DD281409A5 - Verfahren zur genetischen modifikation monokotyler pflanzen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Einschleusung von genetischem Material in monokotyle Pflanzen oder lebensfaehige Teile davon, das dadurch gekennzeichnet ist, dasz Transfer-Mikroorganismen, die in der Lage sind, besagtes genetisches Material in monokotyle Pflanzen oder lebensfaehige Teile davon einzuschleusen und die das einzuschleusende genetische Material in einer transportierbaren Form enthalten, in Form einer Bakteriensuspension in die meristematischen Gewebe-Regionen der Pflanze oder lebensfaehiger Teile davon, inokuliert werden. Dabei kann durch geeignete Wahl des Applikationszeitpunktes im Hinblick auf das Entwicklungsstadium der Empfaengerpflanze die Transformationshaeufigkeit noch zusaetzlich gesteigert werden.{verbesserte Eigenschaften von Nutzpflanzen; Resistenz gegen unguenstige Boden- und Witterungsbedingungen; Krankheit; Schaedlinge; Pflanzenschutzmittel; guenstige Beeinflussung des Naehrstoffgehaltes oder Ernteertrages bei monokotylen Pflanzen}

Description

Hierzu 3 Seiten Zeichnungen

Anwendun|)sgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Einschleusung genetischen Materials in monokotyle Pflanzen odor lebensfähige Teile davon, unter Verwendung von geeigneten Transfer-Mikroorganismen, die Expression des eingeschleusten genetischen Materials in monokotylen Pflanzen oder lebensfähigen Teilen davon sowie die nach diesem Verfahren erhältlichen transgenen pflanzlichen Produkte.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Angesichts des raschen Anstiegs der Weltbevölkerung und dem damit verbundenen höheren Nahrungsmittel- und Rohstoffbedarf gehört die Steigerung des Ertrags von Nutzpflanzen sowie die vermehrte Gewinnung von pflanzlichen Inhaltsstoffen, also der Fortschritt auf dem Gebiet der Nahrungs- und Heilmittel, zu den dringlichsten Aufgaben der biologischen bzw. biotechnologischen Forschung. In diesem Zusammenhang sind als wesentliche Aspekte beispielsweise zu nennen: oine Erhöhung der Resistenz voii Nutzpflanzen gegen ungünstige Bodenverhältnisse oder gegen Krankheiten und Schädlinge, eine gesteigerte Resistenz gegen Pflanzenschutzmittel wie Insektizide, Herbizide, Fungizide und Bakterizide, und eine günstige Veränderung des Nährstoffgehalts oder des Ernteertrags von Pflanzen. Solche wünschenswerten Effekte könnten allgemein durch Induktion oder vermehrte Bildung von Schutzstoffen, wertvollen Proteinen oder Toxinen sowie durch Eingriffet in die regulatorischen Kreisläufe des Pflanzenmetabolismus herbeigeführt werden. Eine entsprechende Beeinflussung des pflanzlichen Lrbgutes kann beispielsweise durch Übertragung neuer Gene in ganze Pflanzen oder Pflanzenzellen erfolgen. Viele der aus agrarökonomischer Sicht bedeutendsten Kulturpflanzen gehören zur Klasse der Monokotyledonen, wobei besonders die Familie der Gramineae hervorzuheben ist, die unsere wichtigsten Getreidearten umfaßt, wie z. B. Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, .Mais, Reis, Hirse, u.a.m.

Das größte Problem bei der Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie bei Pflanzen aus der Gruppe der Monokotyledonen liegt im Fehlen von geeigneten Transfer-Mikroorganismen begründet, mit deren Hilfe für die praktische Anwendung ausreichend hohe Transformations-Frequenzen erzielt werden können und die somit als Hilfsmittel für einen gezielten Eingriff ins pflanzliche Genom Verwendung finden könnten. Agrobacterium tumefaclsns beispielsweise, einer der am meisten verwendeten Transfer-Mikroorganismen zur Einschleusung von genetischem Material in Pflanzen, ist zwar in hervorragender Weise für eine genetische Manipulation zahlreicher dikotyler Pflanzen geeignet, bei Vertretern der Monokotyledonen, insbesondere bei monokotylen Kulturpflanzen, konnten aber bisher noch keine entsprechend zufriedenstellenden Ergebnisse erzielt werden. Aus der Klasse der Monokotyledonen sind nämlich bisher nur einige wenige ausgewählte Familien bekanntgeworden, die ebenfalls auf eine Infektion mit Agrobactorium tumefaciens ansprechen und damit zuinindestens theoretisch einer genetischen Manipulation zugänglich sein könnten. Bei letzteren handelt es sich jedoch aus agrarökonomischer Sicht um unbedeutende Randgruppen, die allenfalls als Modellpflanzen Bedeutung erlangen könnten (/1/ DeHeeno M, Phytopith. Z, 113: 81-89,1985; 111 Hernalsteans JP et al., EMBO J, 3: 3039-3041,1D84; 131 Hooykaas-Van Slogte GMS et al.. Nature 311: 763-764,1984; /4/ Graves ACF and Goldman SL, J. Bacteriol., 169(4): 1745-1746,1987). In jüngster Zeit entwickelte Tranformationsverfahren, die auf einer direkten Einschleusung von exogener DNA in pflanzliche Protoplasten beruhen, wie beispielsweise der „direkte Gentrasfer" (/5/ Hain et al., 1985; 16/ Paszkowski et al., 1984; ΠI Potrykusetal., 1985b, c,d;/8/ Lörzatal., 1985,/9/ Frommetal., 1985) ruer die Mikroinjektion (/10/ Steinbiss und Stabel, 1983; /11/ Morikawa und Yamada, 1985), müssen insofern ais problematisch an jesehen wercJ-in, als die Regenerierbarkeit ausgehend von pflanzlichen Protoplasten bei einer Vielzahl von Pflanzenspezies, insbesondere aus der Gruppe der Gramineae, zur Zeit noch ein weitgehend ungelöstes Problem darstellt.

Gerade die Familie der Gramineen enthält aber nie aus agrarökonomiscner Sicht bedeutendsten Kulturpflanzen wie beispielsweise Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Mais, Reis, Hirse u.a.m., die von besonderem wirtschaftlichem Interesse sind, so daß es als eine vordringliche Aufgabe angesehen werden muß. Verfahren zu entwickeln, die es ermöglichen, unabhängig von den zuvor genannten Einschränkungen, auch die Vertreter der Gramineen einer direkten genetischen Modifikation zugänglich zu machen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuartigen Verfahrens zur Einschleusung genetischen Materials in monokotyle Pflanzen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, geeignete Transfer-Mikroorganismen und geeignete Kultur- und Applikationsverfahren aufzufinden.

Diese Aufgabe konnte nun im Rahmen der vorliegenden Erfindung überraschenderweise mit einfachen Maßnahmen gelöst werden. Entgegen allen Erwartungen hat es sich im Verlauf der im Rahmen dieser Erfindung durchgeführten Untersuchungen überraschenderweise gezeigt, daß durch die Anwendung geeigneter Kultur- und Applikationsmethoden jetzt auch Pflanzen aus der Gruppe dor Monokotyledonen unter Einsatz bestimmter Transfer-Mikroorganismen, wie beispielsweise von Agrobacterium tumefaciens, zielgerichtet transformiert werden können, das heißt, daß nunmehr auch wichtige Vertreter aus der Gruppe der Monokotyledonen, insbesondere zur Familie der Gramineen gehörige Kulturpflanzen, einer Infektion durch besagten Transfer-Mikrocrganismus zugänglich sind.

Besonders hervorzuheben ist die Erweiterung des Wirtsspektrums von Agrobacterium tumofaclens auf die Gramineen, wodurch auch bei Vertretern aus dieser Familie ein direkter und gezielter Eingriff ins Genom möglich wird.

Die auf diese Weise transformierten Pflanzen können mittels geeigneter Nachweismethoden identifiziert werden. Als besonders geeignet erwies sich dabei die Verwundung von Virusgenomen pflanzenpathogener Viren, wie beispielsweise von Maize Streak Virus (MSV), mit deren Hilfe sich erfolgreiche Transformationen anhand der auftretenden Krankheitssymptome sehr effizient nachweisen lassen.

Ein Bestandteil der vorliegenden Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Einschleusung von genetischem Material in monokotyle Pflanzen oder lebensfähige Teile davon, das sich dadurch kennzeichnet, daß man einen Transfer-Mikroorganismus, der das genetische Material in einer transportierbaren Form enthält, durch Anwendung geeigneter Kultur- und Applikationsmethoden, die eine Induktion der Virulenz-Genfunktionen des Transfer-Mikroorganismus ermöglichen, für eine Infektion von Monokotyledonen einsetzbar macht und mit diesem monokotyle Pflanzen oder lebensfähige Teile davon infiziert.

Im Rahmen dieses Verfahrens werden die Transfer-Mikroorganismen wie beispielsweise Agrobacterium tumefaciens ' zweckmäßigerweise in einem der üblicherweise für die Kultivierung von Mikroorganismen verwendeten Nährmedien bei einer Temperatur zwischen 15⁰C und 40⁰C über einen Zeitraum von 30 bis 60 Stunden (h) in einer bewegten Flüssigkultur herangezogen. Die bevorzugte Anzuchctemperatur liegt bei 24⁰C bis 29⁰C. Anschließend erfolgen ein oder mehrere Subkultivierungsschritte vorzugsweii β im gleichen Medium, zweckmäßigerweise in einem Verdünnungsverhältnis von 1:20, die sich jeweils über einen Zeitraum von 15 bis 30h, vorzugsweise vor 18 bis 20 h, erstrecken. Auch in diesem Fall liegt die Kultivierungstemperatur bei 15'C bis 4O⁰C, vorzugsweise bei 24⁰C bis 29°C.

Bei Verwendung von thermophilen Mikroorganismen kann die Anzuchttemperatur auch deutlich höher liegen als 4O⁰C.

Selbstverständlich können auch andere, für die Anzucht der Transfer-Mikroorganismen geeignete Kultivierungsmaßnahmen im Rahmen dieser Erfindung durchgeführt werden.

So ist es beispielsweise möglich, für die Kultivierung der Transfer-Mikroorganismen auch feste Kulturmedien zu verwenden, die beispielsweise mit Hilfe von Agarose oder Alginat oder jedem anderen geeigneten Verfestigungsmittel hergestellt werden können.

Zur Herstellung der Inokulationslösung werden die Zellen abzentrifugiert und in einer für die Infektion geeigneten Konzentration in einem geeigneten Inokulationsmedium resuspendiert, beispielsweise in '/2 Volumen eines MSSP-Mediums (/12/ Stachel et al.. Nature, 318,624-629,19S5). Der Infektionsprozeß wird erfindungsgemäß dadurch in Gang gesetzt, daß man den zuvor beschriebenen Transfer-Mikroorganismus mit dem pflanzlichen Material in Kontakt bringt, z. B. durch Inkubation mit Protoplasten, durch Verletzung von ganzen Pflanzen oder Gewebestücken oder aber insbesondere durch eine Injektion der Mikroorganismen-Suspension direkt in die Pflanze.

Besonders bevorzugt ist die Injektion der Inokulationslösung im Bereich der Wachstumszonen, vorzugsweise denen des Pflanzenstengels und der Blattscheiden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte jetzt darüber hinaus überraschenderweise gezeigt werden, daß die Transformationshäufigkeit der inokulierten Pflanzen nicht nur entscheidend vom Applikationsort an der Pflanze, sondern auch in besonderem Maße vom Entwicklungsstadium der jeweiligen Versuchspflanze sowie weiteren Parametern abhängt.

Ein wesentlicher Bestandteil der vorliegenden Erfindung betrifft daher eine weitergehende Differenzierung des Applikaticnsortes an der Pflanze und damit die gezielte Applikation der transformierenden, mikroorganismenhaltigen Inokulationslösung an genau definierte Stellen der Pflanze, was 711 einer signifikanten Erhöhung der Transformationshäufigkeit der inokulierten Pflanzen führt. Weiterhin kann durch geeignete Wahl des Applikationszeitpunkts im Hinblick auf das Entwicklungsstadium der Empfängerpflanze die Transformationshäufigkeit noch zusätzlich gesteigert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit insbesondere ein neuartiges Verfahren zur Einschleusung von genetischem Material in monokotyle Pflanzen oder lebensfähige Teile davon, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Transfer-Mikroorganismen, die in der Lage sind, besagtes genetisches Material in monokotyle Pflanzen oder lebensfähige Teile davon einzuschleusen und die das einzuschleusende genetische Material in einer transportierbaren Form enthalten, in Form einer Mikroorganismensuspension in die meristematischen Gewebertjionen der Pflanze oder lebensfähiger Teile davon, inokuliert werden.

