DD269166A1

DD269166A1 - Verfahren zur herstellung rekombinanter genprodukte

Info

Publication number: DD269166A1
Application number: DD30672287A
Authority: DD
Inventors: Johannes Gumpert; Horst Malke; Christian Klessen; Monika Voelkel; Rudolf Geuther; Detlev Behnke; Karl-Hermann Schmidt; Udo Taubeneck; Gerda Elske; Frank Laplace; Reinhardt Breitling
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1987-09-07
Filing date: 1987-09-07
Publication date: 1989-06-21
Also published as: DD269166B5

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein gentechnisch-mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung rekombinanter, vorwiegend heterologer Genprodukte (Polypeptide, Proteine) unter Einsatz von gentechnisch veraenderten L-Form-Staemmen (Kurzbezeichnung: L-Formen) als mikrobiellen Produzenten. Sie verfolgt in jeder ihrer Varianten das Ziel, das jeweils ausgewaehlte Genprodukt in oekonomischer Weise herzustellen. Die diesem Ziel zugeordnete Aufgabe wird in der Weise geloest, dass Mikroorganismen-L-Form-Staemme, die mit einem zur Expression eines solchen Polypeptids oder Proteins befaehigten replikablen rekombinanten Vektorplasmid transformiert worden sind, in Submersfermentation zur Expression angeregt werden und anschliessend das rekombinante Genprodukt isoliert wird. Am Beispiel ausgewaehlter Genprodukte prokaryotischen wie auch eukaryotischen Ursprungs (Streptokinase, Staphylokinase, Human-Alpha-Interferone, Prochymosin) wird das Verfahren in verschiedenen Wirts-Vektor-Systemen, d. h. unter Einbezug mehrerer alternativer Vektorplasmide, Expressions-Sekretions-Einheiten sowie vorzugsweise bakterieller stabiler L-Form-Staemme, naeher beschrieben und erprobt.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein mikrobialles Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Genprodukten, insbesondere von Enzymen, Immunmodulatoren, Immundeterminatoren, Hormonen sowie von weiteren biologisch aktiven Peptidwirkstoffen, in gentechnisch-veränderten Produzentenstämmen.

Mit Hilfe der Gentechnik sind die Gene für zahlreiche Wirksubstanzen aus o.g. Produktgruppen isoliert, charakterisiert und teilweise auch sequenziert worden. Beim größten Teil der Produkte, für die diese Gene kodieren, handelt es sich jm Substanzen mit medizinischer Anwendung, z.B. Streptokinase, Interferon, Interleukin, Insulin; andere spielen in der Nahrungs-und Genußmittelindustrie eine bedeutende Rolle, z.B. a-Amylase, ß-Glukanase, Chymosin.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt demnach in biotechnologischen Produktionen in der pharmazeutisch-chemischen sowie in der Nahrungs- und Genußmittelindustrie. Ein weiteres Anwendungsgebiet ist die mikrobiologisch-gentechnische Forschung.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Als Produzenten (Klonierungswirte) homologer und helerologer rekombinanter Genprodukte wurden bisher nur Bakterien-, Hefe- und Pilz-Stämme verwendet, deren Zellen eine intakte Zellumhüllung besitzen (Genetics of Industrial Microorganisms — 1978,1982 [Sebek O.K. and Laskin, A.I., Edts.l, American Soc. Microbiology, Washington; Genetic Engineering I-VII [Setlow, J. K. and Hollaender, A.!, Plenum Press, New York, 1979-1985; Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, Vol. 1, 2,3 [Rüssel, G.E., Edt.), Intercept, Pontelnnd, Newcastle upon Tyne, 1984-1986; Biology of Industrial Microorganisms [A.L.Demaein and N.A.Solomon], The Benjamin/Cumminge Publishing Comp. Inc. London, 1985; Malke, H., Gerlach, D., Koehler, W. and Ferretti, J. J., 1984, MoI. Gen. Genet. 196,360 bis 363; Kleßen, C. and Malke, H., 1986, J. Basic Microbiol. 26,75 bis 81; Patentschriften DD 159782, DD 203071, DD 202307, DD 203330, DD 2CJ 331, DE-OS 31 52001, DD 245444, EP 0089692, EP 01 51337, WO 85/0038;!, WO 85/03945 und viele andere).

Die wichtigsten Wirtsorganismen sind Escherichia coli, Bacillus subtilis, Actinomyceten, Streptokokken, Pseudomonaden und Hefen.

Der Einsatz dieser Mikroorganismen zur Herstellung praxisrelevanter Genprodukte ist in unterschiedlichem Maßt mit folgenden Nachteilen verbunden:

— vorwiegend intrazelluläre Lokalisation der Genprodukte verbunden mit Aggregation zu Inklusionskörpern und mehr oder weniger großen Aktivitätoverlusten (z. B. IFN, Prochymosin),

— - Zerstörung der Zellen bei der Isolierung intrazellulärer Genprodukte und Belastung der Produktfraktion mit intrazellulären

Proteinen und Zellwandkomponenten,

— hoher Gehalt der Produktfraktion an Endotoxinen, immunreaktiven Substanzen und anderen Schadstoffen, die aus dem Zytoplasma und insbesondere aus der Zellwand stammen,

— Zerstörung oder Inaktivierung der gebildeten Genprodukte im periplasmatischen Raum oder im Kulturmedium durch periplasmatische oder extrazelluläre Enzyme, insbesondere Proteasen.

Stabile bakterielle Protoplastentyp-L-Formen, d. h. Bakterienzellen, die ohne Zellwand lebensfähig sind, sind seit etwa 30 Jahren Gegenstand der mikrobiologischen Grundlagenforschung. Sie sind experimentell aus normalen Elternbakterien-Arten gewonnene Organismen, die sich permanent ohne Zellwand vermehren können. Die wichtigsten Unterschiede zu den Elternbakterien sind:

— fehlende Zellwandstrukturen,

— kugl'ge oder pleomorphe Zellformen unterschiedlicher Größe und ohne morphogenetische Determination,

— veränderte Koloniemorphologie,

— Bildung membranöser.Granula,

— größere osmotische Empfindlichkeit,

— Unfähigkeit zur Reversion,

— Resistenz gegenüber ß-Lactar.ien und anderen Antibiotika, die die Zellwandbiosynl.iese hemmen,

— Resistenz gegenüber Bakteriophagen sowie

— Vorliegen chemischer und strukturel'er Veränderungen der zytoplasmatischen Membran (J.Gumpert & U.Taubeneck, Experientia Suppl., vol. 46,1983,227).

Bei den stabilen L-Formen ist die Zellwandbiosynthese irreversibel geblockt, und die Organismen sind als extrem stabile sowie pleiotrope Mutanten anzusehen, die viele phänotypische Eigenschauen mit den Mycoplasmen gemeinsam haben. Durch DNS-DNS-Hybridisierung (B. H. Hoyer& J. R. King, J. Bacteriol., vol.97,1969,1516) und durch Vergleiche der Agarosegel-Bandenmuster der chromosomalen DNS nach Verdauung mit Restriktasen konnten Unterschiede im Genom der L-Formen und der entsprechenden Elternformen nachgewiesen werden.

Die L-Formen wachsen auf Agar-Medien und in flüssigen Nährlösungen mit Zusätzen von 5% bis 10% Serum, von osrnotischen Stabilisatoren (5 % bis 10 % Saccharose, 2% bis 5% NaCI), von zweiwertigen Kationen (Mg⁺⁺, Ca⁺⁺) und von komplexen Komponenten wie Hefeextrakt und Peptonen (J.Gumpert & U.Taubeneck, a.a.O.) In den letzten Jahren ist über die Transformierbarkeit von Protoplastentyp-L-Formen mit natürlich entstandenen Resistenzplasmiden berichtet worden (s.a. die diesbezüglichen Literaturhinweise in J. Gumpert& U. Taubeneck, a.a.O.). Hierbei handelt es sich um Expeiimente, in denen die L-Formen lediglich auf Agar-Medien kultiviert wurden und in denen der Nachweis einer Expression von Antibiotika-Resistenzen nur mit Kolonie-Wachstum gelang.

