DD289135A5

DD289135A5 - PROCESS FOR DETERMINING REDUCING OR OXIDIZING SUBSTANCES

Info

Publication number: DD289135A5
Application number: DD33462489A
Authority: DD
Inventors: Peter Berlin; Dagmar Breitfeld
Original assignee: Adw Zi F. Molekularbiologie,De
Priority date: 1989-11-16
Filing date: 1989-11-16
Publication date: 1991-04-18

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung reduzierender oder oxidierender Stoffe, insbesondere von H2O2 bzw. H2O2-erzeugenden Stoffen. Die Erfindung ist auf den Gebieten der medizinischen Diagnostik, der biotechnologischen Prozeszkontrolle und der Lebensmittelchemie anwendbar. Dabei kommen Indikator-Reagenzphasen zum Einsatz, die auf traegerfixierten Redoxmetallionen-Chelaten basieren. Als Chelatbildner werden Verbindungen angewendet, die mit Redoxmetallionen, vorzugsweise mit * und/oder Fe(III)- oder * und/oder * Farbchelate unterschiedlicher spektraler Eigenschaften bilden. Als Traeger dienen polymere oder makromolekulare Verbindungen und/oder H2O2-erzeugende Proteine, z. B. Oxidasen. Die Traeger gestatten, gegebenenfalls in Schichtform oder als Formkoerper, bei Kontakt mit dem Analysengut die Aufnahme des Analyten. Ein reduzierender oder oxidierender Stoff wird mittels der Indikator-Reagenzphasen durch Farbaenderung, Farbvertiefung oder Farbaufhellung konzentrationsabhaengig angezeigt und visuell oder photometrisch ausgewertet. Anschlieszend wird die Indikator-Reagenzphase durch Behandlung mit ueblichen Oxidations- bzw. Reduktionsmitteln auf einen Redox- (Farb-) Ausgangszustand fuer einen erneuten Einsatz wahlweise eingestellt.{Redoxmetallionen-Farbchelate, traegerfixiert; Indikator-Reagenzphase; Stoffe, reduzierende, oxidierende; H2O2; Auswertung, photometrische; Diagnostik, medizinische}The invention relates to a method for the determination of reducing or oxidizing substances, in particular of H2O2 or H2O2-producing substances. The invention is applicable in the fields of medical diagnostics, biotechnological process control and food chemistry. Indicator reagent phases based on carrier-fixed redox metal ion chelates are used. As chelating agents, compounds are used which form redox metal ions, preferably with * and / or Fe (III) or * and / or * color chelates of different spectral properties. The carriers used are polymeric or macromolecular compounds and / or H2O2-producing proteins, eg. B. oxidases. The carriers allow, optionally in layer form or as a shaped body, upon contact with the analyte, the inclusion of the analyte. A reducing or oxidizing substance is displayed in a concentration-dependent manner by means of the indicator reagent phases by color change, color deepening or color lightening and evaluated visually or photometrically. Subsequently, the indicator reagent phase is optionally adjusted to a redox (color) initial state for reuse by treatment with conventional oxidizing or reducing agents. {Redox metal ion color chelates, carrier fixed; Indicator Reagenzphase; Substances, reducing, oxidizing; H2O2; Evaluation, photometric; Diagnostics, medical}

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung reduzierender und/oder oxidierender Stoffe, vorzugsweise H₂-O₂-erzeugender Stoffe bei Anwesenheit von reduzierenden Stoffen im Analysengut.The invention relates to a method for the determination of reducing and / or oxidizing substances, preferably H ₂ -O ₂ -producing substances in the presence of reducing substances in the analysis.

Anwendungsgebiet der Erfindung sind die medizinische Diagnostik, die biotechnologische Prozeßkontrolle und die Lebensmittelchemie.Field of application of the invention are medical diagnostics, biotechnological process control and food chemistry.