Um ein klares und einheitliches Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche sowie des Umfangs, der den besagten Ansprüchen zukommen soll, zu gewährleisten, werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung die folgende Definitionen aufgestellt:

Transfer-Mikroorganismus: Mikroorganismus, der einen Teil seiner DNA in pflanzliches Material überführen kann (beispielsweise Agrobacterium tumefaciens).

T-Replikon: ein Replikon (/13/ Jacob Fet al., 1963), welches mit Hilfe von Genen, die auf diesem Replikon selbst oder auf einem

anderen, im selben Mikroorganismus vorhandenen Replikon lokalisiert sind, in seiner Gesamtheit oder als Teilstück in Pflanzenzellen transported werden kann (Beispiel: das Ti-Plasmid von Agrobacterlum tumefaciens).

T-DNA-Sequenzon; („border sequences") DNA-Sequenzen, die in einer oder mehreren Kopien mit Hilfe mikrobieller Funktionen DNA-Transfer in pflanzliches Material bewirken.

Cargo-DNA: in einen DNA-Vektor artifiziell eingesetzte DNA.

Genomische DNA: aus dem Genom eines Organismus abgeleitete DNA.

cDNA: durch Reverse-Transkriptase hergestellte Kopie einer mRNA

Synthetische DNA: Eine DNA Sequenz, die für ein spezifisches Produkt, Produkte oder eine biologische Funktion kodiert und die auf synthetischem Wege hergestellt wird.

Keterologe(s) Gen(e) oder DNA: Eine DNA-Sequenz, die für ein spezifisches Produkt, Produkte oder eine biologische Funktion kodiert und die von einer anderen Spezies stammt als derjenigen, in welche das besagte Gen eingeschleust wird; besagte DNA-Sequenz wird auch als Fremdgen oder Fremd-DNA bezeichnet.

Homologe(s) Qen(e) oder DNA: Eine DNA-Sequenz, die für ein spezifisches Produkt, Produkte oder eine biologische Funktion kodiert und die aus der gleichen Spezies stammt, in welche das besagte Gen eingeschleust wird.

pflanzliche Zellkulturen: Kulturen von pflanzlichen Einheiten wie beispielsweise Protoplasten, Zellkulturzellen, Zellen in Pflanzengeweben, Pollen, Pollenschläuchen, Eizellen, Embryosäckon, Zygoten und Embryonen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien.

Pflanze: Jedes photosynthetisch aktive Mitglied aus dem Reich Planta, das durcli einen membranumhüllten Nukleus, ein in Form von Chromosomen organisiertes genetisches Material, membranumhüilte cytoplasmatische Organelle und der Fähigkeit zur Durchführung einer Meiose charakterisiert ist.

Pflanzenzelfe: Struktureile und physiologische Einheit der Pflanze, bestehend aus einem Protoplasten und einer Zellwand.

Protoplast: aus Pflanzenzellen oder -gewoben isolierte zellwandlose „nackte Pflanzenzelle" mit der Potenz, zu einem Zellklon oder einer ganzen Pflanze zu regenerieren.

Pflanzengewebe: Eine Gruppe von Pflanzenzellen, die in Form einer strukturellen und funktioneilen Einheit organisiert sind.

Pflanzenorgan: Ein abgegrenzter und deutlich sichtbar differenzierter Teil einer Pflanze, wie beispielsweise Wurzel, Stamm, Blatt oder Embryo.

Vollständig durchtransformierte Pflanzen: Pflanzen, in denen das Genom jeder Zelle im gewünschten Sinne transformiert ist.

Im einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Transformation monokotyler Pflanzen mit Hilfe von Agrobacterium-Stämmen, die in der Lage sind, besagte Transformation durchzuführen, welches sirh dadurch kennzeichnet,

daß die Wahl des Inokulationszeitpunktes im Hinblick auf das Entwicklungsstadium der Empfängerpflanze und des ,

Inokulationsortes im Bereich der Wachstumszonen in der Woise aufeinander abgestimmt werden, daß eine signifikante Erhöhung der erreichbaren Tnnsformationsraten im Vergleich zu bekannten Verfahren eintritt.

Der erfindungsgemäß bevorzugte Zeitpunkt im Hinblick auf das Entwicklungsstadium der Empfängerpflanze für die Applikation der transformierenden mikroorganismenhaitigen Suspension erstreckt sich über einen Zeitraum, der mit der Entwicklung des pflanzlichen Embryos beginnt und mit dem Erreichen des Blütenstadiums und damit dem Ende der Wachstums- und Entwicklungs- (Differenzierungs-) Phase der Empfängerpflanze endet.

Für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen sich insbesondere Pflanzen, die ein Entwicklungsstadium erreicht haben, welches sich zwischen der Samenkeimung und dem Erreichen des 4-Blatt-Stadiums erstreckt.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Inokulation der mikroorganismenhaitigen, transformierenden Inokulationslösung am unreifen, sich entwickelnden Embryo nach der erfolgten Bestäubung und Befruchtung der Eizellen durch den Spermakern, bevorzugterweise jedoch vor der Ausbildung der Samenschale.

Ganz besonders bevorzugt sind 1-3 Tage alte Keimlinge, bei denen der Abstand zwischen dem Skutellarknoten und der apikalen Koleoptilarspitze 1-2cm beträgt. Besonders geeignet sind jedoch Pflanzen, die sich in einem Entwicklungsstadium befinden, das eine eindeutige Identifizierung des Koleoptilarknotens ermöglicht.

Die Inokulation der mikroor&anismenhaltigen transformierenden Suspension erfolgt bevorzugterweise in Regionen der Pflanze, die meristematisches Gewebe enthalten. Es handelt sich dabei um teil'ings- und stoffwechselaktive Gewebeabschnitte, die in erster Linie totipotente embryonale Zellen enthalten, aus denen sich die Gesamtheit der somatischen Zellen und Gewebe ausdifferenzieit und die damit letztlich auch den Ausgangspunkt für die Entwicklung der Keimzellen bildon.

Durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können daher nicht nur transgene Pflanzen erhalten werden, deren somatische Zellen transformiert sind, sondern in erster Linie auch solche Pflanzen, die transformierte Keimzellen enthalten, aus denen sich im Verlaufe der weiteren Zeil- und Gewebe-Differenzierung transformierte Eizellen und/oder Pollen entwickeln können.

Nach erfolgter Befruchtung unter Beteiligung tranformierter Eizellen und/oder transformierter Pollen erhält man Samen, der transgene Embryonen enthält und der für die Herstellung tfansgener Pflanzen verwendet werden kann.

Als besonders geeigneter Applikationsort für das Einbringen der transformierenden, mikroorganismenhaitigen Suspension an bereits in Stengel, Wurzel und Blätter dilferenzierten Pflänzchen, erweist sich der Grenzbereich zwischen Wurzel und Stengel, der sog. Wurzelhals.

Besonders bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung ist eine mehrmalige Applikation der transformierenden mikroorganismenhaitigen Inokulationslösung in die meristcmatischen Gewebebereiche der Pflanze.

In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Applikation der transformierenden, mikroorganismenhaitigen Suspension am Keimling, ca. 1-3 Tage nach der erfolgten Samenkeimung. Bevorzugte Applikationsorte sind der Bereich der Koleoptile und der Koleorhiza.

Sehr gute Transformationsergebnisse lassen sich bei Applikation in unmittelbarer Nachbarschaft oder insbesondere bei Applikation direkt in den Koleoptilarknoten erreichen.

Demnach ist eina weitere, besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß die Applikation der transformierenden, mikroorganismenhaitigen Inokulationslösung 1-3 Tage nach der erfolgten Keimung in unmittelbarer Nachbarschaft oder direkt in den Koleoptilarknoten des Keimlings erfolgt.

Das Einbringen der transformierenden, rnikroorganismenhaltigen Inokulationslösung in die Pflanze kann auf vielerlei Art und Weise durchgeführt werden, z. B. durch artifizielle Verletzung des epidermalen Gewebes und Einreiben der

mikroorganismenhaltigen, transformierenden Suspension in das verletzte Goweba oder durch gemeinsame Inkubation des Transfer-Mikroorganismus und der pflanzlichen Protoplasten.

Bevorzugt ist die Injektion der inokula'.ionslösung unter Verwendung von Injektionsspritzen, mit deren Hilfe eine sehr genau lokalisierte und damit gezielte Applikation an genau definierten Stellen der P'ienze durchfühl bar ist.

In der Rege! verwendet man hierbei Injektionsspritzen mit austauschbaren Injci.Jonskanülen mit einem Querschnitt zwischen 0,1 und 0,6 mm, angepaßi an die Bedürfnisse und besonderen Anforderungen der jeweiligen Pflanzenspezies und deren Entwicklungsstadium zum Zeitpunkt der Applikation. Das applizierte Volumen schwankt ebenfalls in Abhängigkeit von der jeweiligen Pflanzenspezies und deren Entwicklungsstadium zwischen 1 und 20 μΙ, bevorzugt ist ein Applikationsvolumen von

Selbstverständlich können für die zielgerichtete Applikation der Inokulationslösung in die Pflanze auch andere geeignete Hilfsmittel verwendet werden, wie beispielsweise sehr fein ausgezogene Glaskapillaren, mit deren Hilfe unter Verwendung von Mikromanipulatoren kleinste Applikationsmengen in genau definierte Gewebebereiche der Pflanze (wie z. B. das Meristem) appliziert werden können.

Die Vorgehensweise bei der Applikation der Inokulationslösung an der Pflanze bzw. am Keimling kann ebenfalls variieren, läßt sich jedoch für verschiedene Pflanzenspozies ohne weiteres optimieren. Diese Optimierungsversuche können von jedem Fachmain im Rahmen eines normalen Optimierungsprogrammes gemäß den Richtlinien der vorliegenden Erfindung ohne nennenswerten Aufwand durchgeführt werden.

Für die Effektivität der Transformation ist neben den bereits genannten Parametern auch die Konzentration und Wachstumsphase der inokulierten Transfer-Mikroorganismen von Bedeutung. Die bevorzugte Konzentration liegt in einem Bereich von 10⁶ bis 10¹⁰ Organismen pro ml Inokulationslösung. Besonders bevorzugt ist eine Inokulationskonzentration von 10^e bis 10⁸ Organismen/ml.

Im Rahmen dieser Erfindung durchgeführte Verdünnungsexperimente haben gezeigt, daß mit zunehmender Verdünnung der Inokulationslösung eine Abnahme der Transtörma' lonshäufigkeit einhergeht. Dabei liegt die Effektivität des Agrobacterlum vermittelten DNA-Transfers auf monolyte Pflanzen im gleichen Größenordnungsbereich wie der DNA-Transfer auf dikotyle Wirtspflanzen (Ergebnisteü, Punkt D).

Variationsmöglichkeiten im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahren betreffen somit beispielsweise die Wahl der Applikationsmethode, der Einstechtiefe in das pflanzliche Gewebe, der Zusammensetzung und Konzentration der Bakteriensuspension sowie die Anzahl der pro Infektion vorgenommenen Inokulationen.

In einer weiteren spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Applikation der transformierenden, mikroorganismenhaltigen Lösung nach Dekapitieren der Koleoptilarspitze im Bereich des Koleoptilarknotens unmittelbar in das, Koleoptilarknotengewebe, ohne daß der Keimling in seiner weiteren Entwicklung nachteilig beeinträchtigt wird.

Eine bevorzugte Applikationsmethode umfaßt auch in diesom Fall dia Verwendung von Injektionsspritzen, wobei die Einstechtiefe innerhalb bestimmter Grenzen variiert werden kann, in Abhängigkeit von der Entfernung der Dekapitationsstelle vorn Koleoptilarknoten. Bevorzugt ist in jedem Fall eine Inokulation unmittelbar in das Koleoptilarknotengewebe.

