DD289135A5 - Verfahren zur bestimmung reduzierender oder oxidierender stoffe - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung reduzierender oder oxidierender Stoffe, insbesondere von H2O2 bzw. H2O2-erzeugenden Stoffen. Die Erfindung ist auf den Gebieten der medizinischen Diagnostik, der biotechnologischen Prozeszkontrolle und der Lebensmittelchemie anwendbar. Dabei kommen Indikator-Reagenzphasen zum Einsatz, die auf traegerfixierten Redoxmetallionen-Chelaten basieren. Als Chelatbildner werden Verbindungen angewendet, die mit Redoxmetallionen, vorzugsweise mit * und/oder Fe(III)- oder * und/oder * Farbchelate unterschiedlicher spektraler Eigenschaften bilden. Als Traeger dienen polymere oder makromolekulare Verbindungen und/oder H2O2-erzeugende Proteine, z. B. Oxidasen. Die Traeger gestatten, gegebenenfalls in Schichtform oder als Formkoerper, bei Kontakt mit dem Analysengut die Aufnahme des Analyten. Ein reduzierender oder oxidierender Stoff wird mittels der Indikator-Reagenzphasen durch Farbaenderung, Farbvertiefung oder Farbaufhellung konzentrationsabhaengig angezeigt und visuell oder photometrisch ausgewertet. Anschlieszend wird die Indikator-Reagenzphase durch Behandlung mit ueblichen Oxidations- bzw. Reduktionsmitteln auf einen Redox- (Farb-) Ausgangszustand fuer einen erneuten Einsatz wahlweise eingestellt.{Redoxmetallionen-Farbchelate, traegerfixiert; Indikator-Reagenzphase; Stoffe, reduzierende, oxidierende; H2O2; Auswertung, photometrische; Diagnostik, medizinische}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung reduzierender und/oder oxidierender Stoffe, vorzugsweise H₂-O₂-erzeugender Stoffe bei Anwesenheit von reduzierenden Stoffen im Analysengut.

Anwendungsgebiet der Erfindung sind die medizinische Diagnostik, die biotechnologische Prozeßkontrolle und die Lebensmittelchemie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

H,O₂-erzeugende Oxidase/Substrat-Systeme bilden häufig die Grundlage für die quantitative Bestimmung von Stoffen (Analyten) bei folgendem Reaktionsablauf:

1.) AnalyU= Oxidase-Substrat) + O₂ ⁰"¹""" Produkt + H₂O₂ 2.) H₂O₂ + 2H^+Indiktl<"^iy*^t6ni „opt. Signal" + 2H₂O

Dementsprechend sind zahlreiche Analysenverfahren bekannt geworden, wobei die H₂O₂-lndikatorreaktionen

a) Peroxidase-katalysiert,

b) Katalase-katalysiertoder

c) ohne Enzymkatalyse verlaufen können.

Die Indikatorsysteme werden in Form analytischer Elemente, z.B. Teststreifen, oder in Lösung angewendet. Die Peroxidasekatalysierten Indikatorsysteme sind durch eine große strukturelle Vielfalt der eingesetzten Farbstoff-bildenden Η-Donator- bzw. e-Donator-Ausgangsstoffe gekennzeichnet. Dieser Indikatorreaktion haften jedoch als wesentliche Nachteile

- die begrenzte Stabilität und die Kosten der Peroxidase und

- die Störanfälligkeit der Indikatorreaktion an.

Indikatorreaktionen der Gruppen b), die vergleichsweise zu denen der Gruppe a) weit weniger häufig eingesetzt werden, besitzen analoge Nachteile wie bei Gruppe a) angeführt.

Mit Ausnahme eines Verfahrens (vgl. DD 258474), das von trägerfixierten oxidativen Kupplungs-Stoffkomponenten und/oder p-Phenylendiaminen ausgeht, sind die bisher bekannt gewordenen H₂O₂-lndikatorsysteme vom Typ a) bis c) nur einmalig einsetzbar und nicht regenerierbar.

Ein Mangel aller bisher bekanntgewordenen H₂O_rlndikatorsysteme der Gruppen a) bis c) besteht darin, daß bei Vorliegen reduzierender Stoffe, z. B. Ascorbat, im Analysengut, z. B. in Körperflüssigkeiten, infolge verminderter Farbstoffbildung falsche Werte resultieren können. Der Mangel wird zwar durch Zusatz von Ascorbatoxidase (vgl. z.B. EP186134, DD 130178) oder von oxidierenden Stoffen (vgl. z. B. EP 243126, DD 251002) umgangen, jedoch machen sich die Zusätze bei der Anwendung der Verfahren durch Erhöhung der Kosten je Testansatz bzw. durch eine Erhöhung der Komplexizität des analytischen Reaktionssystems unvorteilhaft bemerkbar.