Characteristic of the known state of the art

H,O₂-erzeugende Oxidase/Substrat-Systeme bilden häufig die Grundlage für die quantitative Bestimmung von Stoffen (Analyten) bei folgendem Reaktionsablauf:H, O ₂ -producing oxidase / substrate systems often form the basis for the quantitative determination of substances (analytes) in the following reaction sequence:

1.) AnalyU= Oxidase-Substrat) + O₂ ⁰"¹""" Produkt + H₂O₂ 2.) H₂O₂ + 2H^+Indiktl<"^iy*^t6ni „opt. Signal" + 2H₂O1.) = AnalyU oxidase substrate) + O ₂ ⁰ ^"1" "" Product + H ₂ O ₂ 2) H ₂ O ₂ + 2H ^{+ Indiktl <} ^"iy * ^t6ni" opt. Signal "+ 2H ₂ O

Dementsprechend sind zahlreiche Analysenverfahren bekannt geworden, wobei die H₂O₂-lndikatorreaktionenAccordingly, numerous analytical methods have become known wherein the H ₂ O ₂ indicator reactions

a) Peroxidase-katalysiert,a) peroxidase-catalyzed,

b) Katalase-katalysiertoderb) catalase-catalyzed or

c) ohne Enzymkatalyse verlaufen können.c) can run without enzyme catalysis.

Die Indikatorsysteme werden in Form analytischer Elemente, z.B. Teststreifen, oder in Lösung angewendet. Die Peroxidasekatalysierten Indikatorsysteme sind durch eine große strukturelle Vielfalt der eingesetzten Farbstoff-bildenden Η-Donator- bzw. e-Donator-Ausgangsstoffe gekennzeichnet. Dieser Indikatorreaktion haften jedoch als wesentliche NachteileThe indicator systems are in the form of analytical elements, e.g. Test strips, or applied in solution. The peroxidase-catalyzed indicator systems are characterized by a large structural diversity of the dye-forming Η-donor or e-donor starting materials used. However, these indicator reactions are considered to be significant disadvantages

- die begrenzte Stabilität und die Kosten der Peroxidase undthe limited stability and cost of peroxidase and

- die Störanfälligkeit der Indikatorreaktion an.- the susceptibility of the indicator reaction.

Indikatorreaktionen der Gruppen b), die vergleichsweise zu denen der Gruppe a) weit weniger häufig eingesetzt werden, besitzen analoge Nachteile wie bei Gruppe a) angeführt.Indicator reactions of groups b), which are used much less frequently than those of group a), have similar disadvantages as mentioned for group a).

Mit Ausnahme eines Verfahrens (vgl. DD 258474), das von trägerfixierten oxidativen Kupplungs-Stoffkomponenten und/oder p-Phenylendiaminen ausgeht, sind die bisher bekannt gewordenen H₂O₂-lndikatorsysteme vom Typ a) bis c) nur einmalig einsetzbar und nicht regenerierbar.With the exception of one process (see DD 258474) which starts from carrier-fixed oxidative coupling components and / or p-phenylenediamines, the H ₂ O ₂ indicator systems of type a) to c) which have become known hitherto are only usable once and can not be regenerated ,

Ein Mangel aller bisher bekanntgewordenen H₂O_rlndikatorsysteme der Gruppen a) bis c) besteht darin, daß bei Vorliegen reduzierender Stoffe, z. B. Ascorbat, im Analysengut, z. B. in Körperflüssigkeiten, infolge verminderter Farbstoffbildung falsche Werte resultieren können. Der Mangel wird zwar durch Zusatz von Ascorbatoxidase (vgl. z.B. EP186134, DD 130178) oder von oxidierenden Stoffen (vgl. z. B. EP 243126, DD 251002) umgangen, jedoch machen sich die Zusätze bei der Anwendung der Verfahren durch Erhöhung der Kosten je Testansatz bzw. durch eine Erhöhung der Komplexizität des analytischen Reaktionssystems unvorteilhaft bemerkbar.A deficiency of all hitherto known H ₂ O _r lndikatorsysteme of groups a) to c) is that in the presence of reducing substances, such. As ascorbate, in the analysis, z. As in body fluids, due to reduced dye formation can result in incorrect values. Although the deficiency is circumvented by the addition of ascorbate oxidase (cf., for example, EP186134, DD 130178) or of oxidizing substances (cf., for example, EP 243126, DD 251002), the additives make use of the processes by increasing the costs per test batch or by an increase in the complexity of the analytical reaction system unfavorably noticeable.

