DD278814A1 - Verfahren zur konditionierung von kollagenhaltigen materialien - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Konditionierung kollagenhaltiger Materialien, insbesondere entmineralisierter Knochen und findet Anwendung in der gelatineherstellenden Industrie. Erfindungsgemaess wird die Konditionierung mit einer Konditionierungsflotte, die Abproduktloesungen der technischen Streptomycinfermentation der Art Streptomyces griseus mit einer proteolytischen Aktivitaet von 0,001 bis 1,0 Kunitz-Einheiten pro ml enthaelt bei Temperaturen von 15 bis 45C in einem p H-Bereich von 5,5 bis 10,0 durchgefuehrt.

Description

Charakterisierung des bekannten Standes der Technik

Bei der Gelatineherstellung werden kollagenhaltige Rohmaterialien, wie entmineralisierte Knochen und andere osseinhaltige Zwischenprodukte sowie Häute, Felle, Schwarten oder Spaltleimleder einer sauren oder alkalischen Behandlung (Äsoherung) unterworfen, um das wasserunlösliche Kollagen in Wasser extrahierbare Gelatine umzuwandeln.

Die in dem Rohmaterial vorhandenen Begleitsubstanzen, beispielsweise Proteine, Glycoproteine und Mucopolysaccharide, verlängern die Äscherungszeiten und erniedrigen den Aufschlußgrad. Die Begleitsubstanzcn sind auch Träger von Farbstoffen, durch welche die Gelatinequalität erniedrigt wird.

Bekannt ist, daß durch Behandlung der kollagenhaltigen Rohmaterialien mit proteolytischen Enzymen die aufgeführten Nachteile des Proteingehalts verringert werden können.

Das Rohmaterial wird durch diese Behandlung in einen für die nachfolgenden Gelatinegewinnungsschritte (Äscherung und Gelatineextraktion) günstigen Zustand versetzt (Konditionierung).

So werden in der DE-PS 2629594 die Anwendung von alkalischen und neutralen Protessen bakterieller Herkunft sowie Trypsin zur Konditionierung vorgeschlagen.

DE-PS 2006514 und DE-PS 2654093 beschreiben den Einsatz proteolytischer Enzympräparate aus Kulturen von Streptomyces fradiae. In den angeführten Patentschriften werden Konditionierungsflotten Enzympräparate zugesetzt, die durch aufwendige Reinigungs- und Konzentrierungsschritte hergestellt werden müssen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, Gelatine auf ökonomisch günstigem Weg herzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch geeignete Konditionierung der kollagenhaltigen Materialien, bevorzugt entmineralisierter Knochen (Osseinschrot), den zeit- und materialaufwendigen Prozeß der alkalischen Äscherung teilweise oder vollständig durch eine Behandlung (Konditionierung) mit einer Konditionierungsflotte zu ersetzen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die Konditionierung mit einer Konditionierungsflotte, die Abproduktlösungen der technischen Streptomyxinfermentation der Art Streptomyces griseus mit einer proteolytischan Aktivität von 0,001 bis 1,0 Kunitz-Einheiten pro ml enthält, bei Temperaturen von 15 bis 45°C in einem pH-Bereich von 5,5 bis 10,0 durchgeführt wird.

Bevorzugt wird eine Abproduktlösung eingesetzt, die bei der technischen Submersfermentation von Streptomycin und der weitgehenden Entfernung des Streptomycins anfällt.

Zur Gewinnung des Abproduktes wird nach 150-200stündiger Fermentation des Mikroorganismus Streptomyces griseus in bekannter Weise in einem Sojaschrot d Glucose enthaltenden Nährmedium bei Phosphatlimitation die Kulturlösung nach Fermentationsende mit 0,1 bis 5% Formaldehyd (Formalinlösung 30%ig), 0,5 bis 2% Kaolin und 0,5 bis 1,5g/l vorneutralisierter Oxalsäure versetzt, gerührt und anschließend die Biomasse und die Festprodukte bei einer Acidität von pH 5,0 bis 7,0 afc gatrennt. Das Filtrat wird durch Adsorption an lonenaustauscherharz bei einem pH-Wert von 7,5 bis 8,0 von Streptomycin weitesigehend befreit. Der Durchlauf von den lonenaustauschersäulen wird mit 0,1 bis 5g/l wasserfreiem Calciumchlorid versetzt. Die so erhaltene Abproduktlösung kann direkt oder nach Konzentrierung oder Trocknung eingesetzt werden. Erfahrungsgemäß liegt die proteolytische Aktivität von Kulturfiltraten zwischen 0,4 bis 2,5 Kunitz-Einheiten/ml (vgl. Ausführungsbeispiel 2). Abproduktlösungen sinri durch eine proteolytische Aktivität von 0,5 bis 0,8 Kunitz Einheiten und einer Acidität von pH 5,0 bis 6,5 gekennzeichnet.