Bekanntermaßen werden Redoxmetallionen-Farbchelate in gelöster Form zur photometrischen Bestimmung von Peroxiden (siehe z.B. bei W.RICK und M.HOCKEBORN, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 20,745 [1982]) bzw. von Ascorbat (vgl. z.B.

DE 15981359, angewendet, was jedoch für einen mehrfachen Indikator-Einsatz ungeeignet ist.

Enzymfreie regenerierbare Indikator-Reagensphasen, die wahlweise auf einen bestimmten Redox-(Farb-)Ausgangszustand einstellbar sind und die Bestimmung sowohl oxidierender als auch reduzierender Stoffe gestatten, sind bisher nicht bekannt geworden.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung sowohl reduzierender als auch oxidierender Stoffe bereitzustellen, bei dem ein Peroxidase- bzw. Katalase-freies Indikatorsystem eingesetzt wird, das bei geringen Kosten auf einfachen Ausgangsstoffen basiert, regenerierbar und somit für den mehrmaligen Gebrauch einsetzbar ist und wahlweise auf einen bestimmten Redox-(Farb-)Ausgangszustand eingestellt werden kann. Darüber hinaus soll das Indikatorsystem die Bestimmung H₂O₂-erzeugender Stoffe in Gegenwart störender reduzierender Stoffe im Analysengut gestatten.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Bestimmung reduzierender und/oder oxidierender Stoffe zur Verfügung gestellt, bei dem Indikator-Reagensphasen, bestehend aus trägerfixierten Redoxmetallionen-Chelaten, zum Einsatz kommen und eine visuelle oder photometrische Auswertung der durch das Indikatorsystem angezeigte konzentrationsabhängigen Farbänderung, Farbvertiefung oder Farbaufhellung erfolgt. Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von H₂O₂, H₂O₂-eizeugenden Stoffen oder H₂O₂-erzeugenden Proteinen oder anderen oxidierenden Stoffen. Die trägerfixierten Redoxmetallionen-Chelöte werden aus einem oder mehreren reaktiven Chelatbildnern und einem polymeren oder makromolekularen Träger und/oder einem Protein als Träger, vorzugsweise einem H₂O₂-erzeugenden Protein, durch kovalente Kopplung hergestellt. Die reaktiven Chelatbildner besitzen Carbonsäurechlorid-, Sulfonsäurechlorid-, NH₂- oder OH-Gruppierungen. Als Träger werden polymere oder makromolekulare Verbindungen eingesetzt, die OH- und/oder NH₂-Gruppierungen enthalten. Beispielsweise kommen Phenolharze, Resole, Novolake, Cellulose, Cellulosederivate oder andere Polysaccharide, Kollagen, H₂O₂-erzeugenc^;e Proteine, wie z. B. Oxidasen, andere Proteine, NH₂- oder OH-funktionalisierte Gläser, aktive Methylengruppen· enthaltende Verbindungen, Polystyrolderivate, Kationen- oder Anionenaustauscherharze unterschiedlicher Vernetzungsgrade mit Gel- oder Kanalstruktur zur Anwendung. Folgende Kopplungsvaris nten aus Chelatbildner und Träger werden als Indikator-Reagensphase angewendet:

1. Kopplungsprodukt durch Umsetzung eines Trägers, z. B. eines Kollagens, oder oines H₂O₂-erzeugenden Proteins, mit einem Chelatbildner, der z. B. eine Carbonsäurechlorid- oder Sulfonsäurechlorid-Gruppierung enthält, gegebenenfalls unter Zusatz einer üblichen organischen oder anorganischen Base, und nachfolgender Behandlung mit Redoxmetallsalz-Lösung.

2. Kopplungsprodukt analog 1., Jedoch unter Einsatz von Chelatblldnern, die Dlsulfonsäuredichlorid· bzw. Dicarbonsäuredichlorid-Gruppierungen besitzen. Danach liegt der Träger vernetzt vor.

3. Kopplungsprodukt durch Umsetzung eines H₂O₂-erzeugenden Proteins als Träger, z. B. einer Oxidase, und eines andersartigen polymeren oder makromolekularen Trägers mit OH- und/oder NH₂-Gruppierungen, z. B. eines Kollagens, mit einem Chelatbildner, der eine Disulfonsäuredichlorid- oder Dicarbonsäuredichlorici-Gruppierung enthält, gegebenenfalls unter Zusatz einer üblichen organischen oder anorganischen Base, und nachfolgender Behandlung mit Redoxmetallsalz-Lösung. Danach liegen die Träger miteinander vernetzt vor.