Bekanntermaßen werden Redoxmetallionen-Farbchelate in gelöster Form zur photometrischen Bestimmung von Peroxiden (siehe z.B. bei W.RICK und M.HOCKEBORN, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 20,745 [1982]) bzw. von Ascorbat (vgl. z.B.As is known, redox metal ion color chelates are in dissolved form for the photometric determination of peroxides (see, for example, W.RICK and M.HOCKEBORN, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 20, 745 [1982]) and ascorbate, respectively (cf.

DE 15981359, angewendet, was jedoch für einen mehrfachen Indikator-Einsatz ungeeignet ist.DE 15981359, but this is unsuitable for multiple indicator use.

Enzymfreie regenerierbare Indikator-Reagensphasen, die wahlweise auf einen bestimmten Redox-(Farb-)Ausgangszustand einstellbar sind und die Bestimmung sowohl oxidierender als auch reduzierender Stoffe gestatten, sind bisher nicht bekannt geworden.Enzyme-free regenerable indicator reagent phases, which are selectively adjustable to a particular redox (color) starting state and allow the determination of both oxidizing and reducing agents, have not previously been disclosed.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung sowohl reduzierender als auch oxidierender Stoffe bereitzustellen, bei dem ein Peroxidase- bzw. Katalase-freies Indikatorsystem eingesetzt wird, das bei geringen Kosten auf einfachen Ausgangsstoffen basiert, regenerierbar und somit für den mehrmaligen Gebrauch einsetzbar ist und wahlweise auf einen bestimmten Redox-(Farb-)Ausgangszustand eingestellt werden kann. Darüber hinaus soll das Indikatorsystem die Bestimmung H₂O₂-erzeugender Stoffe in Gegenwart störender reduzierender Stoffe im Analysengut gestatten.The aim of the invention is to provide a method for the determination of both reducing and oxidizing substances, in which a peroxidase or catalase-free indicator system is used, which is based on simple starting materials at low cost, can be regenerated and thus used for repeated use and optionally set to a particular redox (color) initial state. In addition, the indicator system should allow the determination of H ₂ O ₂ -producing substances in the presence of interfering reducing substances in the analyzer.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Bestimmung reduzierender und/oder oxidierender Stoffe zur Verfügung gestellt, bei dem Indikator-Reagensphasen, bestehend aus trägerfixierten Redoxmetallionen-Chelaten, zum Einsatz kommen und eine visuelle oder photometrische Auswertung der durch das Indikatorsystem angezeigte konzentrationsabhängigen Farbänderung, Farbvertiefung oder Farbaufhellung erfolgt. Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von H₂O₂, H₂O₂-eizeugenden Stoffen oder H₂O₂-erzeugenden Proteinen oder anderen oxidierenden Stoffen. Die trägerfixierten Redoxmetallionen-Chelöte werden aus einem oder mehreren reaktiven Chelatbildnern und einem polymeren oder makromolekularen Träger und/oder einem Protein als Träger, vorzugsweise einem H₂O₂-erzeugenden Protein, durch kovalente Kopplung hergestellt. Die reaktiven Chelatbildner besitzen Carbonsäurechlorid-, Sulfonsäurechlorid-, NH₂- oder OH-Gruppierungen. Als Träger werden polymere oder makromolekulare Verbindungen eingesetzt, die OH- und/oder NH₂-Gruppierungen enthalten. Beispielsweise kommen Phenolharze, Resole, Novolake, Cellulose, Cellulosederivate oder andere Polysaccharide, Kollagen, H₂O₂-erzeugenc^;e Proteine, wie z. B. Oxidasen, andere Proteine, NH₂- oder OH-funktionalisierte Gläser, aktive Methylengruppen· enthaltende Verbindungen, Polystyrolderivate, Kationen- oder Anionenaustauscherharze unterschiedlicher Vernetzungsgrade mit Gel- oder Kanalstruktur zur Anwendung. Folgende Kopplungsvaris nten aus Chelatbildner und Träger werden als Indikator-Reagensphase angewendet:According to the invention, a method for the determination of reducing and / or oxidizing substances is provided, in which indicator reagent phases consisting of carrier-fixed redox metal ion chelates are used and a visual or photometric evaluation of the concentration-dependent color change, color deepening or color lightening indicated by the indicator system takes place , The process according to the invention is particularly suitable for the determination of H ₂ O ₂ , H ₂ O ₂ -exciting substances or H ₂ O ₂ -producing proteins or other oxidizing substances. The supported redox metal ion chelates are prepared from one or more reactive chelants and a polymeric or macromolecular carrier and / or protein as a carrier, preferably a H ₂ O ₂ -generating protein, by covalent coupling. The reactive chelating agents have carboxylic acid chloride, sulfonyl chloride, NH ₂ or OH groups. The carrier used are polymeric or macromolecular compounds which contain OH and / or NH ₂ groups. For example, phenolic resins, resoles, novolacs, cellulose, cellulose derivatives or other polysaccharides, collagen, H ₂ O ₂ -generate ^; e proteins, such as. As oxidases, other proteins, NH ₂ - or OH-functionalized glasses, active compounds containing methylene groups, polystyrene derivatives, cation or anion exchange resins of different degrees of crosslinking with gel or channel structure for use. The following coupling variants of chelating agent and support are used as indicator reagent phase:

1. Kopplungsprodukt durch Umsetzung eines Trägers, z. B. eines Kollagens, oder oines H₂O₂-erzeugenden Proteins, mit einem Chelatbildner, der z. B. eine Carbonsäurechlorid- oder Sulfonsäurechlorid-Gruppierung enthält, gegebenenfalls unter Zusatz einer üblichen organischen oder anorganischen Base, und nachfolgender Behandlung mit Redoxmetallsalz-Lösung.1. Coupling product by reaction of a carrier, for. B. a collagen, or o H ₂ O ₂ -producing protein, with a chelating agent, the z. Example, a carboxylic acid chloride or sulfonic acid chloride group, optionally with the addition of a conventional organic or inorganic base, and subsequent treatment with redox metal salt solution.

2. Kopplungsprodukt analog 1., Jedoch unter Einsatz von Chelatblldnern, die Dlsulfonsäuredichlorid· bzw. Dicarbonsäuredichlorid-Gruppierungen besitzen. Danach liegt der Träger vernetzt vor.2. Coupling product analogous to 1., However, using Chelatblldnern who Dlsulfonsäuredichlorid ® or dicarboxylic acid dichloride groups have. Thereafter, the carrier is networked.

3. Kopplungsprodukt durch Umsetzung eines H₂O₂-erzeugenden Proteins als Träger, z. B. einer Oxidase, und eines andersartigen polymeren oder makromolekularen Trägers mit OH- und/oder NH₂-Gruppierungen, z. B. eines Kollagens, mit einem Chelatbildner, der eine Disulfonsäuredichlorid- oder Dicarbonsäuredichlorici-Gruppierung enthält, gegebenenfalls unter Zusatz einer üblichen organischen oder anorganischen Base, und nachfolgender Behandlung mit Redoxmetallsalz-Lösung. Danach liegen die Träger miteinander vernetzt vor.3. Coupling product by reacting a H ₂ O ₂ -generating protein as a carrier, z. As an oxidase, and another type of polymeric or macromolecular carrier with OH and / or NH ₂ groups, z. As a collagen, with a chelating agent containing a Disulfonsäuredichlorid- or Dicarbonsäuredichlorici grouping, optionally with the addition of a conventional organic or inorganic base, and subsequent treatment with Redoxmetallsalz solution. Thereafter, the carriers are networked together.