Die Applikation der Inokulationslösung kann sowohl in die peripheron Gpwebeabschnitte, als auch insbesondere in den zentralen Teil des offengelegten Koleoptilarknotengewebes erfolgen, wobei die meristematischen Gewebeabschnitte besonders bevorzugt sind.

Bei der Verwendung unreifer Embryonen kann neben den bereits erwähnten Inokulationstechniken ein Verfahren angewendet werden, bei dem der Embryo zunächst von der Mutterpflanze präparativ entfernt und anschließend in einem geeigneten Kulturmedium mit dem Transfer-Mikroorganismus in Kontakt gebracht wird/14/ Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 1, ed. IK Vasil, Academic Press, Inc., 1984;/15/ Pareddy DR, et al, 1987, Plante, 170:141-143,1987).

Als Transfer-Mikroorganismen, die in der Lage sind, genetisches Material auf monokotyle Pflanzen zu übertragen und die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, kommen in erster Linie Mikroorganismen in Frage, die ein T-Replikon enthalten.

Unter Mikroorganismen, welche ein T-Replikon enthalten, sind insbesondere Bakterien, vorzugsweise Bodenbakterien una von diesen vor allem solche der Gattung Agrobacterium, zu verstehen.

Es versteht sie ι von selbst, daß im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens nur Bakterienstämme zu verwenden sind, die unbedenklich sind, das heißt z.B. Bakterienstämme, die in der freien Natur nicht lebensfähig sind bzw. keine ökologischen Probleme verursachen.

Als T-Replikon kommt besonders ein bakterielles Replikon, wie ein Replikon von Agrobacterium, insbesondere von einem Ti- oder Ri-Plasmid eines Agrobacteriums, in Betracht.

Ti-Plasmide besitzen zwei Regionen, die für die Herstellung transformierter Zellen essentiell sind. Bei dikotylen Pflanzen wird eine davon, die Transfer-DNA Region, auf die Pflanze übertragen und führt zur Induktion von Tumoren. Die andere, die virulenzverleihende (vir) Region, ist nur für die Ausbildung, nicht aber für die Aufrechterhaltung der Tumoren essentiell. Die Transfer-DNA Region kann ip. ihren Dimensionen durch Einbau von Fremd-DNA vergrößert werden, ohne d£.i die Übertragungsfähigkeit beeinträchtigt wird. Durch Entfernen der ttimorverursachenden Gene, wodurch die transgenen Pflanzenzellen nicht-tumorös bleiben, und durch Einbau eines selektiomerbaien Markers, kann das modifizierte Ti-Plasmid als Vektor für den Transfer von genetischem Material in eine geeignete Pflanzenzelle vorwendet werden.

Die vir-Region bewirkt den Transfer der T-DNA-Region von Agrobacterium auf das G nom der Pflanzenzelle, unabhängig davon, ob die T-DNA-Region und die vir-Region auf demselben Vektor oder auf verschiedenen Vektoren innerhalb derselben Agrobacterlum-Zelle vorliegen. Eine vir-Region auf einem Chromosom induziert ebenso den Transfer der T-DNA von einem Vektor in eine Pflanzenzelle.

Bevorzugt wird ein System zur Übertragung einer T-DNA-Region von einem Agrobacterium in Pflanzenzellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die vir-Region und die T-DNA-Region auf verschiedenen Vektoren liegen. Ein solches System ist unter dem Begriff „binäres Vektor-System" bekannt, und der die T-ONAenthaltende Vektor wird als ein „binärer Vektor" bezeichnet.

Jeder T-DNA enthaltende Vektor, der in Pflanzenzellen übertragbar ist und der eine Detektion der transformierten Zellen erlaubt, ist für die Verwendung im Rahmen dieser Erfindung geeignet.

Pflanzenzellon oder Pflanzen, die gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert worden sind, können, mit Hilfe eines geeigneten phenotypischen Markers, selektioniert werden. Beispiele solcher phenotypischen Marker, die aber nicht als limitierend aufzufassen sind, beinhalten Antibiotikaresistenz-Marker, wie beispielsweise Kanamycinresistenz- und Hygromycinresistenz-Gene, oder Herbizidresistenz-Marker. Andere phenotypische Marker sind dem Fachmann bekannt und können ebenfalls im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein neuartiges, generell anwendbares Verfahren zcr genetischen Modifikation von Pflanzen aus der Gruppe der Monokotyledonen durch Einschleusung viraler DNA oder ihrer Äquivalente in ganze Pflanzen oder lebensfähige Teile davon.

Es ist bereits in einigen Fällen gelungen, ausgewählte DNA-Fragmente in Virus-DNA einzubauen und dann mit dem Virus in einen anderen Organismus einzuschleusen. Während die meisten Pflanzenviren unter natürlichen Bedingungen durch Insekten übertragen werden, welche bei der Nahrungsaufnahme an infizierten und nicht-infizierton Pflanzen fressen und hierdurch eine Neuinfektion von Pflanzen verursachen, ist dieser Weg für eine gezielte und systematische Übertragung zu aufwendig und zu schwer kontrollierbar. So wurden beispielsweise für eine solche Methode unter kontrollierten Bedingungen herangezüchtete Insektenpopulationen benötigt. Ferner wäre insbesondere bei großen Mengen an Pflanzenmaterial eine planmäßige Virusinfektion sehr schwierig zu erreichen.

Die in der Gentechnologie angewendete Methode der mechanischen Inokulation von Blättern mit Viren ist in der Praxis nur begrenzt anwendbar, da klonierte virale DNA nur in manchen Fällen infektiös ist, in vielen anderen Fällen dagegen nicht. Obwohl es möglich ist, gewisse Arten von Virusgenomen in Bakterien zu Monieren und zu studieren, wie beispielsweise Einzelstrang-DNA-Viren, welche durch Klonierung von Doppelstrang-DNA erhalten werden (/16/ Mullineaux PM et al., [1984]), können doch viela in Bakterien klonierte Viren nicht wieder in die Pflanze eingeschleust oder zur Infektion von pflanzlichem Material verwendet werden. Damit ist aber auch die Anwendung von Methoden wie der In-vitro-Mutagenese und der rekombinanten DNA-Technologie für grundlegende Untersuchungen, wie auch für den Einsatz solcher Viren als Träger von ausgewählter Fremd-DNA ausgeschlossen.

Derartige Probleme treten bei Anwendung des nachstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahrens nicht auf. Basondors bevorzugt sind dabei Konstruktionen, die ein oder mehrere virale Replikons oder Teile eines viralen Replikon in einer Weise eingebaut enthalten, die eine Freisetzung und Replikation des viralen Replikon in der pflanzlichen Zelle erlaubt, unabhängig von der chromosomalen DNA.

Diese Anordnung des viralen Replikons ermöglicht damit eine Freisetzung infektiöser viraler DNA aufgrund einer intramolekularen Rekombination, via Transkription, Revers-Transkription oder anderer Methoden der Umlagerung genetischen Materials. .

Besonders bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein T-Replikon, wie beispielsweise ein Ti-Plasmid oder ein Ri-Plasmid eines Agrobacteriums, weiches virale DNA, beispielsweise DNA von Maize-Streak Virus (MSV), welche gewünschtenfalls Cargo-DNA eingebaut enthält, in Nachbarschaft zu einer oder mehreren T-DNA-Grenz-Sequenzen enthält, wobei die Entfernung zwischen viraler DNA und T-DNA-Grenz-Sequenz(en) so gewählt ist, daß die Übertragung der viralen DNA einschließlich gegebenenfalls vorhandener Cargo-DNA in pflanzliches Material erfolgt.

Als Cargo-DNA können sowohl homologe als auch heterologe Gen(e) oder DNA sowie synthetische Gen(e) oder DNA gemäß der im Rahmen der vorliegenden Erfindung gemachten Definition verwendet werden.

Die kodierende DNA-Sequenz kann ausschließlich aus genomischar, aus cDNA bzw. synthetischer DNA konstruiert sein. Eine ander6 Möglichkeit besteM in der Konstruktion einer hybriden DNA-Sequenz, bestehend sowohl aus cDNA, als auch aus genomischer DNA und'oder synthetischer DNA.

In diesem Fall kann dir/ cDNA aus demselben Gen stammen wie die genomische DNA, oder aber sowohl die cDNA wie auch die genomische DNA kö.inen aus verschiedenen Genen stammen. In jedem Fall können aber sowohl die genomischen DNA und/ oder die cDNA, jede für sich, aus dem gleichen oder aus verschiedenen Genen hergestellt sein.

Wenn die DNA-Sequenz Anteile von mehr als einem Gen beinhaltet, können diese Gene entweder von ein und demselben Organismus, von mehreren Organismen, die mehr als einem Stamm, einer Varietät oder einer Spezies derselben Gattung angehören, oder aber von Organismen, die mehr als einer Gattung derselben oder einer anderen taxonomischen Einheit (Reich) angehören, abstammen.

Die verschiedenen DNA-Sequenzabschnitte können mit Hilfe an sich bekannter Methoden miteinander zu einer vollständigen kodierenden DNA-Sequenz verknüpft sein. Geeignete Methoden schließen beispielsweise die In-vivo-Rekombination von DNA-Sequenzen, die homologe Abschnitte aufweisen sowie die In-vitro-Verknüpfung von Restriktionsfragmenten mit ein. Das erfindungsgemäße Verfahren besteht somit im wesentlichen darin, daß man

a) in ein T-Replikon, wie beispielsweise ein Ti Plasmid oder ein Ri-Plasmid eines Agrobacteriums, virale DNA, beispielsweise DNA von Maize Streak Virus (MSV), welche gewünschtenfalls Cargo-DNA eingebaut enthält, in Nachbarschart zu einer oder mehreren T-DNA-Grenz-Sequenzen einsetzt, wobei die Entfernung zwischen viraler DNA und T-DNA-Grenz-Sequenz(en) so gewählt ist, daß die Übertragung der viralen DNA einschließlich gegebenenfalls vorhandener Cargo-DNA in pflanzliches Material erfolgt,

b) anschließend die Aufnahme des Replikons in einen Transfer-Mikrootganismus veranlaßt, wobei das Replikon in den Transfer-Mikroorganismus gelangt,

c) mit dem gemäß b) modifizierten Transfer-Mikroorganismus Pflanzen aus der Gruppe der Monokotyledonen oder lebensfähige Teile davon infiziert.

Dieses Verfahren gewährleistet, daß nach Induzier ung der mikrowellen Funktionen, welche den Transfer der Plasmid-DNA in die Pflanze fördern, auch die eingesetzte Virus-DNA übertragen wird, einschließlich der gegebenenfalls vorhandenen Cargo-DNA. Das erfindungsgemäße Verfahren besteht somit im wesentlichen aus folgenden Teilschritten:

a) Isolierung von viraler DNA oder ihren Äquivalenten (s. weiter unten) aus infizierten Pflanzen, beispielsweise solchen der Gattung Zoa, und Klonierung dieser DNA in Vektoren eines geeigneten Bakteriums, wie beispielsweise Escherichia coli;

b) Aufbau eines Plasmids (= BaP), welches ein oder mehr als ein viralps Genom oder aber Teile viraler Genome enthält, welche sich in Nachbarschaft zu einer oder mehreren T-DNA-Grenz-Sequenzen befinden, wobei die Entfernung zwischen viraler DNA und T-DNA-Grenz-Sequenz(en) so gewählt ist, daß die Übertragung der viralen DNA einschließlich der gegebenenfalls darin eingebauten Cargo-DNA in ganze Pflanzen oder lebensfähige Teile davon erfolgt;

c) Konstruktion eines Vektor-Systems durch Überführung des Plasmids BaP in einen Transfer-Mikroorganismus (beispielsweise Agrobacterlum tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes);

d) Infektion ganzer monokotyler Pflanzen oder lebensfähiger Teile davon mit dem vorstehend unter c) aufgeführten vektor System.

Die Verwendung von Vektor-Systemen, wie sie vorstehend unter c) beschrieben sind, sowie neue Vektor-Systeme, wie beispielsweise Bakterien des Stammes Agrobacterlum tumefaciens C58 (FUf¹VpTi C58; pEAP200) sowie Agrobacteriumtumefaclent C58 (pTiC58; pEAP37), C58 (pTiC58; pEAP29), C58 (pTiC58; pEAP40) sowieC58 (Nal^R/pTiC58, MSV109)zur gezielten Transformation monokotyler Pflanzen oder lebensfähiger Teile davon bilden weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung.