Die proteolytische Aktivität der Flotten liegt erfindungsgemäß zwischen 0,001 bis 1,0, bevorzugt 0,01 bis 0,2 Kunitz-Einheiten/ml. Die Dauer der Einwirkung der Flotten auf die kollagenhaltigen Rohmaterialien liegt zwischen 2-100 Stunden, ihre Temperatur zwischen 15bis45°Cund ihre Acidität bei pH-Werten von pH 6,0 bis 10,0, bevorzugt pH 7,5-8,5.

8 bis 25kg kollagenhaltiges Material werden für 1kg Konditionierungsflotte benötigt. Es war völlig überraschend und nicht zu erwarten, daß die Abproduktlösungen, Kulturfiltrate oder Konzentrate eine bessere Wirkung bei der Konditionierung aufweisen, als gereinigte Proteasepräparate.

Durch die konzentrierte Wirkung der verschiedenen konditionierungsaktiven Inhaltsstoffo der ungereinigten Lösungen und Konzentrate werden üowohl Bindungen in Glycoproteinen als auch Mucopolysaccharide angegriffen.

Da der Wegfall kostenintensiver Reinigungsschritte bei der Herstellung der konditionierungsaktiven Substanzen sich vorteilhaft für das Verhalten auswirkt und weiterhin Abproduktlösungen technisch bereits realisierter Fermentationen bevorzugt eingesetzt werden, stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine erhebliche wirtschaftliche Bereicherung der Technik dar.

Nach der Konditionierung wird die alkalische Äscherung in bekannter Weise innerhalb von 5 bis 15 Tagen durchgeführt. Die Äscherungszeiten verkürzen sich gegenüber einer ohne Konditionierung durchgeführten Äscherung um etwa 75%. In einer weiteren Ausführungsvariante wird nur die Konditionierung durchgeführt. Die Äscherung entfällt hierbei.

Weiterhin wird bei dieser Variante außer den in bekannter Weise durchgeführten Waschprozessen mit Wasser eine weitere Waschung mit verdünnter Schwefelsäure/Wasser mit einer Acidität von pH 3,5 durchgeführt. Bei einer dritten Ausführungsvariante wird zuerst die zeitlich verkürzte Äscherung und anschließend die Konditionierung in der beschriebenen Weise durchgefühn. Auch hierbei wird eine Waschung mit verdünnter Schwefelsäure/Wasser bei pH = 3,5 durchgeführt.

Im Fall eines vollständigen Wegfalls der alkalischen Äscherung ist es vorteilhaft, daß sich die Zahl der notwendigen nachfolgenden Waschungen von etwa 25 auf 6 verringert.

Die durch die Abproduktlösungen in die Flotten übertragenen enzymatischen Aktivitäten sowie Spuren von Streptomycin werden, bei einer nachfolgenden Äscherung durch die alkalische Behandlung, bei Wegfall der Äscherung durch die Behandlung mit verdünnter Schwefelsäure vollständig entfernt.

Die Gelatine wird anschlhßend an den erfindungsgemäß ausgeführten Aufschluß der kollagenhaltigen Materialien in bekannter Weise mit warmem Wasser extrahiert.

Dem erfindungsgemäßen Vorgehen entsprechend der Ausführungsvarianten erhöht sich die Ausbeute an Gelatine um etwa 10%. Die so hergestellte Gelatine besitzt einen verringerten anorganischen Glührückstand.

Tabelle 1

proteolytische Aktivität von Kulturfiltraten verschiedener Submersfermentationen

Spalte 1:

Gesamtaktivität, bestehend aus dem auf hochmolekularen und niedermolekularen Proteasefraktionen zurückführbarp Aktivitäten in Kulturfiltraten von Streptomycinfermentationen

Spalte 2:

Aktivität hochmolekularer, mit Ammoniumsulfat unter den angeführten Bedingungen ausfüllbarer Proteasen (gemessen in Kunitz-Einheiten/ml nach der im Ausführungsbeispiel 2 beschriebenen Methode)

Spalte 3: *

Anteil der niedermolekularen bzw. nicht fällbaren Proteasen (%)

Fermentation	1	2	3
1.	1,57	0,785	50
2.	1,55	0,590	62
3.	1,80	0,730	59
4.	1,10	0,415	62
5.	1,55	0,590	62