Aus diesen Befunden wurde bislang jedenfalls in keinem Fall eine technische Lahre entwickelt, mit der unter Bereitstellung von in-vitro-rekombinierten Expressionsplasmiden unter Bedingungen etwa einer Submersfermentation mittels L-Formen die Herstellung beliebiger heterologer Genprodukte möglich ist.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist die Herstellung von rekombinanten Genproduktsn auf ökonomische Weise.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gentechnisch-mikrobiologisches Verfahren anzugeben, mit dem ausgewählte, biologisch aktive rekoir.binante Genprodukte unter Einsatz von Expressionsplasmiden und von neuartigen Mikroorganismenstämmen in hohen Ausbeuten hergestellt werden können.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in ihrem Grundzug dadurch gelöst, daß man prokaryotische oder eukaryotische Mikroorganismen-Stämme, die ohne bzw. mit stark reduzie rter Zellwand vermehrungsfähig sind (Kurzbezeichnung: L-Formen), mit einem zur Expression eines rekombinanten Genproduk s, insbesondere eines Enzyms, eines Immunmodulators, eines Immundeterminators, eines Hormons bzw. eines sonstigen biologisch aktiven Peptidwirkstoffs, befähigten replikablen

rekombinanten Vektorplasmid (Kurzbezeichnung: Expressionsplasmid) transformiert, danach in einem Ferme:ilationsmedium zur Expression anregt und das gebildete Genprodukt isoliert.

In dem vorliegenden Verfahren werden vorzugsweise stabile bakterielle oder pilzliche L-Form-Stämme, insbesondere Protoplastentyp-L-Form-Stämme, eingesetzt.

In ihrer weiteren Ausgestaltung ist die Erfindung hinsichtlich ihres Mikroorganismen-Aspektes dadurch gekannzeichnet, daß aus dem Bereich der bakteriellen L-Form-Stämme bevorzugt solche eingesetzt werden, die

— von gramnegativen Elternbalaerien aus den Gattungen Pseudomonas, A jrobacterium, Froteus sowie Escherichia bzw.

— von grampositiven Elternbakterien aus den Gattungen Staphylococcus, Streptococcus (serologische Gruppen D, H und N), Bacillus, Lactobacillus, Streptomyces sowie Thermoactinomyces

herstammen. Insbesondere weiden in diesem Zusammenhang L-Form-Stämme

— einerseits aus den Bakterien-Arten Pseudomonas eruginosa, Pseudomonas putida, Agrobacterium tumefaciens, Proteus mirabilis

Proteus vulgaris sowie Escherichia coli bzw.

— andererseits aus den Bakterien-Arten Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis (Gr. D) Streptococcus pyogenes (Gr. D) Streptococcus sanguis (Gr. H) Streptococcus cremoris (G;. N) Streptococcus lactis (Gr. N) Bacillus subtilis

Bacillus licheniformis

Lactobacillus bulgaricus

Lactobacillus lactis

Streptomyces hygroscopicus

Streptomyces griseus

Streptomyces levoris

Streptomyces noursei sowie

Thermoactinomyces vulgaris

verwendet. In jeder Variante der weiteren Ausgestaltung des vorliegenden Verfahrens werden stabile bakterielle L-Form-Stämme genutzt, die

— durch Behandlung mit Inhibitoren der Zellwand-Biosynthese isoliert,

— an Wachstum in flüssigen Medien adaptiert und

— über einen mehrjährigen Zeitraum selektiv kultiviert

worden sind. Teilweise werden stabile L-Form-Stämme eingesetzt, die seit über 10 Jahren die Fähigkeit zur Zellwand-Resynthese und zur Reversion in die Elternformen verloren haben. Damit sind tiefgreifende Merkmalsänderungein verbunden, die diesen Mikroorganismen neuartige Eigenschaften verleihen, wie zum Beispiel runde und pleomorphe Zellform, Verlust der Geißel-, Fimbrien- und Mesosomen-Bildung, biochemische und strukturelle Veränderungen der zytoplasmatischen Membran, veränderte Enzymaktivitäten, z. B. Fehlen von Exoproteasen, sowie veränderte Antigenitätseigensch.aften. Die in den Varianten der weiteren Ausgestaltung des vorliegenden Verfahrens eingesetzten Zellpopulationen stabiler bakterieller L-Form-Stämme sind darüber hinaus plasmidfrei. Zellmaterial solcher L-Formen wird jeweils mit DNS eines Expressionsplasmids transformiert, welches neben wenigstens einem Replikationsorigin

— Gene für mindestens einen Antibiotikaresistenz- bzw. Auxotrophie-Marker (Kurzwort: Markergene) sowie

— Gene für mindestens ein Polypeptid bzw. für ein anderes Protein (Kurzwort: Strukturgen[e]) in lesorahmeng'-rechter Verknüpfung mit einer Expressions-Sekretions-Einheit (Kurzwort: ESE) bzw. mit einer Expres.;ion<;-Einheit (Kurzwort: EE)

enthält.

In verschiedenen Varianten der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt sog. shuttle-Expressionsplasmide mit wenigstens je einem Replikationsorigin für gramnegative als auch für grampositive Bakterien bzw. mit wenigstens je einem Replikationsorigin für Bakterien als auch für Hefen, insbesondere für gramnegative Bakterien als auch für Hefen der Familie Saccharomycetaceae, eingesetzt.

Hinsichtlich der Wahl eines Phänotyp-Markers wird in den verschiedenen Varianten der vorliegenden Erfindung bevorzugt ein Expressionsplasmid mit wenigstens einem Markergen für eine Antibiotikaresistenz aus der Substanzgruppe !Aminoglykoside, Makrolide, Tetracycline, Chloramphenicol, Lincomycin),

insbesondere für eine Resistenz aus der Antibiotika-Gruppe

(Streptomycin, Kanamycin, Neomycin, Erythromycin, Tetracyclin, Oxytetracyclin), bzw. ein Expressionsplasmid mit wenigstens einem Markergen für eine Leucin-, eine Histidin-, eine Uracil-, eine Threonin- oder für eine Isozitratlyase-Auxotrophie herangezogen.

Unter dem Gesichtspunkt der Auswahl der Expressions-Einheit (EE) bzw. der Expressions-Sekretions-Einheit (ESE) wird in den verschiedenen Varianten der weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung bevorzugt ein Expressionsplasmid mit einer ESE bzw. EE eines Gens für ein Hefe-Enzym oder einen Hefe-Proenzymaktivator bzw. mit einer ESE bzw. EE

— entweder eines Gens für ein Enzym, für einen Gerinnungsfaktor oder für einen Proenzymaktivator bakteriellen Ursprungs

— oder eines auf einem Bakteriophagen lokalisierten Gens für ein Enzym, für einen Gerinnungsfaktor oder für ein anderes Protein

verwendet. Hierbei wird insbesondere mehrfach eine solche ESE bzw. EE genutzt, die nach ihrer Primärisolierung in einem

polylinkertragenden shuttle-Vektor, gegebenenfalls in einem Bakterien-Hefe-shuUle-Plasmidvektor, umkloniert und auf diese Weise portabel gomacht worden ist.

In früheren Erfindungen aus dem Zentralinstitut wurden Expressionsvektoren bzw. -plasmide bereitgestellt, die

— die ESE des Streptokinase-Gens vom Stamm Streptococcus equisimilis H46A (skc-ESE),

— die portabel gemachte ESE des Staphylokinase-Gens des Bakteriophagen 42 D von Staphylococcus aureus (SAK-ESE) oder

— die portabel gerr achte ESE des Gens für das Exotoxin A des Bakteriophagen T12 von Streptococcus pyogenes (spA-ESE) enthalten. Bevorzugt werden für das vorliegende Verfahren somit auch solche Varianten bereitgestellt, in denen Expressionsplasmide eingesetzt werden, die in der einen oder anderen Weise die skc-ESE, die SAK-ESE bzw. die speA-ESE enthalten.

Andere Varianten der beschriebenen Erfindung sind so ausgelegt, daß in ihnen ein Expressionsplasmid mi: einer synthetischen consensus-ESE oder ein Expressionsplasmid mit einer durch einen Medium2.us.atz induzierbaren ESE verwendet wird. Unter dem Gesichtspunkt der Wahl des jeweiligen Strukturgens sind bestimmte Varianten der weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß in ihnen ein Expressionsplasmid verwendet wird, welches ein Strukturgen für ein Enzym, für einen Proenzymaktivator oder für einen Gerinnungsfaktor in leserahmengerechter Verknüpfung mit seiner nativen ESE trägt. Insbesondere umfaßt die vorliegende Erfindung Varianten, in denen ein Expressionsplasmid verwendet wird, welches das Strukturgen

für eine Alpha-Amylase,

fürdieH46A-Streptokinase,

für die 042 D-Staphylokinase oder

für die Isozitratlyase aus Yarrowia lipholyticci H 222-27 jeweils in leserahmengerechter Verknüpfung mit seiner nativen ESE trägt.