4. Kopplungsprodukt analog 1. bis 3., jedoch bei gleichzeitigem Einsatz mehrerer trägerfixierter Fe(II)- und Fe(lll)-Chelate und/oder Cu(I)- und Cu(ll)-Chelate, die bei reversibler Redoxreaktion mit der Red.- oder Ox.-Form der eingesetzten Redoxmetallionen Farbchelate unterschiedlicher spektraler Eigenschaften bilden. Beispielsweise wird der Kontakt eines Redoxanalyten mit der Indikator-Reagensphase, bestehend aus einem Gemisch unterschiedlicher Fe(ll)-/Fe(lll)-Farbchelate, z.B. Kollagen-fixiertes Brenzcatechin-S^-disulfonat/FefllD-Farbchelat und Kollager.'-fixiertes Bathophenanthrolin-3,8-disulfonat/Fe(ll)-Farbchelat, ein reduzierender Analyt, z. B. Ascorbat, durch Rot-Farbvertiefung und ein oxidierender Aralyt, z. B. H₂O₂ durch Blauviolett-Farbvertiefung (pH 4 bis pH 5) angezeigt. Die Stöchiometrie der zugrundeliegenden Farbstoffbildenden Redoxreaktion, ein H₂O₂-Molekül > zwei Farbstoff-fFarbchelat-JMoleküle, erweist sich als vorteilhafte Voraussetzung für die Empfindlichkeit des Analysenverfahrens.4. Coupling product analogous to 1. to 3., but with simultaneous use of several carrier-fixed Fe (II) - and Fe (III) chelates and / or Cu (I) - and Cu (II) chelates, which in reversible redox reaction with the Red.- or Ox.-form of the redox metal ions used to form color chelates of different spectral properties. For example, the contact of a redox analyte with the indicator reagent phase consisting of a mixture of different Fe (II) / Fe (III) color chelates, eg, collagen-fixed catechol-S-disulfonate / FefllD color chelate and collagen Bathophenanthroline-3,8-disulfonate / Fe (II) color chelate, a reducing analyte, e.g. As ascorbate, by red color deepening and an oxidizing Aralyt, z. B. H ₂ O ₂ indicated by blue violet color deepening (pH 4 to pH 5). The stoichiometry of the underlying dye-forming redox reaction, a H ₂ O ₂ molecule> two dye-f-color chelate molecules, proves to be an advantageous prerequisite for the sensitivity of the analytical method.

Die Auswahl des Chelattyps und der Chelatkonzentration in der Indikator-Reagensphase richtet sich nach dem Redoxpotential der Analyte. Bei der Bestimmung oxidierender Stoffe, wie z. B. H₂O₂, werden trägerfixierte Fe- und/oder Cu-Ionen-Chelate eingesetzt, die ein Redoxpotential kleiner dem des H₂O₂ oder des oxidierenden Stoffes besitzen. Dabei werden vorzugsweise Indikator-Reagensphasen eingesetzt, die z.B. aus folgenden Kopplungsprodukten bestehen: Fe(ll)-Ionen und Kollagen-Bathophenanthrolin-3,8-disulfonat- und/oder Kollagen-Brenzcatechin-S.ö-disulfonat-Kopplungsprodukt, oder Cu(l)-Ionen und Anionenaustauscher-Ferrozinderivat-Kopplungsprodukt. Bei Vorliegen eines reduzierenden Stoffes, wie z. B. Ascorbat, werden Indikator-Reagensphasen angewendet, die z.B. aus Fe(lll)-Ionen und Kollagen-Bathophenanthrolin-3,8-disulfonat- und/oder Kollagen-Brenzcatechin-S^-disulfonat-Kopplungsprodukt oder aus Cu(ll)-Ionen und Anionenaustauscher-Ferrozinderivat-Kopplungsprodukt bestehen.The choice of chelate type and chelate concentration in the indicator reagent phase depends on the redox potential of the analytes. In the determination of oxidizing substances, such. As H ₂ O ₂ , carrier-fixed Fe and / or Cu-ion chelates are used, which have a redox potential less than that of H ₂ O ₂ or the oxidizing substance. Indicator reagent phases which consist, for example, of the following coupling products are preferably used: Fe (II) ions and collagen-bathophenanthroline-3,8-disulfonate and / or collagen-catechol-S-disulfonate coupling product, or Cu ( l) ions and anion exchanger ferrozine derivative coupling product. In the presence of a reducing substance, such. As ascorbate, indicator reagent phases are used, for example, from Fe (III) ions and collagen-bathophenanthroline-3,8-disulfonate and / or collagen-catechol-S ^ -disulfonate coupling product or Cu (II) - Consist ion and anion exchanger Ferrozinderivat coupling product.