4. Kopplungsprodukt analog 1. bis 3., jedoch bei gleichzeitigem Einsatz mehrerer trägerfixierter Fe(II)- und Fe(lll)-Chelate und/oder Cu(I)- und Cu(ll)-Chelate, die bei reversibler Redoxreaktion mit der Red.- oder Ox.-Form der eingesetzten Redoxmetallionen Farbchelate unterschiedlicher spektraler Eigenschaften bilden. Beispielsweise wird der Kontakt eines Redoxanalyten mit der Indikator-Reagensphase, bestehend aus einem Gemisch unterschiedlicher Fe(ll)-/Fe(lll)-Farbchelate, z.B. Kollagen-fixiertes Brenzcatechin-S^-disulfonat/FefllD-Farbchelat und Kollager.'-fixiertes Bathophenanthrolin-3,8-disulfonat/Fe(ll)-Farbchelat, ein reduzierender Analyt, z. B. Ascorbat, durch Rot-Farbvertiefung und ein oxidierender Aralyt, z. B. H₂O₂ durch Blauviolett-Farbvertiefung (pH 4 bis pH 5) angezeigt. Die Stöchiometrie der zugrundeliegenden Farbstoffbildenden Redoxreaktion, ein H₂O₂-Molekül > zwei Farbstoff-fFarbchelat-JMoleküle, erweist sich als vorteilhafte Voraussetzung für die Empfindlichkeit des Analysenverfahrens.

Die Auswahl des Chelattyps und der Chelatkonzentration in der Indikator-Reagensphase richtet sich nach dem Redoxpotential der Analyte. Bei der Bestimmung oxidierender Stoffe, wie z. B. H₂O₂, werden trägerfixierte Fe- und/oder Cu-Ionen-Chelate eingesetzt, die ein Redoxpotential kleiner dem des H₂O₂ oder des oxidierenden Stoffes besitzen. Dabei werden vorzugsweise Indikator-Reagensphasen eingesetzt, die z.B. aus folgenden Kopplungsprodukten bestehen: Fe(ll)-Ionen und Kollagen-Bathophenanthrolin-3,8-disulfonat- und/oder Kollagen-Brenzcatechin-S.ö-disulfonat-Kopplungsprodukt, oder Cu(l)-Ionen und Anionenaustauscher-Ferrozinderivat-Kopplungsprodukt. Bei Vorliegen eines reduzierenden Stoffes, wie z. B. Ascorbat, werden Indikator-Reagensphasen angewendet, die z.B. aus Fe(lll)-Ionen und Kollagen-Bathophenanthrolin-3,8-disulfonat- und/oder Kollagen-Brenzcatechin-S^-disulfonat-Kopplungsprodukt oder aus Cu(ll)-Ionen und Anionenaustauscher-Ferrozinderivat-Kopplungsprodukt bestehen.

Erfindungswesentlich ist, daß die Indikator-Reagensphasen bei mehrfachem Gebrauch durch Behandlung mit üblichen Oxidations- bzw. Reduktionsmitteln unter Erhalt eines bestimmten Redox-(Farb-)Ausgangszustandes wahlweise regenerierbar sind und daß die Bestimmung eines H₂O₂-erzeugenden Oxidase/Substrat-Systems, z. B. Glucoseoxidase/Glucose, Uratoxidase/ Urat, Cholesteroloxidase/Cholesterol u.a., auch bei gleichzeitigem Vorliegen eines reduzierenden Stoffes, z. B. Ascorbat, im Analysengut, z. B. Körperflüssigkeiten, ohne weitere Zusätze möglich ist. Dazu wird die teilweise im Ox.-Farbzustand befindliche Reagensphase mit der gegebenenfalls Ascorbat-haltigen Analysengut-Probe in Kontakt gebracht, die spektrale Änderung der Indikator-Reagensphasen photometrisch vermessen, anschließend die Oxidase-k^r<alysierte Analytreaktion in Gang gesetzt und die H₂O₂-konnzentrationsabhängige spektrale Änderung der Indikator-Reagensphi.se erneut photometrisch vermessen. Die Indikator-Reagensphase werden, z. B. im Falle Kollagen als Träger, im gelösten Zustand oder in Form einer Schicht, gegebenenfalls in Kombination mit einer H₂O₂-erzeugenden Oxidase, z.B. Glucoseoxidase, Uratoxidase, Cholesteroloxidase u.a., angewendet. Ebenso können die Indikator-Reagensphasen, z. B. ausgehend von Polystyrolderivaten als Träger, als Formkörper, z. B. in Kugelform, eingesetzt werden, wobei die H₂O₂-erzeugende Oxidase Bestandteil der Analysengut-Probe oder der Indikator-Reagensphase ist. Die erfindungsgemäß eingsetzte Indikator-Reagennsphase bietet die Vorteile, daß sie auf einfachen Ausgangsstoffen basiert und damit kostengünstig ist, daß die H₂O₂-lndikation enzymfrei erfolgt und daß sie regenerierbar ist, indem sie nach einer Bestimmung durch Behandlung mit üblichen Oxidations- oder Reduktionsmitteln wahlweise auf den Redox-(Farb-)Ausgangszustand für einen erneuten Einsatz eingestellt werden kann. Durch Anwendung der erfindungsgemäßen Indikator-Reagensphase ist es möglich, H₂O₂-erzeugende Stoffe oder H₂O₂-erzeugende Oxidase-Reaktionen bei gleichzeitiger Anwesenheit eines reduzierenden Stoffes, z. B. Ascorbat, im Analysengut störfrei und ohne weitere Zusätze zu vermessen.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Herstellung von Kollagen Brenzcatechin-S.S-disulfonat-Kopplungsprodukt (K-BS) unter Basenzusatz Das Gemisch aus 50mg Kollagen (gefriergetrocknet und zerkleinert), ca. 0,1 cm³ 0,001 η Natronlauge und 0,4mMol Brenzcatechin-S.B-disulfonsäuredichlorid in 1 cm³ Äther wird für die Zeitdauer von 6 Stunden bei Raumtemperatur und unter Verschluß des Reaktionsgefäßes geschüttelt. Anschließend erfolgen die Aufarbeitung des Reaktionsansatzes durch Abtrennung