Überwiegend enthält die vorliegende Erfindung jedoch solche Verfahrensvarianten, in denen jeweils ein Expressinsplasmid eingesetzt wird, welches ein heterologes Strukturgen

für ein Enzym sowohl pro- als auch eukaryotischen Ursprungs,

für einen Immunmodulator,

für einen Immimdeterminator,

für einen weiteren biologisch aktiven Peptidwirkstoff

sowohl pro- als auch eukaryotischen Ursprungs

in leserahmengerechter Verknüpfung mit der skc-ESE, mit der SAK-ESE, mit der speA-ESE, mit einer synthetischen consensus-ESE oder mit einer durch einen durch einen Mediumzusatz induzierbaren ESE aufweist.

Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung in ihrer weiteren Ausgestaltung auch Verfahrensvarianten, in denen jeweils ein Expressionsplasmid verwendet wird, welches durch Insertion eines aus einem verfügbaren rekombinanten Trägerplasmid als Kompaktfragment entnommen (ESE-Strukturenl-DNS-Blockes in einen Klonierungsvektor mit repeat-Sequenzen erhalten wird. Ein solcher Klonierungsvektor mit repeat-Sequenzen steht beispielsweise mit dem Streptokokken-Pasmid pDB 101 (Molekülgröße 17,8kb) zur Verfügung.

Die Transformation des jeweils gewählten L-Form-Stammes mit einem der bereitgestellten Expressionsplasmide wird in Gegenwart von Polyethylenglycol (MG 4 000 bis 6000) sowie unter osmotischer Stabilisierung, zu der 0,3 M bis 0,4 M Saccharose eingesetzt wird, vorgenommen. Im Anschluß an die Transformation mit einem Expressionsplasmid wird auf einem Agar-Medium, welches einen Zusatz von 0,3pg bis 30pg Selektivantibiotikum obiger Kennzeichnung pro ml Medium enthält, nach positiven Transformanten-Klonen selektioniert (Screening).

Solcherart erhaltene positive L-Form-Transformanten-Kolonien werden anschließend durch mehrfache Passagierunpen auf dem genannten Agar-Medium varmehrt, bis ein Wachstum als Kolonierasen erreicht ist. Anschließend wird die in den auf diese Weise gewonnene L-Form-Transformanten enthaltene Plasmid-DNS analysiert, und es werden hierbei rekombinante L-Form-Klone mit hoher Genexpression sowie mit hoher extrazellulärer Produktbildungsrate ausgewählt.

Nach der hier beschriebenen technischen Lösung wurden in dieser Stufe ihrer weiteren Ausgestaltung rekombinante L-Form-Stämme für eine Reihe von Bakterienarten, so unter anderem für

Pseudomonas aeroginosa

Pseudomonas putida

Agrobacterium tumefaciens

Proteus mirabilis

Proteus vulgaris

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Streptococcus faecalis

Streptococcus pyogenes

Streptococcus sanguis

Streptococcus cremoris

Streptococcus lactis

Bacillus subtilis

Bacillus licheniformis

Lactobacillus bulgaricus

Lactobacillus lactis

Streptomyces hygroscopicus

Streptomyces griseus

Streptomyces levoris

Streptomyces noursei

Thermoactinomyccs vulgaris, erhalten, die die Fähigkeit erworben haben, heterologe Genr-rodukte wie unter anderem Streptokinase (Kurzbezeichnung: SK),

Staptiylokinaso (Kurzbezeichnung: SAK), Human-Alpha-lnterferone (Kurzbezeichnung: hlFN-alpha)- bzw. (hlFN-alpha)-Fusionsproteine, Prochymosin (Kurzbezeichnung: PChy) oder Isozitratlyase (Kuizbezcichnung: ICL) zu synthetisieren. Die im Ergebnis dieses Selektions- und Prüfschrittes erhaltenen rekombinanten L-Form-Stämme werden nach ihrer Adaptation an ein Wachstum in flüssigen Nährmedien in einem Fermentationsansatz unter technischen Kultivierungsbedingungen zur Expression angeregt. Vorzugsweise werden diese Stämme in technischer Submorsfermentation zur Expression angeregt. In ihrer weiteren Ausgestaltung ist die vorliegende Erfindung schließlich noch dadurch gekennzeichnet, daß zur Adaptation vieler der erhaltenen rekombinanten L-Form-Stämme an Wachstum in flüssigen Medien sog. flüssiges LFS-Medium (L-Form-Standardmedium), bestehend aus

Fleischbouillon (Eigenherstellung aus Rindfleisch)

Hefeextrakt 0,3 % bis 1,0 %

Saccharose 5,0 % bis 10 %

Fferdeserum 2,0 % bis 10 %,

gegebenenfalls in Mikrogramm-Mengen mit dem jeweiligen Selektivantibiotikum der zugehörigen Wirts-Vektor-Konstruktion supplementiert, eingesetzt wird.

Das gleiche Nährmedium wird eingesetzt, wenn zur Herstellung des jeweiligen heterologen Genprodukts ein verfahrensgemäß erhaltener zugehöriger rekombinanter L-Form-Stamm als submerse Schüttelkul .ur (in Mengen von 20 ml bis 100 ml) fermentiert wird. Diese Fermentation erfolgt unter aeroben, sterilen Bedingungen bei Temperaturen von 32°C bis 37⁰C für die Dauer von 12 Stunden bis 48 Stunden.

In weiteren Varianten der beschriebenen Erfindung wird die technische Kultivierung in Rührfermentoren bzw. in Fermentoren größeren Nutzvolumens durchgeführt, wobei komplexe Nährmedien auf Fleischextrakt- oder Gewebeextraktbasis mit Zusätzen von Pepton (0,5% bis 1,0%), Hefeextrakt (0,5% bis 1,0%), Saccharose (2,0% bis 10%) sowie Pferdeserum (2% bis 10%) 2um Einsatz kommen. Hierbei wird die Kultivierung unter sterilen Bedingungen gleichfalls bei Temperaturen von 32°C bis 37⁰C sowie bei Aziditäten von pH 6,0 bis pH 0,0 vorgenommen, wobei im Falle eines Rührfermentors die Rührgeschwindigkeiten auf Werte im Bereich zwischen 100U/min und 400U/min eingestellt sowie Belüftungsraten von 1 bis 2 Volumenteilen Luft pro 1 Volumenteil Medium gewählt werden.

Für bevorzugte Ausführungsformen des beschriebenen Verfahrens werden insbesondere die genotypisch stabilen bakteriellen Protoplastbmyp-L-Form-Stämmo

Pr. mirabilisLVI

Pr. mirabilisLD52,

E. coliLW1655F(plus)

E.coliLW1655F(minus)

E. coliLCB,

S'aph. aureusL66

Staph. aureusL61,

Bac. subtitis L170

Bac. subtilis L 1997,

Strep, hygroscopius L 33-354

Strep, hygroscopius L0B56

Strep. griseusL86

Strep, levoris L EK1331 sowie

Th. vulgarisLK481

bereitgestellt. Einige dieser Stämme sind in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DL)R, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW, DDR - Jena, 6900 Beutenbergstr. 11, unter nachstehenden Registriernummern

Pr. mirabilisLVI ZIMET 11 199

Bac. subtilis L 1997 ZIMET 11 198

Bac.subtilisL170 ZIMET 11 201

E.coliLW1655F(plus) ZIMET 11 200

E.coliLW1655F(minus) ZIMET 11 207

hinterlegt worden.

Für jene Varianten der vorliegenden Erfindung, in denen zur Transformation der gewählten L-Form-Stämme ein Expressionsplasmid verwendet wird, welches ein Strukturgen für ein Enzy ·η bzw. für einen Proenzymaktivator (einschließlich „seiner" jeweiligen Terminatorsequen · für den Translationsstop) in unmodifizierter Verknüpfung mit seiner nativen ESE trägt, werden in ihren bevorzugten Ausführungsformen insbesondere

— dasshuttle-Plasmid pSM752 (Molekülgröße 13,3kb; Erythromycin-Marker), kodierend für dieH46A-Streptokinase, bzw.