Erfindungswesentlich ist, daß die Indikator-Reagensphasen bei mehrfachem Gebrauch durch Behandlung mit üblichen Oxidations- bzw. Reduktionsmitteln unter Erhalt eines bestimmten Redox-(Farb-)Ausgangszustandes wahlweise regenerierbar sind und daß die Bestimmung eines H₂O₂-erzeugenden Oxidase/Substrat-Systems, z. B. Glucoseoxidase/Glucose, Uratoxidase/ Urat, Cholesteroloxidase/Cholesterol u.a., auch bei gleichzeitigem Vorliegen eines reduzierenden Stoffes, z. B. Ascorbat, im Analysengut, z. B. Körperflüssigkeiten, ohne weitere Zusätze möglich ist. Dazu wird die teilweise im Ox.-Farbzustand befindliche Reagensphase mit der gegebenenfalls Ascorbat-haltigen Analysengut-Probe in Kontakt gebracht, die spektrale Änderung der Indikator-Reagensphasen photometrisch vermessen, anschließend die Oxidase-k^r<alysierte Analytreaktion in Gang gesetzt und die H₂O₂-konnzentrationsabhängige spektrale Änderung der Indikator-Reagensphi.se erneut photometrisch vermessen. Die Indikator-Reagensphase werden, z. B. im Falle Kollagen als Träger, im gelösten Zustand oder in Form einer Schicht, gegebenenfalls in Kombination mit einer H₂O₂-erzeugenden Oxidase, z.B. Glucoseoxidase, Uratoxidase, Cholesteroloxidase u.a., angewendet. Ebenso können die Indikator-Reagensphasen, z. B. ausgehend von Polystyrolderivaten als Träger, als Formkörper, z. B. in Kugelform, eingesetzt werden, wobei die H₂O₂-erzeugende Oxidase Bestandteil der Analysengut-Probe oder der Indikator-Reagensphase ist. Die erfindungsgemäß eingsetzte Indikator-Reagennsphase bietet die Vorteile, daß sie auf einfachen Ausgangsstoffen basiert und damit kostengünstig ist, daß die H₂O₂-lndikation enzymfrei erfolgt und daß sie regenerierbar ist, indem sie nach einer Bestimmung durch Behandlung mit üblichen Oxidations- oder Reduktionsmitteln wahlweise auf den Redox-(Farb-)Ausgangszustand für einen erneuten Einsatz eingestellt werden kann. Durch Anwendung der erfindungsgemäßen Indikator-Reagensphase ist es möglich, H₂O₂-erzeugende Stoffe oder H₂O₂-erzeugende Oxidase-Reaktionen bei gleichzeitiger Anwesenheit eines reduzierenden Stoffes, z. B. Ascorbat, im Analysengut störfrei und ohne weitere Zusätze zu vermessen.It is essential to the invention that the indicator reagent phases can be optionally regenerated in repeated use by treatment with customary oxidizing or reducing agents to obtain a specific redox (color) starting state and that the determination of an H ₂ O ₂ -producing oxidase / substrate system , z. As glucose oxidase / glucose, urate oxidase / urate, cholesterol oxidase / cholesterol, etc., even with the simultaneous presence of a reducing substance, eg. As ascorbate, in the analysis, z. As body fluids, without further additives is possible. For this purpose, the reagent phase located partly in ox color state is contacted with the optionally ascorbate-containing material to be analyzed sample into contact photometrically measure the spectral change in the indicator Reagensphasen, then set the oxidase-k ^{r <alysierte} analyte reaction started and the H ₂ Measure O ₂ -concentration-dependent spectral change of the indicator reagent pH again photometrically. The indicator reagent phase are, for. B. in the case of collagen as a carrier, in the dissolved state or in the form of a layer, optionally in combination with a H ₂ O ₂ -producing oxidase, eg glucose oxidase, urate oxidase, cholesterol oxidase, inter alia, applied. Likewise, the indicator reagent phases, e.g. B. starting from polystyrene derivatives as a carrier, as a shaped body, for. B. in spherical form, are used, wherein the H ₂ O ₂ -generating oxidase is part of the sample of analyte or the indicator reagent phase. The indicator reagent phase employed in the present invention has the advantages of being based on simple starting materials and thus cost-effective in that H ₂ O ₂ delivery is enzyme-free and regenerable by being determined by treatment with conventional oxidizing or reducing agents can be optionally set to the redox (color) initial state for reuse. By using the indicator reagent phase according to the invention, it is possible H ₂ O ₂ -generating substances or H ₂ O ₂ -generating oxidase reactions in the simultaneous presence of a reducing substance, eg. As ascorbate, in the analysis material without interference and without further additions to measure.