des Feststoffes und Waschen mit Äther, frei von überschüssigem Brenzcatechin-S.ö-disulfonsäuredichlorid, sowie Dialyse des in

Wasser gequollenen Kollagen-Brenzcatechin-S.S-disulfonat-Kopplungsproduktes (K-BS) gegen Wasser. Danach wird das K-BS-Kopplungsprodukt gefriergetrocknet, wobei ein schaumstoffähnliches Produkt, das die Gegenwart von Fe(lll)-Ionen durch Blauviolett-Färbung anzeigt. Beispiel 2 Herstellung von Kollagen-Bathophenanthrolin-S.e-disulfonat-Kopplungsprodukt (K-BPS) unter Basenzusatz Das Gemisch aus 100 mg Kollagen (gefriergetrocknet und zerkleinert), 0,01 mMol Bathophenanthrolin-3,8-

disulfonsäuredichlorid, 2cm³ Äther und 1 cm³ 0,01 η Natronlauge wird unter Verschluß des Reaktionsgefäßes für die Zeitdauer

von 5 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wird Reaktionsansatz durch Abziehen des Äthers im Vakuum,

anschließendem Zusatz von 1 cm³ Wasser zum Reaktionsgemisch und nachfolgender Dialyse gegen Wasser aufgearbeitet. Das verbleibende K-BPS-Kopplungsprodukt wird gefriergetrocknet, wobei ein schaumstoffähnliches Produkt entsteht, das die Gegenwart von Fe(ll)-Ionen durch Rotfärbung anzeigt.

Beispiel 3 Herstellung einer Indikator-Reagenrphase aus K-BS Ein Gemisch aus 83,5 mg K-BS, z. B. ο us Beispiel 1,72,7 mg Kollagen und 2cm³ Acetat-Pufferlösung pH 4 wird kurzzeitig, bis zum

„Aufschmelzen" des Koliagens, auf 6O⁰C erhitzt und nach Abkühlung (auf ca. 4O⁰C) auf einem transparenten Foliestreifen

(17,0cm x 3,5cm) gleichmäfvg verteilt. Nach Trocknen der Kollagenschicht wird diese mit einer 10mmolaren Fe(ll)-Salzlösung(Mohrsches Salz) in Acetat-Puiferlösung (5C -^Mol/l, pH 4) getränkt. H₂O₂ wird durch blauviolette Färbung angezeigt.