— das Plasmid pDB 15 (Molekülgröße 8,9kb; Erythromycin-Marker), kodierend für 042D-Staphylokinase,

he angezogen. Beide Expressionsplasmide sind nach Verfar ren, die Gegenstand früherer Patentanmeldungen des Zentralinstituts sind, hergestellt worden.

Für jene Varianten der vorliegenden Erfindung, in denen zur Transformation der gewählten L-Form-Stämme ein Expressionsplasmid verwendet wird, welches ein heterologes Strukturgen für ein Enzym pro- bzw. eukaryotischen Ursprungs oder für einen anderen biologisch aktiven Peptidwirkstoff (einschließlich „beiner" jeweiligen Terminatorsequenz für den Translationsstop) in leserahmengerechter Verknüpfung mit einer ESE aus nachstehender Gruppe

(skc ESE, SAK-ESE, speA-ESE)

enthält, werden in ihren bevorzugten Ausführungsformen insbesondere

— dasshuttie-Expressionsplasmid pBB 203 (Molekülgröße 10,8kb; Erythromycin-Marker; SAK-ESE), kodierend für ein Human-Alpha 1-Interferon Fusionsprotein,

— dasshuttle-ExpressionsplRsmid pJS1?7 (Molokülgrößo 9,8kb; Erythromycin-Marker; spoA-ESE), kodierend für ein weiteres Human-Alpha 1 -Interferon-Fusionspro.oin, bzw.

— das shuttle-Expressionsplasmid pS636 (Molekülgröße 1O,5kb; Erythromycin-Marker; speA-ESE), kodierend für Prochymosin,

herangezogen. Die beiden erstgenannten Expressionsplasmide sind dabei wiederum nach Verfahren, die Gegenstand früherer Patentanmeldungen des Zentralinstituts sind, hergestellt worden. Plasmid pS 636 hingegen ist nach einem Verfahren, welches Gegenstand einer zeitgleichen Patentanmeldung des Zentralinstituts ist, konstruiert worden.

Nachdem die für die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung bereitgestellten stabilen Protoplastentyp-L-Form-Stämme 'm Anschluß an die Transformation mit den voranstehend genannten Expressionsplasmiden auf Agar-Medium solektioniert sowie bis zu einem Wachstum als Kolonierasen vermehrt worden sind, konnten — jeweils nach Analyse darin den gewonnenen L-Form-Transformanten enthaltenen Plasmid-DNS — die rekombinanten L-Form-Stamme

— Pr.mirabilisLVI(pSM752) Pr. mirabilis L D52 (pSM 752)

E. coli LW1655F(plus) (pSM752)

E. coli LW1655F(minus) (pSM752) Bac.subtilisL170(pSM752) Bac. subtilis L 1997 (pSM 752) Strep, hygroscopicus L 33-354 (pSM 752) Strep, hygroscopicus L OB 56 (pSM 752)

— Pr..-nirabilisLVI(pDB15) Pr. mirabilis L D52(pDB 15)

E. coli L W1355 F (plus) (pDB 15) E.coliLW165ur;minus)(pDB15) E.coliLCB(pDB15) Staph. aureus L 66 (pDB 15) Staph. aureusL61 (pDB15) Bac.subtilisL170(pDB15) Bdc.subtilisL1997(pDB15) Strep, levoris L EK1331 (pDB 15) Th.vulgarisLK481(pDB15)

— Pr. mirabilis LVKpBB 203) Pr. mirabilis L D52 (^BB 203)

E. cdi L W1655F (plus) (pBB203)

E. coli L W1655 F (minus) (pBB 203) Bac.subtilisL170(pBB203) Bac. subtilis L 1997 (pBB 203) Strep, hygroscopicus L 33-354 (pBB 203) Strep, hygroscopicus L OB56 (pBB203)

— Pr.mirabilisLVI(pJS127) Pr. mirabilis L D52(pJS 127) E.coliLW1655F(plus)(pJS127) E. coli LW1655F (minus) (PJS 127) E.coliLCB(pJS127) Staph. aureus L66(pJS 127) Staph. aureus L 61 (pJS 127) Bac.subtilisL170(pJS127) Bac. subtilis L1997 (pJS 127) Strep.griseusL86(pJS127) Th.vulgarisLK481(pJS127)

— Pr. mirabilis LVI (pS636) Pr.mirabilisLD52(pS636) Bac.subtilisL170(pS636) Bac. subtilis L1997 (pS636)

als Klone mit hoher Genexpression sowie hoher extrazellulärer Produktbildungsrate isoliert werden.

Ausgewählte rekombinante L-Form-Stämme dieser Kollektion sind in den oben angegebenen Medien (u.a. LFS-Medium) unter Schüttelkolben- wie unter Fermentor-Bedingungen kultiviert. Dabei konnten, wie auch die Ausführungsbeispiele belegen, die rekombinanten L-Form-Populationen mit Generationszeiten von 60 Minuten bis 180 Minuten unter Erreichen von Zellzahlen über 10^D/ml sowie von hohen extrazellulären Konzentrationen des jeweiligen heterologen Genprodukts wachsen. Zusammengefi 3t bieten die verfahrensgemäß eingesetzten rekombinanten Produzenten-Organismen im Vergleich zu herkömmlichen rekombinanten Bakterien-und Hefe Stämmen folgende Vorteile:

— leichte Transformierbarkeit mit rekombinanten Expressionsplasmiden in einem breiten Wirtsbereich;

— gute Sekretion mit Frreichen hoher extrazellulärer Genprodukt-Konzentrationen;

— Fehlen von in der Zellwand lokalisierten Endotoxinen, immunreaktiven Komponenten und Schadstoffen und dadurch günstigere Aufarbeitungsprozeduren;

— Unfähigkeit der genetisch manipulierten L-Formen zum Überleben außerhalb der Laborbedingungen;

— erhöhte bzw. absolute Resistenz ge onüber Bakteriophagen infolge Fehlens von wandgebundenen Rezeptorsubstanzon;

— hohe Stabilität der gebildeten und s ;κ etierten Genprodukte in der Kulturlösung infolge fehlender extrazellulärer Proteaseaktivität;

— gegebenenfalls leichte Aufarbeite rkeit der L-Form-Zellen nach Anwendung eines osmotischen Schocks (durch Aqua dest.— oder durch geringe Detergenz-Zugübe).

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1: Streptonnase-Bildung durch L-Formon von Protons mirabiiis L Vl

— Isolierung dor L-Formen:

Nach Bespateln von Fleischbouillon-Agar-Platton mit Zusiitzon von 10% Pfordosorum, 1 % NnCI und 400 E Penicillin G/ml mit 0,1 ml einer Kultur von Proteus mirabiiis Vi aus der uxponontic'lon Wachstumsphaso und Bobrütung bei 37 'C ontstohnn noch 3 bis 5 Tagen A- und B-TypL-Form-Kolonion(Gumpcrt,J. um¹ Taubonock, U., Z. MIg. Mikrobiol. 15,1975, 399). Durch Übertragung von A-Typ-Kolonion auf Ponicillin-froios Medium werden nach 5' ,., 10 Passagen stnl. <'c L-Formen et halten.

— - Adaptation an Wachstum in flüssigen Nährmedien:

Die Adaptation der L-Form-Kulturen an Wachstum in flüssigen Nährmodicn erfolgte durch Einbringen dicht bewachsener Agarblöckrhon in 10 bis 20ml LFS-Mcdium und Bnbrütung unter Sduittclbcdingungcn (Rundscliwingtisch bei 200U/min) bei 37 "C. Nach 5 bis 10 Passagiorungen kann gutes Wachstum mit Zelldichten von 10" bis lO'KoloHobildendonEinhoiten/ml erhalten werden.