embodiments example 1 Preparation of collagen catechol-S.S-disulfonate coupling product (K-BS) with base addition The mixture of 50 mg collagen (freeze-dried and comminuted), about 0.1 cm ³ 0.001 η sodium hydroxide solution and 0.4 mmol Catechol-SB-disulfonic acid in 1 cm ^{3 of} ether is allowed to sit for 6 hours at room temperature and under Shaken the closure of the reaction vessel. Subsequently, the workup of the reaction mixture by separation

des Feststoffes und Waschen mit Äther, frei von überschüssigem Brenzcatechin-S.ö-disulfonsäuredichlorid, sowie Dialyse des inof the solid and washing with ether, free of excess catechol-Söö-disulfonsäuredichlorid, and dialysis of in

Water-swollen collagen-catechol-S.S-disulfonate coupling product (K-BS) against water. After that it will be K-BS coupling product freeze-dried, using a foam-like product that detects the presence of Fe (III) ions Indicates blue-violet staining. Example 2 Preparation of collagen-bathophenanthroline-S.s-disulfonate coupling product (K-BPS) with addition of base The mixture of 100 mg of collagen (freeze-dried and comminuted), 0.01 mmol of bathophenanthroline-3,8-

disulfonsäuredichlorid, 2cm³ Äther und 1 cm³ 0,01 η Natronlauge wird unter Verschluß des Reaktionsgefäßes für die Zeitdauerdisulfonsäuredichlorid, 2cm ³ ether, and 1 cm ³ 0.01 η sodium hydroxide solution under closure of the reaction vessel for the duration

von 5 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wird Reaktionsansatz durch Abziehen des Äthers im Vakuum,shaken for 5 hours at room temperature. Thereafter, the reaction mixture by removing the ether in vacuo,

anschließendem Zusatz von 1 cm³ Wasser zum Reaktionsgemisch und nachfolgender Dialyse gegen Wasser aufgearbeitet. Das verbleibende K-BPS-Kopplungsprodukt wird gefriergetrocknet, wobei ein schaumstoffähnliches Produkt entsteht, das die Gegenwart von Fe(ll)-Ionen durch Rotfärbung anzeigt.subsequent addition of 1 cm ^{3 of} water to the reaction mixture and subsequent dialysis worked up against water. The remaining K-BPS coupling product is freeze-dried to give a foam-like product which indicates the presence of Fe (II) ions by red coloration.

Example 3 Preparation of an Indicator Reagent Phase from K-BS A mixture of 83.5 mg K-BS, e.g. B. for example, 1.72.7 mg of collagen and 2cm ³ acetate buffer pH 4 is briefly, until

„Aufschmelzen" des Koliagens, auf 6O⁰C erhitzt und nach Abkühlung (auf ca. 4O⁰C) auf einem transparenten Foliestreifen"Melting" of the Koliagens, heated to 6O ⁰ C and after cooling (to about 4O ⁰ C) on a transparent film strip

(17,0cm x 3,5cm) gleichmäfvg verteilt. Nach Trocknen der Kollagenschicht wird diese mit einer 10mmolaren Fe(ll)-Salzlösung(Mohrsches Salz) in Acetat-Puiferlösung (5C -^Mol/l, pH 4) getränkt. H₂O₂ wird durch blauviolette Färbung angezeigt.(17.0cm x 3.5cm) evenly distributed. After the collagen layer has dried, it is impregnated with a 10 mmol Fe (II) salt solution (Mohr's salt) in acetate-puifer solution (5C-1 mol / l, pH 4). H ₂ O ₂ is indicated by blue-violet staining.