6. 2,24 0,995 56

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 (Vergleichsbeispiel)

20kg entfettetes Knochenschrot werden mit 5%iger Salzsäure in bekannter Weise entmineralisiert. Das so erhaltene Ossein wird in fünfmaligem Wechsel mit je 20I Kalziumhydroxidsuspension (2% CaO) insgesamt 40 Tage bei Temperaturen zwischen 15 und 20°C behandelt. Anschließend wird das geäscherte Ossein mit verdünnter Salzsäure zur Entfernung des überschüssigen Kalziumhydroxids behandelt und bis zum Sud pH-Wert gewaschen. Nach Ablassen des Waschwassers wird Gelatine in bekannter Weise extrahiert.

Aus 20kg trockenem und entfettetem Knochenschrot werden bei herkömmlicher alkalischer Äscherung 3,0kg Trockengelatine erhalten.

Beispiel 2

1 kg Knochenschrot wird entmineralisiert und mit Wasser so lange gewaschen, bis ein pH-Wert von 6,0 erreicht ist. Anschließend wird das feuchte Ossein mit 500 ml Wasser und 15 ml ungereinigter und nichtkonzentrierter Abproduktlösung aus der Streptomycinfermentation mit einer protoelytischen Aktivität von 0,8 Kunitz-Einheiten ml versetzt und die Mischung eine halbe Stunde gerührt

Die Einwirkungszeit beträgt 15 Stunden, die Temperatur 20°C und die Acidität pH 7,0.

Danach wird die Flüssigkeit abgelassen, das Ossein dreimal mit Wasser abgespült und anschließend mit 1' Wasser 1 Stunde gewaschen. Dann wird die Waschflotte gewechselt und das Waschwasser mit Schwefelsäure auf eine Acidität von pH 3,5 eingestellt. Das Ossein wird drei Stunden unter Rühren bei diesem pH-Wert belassen und anschließend mit Wasser so lange gewaschen, bis ein pH-Wert von 5,6 das so konditionierte Ossein v/ird mit Wasser, boi 45°C, 5O⁰C, 60⁰C und 75"C extrahiert. Die Gelatineextrakte werden filtriert und in einem Verdampfer aufkonzentriert

Das Konzentrat wird auf einem Kühlbad gekühlt, zerkleinert und anschließend getrocknet. Aus 1kg trockenem entfettetem Knochenschrot werden 165g getrocknete Gelatine erhalten.

Zur Bestimmu- ig der proteolytischen Gesamtaktivität von Abproduktlösungen bzw. von Kulturfil,traten oder Konzentraten werden 1 ml entsprechend verdünnter Enzymlösung mit 1 ml Caseinlösung (Casein nach Hammersten, 1%ig, in 0,1 M Acetatpuffer, pH 7,8) 20 Minuten bei 35°C inkubiert. Nach dieser Zeit wird das Casein durch Zugabe von 3ml 5%iger Trichloressigsäure ausgefällt. Die Proben werden 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Parallel wird eine Blindprobe mitgeführt, bei der im ersten Schritt statt des Caseins die Trichloressigsäure zugegeben wird. Nach Beendigung der Inkubation der Meßproben wird zur Blindprobe die Caseinlösung zugegeben. Die Proben werden anschließend zentrifugiert und im klaren Überstand die Extinktion bei 280ηm gegen die Blindprobe gemessen. Eine Kunitz-Einheit (KE) entspricht einer proteolytischen Aktivität, die unter den vorgegebenen Bedingungen in 1 Minute eine Extinktionsänderung von 1,000 verursacht. Zur Bestimmung der niedermolekularen Proteaseaktivität wird 1 ml der entsprechend verdünnten Enzymlösung mit 1 ml gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt. Der entstandene Niederschlag wird nach 4stündigem Stehen abzentrifugiert, mit gesättigter Ami loniumsulfatlösung gewaschen und das abzentrifugierte Präzipitat in 1 ml Wasser gelöst. Mit dieser Lösung wird die Aktivitätsbestimmung durchgeführt.