— Transformation mit Streptokinaso-rckombinanten Plasmidvektoren

Das zur Transformation der L-Formen benutzte rekombinanto Stroptokinasc-Plasmid ist pSM 752, das von Malko (MHke, M. et al., Mol. Gen. Genet. 196,198Ί, 360), Kleßen, C. and Mslko, H. (J. Basic Microbiol. 26, 198G, 70) beschrieben wurde. pSM75? hat eine molekulare Größo von 13,3kb, ist ein Fusionsplasmid aus dom E. culi-Voktor pBR322 und dom Stroptokokkon-Vektor pSM 7, determiniert als selektive Markör Tetracyclin· und MLS-Rosistenz und tragt das SK-Gon als 2668-hp-lir.nrt im Pstl-Ort des bla-Gens von pBR322.

Die Jiandard-Transformationsprozedur umfaßt folgondo Schritto: 18 bis 24 Stunden altu Schüttolkul;ur von L Vl in LFS-Medium; zentrifugieren bei 5000g für 10 Minuten; rosuspendioron in LFS-Mcdium zu oiner Konzentration von 10¹⁰ Zollen/ml; zu 0,1 ml dieser L-Form-Susponsion 10 bis 30pg Plasmid-DNS und 0,15ml Polyethylonglycol-Lösung (30%ig,MG 6000, in 0,4 M Saccharose) geben; 10 Minuton im Eisbad abkühlf.i; 5 bis 10 Minuton boi 37 ⁰C schütteln; 0,9ml osmotisch stabilisiertes LFS-Medium zugoben; 2 bis 4 Stunden boi 37⁰C schüttoln; 0,1 ml davon auf LFS-Agar-Platton mit und ohno 10pg Erythromycin ausspateln; Bobrütung der Platten bei 37⁰C. Die Isolierung der aufdonErythromycin-onthaltotiden Agarplat.cn gewachsenen Transformantenkolonien erfolgt nach Üborschichtpn mit einom Overlay (TRIS-HCI-Agar, 1%ig. mit Zusätzen von 20% Magermilch und 10ug Plasminogen/ml) und Selektion derjenigen Kolonien, dio nach 2 bis 18 Stunden üebrutung bei 37⁰C Aufhollungszonen im Overlay gebildet haben.

— Nachweis der Plasmid-DNS in clon L-Form-Zellen und Charakterisierung der Bandenmuster:

Die einzelnen Transformantenkclonien werden mit Hilfe der Agarblock-Mothodo mohrfach auf frisches Medium übertragen bis reichliches Wachstum mit Bildung ν τη Kolonierasen vorliegt. Aus diesen nach Abschwemmung mit( .4M C-nccharo&o erhaltenen Zellen oder aus solchen, die in LFS-Medium gewachsen waren, wurde nach der Methode von ι rnboim & DoIy (Nucleic Acid Research 7,1979,1513) mc ¹³I^mId-DNS isoliert und mit der Agarose-Goleloktrophoresc chii'aktcrisicrt (Agarose Sigma 0,7%, TRIS-Puffer 36mM, NaH₂PO₄ 3OmM, EDTA 1OmM, Färbung mit Ethidiumbromid, Horizontalelektrophorese bei 8V/nm Spannung).

— Selektion von Transformantenstämmen und Nachweis der SK-Bildung:

Transformantenkulturen mit reichlichem Plasmid-DNS-Gohalt und Bandonmustorn, dio mit dem Originalplasmid identisch sind, werden an das Wachstum in flüssigen Medien adaptiert, wobei wie oben verfahron wird. Zur Bestimmung (!er SK-Bildung erfolgt eine Beimpfung von 50ml LFS-Medium mit üusatz von 10pg Erythromycin/ml mit 5ml einer 10 bis 29 Stunden alten Schüttelkultur. In Abständen . jn3bis4 Stunden wurden 2ml Proben entnommen und bei 5000U/min in einer Laborzentrifuge zentrifugiert. 30 bis 50μΙ des unverdünnten und des verdünnten Überstandes wurden dann in Stanzlöcher einer Agarplatte gegeben. Der Agar besteht aus TRIS-HCI (50m,M)-NaCI (150mM)-Pi'fer (pH 8,1), 1 % Difco-Agar, 10% bis 20% Magermilch und 1 OOOpg Human-Plasminogen/ml. Abbildung 1 zeigt eine solche Testplatto mit den Proben von Protous miiabilis L Vl (L VIT1 bis T6) neben denen von Bacillus subtilis 1.170 (L 170,2,3, 5, 6,1i, den Verdünnungen eines Streptokinase-Standards (200-5000 E/ml) und den Kontrollen (nicht transform ierte L-Formen L Vl K und L 170 K ohne pSM 752 sowie Agarmedium ohne Plasminogen).

Um positive SK-Proben herum beginnt nach 3 bis 6 Stunden eine Aufhellung dos trüben Agars infolge Protcolyse des Milchcaseins durch die Streptokinase. Nachdem keine Ausbreitung der Klärzonen mehr nachweisbar ist (18 bis 24 Stunden Bebrütung bei 37°C), werden die Durchmesser ausgemessen und die SK-Konzentration durch Vergleich mit den Zonendurchmessern dar Standardp'oben ermittelt

Abbildung 1 dokumentiert für das Ausführungsbeispiel 1,daß

— die 6 untersuchten P. mirabiiis L-Form-Trensformanten SK bilden,

-- mit 4 Transformanten ohne besondere Anpassung maximale Werte von über 6000E/ml erreicht werden,

— die SK auch nach 48 Stunden Kultivierung unter Schüttelbedingungen bei 37°C und ohno Zusätze von Proteinasehcmmern stabil in der Kulturlösung erhalten bleibt.

Beispiel 2: Streptokinase-Bildung durch L-Formen von Bac. subtilis L 170

Die Isolierung der L-Formen von Bac. subtilis 170 erfolgt nach der Gradientenmethode durch Zugabo von 1000E/ml Penicillin 6 oder 500pg lysozym/ml in Stanzlöchereines Agarmediums aus Fleischbouillon (FB), 10%Pferdeserun und 3% NaCI. Die -Form-Kolonien entstehen in der Lysezone des nach Bespateln mit einer 8 bis 24 Stunden alten Kultur von Bac. subtilis sich entwickelnden Bakterienrasens. Stabile L-Formen werden durch fortlaufende Übertragung der L-Form-Kolonien mit LFS-Agarmedien ohne Penicillin- und Lysozymzusätze erhalten.

Bei der Adaptation an Wachstum in flüssigen Nährmedien, der Transformation mit SK-Plasmiden, dom Nachweis der Plasmid-DNS in den L-Form-Zellen, der Selektion der Transformantsnstämrne mit SK-Bildung und der Bestimmung der SK-Produktion wird verfahren wie in Ausführungsbeispiel 1

Die Abbildung 1 dokumentiert für das AusführijngsLeispiel 2,

— daß die 6 untersuchten Transformanten von Bac. subtilis L 170 SK bilden,

— daß die Höchstwerte ohne genotypische und phänotypische Folgeanpassungen zwischen 200 und 500E/ml SK liegen,

— daß die SK auch nach 48 Stunden Kultivierung unter Schüttelbedingungen bei 37⁰C und trotz partieller Lyse eier L-Form· Zellen und ohne Zugabe von Proteinasehemmern stabil in der Kulturlösung erhalten bleibt.

Beispiel 3: Human-lnterferon-alpha 1-Bildung durch L-Formen von Escherichia coli

— Isolierung der L-Formen:

Die Primärisolierung der L-Formen von E. coli W1655Fplus und E.coli W1655F minus erfolgt durch Beimpfung von vorgetrockneten Agarplatten (Fleischwasser, 1 % bakteriologisches Pepton, 0,5% NaCI, 10% Pferdeserum, 6 bis 8% Saccharose, 0,8 bis 1 % Bacto-Agar, 500 bis 20000E Penicillin G/ml) mit einer 18- bis 24stündigen Flüssigkeitskultur und Bebrütung unter semiaeroben Bedingungen bei 37°C. Nach mehrfacher Übertragung mit Hilfe der Agarblock-Technik wachsen die L-Form-Kolonien auch unter normalen aeroben Bedingungen und reduzierten Pcnicillinkonzentrationen dOOOE/ml). Genotypisch stabile L-Formen werden durch fortlaufende Üoertragung von L-Form-Kolonien auf Agarmedien ohne Penicillin oder anderen Zellwand-inhibierenden Substanzen erhalten.

Die Adaptation der L-Form-Stämme an Wachstum in flüssigem LFS-Medium, die Transformation mit dem Vektorplasmid pBB203 sowie der Plasmidnachweis erfolgen nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methodik.