When treating the indicator reagent phase with a reducing agent, e.g. Ascorbate, in acetate buffer pH 4 is the Leuco form of indicator reagent phase set. Example 4 Preparation of an anion exchange-based indicator reagent phase A mixture of 500 mg SBW-WofatiC anion exchange resin and 5 cm ³ ferrocene solution (10 mmol / l in water) was added Room temperature for the period of 1 to 2 hours shaken. Subsequently, the anion exchange resin is separated,

mit Wasser gewaschen, frei von überschüssigem Ferrozin, und danach mit einer Cu(ll)-Salz-Lösung (IOmMol/1 in Wasser) für diewashed with water, free from excess ferrozine, and then with a Cu (II) salt solution (IOmMol / 1 in water) for the

Shaken for 30 minutes. After subsequent washing of the anion exchange resin with water, free from

überschüssigem Cu(II)-SaIz, ist die Reagensphase für die Analyse reduzierender und oxidierender Stoffe durch Vermessen einerexcess Cu (II) salt, is the reagent phase for the analysis of reducing and oxidizing substances by measuring a

Green color lightening or reddish-brown color pit used.

Claims

Ί. Method for the determination of reducing or oxidizing substances by visual or photometric evaluation of the concentration-dependent spectral property changes such as color change, color lightening or color deepening indicated by an indicator system, characterized in that an reagent phase consisting of carrier-fixed redox metal ion chelates of different spectral properties is used as the indicator system.

2. The method according to claim 1, characterized in that the reagent phase, consisting of carrier-fixed redox metal ion chelates, for the determination of H ₂ O ₂ , H ₂ O ₂ -producing substances, H ₂ O ₂ -producing proteins or other oxidizing substances is used.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that for the determination of oxidizing substances or H ₂ O ₂ carrier-fixed Fe-ion or Cu-ion chelates are used which have a redox potential less than that of H ₂ O ₂ or oxidizing substances and react with the oxidizing agent to change the spectral properties.

4. The method according to claim 3, characterized in that is used as carrier-fixed Fe ion chelate collagen-fixed pyrocatechol-S.ö disulfonate / FeOO chelate.

5. The method according to claim!, Characterized in that for the determination of reducing substances carrier-fixed Fe-ion or Cu-ion chelates are used which have a redox potential greater than that of the reducing substance and react with the reducing substance to change the spectral properties.

6. The method according to claim 5, characterized in that collagen-fixed pyrocatechol Sjö disulfonate / FeOIO chelate is used as carrier-fixed Fe ion chelate.

7. The method according to claim 3 and 5, characterized in that as carrier-fixed Cu-ion chelates anion-fixed ferrocene / Cu (l) - and Cu (II) chelates are used.

8. The method according to claim 2,3 and 5, characterized in that for the determination of H ₂ O ₂ -producing substances and reducing substances mixtures of carrier-fixed Fe (II) - and Fe (III) chelates and / or Cu (I) - And Cu (II) chelates of different spectral properties are used.

9. The method according to claim 3,5 and 8, characterized in that carrier-fixed Fe (II) -Bathophenanthrolinderivat- and FedlD catechol derivative chelates are used as redox metal ion chelates.

10. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the chelates are coupled to polymers or macromolecules with NH ₂ - and / or OH groups as a carrier.

11. The method according to claim 10, characterized in that the polymers or macromolecules are phenolic resins, resoles, novolacs, polystyrene derivatives, cellulose or other polysaccharides.

12. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the chelates are coupled to NH ₂ - or OH-functionalized glasses or active methylene-containing compounds as a carrier.

13. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the chelates are coupled to anion or cation exchange resins as a carrier.

14. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the chelates are coupled to proteins as a carrier.

15. The method according to claim 14, characterized in that the proteins are collagen or H ₂ O ₂ -generating proteins.

16. The method according to claim 15, characterized in that the H ₂ O ₂ -generating proteins are oxidases.

17. The method according to claim 10-16, characterized in that the carrier is present as a shaped body, as a layer or dissolved.

18. The method of claim 1,2 and 10-16, characterized in that redox metal ion chelates are used, which are coupled to a carrier according to claim 10-18 and at the same time to a second carrier according to claim 14-16.