Ganz besonders bevorzugt sind Bakterien des Stammes Agrobacterium tumefaciens C58 (pTiCG8; pEAP37), C58 (pTiC58; pEAP29), C58 (pTiC58; pEAP40) sowie C58 (Nal^R/pTiC58, MSV109).

Unter viraler DNA und ihren Äquivalenten sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere folgende DNA-Typen zu verstehen:

- doppelsträngige DNA-Formen von Einzelstrang-DNA-Viren (beispielsweise Gemini-Viren, wie Maize Streak Virus [MSV])

- natürliche Virus-DNA (beispielsweise CaMV);

- cDNA-Kopien von Virus-RNA oder Viroid-RNA (beispielsweise von Tabak-Mosaik-Virus oder Cadang Cadang-Viroid);

- jegliche lcthalen oder lebensfähigen Mutanten von Viren;

- klonierte DNA unter dem Einfluß viraler Replications- und/oder Expressionssignale;

- klonierte DNA unter dem Einfluß eukaryontischer Replikations- und/oder Expressionssignale;

- Teile von Virus-DNA;

- Äquivalente der vorstehend aufgeführten DNA-Typen in Tandem-Form und

- Äquivalente der vorstehend aufgeführten DNA-Typen mit eingebauter Cargo-DNA.

Die am Beispiel des vorstehend beschriebenen Vektor-Systems beschriebene Anwendung des erfindungsgemäßen Veifahrens hat z. B. folgende gravierende Vorteile:

- Eine Erweiterung das Wirtsbereichs von normalerweise Dikotylodonenspezifischen Transfer-Mikroorganismen, wie zum Beispiel Agrobacterium tumefaciens ocfcr Agrobacterium rhizogenes, auf Monokotyledonen.

- Die Möglichkeit der systemischen Infektion ganzer Pflanzen durch Verwendung viraler DNA bzw. deren Äquivalente.

- Die Erzielung der Infektiosität von Viren, welche bisher artifiziell nicht zur Infektion gebracht werden konnton (beispielsweise Maize Streak Virus), unter Umgehung der natürlichen Vektoren w<e beispielsweise Insekten.

- Die Möglichkeit der Manipulation von Virus-DNA in einem bakteriellen System wie beispielsweise F. coil.

- Eine Erweiterung des Wirtsbereiches von Viren.

- Eine Vereinfachung der Inokulation durch Vermeidung der DNA-Reinigung und drastische Verminderung der zur Inokulation erforderlichen Menge an Inokulum.

- Möglichkeit der Transformation von Zellen, Geweben und ganzen Pflanzen, wodurch Einschränkungen, die auf Grund von Schwierigkeiten bei der Regeneration ganzor Pflanzen aus Protoplasten auftreten können, überwunden werden.

- Unter Kontrolle bakteriell kodierter Funktionen kann die T-DNA, einschließlich der ausgewählten viralen DNA, in das Wirtsgenom eingebaut werden. Da in manchen Fällen nach einer Transformation mit Bakterien aus einer Einzelzelle eine ganze Pflanze regeneriert werden kann, kann virale DNA in das nukleare Genom sämtlicher Zellen einer Pflanze eingeführt werden. Solche integrierten Virusgenome können

a) auf sexuellem Wege auf die Nachkommenschaft übertragen werden;

b) eine Infektion mit überinfizierenden Viren verhindern und

c) gegebenenfalls als Quelle dienen für weitere, gegebenenfalls auch ausgewählte Cargo-DNA enthaltende Viruskopien, welche sich via Transkription, Revers-Transkription, homologe Rekombination oder andere Methoden der Umlagerung genetischen Materials von der integrierten Kopie absetzen.

d) Ferner kann möglicherweise eine Zweitinfektion („Superinfection") von pflanzlichem Material, welches Toile viraler Genome in die nukleare DNA eingebaut enthält,

α) zur Entwicklung besserer viral ir Vektoren führen, da die Expression viraler Gene aus der nuklearen DNA vielleicht die Möglichkeit bietet, indem ''''e Zweitinfektion bewirkenden Virus virale DNA durch Fremd-DNAzu ersetzen; und

ß) zum besseren Verständnis der Wirt-Parasiten-Beziehungen und damit zur besseren Schützbarkeit der Pflanzen in erheblichem Maße beitragen.

Es werden somit eine Vielzahl von Aueführungsformen von dom breiten Konzept dieser Erfindung umfaßt. Unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens läßt sich in das Virusgennm eingebaute Cargo-DNA ebenfalls in pflanzliches Material transportieren und darin ausbreiten. Die Ausbreitung der Viren und damit auch des durch sie transportierten Fremdgens in Pflanzen ist insbesondere dann außerordentlich vorteilhaft, wenn die Pflanzen asexuell vermehrt werden sollen oder auf direktem Wege und in kürzester Zeit gegen schädigende Einflüsse geschützt werden sollen; beispielsweise durch Einbringen eines Resistenzgens in die Pflanzen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere dazu geeignet, ausgewählte Gene und damit eine gewünschte Eigenschaft in pflanzliches Material, aber auch ausgewachsene Pflanzen einzuschleusen und darin zu verbreiten. Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auch im Pflanzenschutz einsetzen, um Pflanzen durch einen Transfer-Mikroorganismus, wie vorstehend beschrieben, gegen Virusbefall zu „immunisieren", indem man die Pflanzen mit einem geschwächten, nicht pathogenen oder nur schwach pathogenen Virus transformiert, was dazu führt, daß man sie auf diese Weise vor unerwünschten, weiteren Virusinfektionen schützt.

Als virale DNA, welche im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann, läßt sich, ohne daß dies eine Beschränkung darstellt, beispielsweise DNA von Caulimoviren, einschließlich Cauliflower Mosaik Virus (CaMV), des weiteren DNA von Vertretern der Geminiviren, wie z. B. von Bean Golden Mosaic Virus (BGMV), Chloris Striate Mosaic Virus (CSMV), Cassava Latent Virus (CLV), Curly Top Virus (CTV), Maize Streak Virus (MSV), Tomato Golden Mosaic Virus (TGMV) und Wheat Dwarf Virus (WDV) verwenden.

Vertreter aus der Gruppe der Caulimoviren, insbesondere aber Cauliflower Mosaik Viren, sind für eine Verwendung im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders geeignet, da sie aufgrund ihres Genomaufbaus (doppelsträngige DNA) einer genetischen Manipulation unmittelbar zugänglich sind.

Alle bisherigen Experimente und die damit verbundenen Beobachtungen sprechen dafür, daß auch die Vertreter der

Geminiviren, deren Genom aus einzelsträngiger (ss) DNA aufgebaut ist, nls Vektoren für die Übertragung genetischen Materials eingesetzt werden können. Zudem ist auch bekannt, daß im Verlauf des Entwicklungszyklus der Geminiviren doppelsträngige

ds-DNA in infizierten Pflanzen gebildet wird und daß diese ds-DNA infektiös ist (^17> Kegami M et al., Proc. Natl. Acad. ScI., USA, 78:4102,1981).

Damit kommen auch Vertreter aus der Gruppe der Geminiviren, die im Verlaufe ihres Entwicklungszyklus ds-DNA bilden und damit einer direkten genetischen Manipulation zugänglich sind, im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Träger fremden genetischen Materials in Frage.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Geminiviren als Marker, da sich erfolgreiche Genübertragungen auf Pflanzen unter Einsatz von Viren sehr leicht an den meist makroskopisch sichtbaren Infektionssymptomen erkennen lassen, z. B. an Hand von gelben Punkten oder Streifen, an der Basis neugebildeter Blätter bei Verwendung von MSV.

Der Wirtsbereich der Geminiviren umfaßt eine ganze Reihe von wirtschaftlich bedeutenden Kulturpflanzen, wie Mais, Weizen, Tabak, Tomaten, Bohnen, sowie zahlreiche tropische Pflanzen.

Von besonderer kommerzieller Bedeutung ist der Wirtsbereich von Maize Streak Virus, der zahlreiche monokotyle Kultur- und Getreidspflanzen umfaßt, wie z. B. Mais, Reis, Weizen, Hirse, Sorghum, sowie veischiedene afrikanische Gräser.

Das erfindungsgemäße Vorfahren ist insbesondere geeignet zur Infektion ganzer Pflanzen aus der Klasse der Monocotyledoneae oder lebensfähiger Teile dieser Pflanzen, wie z. B. pflanzliche Gewebekulturen oder Zellkulturzellen mit viraler DNA sowie deren Äquivalenten. Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung betrifft daher die aus dem erfindungsgemäßen Verfahren resultierenden transformierten Protoplasten, Pflanzenzellon, Zellklone, Zellaggregate, Pflanzen und Samen sowie deren Nachkommen, die die durch die Transformation erzeugte neue Eigenschaft aufweisen, ferner alle Kreuzungs- und Fusionsprodukte des transformierten Pflanzenmaterials, die die durch die Transformation erzeugten neuen Eigenschaften aufweisen.

Ebenso ein Bestandteil der vorliegenden Erfindung sind transformierte ganze Pflanzen sowie lebensfähige Teile dieser Pflanzen, insbesondere Pollen, Eizellen, Zygoten, Embryonen oder jedes beliebige andere aus transformierten Keimbahnzellen hervorgegangene Vermehrungsgut.

Weiterhin werden durch die vorliegende Erfindung auch vollständig durchtransformierte Pflanzen umfaßt, die aus lebensfähigen Teilen transformierter monokotyler Pflanzen regeneriert worden sind.

Monokotyle Pflanzen, die für die erfindungsgemäße Verwendung geeignet sind, schließen beispielsweise Spezies aus den Familien Alllaceae, Amaryllidaceae, Asparagaceae, Bromeliaceae, Gramlneae, l.illaceae, Musaceao, Orchldaceae oder Palmae

Besonders bevorzugt sind dabei Vertreter aus der Familie der Gramineae, wie z. B. Pflanzen, die großflächig angebaut werden und hohe Ernteerträge liefern. Als Beispiele seien genannt: Mais, Reis, Weizen, Gerste, Roggen, Hafer oder Hirse.

Weitere Zielkulturen für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind beispielsweise Pflanzen der Gattungen Allium, Avena, Hordeum, Oryzae, Panlcum, Saccharum, Sacale, Setaria, Sorghum, Triticum, Zea, Musa, Cocos, Phoenix und Elaeis.

Der Nachweis einer erfolgreichen Transformation durch Übertragung von MSV DN/. auf die jeweilige Testpflanze kann auf an sich bekannte Weise erfolgen, beispielsweise anhand von Krankheitssymptomen sowie durch molekularbiologische Untersuchungen, zu denen besonders die «Southern blot'-Analyse gehört.

Die extrahierte DNA wird zunächst mit Restriktioiiscnzymen behandelt, anschließend einer Eloktrophore.se in 1 %igem Agarose-GeI unterworfen, auf eine Nitrozellulosemembran ("'Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98, 503-517 [1975]) transferiert und mit der nachzuweisenden DNA, welche zuvor einer Nick Translation ("' Rigby, W. J., Dieckmann, M. Rhodes, C, und P. Berg, J.Mol. Biol.

113,237-251 (unterworfen wurde (DNA-spezifische Aktivitäten von 5 χ 10⁸ bis 10 χ lO'cp.m./pg) hybridisiert. Die Filter werden dreimal je eine Stunde lang mit einer wäßrigen Lösung von 0,03 M Natriumeitrat und 0,3 M Natriumchlorid bei 65⁰C gewaschen. Die hybridisierte DNA wird durch Schwärzung eines Röntgenfilms während 24 bis 48 Stunden sichtbar gemacht.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.

Zur Illustration der eher allgemeinen Beschreibung sowie zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung soll nunmehr auf spezifische Ausführungsbeispiele Bezug genommen werden, die keinen limitierenden Charakter haben, es sei denn, es wird speziell darauf hingewiesen.