Das Plasmid pBB203 hat eine molekulare Größe von 10,9kb. Es trägt als 600-bp-Sequenz das hlFN-Alpha 1-Gen aus dem E.

coli-Plasmid pHRW500, als 420bp langes Hinf I-Tagl-Teilfragment die native Expressions-Sekretions-Einheit des Staphylokinasegens aus dem temperenten Staph. aureus-Phagen 42D sowie eine MLS-Resistenz.

— Nachweis der hlFN-Alpha 1-Bildung:

Isolierte und an flüssiges LFS-Medium adaptierte Klone werden in 50 bis 200ml LFS-Medium mit Zusatz von 10pg Erythromycin/ml submers unter Schüttelbedingungen bei 37⁰C fermentiert. In den in Abständen von 2 bis 4 Stunden entnommenen Proben erfolgt durch Zentrifugieren bei 5000g eine Abtrennung der L-Form-Zellen vcn der Kulturlösung. Der Nachweis des extrazellulären hlFN-Alpha 1 geschieht in der Kulturlösung mit und ohne Zusatz von Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Zur Bestimmung des intrazellulären hlFN-Alpha1 wird das Sediment von 50 bis 100ml in Tris (50mM)-Saccharose (20%)-HCI-Puffer mit Zusätzen von DNAse und PMSF (δθμΐ/ml) resuspendiert und anschließend durch Behandlung mit Ultraschall (3- bis 6mal für 30 Sekunden) oder durch Zugabe von TRITON X-100 lysiert. Die hlFN-Alphai-Bestimmung geschieht mit dem Überstand des Lysatesnach 20 Minuten Zentrifugieren bei 15000g und4°C. Die quantitative hlFN-Alpha1-Bestimmung erfolgt im Biotestverfahren nach der Methode von Tonev und Glück (J. Basic Microbiol. 26,1986,173-189, in Anlehnung an Rubinstein (Rubinstein et al., J. Virology 2,1981, 755-760). Grundlage der Bewertung ist die 50%ige Hemmung des zytopathischen Effektes von Vesicularstomatkisviren (VSV Indiana) auf der bovinen Zellinie MDBK (Machin Darby Bovine Kidney). Die Ablesung erfolgt mikroskopisch. Die Titerbestimnrjng wird an Hand eines miigeführten, nach internationalen Einheiten geeichten Laborstandards für hlFN-Alpha 1 vorgenommen. Die in Tabelle 1 zusammengefaßten Ergebnisse dokumentieren,

— daß von jedem der jeweils ausgewählten Transformantenklone der Stämme E. coli L W1655F plus und E. coli L W1655F minus hlFN-Alpha 1 gebildet und in das Kulturmedium ausgeschieden wird. (Ohne phänotypische Anpassung des Wachstums liegen die extrazellulären Konzentrationen zwischen 1,5 x 10⁷und 5 χ 10⁸E hlFN-Alpha 1/1. Die höchsten WertewurdenmitE.coM L W 1655FplusTE 11507undE.coliLW1655FminusTE 141507 nach 20stündiger Schüttelkultur bei 37⁰C gemessen),

— daß die Bildung und Sekretion des hlFN-Alpha 1 mit dem Einsetzen des Wachstums beginnt und in der frühen stationären Wachstumsphase nach 10 bis 20 Stunden Bebrütung in Abhängigkeit von der Wachstumsrate das Maximum erreicht,

— daß die gebildeten hlFN-Alpha 1 -Mengen bei Fortführung der Kultivierung bis zu 48 Stunden in der Kulturlösung erhalten bleiben (Mikroskopisch feststellbare Lysevorgänge in der Kultur und längere Aufbewahrung der Proben ohne PMSF-Zusätze und Einfrieren führten unter den verwendeten Mediumbedingungen zu keiner wesentlichen Verringerung der hlFN-Alpha 1-Konzentrationen.),

— daß das von E. coli L-Formen gebildete hlFN-Alpha 1 nahezu quantitativ in das Nährmedium ausgeschieden wird (Die intrazellulären hlFN-Alpha 1 -Konzentrationen betrugen bei Zugrundelegung gleicher Probenvolumen für E. coli L W1655F plusTE 11507 0,1 %bisO,8%undfürE. coli LW1655FminusTE 141507 0,6% bis 1,2% der gemessenen extrazellulären Mengen.).

Beispiel 4: Prochymosin-Bildung in L-Formen von Bacillus subtilis L 1997

Die Isolierung der L-Form von Bac. subtilis 1997 erfolgt nach dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 2 beschrieben. Die Methoden zur Adaptation an Wachstum in flüssigen Nährmedien, zur Transformation mit dem Piasmid pS636, zum Nachweis der Plasmid-DNS in den L-Form-Zellen und zur Selektion der Klone mit Prochymosin-Bildung sind im wesentlichen die gleichen wie in Beispiel 1 dargelegt.

Der Vektor pS636isteinChymosin-Expressionsplasmid von einer molekularen Größe von 10,5kb. Es enthält das Chymosin-Gen unter Kontrolle der speA-Expressions-Sekretion-Einheit sowie eine MLS-Resistenz. Zur Selektion und zur Kuivivierung der Transformanten werden 5 bis 15pg Erythromycin/ml verwendet.

— Fermentation:

Rundkolben mit 20 bis 100 ml LFS-Medium, dem 5pg Erythromycin/ml zugesetzt sind, werden mit einer 12-bis 24stündigen Vorkultur beimpft und unter Schüttelbedingungen bei 37⁰C 20 bis 30 Stunden bebrütet. Nach Abtrennung de^r Zellen durch Zentrifugation erfolgt der Nachweis des gebildeten Prochymosins direkt in der Kulturlösung.

Immunologischer Nachweis des Chymosins: Je 1 ml der Kulturlösungen werden mit kristallinem Tris auf pH8,0 eingestellt und mit SDS auf eine Endkonzentration von 1 % gebracht. Diese Lösung wird 5 Minuten unter Kochen im Wasserbad erhitzt. Anschließend werden je 80μΙ in 10%igen Polyacrylamid-SDS-Flachgelen elektrophonisch nach der Methode von Laemmli (Laemmli. M. K., Nature 227,1970,680-685) aufgetrennt. Die Übertragung des aufgetrennten Proteingemisches auf Nitrozellulosefolie (Schleicher & Schüll) wird nach der Methode von Kyhse-Andersen (J. Kyhse-Andersen, J. Biochem. Biophys. Methods 10,1984,203-209) durchgeführt. Der immunologische Nachweis des Prochymosins auf der Nitrozellulosefolie erfolgt nach der Methode von Towbin et al. (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76,1979,4350-4343). Als primärer Antikörper dient ein Anti-Kalbchymosin-Serum vorn Kaninchen und als sekundärer Antikörper zum Nachweis

einer immunologischen Reaktion ein Anti-Kaninchen IgG-Peroxidase-Konjugat von der Ziege. Als Farbreagenz wird Diaminobenzidin verwendet.

Das exprimierte Prochymosin (Molekulargewicht von 37,5KD) läßt sich nach der Methode von Foltmann (Methode in Enzymology 19,1970,421-436) im Kulturfiltrat nach einer Aktivierungszeit von 20 Stunden vollständig in aktives Chymosin (Molekulargewicht 35,5KD) überführen. Das aktivierte Enzym wird nach 10facher Konzentrierung durch Ethanolfüllung im Doppeldiffusionstest nach Ouchterlony nachgewiesen; es zeigt eine Identitätsreaktion mit Kalbchymosin.