Bei Behandlung der Indikator-Reagensphasc mit einem Reduktionsmittel, z.B. Ascorbat, in Acetat-Puffer pH 4 wird die Leuko-Form der Indikator-Reagensphase eingestellt. Beispiel 4 Herstellung einer Indikator-Reagensphase auf Anionenaustauscherbasis Ein Gemisch aus 500 mg „SBW-WofatiC-Anionenaustauscherharz und 5cm³ Ferrozin-Lösung (IOmMol/1 in Wasser) wirci bei Raumtemperatur für die Zeitdauer von 1 bis 2 Stunden geschüttelt. Anschließend wird das Anionenaustauscherharz abgetrennt,

mit Wasser gewaschen, frei von überschüssigem Ferrozin, und danach mit einer Cu(ll)-Salz-Lösung (IOmMol/1 in Wasser) für die

Zeitdauer von 30 Minuten geschüttelt. Nach anschließendem Waschen des Anionenaustauscherharzes mit Wasser, frei von

überschüssigem Cu(II)-SaIz, ist die Reagensphase für die Analyse reduzierender und oxidierender Stoffe durch Vermessen einer

Grün-Farbaufhellung bzw. Rotbraun-Farbvertiefung einsetzbar.

Claims (18)

1. Ί. Verfahren zur Bestimmung reduzierender oder oxidierender Stoffe durch visuelle oder photometrische Auswertung der durch ein Indikatorsystem angezeigten konzentrationsabhängigen spektralen Eigenschaftsänderungen wie Farbändsrung, Farbaufhellung oder Farbvertiefung, gekennzeichnet dadurch, daß als Indikatorsystem eine Reagensphase eingesetzt wird, die aus trägerfixierten Redoxmetallionen-Chelaten unterschiedlicher spektraler Eigenschaften besteht.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Reagensphase, bestehend aus trägerfixierten Redoxmetallionen-Chelaten, zur Bestimmung von H₂O₂, H₂O₂-erzeugenden Stoffen, H₂O2-erzeugenden Proteinen oder anderen oxidierenden Stoffen eingesetzt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß zur Bestimmung oxidierender Stoffe oder H₂O₂ trägerfixierte Fe-Ionen- oder Cu-Ionen-Chelate eingesetzt werden, die ein Redoxpotential kleiner dem des H₂O₂ oder der oxidierenden Stoffe besitzen und mit dem oxidierenden Stoff unter Änderung der spektralen Eigenschaften reagieren.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß als trägerfixiertes Fe-Ionen-Chelat Kollagen-fixiertes Brenzcatechin-S.ö-disulfonat/FeOO-Chelat eingesetzt wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß zur Bestimmung reduzierender Stoffe trägerfixierte Fe-Ionen- oder Cu-Ionen-Chelate eingesetzt werden, die ein Redoxpotential größer dem des reduzierenden Stoffes besitzen und mit dem reduzierenden Stoff unter Änderung der spektralen Eigenschaften reagieren.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, daß als trägerfixiertes Fe-Ionen-Chelat Kollagen-fixiertes Brenzcatechin-Sjö-disulfonat/FeOIO-Chelat eingesetzt wird.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 3 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß als trägerfixierte Cu-Ionen-Chelate Anionenaustauscher-fixierte Ferrozin/Cu(l)- und Cu(ll)-Chelate eingesetzt werden.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 2,3 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß zur Bestimmung von H₂O₂-erzeugenden Stoffen und reduzierender Stoffe Gemische aus trägerfixierten Fe(II)- und Fe(lll)-Chelaten und/oder Cu(I)- und Cu(ll)-Chelaten unterschiedlicher spektraler Eigenschaften eingesetzt werden.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 3,5 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß trägerfixierte Fe(II)-Bathophenanthrolinderivat- und FedlD-Brenzcatechinderivat-Chelate als Redoxmetallionen-Chelate eingesetzt werden.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Chelate an Polymere oder Makromoleküle mit NH₂- und/oder OH-Gruppen als Träger gekoppelt sind.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, gekennzeichnet dadurch, daß die Polymeren oder Makromoleküle Phenolharze, Resole, Novolake, Polystyrolderivate, Cellulose oder andere Polysaccaride sind.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Chelate an NH₂- oder OH-funktionalisierte Gläser oder an aktive Methylengruppen-enthaltende Verbindungen als Träger gekoppelt sind.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Chelate an Anionen- oder Kationenaustauscherharze als Träger gekoppelt sind.
14. 14. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Chelate an Proteine als Träger gekoppelt sind.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, daß die Proteine Kollagene oder H₂O₂-erzeugende Proteine sind.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, daß die H₂O₂-erzeugenden Proteine Oxidasen sind.
17. 17. Verfahren nach Anspruch 10-16, gekennzeichnet dadurch, daß die Träger als Formkörper, als Schicht oder gelöst vorliegen.
18. 18. Verfahren nach Anspruch 1,2 und 10-16, gekennzeichnet dadurch, daß Redoxmetallionen-Chelate eingesetzt werden, die an einen Träger nach Anspruch 10-18 und gleichzeitig an einen zweiten Träger nach Anspruch 14-16 gekoppelt sind.