Nichtlimitleronde Ausführungsbeispiele

Beispiel 1: Konstruktion eines Vektors mit dimerem MSV-Genom

Die Isolierung von MSV-Genomen kann aus in der Natur vorhandenen, infizierten Maispflanzen gemäß ^16> Mullineaux PM et al., QMBO J, 3: 3063-3068,1984 erfolgen. Dabei dient Virion ss DNA als Matritze für die in vitro Synthese doppelsträngiger MSV-DNA unter Verwendung von Klenow-Polymeraselundeinem endogenen Primer (^l8lDonson J et al., EMBO J, 3: 3069-3073,1984).

Eine andere Möglichkeit besteht in der Isolierung von doppelsträngiger MSV-DNA („supercoiled MSV-DNA") direkt aus infiziertem Blattmaterial. Doppelsträngige MSV-DNA wird als Intermediärprodukt bei der Virus-Replikation gebildet. Sie wird als „replicative form DNA" oder .RF-DNA" bezeichnet.

Die Klonierung der MSV-Genome erfolgt durch Einbau der RF-DNA bzw. der in vitro synthetisierten DNA in einen durch BamHI linearisierten pUC9 Vektor ('^9I Vieira T and Messing T, Gene 19: 259-268,1982). Zur Identifizierung der rekombinanten Phagen wird der Iac Komplementations-Test herangezogen.

Die weitere Vorgehensweise besteht zunächst im Ausschneiden der klonierten MSV-DNA an der einzigen BamHI-Restriktionsschnittstelle. Das anfallende linearisierte DNA-Fragment wird anschließend nach gelelektrophoretischer Auftrennung des DNA-Gemisches isoliert. (^2Oi Maniatis et al., (1982)).

Bei Virusstämmen mit zwei oder mehreren BamHI-Restriktionsschnittstellen wird das MSV-Genom entweder partiell verdaut, oder man sucht eine andere geeignete Schnittstelle, die nur einmal im MSV-Genom vorkommt. Letzteres gilt auch für den Fall, daß keine BamHl-Schnittstelle im rviSV-Genom existiert.

Es folgt das Einspleißen des BamHI-Fragmentes in Tandem-Anordnung in die BgI !!--Schnittstelle des Plasmids pGA471 (²¹¹An G et al., EMBO J, 4: 277-284,1985), welche sich zwischen den T-DNA-Grenzsequenzen befindet. Dieses sogenannte TanJem-Klonieren kann über die jeweiligen Konzentrationen von Vektor und Insert gesteuert werden. In der Ligationslösung sollte das

Insert im Überschuß vorliegen. Das bevorzugte Konzentrationsverhältnis liegt in diesem Fall bei 10:1 (Insert Vektor).

Bei dem Plasmid pGA471 handelt es sich um einen sogenannten Shuttle -Vektor, der sowohl in E. coil wie auch in Agrobacterlum tumefaclens in Anwesenheit von Tetrazyklin stabil repliziert wird.

Dieser Vektor besitzt neben dem zwischen den T-DNA Grenzsequenzen liegenden CoIE 1 -Rcplikationsursprung einen Walteren Replikationsursprung, der einen weiteren Wirtsberoich umfaß! und die Erhaltung des Plasmids in Agrobacteriurri tumefaclens erlaubt. Dieser Replikationsursprung stammt aus dem Plasmid pTJS 75, einem Plasmid mit weitem Wirtsbereich und einem Tetrazyklin Resistenz-Gen, einem Abkömmling von RK2 {'"An G et al., EMBO-J, 4: 277-284,1985).

Weitere charakteristische Eigenschaften des Piosmids pGA471 sind:

1) Der Besitz verschiedener Restriktionsschnittstellen zwischen den T-DNA-Gromsequenzen, die einen Einbau von Fremd-DNA ermöglichen;

2) eine cos-Region des Bakteriophagen λ, die eine Klonierun^ großer DNA-Fragmente (25-35kb) erlaubt; .

3) ein chimäres Markergen, zusammengesetzt aus den Kontrollsequenzen des Nopalin-Synthase-Gens (nos) und einer für Neomychin-Phosphotransferase codierenden DNA-Sequenz sowie

4) eine bom-Schnittstelle, die eine Mobilisierung des Plasmids aus E. coil in Agrobacterium tumefaciens ermöglicht.

Die oben erwähnte Inkubationslösung, enthaltend den Vektor sowie die einzuspleißende MSV-DNA, bevorzugterweise in einem Konzentrationsverhältnis von 1:10, wird für dio Transformation des E.coli-Stammcs DH1 ("'Hanahan, D., and Mese'son, M, Gene, 10: 63-67,1980) verwendet. Die Selektionierung erfolgt aufgrund der Tetrazyklin-Resisteiiz der transformierten K'.one sowie von Hybridisierungsexperimenten unter Verwendung radioaktiv markierter MSV-DNA.

Eine Auswahl positiver Klone wird anschließend auf das Vorhandensein von MSV-Genomen in Tandem-Anordnung untersucht. Dazu wird die Plasmid-CNA nach an sich bekannten Methoden (^wlManiatis et al., [1982]) aus den positiven Klonen isoliert und anschließend einer Restriktionsaiiaiy..o unterzogen.

Einer der "Tandem Klone" wird selektioniert und von E. coll DH1 auf Agrobacterium tumefaciens C 53 (R^-If¹ZpTiC 58) übertragen.

Die Übertragung erfolgt in einem "triparental mating", wie bei "'Rogers SG et al. (1986) ausführlich boschrieben. Zur Selektion werden in diesem Fall Rifampicin (100pg/ml) und Tetracylin (5pg/ml) verwendet. Die erfolgreiche Übertragung der dimeren MSV-Genome wird mit Hilfe der Southern Hybridisieruny getestet (^2<lDhaese P et al.. Nucleic Acids Res. 7:1837-1849,1979). Agrobacterium tumefaciens C58 (Rifⁿ/pTiC 58) |^2SIHolsters et al., Plasmid, 3,212,1980], enthält ein Wildtyp Ti-Plasmid mit intakten Virulenzfunktionen, wodurch die Mobilisierung des "Shuttle Vektors" in die pflanzliche Zelle ermöglicht wird. Der auf die oben beschriebene Weise transformierte Agrobacterium-Stamm erhält folgende Stammbezeichnung: Agrobacterium tumefaciens (Rif"/pTiC58; pEAP 200)

Beispiel 2: Konstruktion eines Kontrollvektors

Zur Konstruktion eines Kontrollvektors ohneT-DNA Grenzsequenzen wird das Plasmid pRK 252 Kanlll verwendet, ein Abkömmling des Plasmids pRK (^2elBevan, M, Nucleic Acid Res., 12:204-207,1984), das keine T-DNA Grenzsequenzen aufweist. Der Einbau des dimeren MSV-Genoms in den Kontrollvektor erfolgt durch Einspleißen des oben beschriebenen BamHI-Fragmentes (siehe Seite 24) in Tandem-Anordnung mit Hilfe eines SaI l/BamHI-Adapters in die SaI !-Schnittstelle des Plasmids pRK252 Kanlll.

Die Mobilisierung des Kontrollvektors in Agrobacterium tumefaciens C58 (Rif^R/pTiC 58) erfolgt über ein "triparentdl mating", wie bei "'Rogers SG et al., 1986 ausführlich beschrieben.

Der transformierte Agrobacterium-Stamm erhält folgende Stammbezeichnung: Agrobacterium tumefaciens C58 (Rif"/pTiC58; pFA21).

Beispiel 3: Herstellung des bakteriellen Vektors pEAP 25

Durch Austausch eines 0,65kb Hind W-Sd I Fragments im Cosmid pHC 79, einem Derivat des E. coil Plasmids pBR322 ("'Hohn and Collins, 1980), durch ein 1,2 kb umfassendes Fragment aus dem Transposon Tn 903 (^2elGrindley et al., 1980), welches ein Kanamycin-Resistenzgen trägt, enxsteht das hybride Cosmid p22G 1.

Die Integration des 1,2kb Fragments in die Hind Ill-Sal !-Schnittstelle von pHC 79 wird ermöglicht durch Anfügen von Hind Ill-Sal I Linker-Sequenzen.

Aus dem Plasmid pCaMV6Km wird ein 2,9kb umfassendes SaI I-Bst EU-Fragment, welches ein Gen enthält, das für Kanamycinresistenz bei Pflanzen kodiert (⁶¹Paszkowski et al., 1984), ausgeschnitten und mit einem 2,4kb Sa' I-Bst Ell-Fragment aus p22G1 ausgetauscht.

Die endgültige Konstruktion von pEAP 25 erfolgt durch Integration des zuvor mit Sal I geschnittenen Plasmids pB S in die SaII-Schnittstelle von pEAP 1. Das Plasmid pB S wurde von J. Davies vom John Innes Institut, Norwich, England entwickelt und zur Verfügung gestellt. Dieses Plasmid ist inzwischen bei ^wlN.Grimsley et al., 1987 unter der Bezeichnung pMSV12 publiziert.

Das Plasmid pB 6 enthält ein dimeres MSV-Genom, welches zuvor in dem Piasmid pACYC 184 ("'Chang and Cohen, 1978) kloniert v/urde.

Beispiel 4: Herstellung des bakteriellen Vektors ρEAP 37

Der bakterielle Vektor pEAP37 wird konstruiert durch einfügendes Plasmids pB6, das zuvor mit Salt ges hnitten wurde, in die Sail Restriktionsschnittstelle des Plasmids pCIS 10. Das Plasmid pCIBIO wjrde von Mary-Dell Chilton, CIBA-GEIGY Biotechnology Facility, Research Triangle Park, Raleigh N. C, USA, entwickelt und zur Verfügung gestellt.

Beispiel 5: Herstellung des bakteriellen Vektors pEAP 40

Ein 1,6mer des MSV Genoms [Bglll-BamHI-Fragment (0,6mer) + BamM-BamHI-rragment, (Monomer)) wird in die BamHI Restriktionsstellen des Plasmids pTZ 19 R, das bei ^31lMead et al. (1986) beschrieben ist, eingespleißt. Das so enstan Jene Plasmid mit der Bezeichnung ρ3547, das ein 'i,6mer des MSV Genoms enthält, wird mit EcoRI geschnitten und anschließend in die EcoRI-Stelle des Plasmids pCIB200 (³²¹Rothstoin et al., 1987) eingespleißt. Durch diese Maßnahmen werden die MSV-Sequenzen zwischen dieT-DNA "border'-Sequenzen von pCIB200 plaziert.

Beispiel 6: Konstruktion dos bakteriellen Vektors pMSV109

5 Mg des Plasmids pMSV 12, dessen Konstruktion zuvor im Beispiel 3 beschrieben wurde, werden mit BamHI in einer Pufferlösung (^MIManiatis et al., 1982) für einen Zeitraum vcn 2 Stunden bei einer Temperatur von 37°C verdaut. Das aus dieser enzymatischen Verdauung resultierende 2,7 Kb umfassende DNA-Fragment wird nach der elektrophoretischen Auftrennung der Probe in einem 1 % Agarose-TAE Gel (4OmM Tris-HCI, 2QmM Natriumacetat, 2 mM EDTA) aus diesem eluiert und in die einzige Barn HI-Schnittstelle des binären T-DNA-Vektors pBin19 (^26lBevan, 1984) eingespleißt.

Für die Verknüpfungsreaktion arbeitet man mit einem 10Ofachen molaren Überschuß des 2,7 Kb MSV-Fragments (des „Inserts") im Vergleich zum Vektor pBin i 9 und einer hohen T₄-DNA Ligase Konzentration, um eine hohe Einbaurate der dimeren MSV-DNA in den Vektor zu gewährleisten. Die im einzelnen verwendeten Konzentrationen liegen bei 625ng pMSV DNA und 25ng pBin 19 DNA, die bei einer Temperatur von 10°C für einen Zeitraum von 16 Stunden in Gegenwart von 5 Einheiten T₄-DNA i.igase in einem Gesamtvolumen von 10 μΙ miteinander verknüpft werden. Eine Hälfte diese Lig Jtions-Mischung wird in kompetente E. coil JM83 rec^A-Zellen transformiert und auf "Luria Broth" (LB)-Agar (^wlManiatis et al. 1982), der mit 50pg/ml Kanamycin-Sulfat und A0\ig/m\ B-DibronrM-chlor-S-indolylgalactosid (X-gal) angereichert ist, ausplattiert und bei 37⁰C über Nacht inkubiert. Weiße Kolonien, die das MSV-lnsert enthalten, werden ausgelesen und ein Klon, der das dimere MSV-lnsert in Tandem-Anordnung enthält (pMSV 109) wird für die Konjugation in Agrobacterlum tumefaclens C 58 NaI" ("'Hepburn et al., 1985) ausgewählt, die nach einem Verfahren, das bei Ditta et al., 1980, beschrieben ist, durchgeführt wird. Die Selektion der Exkonjuganten erfolgt auf LB-Agar, enthaltend 50pg/ml Kanamycinsulfat und 50pg/ml Nalidixinsäure. Die gewählte Kolonie, die in den im folgenden beschriebenen Inokulationsexperimenten eine Infektion bei Mais auslöst, erhält die Bezeichnung pMSV114.