Beispiel 3

1 kg Knochenschrot wird entmineralisiert auf pH 4,0 ausgewaschen und mit einem Liter einer Lösung von 20g Calziumoxid in Wasser suspendiert und bei Temperaturen um 150°C zwei Tage stehen gelassen. Anschließend wird Calziumhydroxidlösung gewechselt und nach 5 Tagen noch einmal erneuert. Nach zwei weiteren Tagen Einwirkung wird die Äscherlösung abgelassen. Das geäscherte Ossein wird so lange gewaschen, bis das Waschwasser einen pH-Wert von 7,0 aufweist. Anschließend werden 1000ml Wasser und 10ml Kulturfiltrat mit einer proteolytischen Aktivität von 2,5 Kunitz-Einheiten/ml zugesetzt. Das weitere Vorgehen entspricht dem des 2. Ausführungsbeispiels. Aus 1 kg trockenen und entfettetem Knochenschrot werden 160g trockene Gelatine erhalten.

Beispiel 4

20 kg Knochenschrot werden entmineralisiert auf pH 4,0 ausgewaschen und in dreimaligem Wechsel mit Kalkmilch (2% CaO) bei Temperaturen von 15 bis 20°C über eine Dauer von 10 Tagen mit dreimaligen Wechsel behandelt. Anschließend wird das Ossein sechsmal mit Wasser gewaschen.

Zur Durchführung der Konditionierung werden 140ml Abproduktlösung mit einer proteolytischen Aktivität von 0,7 Kunitz-Einheiten (ml und 2Ol Wasser zugegeben und bei Temperaturen von 15 bis 2O⁰C 15 Stunden behandelt. Anschließend wird die Lösung abgelassen und das geäscherte und konditionierte Ossein dreimal mit je 2Ol Wasser, einmal mit 201 verdünnter Schwefelsäure mit einer Acidität von pH 3,0 und anschließend fünfmal mit Wasser je 201 gewaschen. Gelatine wird in bekannter Weise extrahiert.

Aus 1 kg trockenem und entfettetem Knochenschrot werden 3,20kg trockene Gelatine erhalten.

Beispiel 5

20 kg Knochenschrot werden mit 201 Wasser und 140 ml Abproduktlösung (0,01 M CaCI 2) versetzt und 15 Stunden in der Konditionierungsflotte bei Temperaturen von 20⁰C belassen. Anschließend wird die Konditionierungsflotte abgelassen und zweimal mit je 201 Kalziumhydroxidsuspension 2 Tage geäschert. Anschließend wird sechsmal mit Wasser gewaschen. Die Gelatine wird aus dem konditionierten und geäscherten Osseinschrot in bekannter Weise extrahiert. Aus 20kg trockenem und entfettetem Knochenschrot ergeben sich 163kg trockene Gelatine.

Beispiel 6

1 kg Knochonschrot werden entsprechend dem Beispiel 2 behandelt. Im Unterschied zu Beispiel 2 werden statt der Abproduktlösung mit einer Gesamtaktivität von 12 Kunitz-Einheiten ein gereinigtes, von niedermolekularen Verbindungen freies proteolytisches Enzympräparat eingesetzt.

Das gereinigte Enzympräparat wurde folgendermaßen hergestellt:

Eine Abproduktlösung wird auf pH 6,0 mit verdünnter Salzsäure eingestellt. In die Lösung werden 1 % neutralisiertes und 12 Stunden vorgequollenes Bentonit zugesetzt und 30 Minuten bei 20°C gerührt. Anschließend wird das Betonit abgetrennt und dem Filtrat 1 % vorgefälltes und neutralisiertes Calziumphosphat zugesetzt.

Nach Abtrennung der Feststoffe wird die Lösung mit Ammoniumsulfat (500g/l) versetzt. Nach zweistündigem Stehen wird das entstandene Präzipitat gewonnen und in wenig Wasser gelöst. Die Lösung wird 1 Tag bei 40⁰C dialysiert.

12 Kunitz-Einheiten dieses Präparats werden zur Konditionierung entsprechend Ausführungsbeispiel 1 eingesetzt.

Aus 1 kg trockenem und entfettetem Knochenschrot werden 165g trockene Gelatine erhalten.

Claims (1)

1. Verfahren zur Konditionierung von kollagenhaltigen Materialien, insbesondere von entmineralisierten Knochen, mit einer wäßrige Enzyme enthaltenden Konditionierungsflotte, gekennzeichnet dadurch, daß die Konditionierung mit einer Konditionierungsflotte, die Abproduktlösungen der technischen Streptomycinfermentation der Art Streptomyces griseus mit einer proteolytischen Aktivität von 0,001 bis 1,0 Kunitz-Einheiten pro ml enthält, bei Temperaturen von 15 bis 45⁰C in einem pH-Bereich von 5,5 bis 10,0 durchgeführt wird.

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Gelatine aus kollagenhaltigen Materialien. Die Erfindung ist in der gelatineherstellenden Industrie anwendbar.