohydrolasegen exprimiert, welches in Position 1063 eine Mutation der Base G in A enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als rekombinante DNA das Plasmid pBT119, DSM 4107 P exprimiert.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Expressionssystem einen Mikroorganismus der Gattung E. colli oder Pseudomonas putida verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man E. coli ED 8654, DSM 2102 verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Pseudomonas putida, DSM 2106 verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man E. coli, DSM 4105 züchtet.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 4,5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß man E. coli, DSM 4106 züchtet.
12. Verfahren eines Enzyms; hergestellt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zui Bestimmung des Creatiningehalts im Serum, Plasma oder Harn eingesetzt wird.
Applications Claiming Priority (1)
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| SU1731066A3 (ru) | 1992-04-30 |
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