Beispiel 7: Herstellung eines Kontrollvektors (pEA 2) ohna T-DNA-Grenzsequenzen Zur Konstruktion des Kontroll-Vektors pEA2 wird die SaI!-Schnittstelle des Plasmids pRK252/km IiI, eines Vorläufer-Plasmids, von pBIN 19 (^J61Bevan, 1934) mit dem Sal I geschnittenen Plasmid pB6 verknüpft.

Die Selektionierung von pEA 2 erfolgt aufgrund der Kanamycin (Km")- und Chloramphenicol (Cm^R)-Resistenz des Kontroll-Vektors.

Beispiel 8: Einführung der Plasmide pEAP25, ρEAP37 und pEA2 In Agrobacterium tumefaciens Das Plasmid pEAP 25 wird in Bakterien des Stammes Escherlchla coli GJ 23 (pGJ 28, R 64 rd 11) ("'van Haute et al., 1983) kloniart.

Dieser E.coli-Stamm ermöglicht den konjugalen Transfer von Plasmiden, welche eine bom-Schnittstelle aufweisen, in Agrobacterlum tumefaclens. Die Plasmide pEA2, pEAP37 und pEAP40 werden via eines "triparontal mating" in Agrobacterium tumefaclens mobilisiert ("'Rogers, S. G , et al., 1986). Als Empfängerstämme werden zwei Agrobacterlum tumefaciens-Stämme verwendet

1) C58 (pTiC58) für die binären Vektoren pEAP40,pEA2 und pEAP37

2) C58 (pTiC58, pEAP18) für das Plasmid pEAP25.

Wildtyp-Stämme von Agrobacterlum turnefaclens können von der "Culture Co. action of the Laboratory of Microbiology, Microbiology Department of the University of Gent" bezogen werden.

pEAP25: Als Rezipienten-Stamm für das Plasmid pEAP 25 dient der Agi obacterium-Stamm C58 (pTiC58, pEAP 18). Bei pEAP 18 handelt es sich um einen binären Vektor, welcher konstruiert wird, indem man das 6,7kb umfassende EcoRI-BamHI-Fragment des Plasmids pGA4?2 (^2!| An, G., et al., 1985) durch das aus 2,6kb bestehende EcoRI-BGIII-Fragment des Plasmids pHC79 ("' Hohn, B. et al., '980), welches zwischen T-DNS-Grenz-Sequenzan einen Bereich für homologe Rekombination in dem Plasmid pEAP25 enthält, ersetzt. Da das Plasmid pEAP25 in Agrobacterium tumefaciens nicht zur Replikation gelangt, ergibt die Selektionieriing der Exkonjuganten auf Rifampicin, Kanamycin und Carbenicillin den neuen Agrobacterium-Stamm Agrobacterium tumofaclens C58 (pTiC58, pEAP29), worin das Plasmid pEAP25 in den binären Vektor pEAP18 durch homologe Rekombination intogriert worden ist.

pEAP37, pEAP40: Die Mobilisieruri ι der Plasmide pEAP37 und pEAP40 aus E.coli in Agrobacterlum tumefaciens via "triparental mating" führt zum Aufba.i eines binären Vektor-Systems.

pEA2: Das Kontroll-Plasmici pEA2 w rd in den Agrobacterium-Starnm C58 (pTiC58) eingeschleust, wo es sich in trans zu dem dort bereits vorhandenun Ti-Ptasmiu etabliert.

Die, wie vorstehend beschrieben, neukonstruierten Plasmide werden anhand von DNA-Isolierung und Restriktionskartierung geprüft.

Üie im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Fiasmide pEAP37, pEAP40 und pMSV109 wurden bei der als Internationais Hinterlegungsstelle anerkannten "Deutschen Sammlung von Mikroorganismen" (DSM), in Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, bzw. "The National Collection c' Industrial Bacteria" (NCIB), Torry Research Station, P.O. Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen entsprechend den Anforderungen α -Budapester Vertrages für die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke der Patentierung, hinifcrlegt. Eine Erklärung zur Lebensfähigkeit der hinterlegten Proben wurde durch die besagte Internationale Hinterlegungsstelle ausgefertigt.

Mikroorganismen Hinterlegungs- Hinterlegungs- Datum der Lebens

datum Nummer* fähigkeits-

bescheinigung

pEAP37 16. Juni 1987 DSM 4147 19. Juni 1987

(Escherlchiacoll

DHI transformiert

mitpEAP37

Plasmid-DNA)

pEAP40 16. Juni 1987 D3M4148 19. Juni 1987

(Escherlchiacoli

DHI transformiert

mitpEAP40

Plasmld-DNA)

pMSV 1987 NCIB 1987

* Hinterlegungs-Nummer, ausgegeben durch die oben bezeichnete Internationale Hinterlegungsstelle.

Einschränkungen der Zugänglichkeit besagter Mikroorganismen sind seitens des Hinterlegers nicht verlangt worden.

BelspleO: Kultivierung der AgrobacterIon-Stämme C58 (Rlf^R/pTIC58; pEAP200) C58 (Rif"/pTiC58, pEA21), C58 (pOC58, pEA2) und C58 (pTIC58, pEAP37), C58 (pYIC58, pEAP29); C58 (pTiC58, pEAP40) sowie C58 (Nal^R/pTiC58, pMSV 109) und Herstellung der Inokulationslösung

Vor der Inokulation werden die Agrobacterien-Stämme auf YEB Medium (Bacto Rindfleischextrakt 5g/l, Bacto Hefeextrakt 1 g/l, Peptone 5g/l, Sucrose 5g/l MgSO₄ 2 mM, pH 7,2), welches zuvor mit lOOpg/ml Rifampicln und 25pg/m! Kanamycin bzw. 50pg/ml Nalidixinsäure angereichert und mit 1,5 % Agar verfestigt wurde, ausplattiert. Nach einer Kultivierungsdauer von 48 h bei einer Temperatur von 28°C wird eine einzelne Kolonie zum Animpfen einer Flüssigkultur verwendet. Diese wird in 100-ml-Erlenmoyer-Kolben in einem f lüsrigen YEB-Medium, welches mit Antibiotika in der zuvor angegebenen Konzentration angereichert ist, durchgeführt. Die Kultivierung erfolgt bei einer Temperatur von 28°C auf einer Schüttelmaschine bei einer · Geschwindigkeit von 20Or.p.m. Die Kultivierungsdauer beträgt 24h.

Anschließend wird eine zweite Subkultivierung in flüssigem Medium mit einem Verdünnungsverhältnis von 1:20 unter ansonsten gleichen Bedingungen durchgeführt. Die Inkubationsdauer beträgt in diesem Fall 20h.

Diese Maßnahmen führen zu einer Populationsdichte an lebenden Agrobact6rien von etwa 10⁹/ml.

Die Bakterienzellen werden durch Abzentrifugieren geerntet und anschließend in einem äquivalenten Volumen einer 1OmM MgSO₄-Lösung, die keine Antibiotika enthält, resuspendiert.

Diese Suspension wird im weiteren Verlauf als unverdünnte Stammlösung bezeichnet. Bei der Herstellung von Vordünnungsreihen wird als Verdünnungsmittel ebenfalls 1OmM MgSO₄-Lösung verwendet.

Beispiel 10: Sterilisation und Keimung von Mals-Samen

Für die Inokulationsexporimente werden Pflanzen der Varietäten Golden Cross Bantam, B 73, North Star und/oder Black Mexican Sweetcorn verwendet, die alle erfolgreich agroinfizieit werden können.

Es werden für die folgenden Experimente in der Regel 3 Tage alte, zuvor sterilisierte, Keimlinge verwendet. Dia Sterilisation der Keimlinge umfaßt die folgenden Verfahrensschritte:

1. Sterilisation der Samen in einer 0,7% w/vCalciumhypochlorit-Lösung (250ml Lösung/100 Samen). Die Durchmischung von Samen und Lösung erfolgt mit Hilfe eines Magneirührers.

Nach 20 Minuten wird die Sterilisationslösung dekantiert.

2. Es folgt ein 3maliges Waschen des so behandelten Samens mit destilliertem Wasser (250 ml dest. Wasser/100 Samen) für jeweils 30 Minuten.

Die auf diese Weise sterilisierten Samen werden anschließend in zuvor ebenfalls sterilisierte Keimkammern eingebracht. Dabei handelt es sich um Petrischalen, die jeweils 3 sterile Macherey-Nagel*-Rundfilter mit einem Durchmesser von 8,5 cm sowie etwa 10ml steriles Wasser enthalten.

In jede dieser Keimkammern werden 20 Samen eingebracht und für etwa 3 Tage bei einer Temperatur von 28⁰C im Dunkeln inkubiert.

Für die anschließenden Inokulationsexperimente werden nur Keimlinge verwendet, bei ebnen der Abstand zwischen Skutellarknoten und derapikalen Koleoptilarspitze 1-2cm beträgt. Auf alle Fällen muß aber gewährleistet sein, daß der Koleoptilarknoten deutlich identifizierbar ist.

Beispiel 11: Inokulation der Mal^-Keimlinge

Für das Einbringen der unter Punkt 3. beschriebenen Inokulationslösung in die Mais-Keimlinge werden Hamilton Injektionsspritzen (A 50μΙ oder 100μΙ) verwendet, die mit austauschbaren Injektionsnadeln von 0,4mm Durchmesser ausgestattet sind.

Das Aufziehen der Inokulationslösung in die injektionsspritze wird in der Weise durchgeführt, daß keine Luftblasen gebildet werden.

11.1. Inokulation 10 Tage alter Maispflanzen

Die Inokulation der bakterionhaltigen Suspension in 10 Tage alte Maispflanzen wird mit verschiedenen Methoden und an verschiedenen Stellen der Pflanze durchgeführt.

1. Aufbringen von 20μΙ Bakteriensuspension auf eines der oberen Blätter und Einreihen der Suspension mit Hilfe von Carborundum-Pulver in das Blatt, bis das gesamte Blatt naß erscheint (Position A in Abbildung 1).

2. Injektion von 10μΙ der Bakteriensuspension unter Verwendung einer 100μΙ Hamilton-Injektionsspritze in den zentralen TgM der Pflanze,

a) genau oberhalb der Llgula des Primärblattes (Position B in Abbildung 1)

b) 1 cm unterhalb der Ligula des Primärblattes (Position C in Abbildung 1)

c) an der Basis der Pflanze in den sog. Wurzelhals, ein meristematisches Gewebe, aus dem sich später Adventivwurzeln entwickeln (Position D in Abbildung 1).

11.?. Inokulation von 3 Tage alten Mais-Keimlingen

Die Inokulation der bakterienhaltigen Suspension in 3 Tage alte Mais-Keimlinge erfolgt durch Injektion in den Keimling mit Hilfe einer 100-ml-Hamilton-lnjektionsspritze.

1. Injektion der Bakteriensuspension in den Koleoptilarknoten durch Einführen der Injektionskanüie durch die Koleoptile, ausgehend von der abikalen Koleoptilarspitze bis in den Bereich des Koleoptilarknotens (Position E in Abbildung 2).

2. Injektion ds.· Bakteriensuspension unmittelbar in die Koleoptile, 2mm unterhalb der apikalen Koleoptilarspitze (Position F in Abbildung 2).

3. Injektion der Bakteriensuspension unmittelbar in die Koleoptile, 2mm oberhalb des Koleoptilarknotens (Position G in Abbildung 2).

4. Injektion der Bakteriensuspension unmittelbar in den Koleoptilarknoten (Position H in Abbildung 2).

5. Injektion der Bakteriensuspension unmittelbar in die Koleoptile, 2mm unterhalb des Koleoptilarknotens (Position I in Abbildung 2).

6. Injektion der Bakteriensuspension direkt in den Skutellarknoten (Position J in Abbildung 2).

7. Injektion der Bakteriensuspension in den Skutellarknoten durch Einführen der Injektionskanüle durch die Primärwurzel, ausgehend von der Wurzelspitze bis in den Bereich des Skutellarknotens (Position K in Abbildung 2).

11.3. Dekapitleren der Koleoptile im Bereich des Koleoptilarknotens

3Tage alte Mais-Keimlinge werden an verschiedenen Stellen im Bereich des Koleoptilarknotens dekapitiert (siehe Abbildung 3).

1. unmittelbarauf Höhe des Koleoptilarknotens

2. 1 mm oberhalb des Koleoptilarknotens

3. 2mm oberhalb des Koleoptilarknotens

4. 5mm oberhalb des Koleoptilarknotens

Anschließend werden die dekapitierten Sämlinge in feuchte Erde eingepflanzt und entsprechend den unter Punkt 6. angegebenen Bedingungen kultiviert. -

Die eigentlichen Inokulationsexperimente mit Agrobacterium werden an Keimlingen durchgeführt, deren Koleoptilarspitzen 2 mm oberhalb des Koleoptilarknotens präparativ entfernt wurden.

Beispiel 12: Kultivierung der behandelten Mais-Pflanzen und Mals-Keimlinge Die Mais-Keimlinge werden unmittelbar nach der Inokulationsbehandlung in fruchte Erd'. eingepflanzt und in gleicher Weise wie die 10 Tage alten Maispflänzchen bei einer Temperatur von 22°C +2⁰C unter DauerbeleuciMung mit Weißlicht (Phillips 400 W/G/ 92/2) bei 3000-5000lux kultiviert.

Die Pflanzen werden anschließend täglich auf das Vorhandensein von Symptomen einer Virusinfektion hin untersucht, welche durch das Auftreten von gelben Punkten und/oder Streifen an der Basis neugebildeter Blätter charakterisiert ist.

Beispiel 13: DNA-Extraktion aus infizierten, symptomatischen ' lalspflanzen Etwa 400mg (Frischgewicht) junges Blattgewebe wird zunächst in einem Mörser auf Eis homogenisiert, unter Zugabe von 0,5ml-1,0ml STEN (15% Sucrose, 5OmM Tris-HCI, 5OmM Na₃ EDTA, 0,25M NaCI, pH 8! und von Sand (~ 50mg) zur Unterstützung des Gawebeaufschlusses. Das Homogenisat wird anschließend in ein Zentrifugenröhrchen (1,5ml) überführt und 5 Minuten bei einer Temperatur von 4°C in einer Tischzentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 0,5ml eiskaltem SET (15% Sucrose, 5OmM Na₃EDTA, 5OmM Tris-HCI, pH 8) unter Rühren zunächst mit einem sterilen Zahnstocher, dann unter kurzzeitiger (5 Sekunden) Verwendung eines Vortex, resuspendiert. Anschließend werden 10μΙ einer 20% SDS-Lösung sowie ΙΟΟμΙ Proteinase K (20mg/ml) hinzugegeben, vermischt und anschließend indem Röhrchen für 10 Min. auf 68 ⁰C erwärmt. Nach der Zugabe von 3 M Natriumacetat (1/10 Volumen) wird das Lysat zweimal mit Phenol/Chloroform (3:1) extrahiert. Die DNA wird dann durch Zugabe von 2 Volumenteilen Ethanol prezipitiert und über Nacht bei -20⁰C aufbewahrt. Durch Zentrifugation (10Min.) in einer Tischzentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit erhält man ein DNA-haltiges Pellet, das anschließend in 40μΙ TE-Puffer (40 mM Tris-HCI, 1 mM Na₃ EDTA, pH 8) gelöst wird. Aliquots dieser DNA-Lösung werden für die "Southern blot'-Experimente (^3el Southern EM, J. Mol. BIoI., 98: 503-517,1975) verwendet.

Beispiel 14: "Southern blot'-Analyse

Die extrahierte DNA wird zunächst mit Restriktionsenzymen behandelt, anschließend einer Elektrophorese in 1%igem Agarose-GeI unterworfen, auf eine Nitrozellulosemembran ("' Southern, E. M., J. Mol. Biol, 98,503-517 [1975]) transferiert und mit der nachzuweisenden DNA, welche zuvor einer Nick Translation [²³¹Rigby, W.J., Dieckmann, M., Rhodes, C. ijnd P.Serg, J. Mol. Biol. 113, 237-251)) unterworfen wurde (DNA-spezifische Aktivitäten von 5 χ 10⁸ bis 10 χ 10* ep.rn./μ^) hybridisiert. Die Filter werden dreimal je eine Stunde lang mit einer wäßrigen Lösung von 0,03 M Natriumeitrat und 0,3 M N&'riumchlorid bei 65⁰C gewaschen. Die hybridisierte DNA wird durch Schwärzung eines Röntgenfilms während 24 bis 48 Stunden sichtbar gemacht.

Ergebnisse:

A) Inokulation 10 Tage alter Malspflanzen

Tabelle 1 gibt die Ergebnisse von Inokulationsexperimenten an 10 Tage alten Maispflanzen wieder, die unter Punkt 10.1.

beschrieben sind. Die Inokulation erfolgt unter Verwendung von pEAP 37 DNA.

Tabelle 1

Inokulationsort Zahl der Pflanzen mit Symptomen/Zahl der inokulierten Pflanzen pEAP37 pMSV109 pEAP200 pEAP25

A 0/46(0%) - - B 0/44(0%) - - C 3/46(6,5%) - + +

D 42/&3(62%) 26/65(40%) ++ + +

Die Ergebnisse der Tabelle 1 machen deutlich, daß der bevorzugte Applikationsort an der Pflanze im Bereich des Wurzelhalses lokalisiert ist, wo 62% bzw. 40% der behandelten Pflanzen Infektionssymptome zeigen, während die Zahl der infizierten Pflanzen bei Inokulation an den übrigen Inokulationspunkten der Pflanze (A, B, C) 0 oder vernachlässigbar gering ist.

B) Inokulation von 3 Tage alten Maiskeimlingen

Tabelle 2 gibt die Ergebnisse von Inokulationsexperimenten an 3 Tage alten Mais-Keimlingen wieder, die unter Punkt 10.2.

beschrieben sind. Die Inokulation erfolgt unter Verwendung von pEAP37 und pEAP40 DNA.

Tabelle 2

Inokulationsort	Zahl der Pflanzen mit Symptomen/
	Zahl der inokulierten Pflanzen
	pEAP37 pEAP40
E	21/27(78%)
F	0/20(0%)
G	3/19 i16%)
H	25/30(83%) 51/58(88%)
I	0/16(0%)
J	1/20(5%)
K	2/12(17%)

Wie die Ergebnisse der Tabelle 2 zeigen, befindet sich der bevorzugte Applikationsort beim Maiskeimling im Bereich des Koleoptilarknotens, wobei die direkte und indirekte Applikation der Bakteriensuspension unmittelbar in den Koleoptilarknoten mit 83 % und 88% bzw. 78% infizierter Pflanzen eindeutig bevorzugt ist gegenüber allen anderen untersuchten Applikationsorten.

Dabei spielt es offensichtlich keine Rolle, ob die Injektion der Suspension direkt seitlich in den Koleoptilarknoten erfolgt oder über den Umweg durch die Koleoptile.

C) Dekaptitatlon 3 Tage alter Maiskeimlinge

Tabelle 3 gibt die Anzahl der überlebenden Keimlinge 2 Wochen nach Dekaptitation der Koleoptile an verschiedenen Stellen im Bereich des Koleoptilarknotens wieder.

Tabelle 3

Dekaptitationsstelle Zahl der überlebenden Keimlinge/

Zahl der dekapitierten Keimlinge

1 0/7

2 5/8

3 8/8

4 8/8

Es zeigt sich, daß die Plumula bis zu 2 mm oberhalb des Koleoptilarknotens entfernt werden kann, ohne daß eine Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit der so behandelten Keimlinge beobachtet werden kann. Auch das Entfernen der Plumula nur 1 mm oberhalb des Koleoptilarknoiens führt noch in etwa 60% der Fälle zu vollständig lebensfähigen Pflänzchen. Tabelle 4 gibt die Ergebnisse von Inokulationsexperimenten an 2 mm oberhalb des Koleoptilarknotens dekaptitierten Keimlingen wisder. Die Inokulation erfolgt unter Verwendung von pEAP37 DNA.

Tabelle 4

Inokulationsort Zahl der Pflanzen mit Symptomen/

Zahl der inokulierten Pflanzen

L 48/49(98%)

M 14/44(32%)

Die Ergebnisse der Tabelle 4 machen deutlich, daß die Position L am dekapitierten Keimling, d.h. der meristematischen Gewebebereiche, eindeutig bevorzugt ist gegenüber der Position M, die die peripheren Gewebeabschnitte abdeckt.

D) Verdünnungsexperimente Die unter Punkt 9 beschriebene Bakteriensuspension wird in YEB Medium ohne Antibiotikazusatz verdünnt und in den unten

angegebenen Konzentrationen in den Koleoptilarknotan appliziert.

Verdünnung	Geschätzte in der	Anzahl der
	Inokuletionsstelle	Pflanzen mit
	verbleibende Bakterien	Symptomen/
	zahl	Anzahl der in
		okulierten Pflanzen
unverdünnt	2 x 10"	84/102 (82%)
ΙΟ"1	2x10B	42/55 (76%)
ΙΟ"2	2x104	34/54 (62%)
ΙΟ"3	2x103	19/56 (34%)
ΙΟ"4	0	0/10 (0%)
ΙΟ"6	0	0/10 (0%)

Geht man davon aus, daß die Kopienzahl des binären Vektors, der die MSV-Soquenzen enthält, ungefähr 10 beträgt und daß die Bakterien sich in der Inokulationsstelle nicht weiter vermehren, dann enthalten 10⁴ Bakterien etwa 400 fg (4 χ 10¹³g) MSV DNA.

Das bedeutet, daß Agrobacterium seine DNA mit der einer vergleichbaren Effizienz auf Mais überträgt, wie dies bei dikotylen Wirtspflanzen der Fall ist.

E) Agrobacterlum-Wlrtsbereich

Neben Mais konnten noch weitere Vertreter aus der Klasse Gramineae ermittelt werden, die einer Infektion mit Agrobacterium zugänglich sind.

Die Ergebnisse von Inokulationsexf. drimenten mit diesen Gramineen-Spezies sind in Tabelle 5 wiedergegeben:

Tabelle 5	Zahl der Pflanzen
Gramineen	mit Symptomen/
Spezies	Zahl der inokulierten
	Pflanzen
	1/15 (6%)
Gerste (Maris Otter)	1/40 (2%)
Weizen (Maris Butler)	1/25 (4%)
Weizen (Normal)	1/25 (4%)
Flughafer (Saladin)	3/8 (35%)
Panicunmilaceum	2/10 (20%)
Digitaria Sanguinalis	1/25 (4%)
Loliumtemulentum

Einige der negativen und weniger effektiven Ergebnisse sind möglicherweise auf technische Schwierigkeiten im Verlaufe der Inokulation zurückzuführen, da die Pflanzen z.T. sehr klein sind und daher nur geringe Stengeldurchmesser aufweisen, was eine zielgerichtete Injektion der Inokulationslösung schwierig macht.

Dessen ungeachtet zeigen die vorliegenden Ergebnisse, daß neben Mais eine Reihe weiterer Vertreter aus der Gruppe der Gramineen durch Agrobacterium transformierbar sind.

F) Agrobacterium-Stämme

Neben dem in den Inokulationsexperimenten mit Mais routinemäßig verwendeten Agrobacterium tumefaclens-Stamm C58 wurden noch weitere A.tumefaciens und A.rhizogenes-Stämme getestet. Dabei konnte bei Verwendung der folgenden in Tabelle 6 aufgelisteten Agrobacterium-Stämme ebenfalls eine Übertragung der MSV-DNA auf Mais nachgewiesen werden.

Tabelle 6:	Zahl der Pflanzen mit Symptomen	ρΕΑΡ37·2	-
Agrobacterium-	Zahl der inokulierten Pflanzen		-
Stamm	pMSV 109*1	6/6(100%)	-
		15/21(5%)
A.tumefaciens	3/6(50%)	2/37(5%)
T 37	21/23(91%)
LBA 430KpTiC 58)	0/8 (<1%)
A6
A. rhizogenes	17/22(81%)
R 1000	15/20(75%)
LBA 9402	7/12(51%)
2626

* 1 Die Inokulationsexperimente mit pMSV 109 wurden an 10 Tage alten Malspflanzen durchgeführt. •2 Die Inokulationsexperimente mit pEAP 37 wurden an 3 Tage alten Maiskeimlingen durchgeführt.

Literaturverzeichnis

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Claims (58)

1. Verfahren zur Einschleusung von genetischem Material in monokotyle Pflanzen oder lebensfähige Teile davon, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Transfer-Mikroorganismus, der das genetische Material in einer transportierbaren Form enthält, und der in der Lage ist, besagtes S -»etisches Material in monokotyle Pflanzen oder lebensfähigeTeile davon einzuschleusen durch Anwendung geeigneter Kultur- und Applikationsmethoden, die eine Induktion eier Virulenz-Genfunktionen des Transfer-Mikroorganismus ermöglichen, für eine Infektion von . /lonokotyledonen einsetzbar macht und mit besagtem Transfer-Mikroorganismus monokotyle Pflanzen oder lebensfähige Teile davon infiziert.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man besagten Transfer-Mikroorganismus in an sich bekannten Kulturmedien heranzieht, wobei gegebenenfalls ein oder mehrere Subkultivierungsschritte durchgeführt werden, die Transfer-Mikroorganismen abzentrifugiert und anschließend in einem geeigneten Medium resuspendiert und man die so erhaltene Inokulationslösung in eine Wachstumszone einer monokotylen Pflanze einbringt.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man besagten Transfer-Mikroorganismus in einer Schüttelkultur über einen Zeitraum von 30 bis 60 Stunden (h), bei einer Inkubationstemperaturvon 15⁰C bis 40⁰C₁ in einem für die Kultivierung von Transfer-Mikroorganismen geeigneten Medium heranzieht und anschließend gegebenenfalls einen oder mehrere Subkultivierungsschritte durchführt, wobei jeder einzelne dieser Subkultivierungsschritte über einen Zeitraum von 15 bis 30 Stunden erfolgt und bei einer Temperatur von 15 bis 4O⁰C durchgeführt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Inkubationszeitraum für die Kultivierung sowie dia gegebenenfalls erforderlichen Subkultivierungen des Transfer-Mikroorganismus 40 bis 50 Stunden beträgt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die !nkubationstemperatur für die Kultivierung sowie die gegebenenfalls erforderlichen Subkultivierungen des Transfer-Mikroorganismus 24 bis 29°C beträgt.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein mit Agarose oder Alginat oder jedem beliebigen anderen geeigneten Verfestigungsmittel verfestigtes Kulturmedium verwendet.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man besagte Transfer-Mikroorganismen in Form einer Mikroorganismensuspension in die meristematischen Gewebe-Regionen der Pflanze oder lebensfähige Teile davon inokuliert.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man besagte Mikroorganismensuspension mehrfach inokuliert.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Wahl des Inokulationszeitpunktes - im Hinblick auf das Entwicklungs- und Differenzierungsstadium der Pflanze-sowie des Inokulationsortes auf der Pf lanze in der Weise aufeinander abstimmt, daß eine signifikante Erhöhung der Transformationshäufigkeit resultiert.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inokulation der transformierenden Mikroorganismensuspension an einer Pflanze vornimmt, die sich in einem Entwicklungsstadium befindet, welchos zwischen dem Beginn der Entwicklung des pflanzlichen Embryos und dem Beginn der Blütenbildung liegt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sich besagte Empfängerpflanze in einem Entwicklungsstadium zwischen der Samenkeimung und dem Erreichen des 4-Blattstadiums befindet.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Pflanze im 1. bis 3.Tag der Keimung befindet, wobei der Abstand zwischen dem Skutellarknoten und der apikalen Koleoptilarspitzeetwa 1-3cm beträgt.

13. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Inokulation der transformierenden Mikroorganismensuspension durch Injektion in die meristematischen Gewebe-Regionen der Pflanze erfolgt.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Injektion der transformierenden Mikroorganismensuspension beim bereits in Wurzel, Stengel und Blätter differenzierten Pflänzchen im Bereich des Wurzelhalses erfolgt.

-2- 231409

15. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Injektion der transformierenden Mikroorganismensuspension beim Keimling in die unmittelbare Nähe des Koleoptilarknotens erfolgt.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Injektion der transformierenden Mikroorganismensuspension direkt in den Koleoptilarknoten oder innerhalb eines Bereichs von etwa 2mm um den Koleoptilarknoten erfolgt.

17. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Injektion dertransformierenden Mikroorganismensuspension nach Dekaphieren der Koleoptilarspitze unmittelbar in die meristematischen Gewebebereiche der Koleoptüe erfolgt.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Dekapitation der Koleoptilarspitze in einem Bereich, der sich 1-5 mm oberhalb des Koleoptilarknotens befindet, erfolgt.

19. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagtem genetischem Material um virala DNA handelt, die gegebenenfalls eingebaute Cargo-DNA enthalten kann.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19 zur Einschleusung viraler DNA, die gegebenenfalls Cargo-DNA eingebaut enthält, in Pflanzen aus der Klasse Monocotyledoneae, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) in ein T-Replikon virale DNA, welche gegebenenfalls Cargo-DNA eingebaut onthält, in Nachbarschaft zu einer oder mehreren T-DNA-Grenz-Sequenzen integriert, wobei die Entfernung zwischen viraler DNA und T-DNA-Grenz-Sequenz(en) so gewählt ist, daß die Übertragung der viralen DNA einschließlich gegebenenfalls vorhandener Cargo-DNA in pflanzliches Material erfolgt,

b) anschließend die Aufnahme des T-Replikons in einen geeigneten Transfer-Mikroorganismus veranlaßt, wobei das Replikon in den Transfer-, Mikroorganismus gelangt,

c) mit dem gemäß b) modifizierten Transfer-Mikroorganismus Pflanzen aus der Klasse Monocotyledoneae infiziert.

21. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) virale DNA oder ihre Äquivalente aus infiziertem pflanzlichen Material isoliert und mit Hilfe geeigneter Vektoren in einem Wirt.sorganismus kloniert;

b) die klonierte virale DNA oder Teile davon sowie eventuell darin eingebaute Cargo-DNA zum Aufbau eines bakteriellen Plasmids (= BaP) verwendet, welches mehr als ein virales Gonom oder Teile viraler Genome sowie eventuell darin eingebaute Cargo-DNA enthält, welche sich in Nachbarschaft zu einer oder mehreren T-DNA-Grenz-Sequenzen befinden, wobei die Entfernung zwischen viraler DNA und T-DNA-Grenz-Sequenzen so gewählt ist, daß die Übertragung der viralen DNA einschließlich der gegebenenfalls darin eingebauten Cargo-DNA in pflanzliches Material erfolgt;

c) zum Aufbau eines für Pflanzen verwendbaren Vektorsystems das Plasrnid BaP in einen geeigneten Transfer-Mikroorganismus überführt;

d) Pflanzen aus der Klasse Monocotyledoneae ode'' lebensfähige Teile davon mit dem so modifizierten Vektorsystem infiziert.

22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man als virale DNA doppelsträngige DNA-Formen von Einzelstrang-DNA-Vircn verwendet.

23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man als virale DNA solche von Gemini-Viren verwendet.

24. Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man als virale DNA solche von Maize Streak Virus (MSV), Bean Golden Mosaik Virus (BGMV), Chloris Striate Mosaic Virus (CSMV), Cassava Latent Virus (CLV), Curly Top Virus (CTV), Tomato Golden Mosaic Virus (TGMV) oder Wheat Dwarf Virus (WDV) verwendet.

25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man als virale DNA natürliche Virus-DNA verwendet.

26. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man als virale DNA solche von Cauliflower-Mosaik-Virus verwendet.

27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man als virale DNA cDNA-Kopien von Virus-RNA verwendet.

28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man als virale DNA cDNA-Kopien von Viroid-RNA verwendet.

29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß man aisvira\e DNA solche von lethalen oder lebensfähigen Mutanten von Viren verwendet.

30. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als virale DNA unter der Kontrolle viraler Replikationssignale stehende, Monierte DNA verwendet.

31. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als virale DNA unter der Kontrolle viraler Expressionssignale stehende Monierte DNA verwendet.

32. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als virale DNA unter Kontrolle viraler Replikations- und Expressionssignale stehende klonierte DNA verwendet.

33. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als virale DNA unter der Kontrolle eukaryontischer Replikations- und Expressionssignale stehende klonierte DNA verwendet.

34. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als virale DNA Teile von Virus-DNA verwendet.

35. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die virale DNA in Tandem-Form verwendet.

36. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß man die virale DNA oder Äquivalente davon in Tandem-Form verwendet.

37. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß man virale DNA mit eingebauter Cargo-DNA verwendet.

38. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß man virale DNA oder Äquivalente davon mit eingebauter Cargo-DNA verwendet.

39. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß man ein bakterielles T-Replikon verwendet.

40. Verfahren gemäß Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß man ein T-Replikon von einem Bakterium der Gattung Agrobacterium verwendet.

41. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 39 oder 40, dadurch gekennzeichnet, daß man als T-Replikon ein Ti-Plasmid oder ein Ri-Plasmid aus einem Bakterium der Gattung Agrobacterium verwendet.

42. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus, welcher ein T-Replikon gemäß einem der Ansprüche 39 bis 41 beherbergt, ein Bakterium verwendet.

43. Verfahren gemäß Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus, welcher das T-Repükon beherbergt, ein Bodenbakterium verwendet.

44. Verfahren gemäß Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus, welcher das T-Replikon beherbergt, ein Bakterium der Gattung Agrobacterium verwendet.

45. Verfahren gemäß Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Cargo-DNA entweder aus genomischer DNA, aus cDNA oder aus synthetischer DNA besteht.

46. Verfahren gemäß Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Cargo-DNA sowohl aus genomischer als auch aus cDNA und/oder synthetischer DNA zusammengesetzt ist.

47. Verfahren gemäß Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Cargo-DNA aus Genfragmenten von mehreren Organismen, die verschiedenen Gattungen angehören, zusammengesetzt ist.

48. Verfahren gemäß Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Cargo-DNA aus Genfragmenten von mehr als einem Stamm, einer Varietät oder eine Spezies des gleichen Organismus zusammengesetzt ist.

49. Verfahren gemäß Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Cargo-DNA aus Anteilen von mehr als einem Gen derselben Organismen zusammengesetzt ist.

50. Verfahren nach Anspruch !,dadurch gekennzeichnet, daß man als lebensfähige Teile von monokotylen Pflanzen pflanzliche Gewebekulturen oder Zellkulturzellen verwendet.

51. Verfahren nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pflanzen oder lebensfähige Teile davon Pflanzen aus der Familie der Alliaceae, Amaryllidaceae.. Asparagaceae, Bromeliaceae, Gramineae, Liliaceae, Musaceae, Orchidaceae oder Palmae verwendet.

52. Verfahren nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pflanzen oder lebensfähige Teile dieser Pflanzen solche aus der Familie der Gramineae verwendet.

53. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pflanzen oder lebensfähige Teile von Pflanzen Mais, Reis, Weizen, Gerste, Roggen, Hafer oder Hirse verwendet.

54. Verfahren nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pflanzen oder lebensfähige Teile von Pflanzen, solche aus der Gattung Allium, Avena, Hordeum, Oryzae, Panicum, Saccharum,

Seeale, Setaria, Sorghum, Triticum, Zea, Musa, Cocos, Phoenix, Elaeis oder Teile dieser Pflanzen verwendet.

55. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Protoplasten zusammen mit dem Transfer-Mikroorganismus inkubiert.

56. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagtem Plasmid BaP um Plasmid pEAP 37 oder pEAP 40 handelt.

57. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagtem Plasmid BaP um das Piasmid pMSV 109 handelt.

58. Verwendung des Transfer-Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er im Pflanzenschutzzur „Immunisierung" von Pflanzen gegen unerwünschten Virusbefall eingesetzt wird.