— Nachweis der Milchgerinnungsaktivität:

Zum Nachweis der Milchgerinnungsaktivität wird 1%iger Magermilchagar in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, 0,01 M CaCI₂, pH6,2, verwendet. Trockenmagermilch wird zu 12 %im obigen Puffer bei 37"C unter Rühren suspendiert und davon 0,25ml zu 10ml auf 50⁰C temperierten Agar gegeben und gemischt. Das homogene Gemisch wird zu 1 mm Schichtdicke auf eine Glasplatte gegossen. In die erstarrte Agarschicht werden Löcher im Durchmecser von 3 bis 4mm gestanzt. Die Kulturfiltrate der zu prüfenden Stämme werden 2 bis 3 Stunden bei pH2,5 nach der Methode von Foltmann (a.a.O.) aktiviert. Nach Einstellung des pH-Wertes auf 6,2 werden je 7μΙ der Testlösung sowie deren Verdünnungen in die gestanzten Löcher aufgetragen. Als Standard wird SDS-eloktrophoretisch einheitliches Kalbchymosin, das nach der Methode von Amourache und Vijayalakshmi (Amourache & Vijayalakshmi, J. Chromatography 303,1984,285-290) aus Pansenlab an Histidylsepharose gereinigt wird, verwendet. 10pg/ml des verwendeten Standardchymosins bringen innerhalb von 100 Sekunden 10ml Magermilch (hergestellt aus Trockenmilch) bei 3O⁰C zur Gerinnung (Foltmann, a.a. O.).

Abbildung 2 zeigt die Milchgerinnungsaktivität in Kulturlösungen von drei verschiedenen Bac. subtilis L 1997 (pS636)-Klonen unverdünnt und in einer Verdünnung 1:2 im Vergleich zu verschiedenen Kalbchymosin-Konzentrationen. Die Ergebnisse der Fermentationsversuche zeigen,

— daß verschiedene Klone von Bac. subtilis L 1997 (pS636) während submerser Fermentation Prochymosin bilden und in das Nährmedium sekretieren,

— daß die Bildung überwiegend in der aktiven Wachstumsphase erfolgt,

— daß das gebildete Prochymosin nahezu vollständig aktivierbar und das entstehende Chymosin mit dem Kalbchymosin identisch ist,

— daß mit den erhaltenen Klonenzwischen 5pg und 15μg Chymosin/rr.l Kulturlösung erhalten werden,

— daß das sekretierte Prochymosin bei verlängerter Fermentationszoit bis 40 Stunden stabil m halten bleibt.

Beispiel 5: Bildung von Prochymosin durch L-Formen von Bacillus subtilis L 1997 im Laborfermentor Zur Fermentation im 2-l-Maßstab werden Chymosin-Klone von Bac. subtilis L 1Ί37 verwendet, wie sie in Beispiel 4 beschrieben sind. Ein Laborfermentor aus Glas mit Rühr- und Belüftungseinrichtung sowie automatischer pH- und pO₂-Regelung wird mit 1,91 LFS-Medium mit Zusatz von 5 pg Erythromycin/ml gefüllt und nach Erwärmung auf 36°C mit 200ml einer 18stündigen Bac. subtilis L 1997 (pS636)-Kultur beimpft. Die Fermentation erfolgt mit Rührgeschwindigkeiten zwischen 300 bis 400U/min, Belüftungsraten von 0,5 bis 1 Volumen Luft pro 1 Volumen Medium, pH-Einstellung auf pH6,5 bis pH7,2 und Temperaturregelung auf 35⁰C bis 37°C. Die in Abständen von 2 Stunden entnommenen Proben werden 10 Minuten bei 6000g zentrifugiert. Die Bestimmung der Prochymosin-Bildung erfolgt im Überstand nach den in Beispiel 4 beschriebenen Methoden. Die Ergebnisse zeigen,

— daß 3ac. subtilis L 1997 (pS636)-Klone unter den beschriebenen Fermentationsbedingungen mit Generationszoiten zwischen 100 Minuten und 130 Minuten wachsen und Zellzahlen über 10⁹ Zellen/ml erreicht werden,

— daß die Bildung und Sekretion des aktivierbaren Prochymosins mit dem Einsetzen des Wachstums beginnt,

— daß nach 10 Stunden Fermentation Prochymosinkonzentrationen zwischen 5 bis 10pg/ml erreicht werden.

Tabelle 1: Extrazelluläre und intrazelluläre hlFN-Alpha1 -Konzentrationen inTransformantenkulturen der stabilen Protoplastentyp L-Formen von E. coli LW1655 F* und E. coli LW1655 F"

Transformantenstamm	extrazelluläres hlFN E/L	nach18Std.	nach40Std.	intrazelluläres hlFN E/L	Anteil in
	Schüttelkultur	Schüttelkultur	nach 18 bzw.	%
	1,5-5 χ 10"	1,5-5 χ 10⁸	40 Stunden	0,1-0,8
E. coli LWF* TE 11507	3-5x10'	3-5x10'	1-13 χ 10⁵	0,1-0,5
E. coli LWF* TE 21507	1,5-5 x 10⁸	1,5-5 x 10⁸	4-15x10*	0,2-0,3
E. coli LWF* TE 12002	1,5-5 x 10'	1,5-5x10'	1-15 x 10*	0,1-0,2
E. coli LWF* TE 11507	1,5-5x10'	1-3 x 10'	1,5-9 x 10⁴
E. coli LWF" TE 31507	1,5-5 XiO⁸	1,5-4,5x10⁸		0,6-1,2
E. coli LWF" TE 14 1507	9-50 x 10⁵

umgerechnet im Verhältnis des intrazellulären IFN von Zellen aus 1 ml Kultur zu extrazellulären IFN in 1 ml Kulturlösung.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung rekombinanter Genprodukte, insbesondere Enzyme, Immunmodulatoren, Immundeterminatoren, Hormone sowie weiterer biologisch aktiver Peptidwirkstoffe, auf mikrobiellem Wege, gekennzeichnet dadurch, daß man prokaryotische oder eukaryotische IViikroorganismen-Stämme, die ohne bzw. mit stark reduzierter Zellwand vermehrungsfähig sind (Kurzbezeichnung: L-Formen), mit einem zur Expression des jeweiligen Genprodukts befähigten replikablen rekombinanten Vektorplasmid (Kurzbezeichnung: Expressionsplasmid) transformiert, in einem Fermentationsmedium zur Expression anregt und das Genprodukt isoliert.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurcn, daß man stabile bakterielle oder pilzliche L-Form-Stämme verwendet.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß man Protoplastentyp-L-Form-Stämme verwendet.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man L-Form-Stämme verwendet, die von gramnegativen Elternbakterien herstammen.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß man L-Form-Stämme aus den Bakterien-Gattungen

Pseudomonas, Agrobacterium, Proteus sowie Escherichia verwendet.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, daß man L-Form-Stämme aus den Bakterien-Arten

Pseudomonas aeroginosa, Pseudomonas putida, Agrobacterium tumefaciens, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris sowie Escherichia coli, verwendet.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1,2,3 und 6, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Transformation die genotypisch stabilen Protoplastentyp-L-Form-Stämme

Pr. mirabiiis L Vl, Pr. mirabilis L D52, E. coliLW1655F(plus), E. coli L W1655 (minus) sowie E. coli L CB verwendet.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man L-Fo^rm-Stämme verwendet, die von grampositiven Elternbakterien herstammen.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, gekennzeichnet dadurch, daß man L-Form-Stämme aus den Bakterien-Gattungen Staphylococcus, Streptococcus (serolog. Gruppen D, H und N), Bacillus,

Lactobacillus, Streptomyces sowie

Thermoactinomyces verwendet.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, gekennzeichnet dadurch, daß man L-Form-Stämme aus den Bakterien-Arten

Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Streptococcus pyogenes,

Stiepiococcus sanguis, Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lactis, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces griseus, Streptomyces levoris, Streptomyces noursei sowie Thermoactinomyces vulgaris verwendet.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 und 10, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Trancformation die genotypisch stabilen Protoplastentyp-L-Form-Stämme

Staph. aureusL66, Staph. aureus L 61, Bac. subtilis L 170, Bac. subtilis L 1997, Strep, hygroscopious L 33-354, Strep, hygroscopicus L OB56, Strep, griseus L 86, Strep, levoris L EK 1331 sowie Th. vulgaris L K 481 verwendet.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, 6 und 7 sowie 10 und 11, gekennzeichnet dadurch, daß man stabile bakterielle L-Form-Stämme verwendet, die

— durch Behandlung mit Inhibitoren der Zellwand-Biosynthese isoliert,

— an Wachstum in flüssigen Medien adaptiert und

— über einen mehrjährigen Zeitraum selektiv kultiviert worden sind.

13. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Transformation des gewählten L-Form-Stammes jeweils ein Expressionsplasmid verwendet, welches neben wenigstens einem Replikationsorigin

— Gene für mindestens einen Antibiotikaresistenz- b/w. Auxotrophie-Marker sowie

— Gene für mindestens ein Polypeptid bzw. für ein anderes Protein in leserahmengerechter Verknüpfung mit einer Expressions-Sekretiono-Einheit (Kurzwort: ESE)

enthält.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, gekennzeichnet dadurch, daß man ein shuttle-Expressionsplasmid mit wenigstens je einem Repükationsorigin für gramnegative als auch für grampositive Bakterien verwendet.

15. Verfahren gemäß Anspruch 13, gekennzeichnet dadurch, daß man ein shuttle-Expressionsplasmid mit wenigstens je einem Replikationsorigin für Bakterien und für Hefen verwendet.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, daß man ein shuttle-Expressionsplasmid mit mindestens je einem Replikationsorigin für gramnegative Bakterien und für Hefen der Familie Saccharomycetaceae verwendet.

17. Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie 13 bis 16, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Expressionsplasmid mit mindestens einem Mar kergen für eine Antibiotikaresistenz aus nachstehender Substanzgruppe (Aminoglykoside, Makrolide, Tetracycline, Chloramphenicol, Lincomycin) verwendet.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Expressionsplasmid mit mindestens einem Markergen für eine Resistenz aus nachstehender Antibiotika-Gruppe (Streptomycin, Kanamycin, Neomycin; Erythromycin; Tetracyclin, Oxytetracyclin) verwendet.

19. Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie 13 bis 16, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Expressionsplasmid mit mindestens einem Markergen für eine Leucin-, eine Histidin-, eine Uracil-, eine Threonin- oder eine Isozitratlyase-Auxotrophie verwendet.

20. Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie 13 bis 19, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Expressionsplasmid mit einer, gegebenenfalls nach ihrer Pr imärisolierung durch Umklonierung in einen polylinkertragenden shuttle-Vektor (Bakterien-Hefe-shuttle) portabel gemachten ESE eines Gens für eine Hefe-Enzym oder einen Hefe-Proenzymaktivator verwendet.

21. Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie 13 bis 18, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Expressionsplasmid mit einer, gegebenfalls nach ihrer Primärisolierung durch Umklonierung in einen polylinkertragenden Plasmidvektor portabel gemachten ESE

— entweder eines Gens für ein Enzym, iur einen Gerinnungsfaktor odor für einen Proenzymaktivator bakteriellen Ursprungs

verwendet.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, gekennzeichnet dadurch, daß man

— die ESE des Streptokinase-Gens von Stamm Streptococcus equisimilis H46A (skc-ESE),

— die portabel gemachte ESE des Staphylokinase-Gens des Bakteriophagen 42D von Staphylococcus aureus (SAK-ESl oder

— die portabel gemachte ESE des Gei.. 'ürdas Exotoxin Ades BakteriophagenT12 von Streptococcus pyogenes (speA-ESE)

verwendet.

23. Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie 13 bis 16, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Expressionsplasmid mit einer synthetischen consensus-lESE verwendet.

2Λ. Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie 13 bis 18, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Expressionsplasmid mit einer durch einen Mediumzusatz induzierbaren ESE verwendet.

25. Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie 13 bis 22, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Expressionsplasmid verwendet, welches ein Strukturgen für ein Enzym,

für einen Proenzymaktivator oder
für einen Gerinnungsfaktor
in leserahmengerechter Verknüpfung mit seiner nativen ESE trägt.

26. Verfahren gemäß Anspruch 25, gekennreichnet dadurch, daß man ein Expressionsplasmid verwendet, welches ein Strukturgen für eine Alpha-Amylase, für die H 46A-Streptokinar.vi oder für die 42 D-Staphylokinase jeweils in leserahmengerechter Verknüpfung mit seiner nativen ESE trägt.

27. Verfahren gemäß Anspruch 13,14,18 und 26, gekennzeichnet dadurch, daß man

— das shuttle-Expressionsplasmid pSM 752 (Erythromycin-Marker), kodierend für H 46A-Streptokinase, bzw.

— das Expressionsplasmid pDB15 (Erythromycin-Marker), kodierend für42D-Staphylokinase, verwendet.

28. Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie 13 bis 24, gekennzeichnet dadurch, daß man jeweils ein Expressionsplasmid verwendet, welches ein Strukturgen für ein Enzym sowohl pro- als auch eukaryotischen Ursprungs, für einen Immunmodulator,

für einen Immundeterminator,

für ein Hormon oder

für einen weiteren biologisch aktiven Peptidwirkstoff sowohl pro- als auch eukaryotischen Ursprungs

in leserahmengerechter Verknüpfung mit der skc-ESE, mit der SAK-ESE, mit der speA-ESE, mit einer synthetischen consensus-ESE oder mit einer durch einen Mediumzusatz induzierbaren ESF enthält.

29. Verfahren gemäß Anspruch 13,14,18 und 28, gekennzeichnet dadurch, daß man

— das shuttle-Expressionsplasmid pBB203 (Erythromycin-Marker; SAK-ESE), kodierend für ein Human-Alpha 1-Interferon-Fusionsprotein,

— das shuttle-Expressionsplasmid pJS 127 (Erythromycin-Marker; speA-ESE), kodierend für ein weiteres Human-Alphal-Interferon-Fusionsprotein, oder

— das shuttlo-Expressionsplasmid pS636 (Erythromycin-Marker; speA-ESE), kodierend für Prochymosin,

verwendet.

30. Verfahren gemäß Anspruch 13,18 sowie 25 bis 29, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Expressionsplasmid verwendet, welches durch Insertion eines aus einem Trägerplasmid als Kompaktfragment entnommenen (ESE-Strukturgen)-DNS-Blockes in einen Klonierungsvektor mit repeat-Sequenzen erhaben wird.

31. Verfahren gemäß Anspruch 30, gekennzeic met dadurch, daß man als Klonierungsvektor mit repeat-Sequ "!nzen das Streptokokken-Plasmid pDß 101 verwendet.

32. Verfahren gemäß Anspruch 1,7,11 sowie 13 bis 31, gekenn: aichnet dadurch, daß man die Transformation des jeweiligen L-Form-Stammes mit einem Expressionsplasmid in Anwesenheit von Polyethylenglycol (MG 4000 bis 6000) sowie unter osmotischor Stabilisierung mittels 0,3 M bis 0,4M Saccharose durchführt.

33. Verfahren gemäß Anspruch 1,7,11 sowie 13 bis 32, gekennzeichnet dadurch, daß man im Anschluß an die Transformation mit einem der bereitgestellten Expressionsplasmide

— positive Transformanten-Klone auf Agar-Medium mit Zusatz von 0,3\ig bis 30Mg Selektivantibiotikum/ml selektioniert,

— hierbei erhaltene L-Form-Transformanten-Kolonien durch mehrfache Passagierungen auf diesem Agar-Medium vermehrt, bis ein Wachstum als Kolonierasen erreicht ist und

— nach Analyse der in diesen Transformanten enthaltenen P!asmid-DNS jeweils einen der nachstehenden Stämme

Pr. mirabilis LVI (pSM752) Pr. mirabilis L D 52 (pSM"/ j2) E. coli LW 1655 F(plus) (pSM 752) E. coli LW 1655 F (minus) (pSM 752) Bac. subt.Ms L170 (pSM 752) Bac. subtil.s L 1997 (pSM 752) btrep. hygroscopicus L 33-354 (pSM 752) Strep, hygroscopicus L OB 56 (pSM 752) -Pr. mirabilis LVKpDB 15) Pr. mirabilis L D 52 (pDB 15)

E. coli LW 1655 F(minus) (pDB 15) E. coli LCB (pDB 15) Staph. aureus L66(pDB 15) Staph.aureusL61(pDB15) Bac. subtilis L170 (pDB 15) Bac.subtilisL1997(pDB15) Strep, levoris L EK 1331 (püB 15) Th.vulgarisLK481(pDB15) -Pr. mirabilis LVKpBB 203) Pr. mirabilis L D 52 (pBB 203) E. coli L W1655 F (plus) (pBB 203) E. coli L W1655 F (minus) (pBB 203) Bac. subtilis L 170 (pBB 203) Bac. subtilis L 1997 (p6B 203) Strep, hygroscopicus L 33-354 (pBB 203) Strep, hygroscopicus L OB 56 (pBB 203) Pr. mirabilis LVKpJS 127) Pr. mirabilis I. D 52 (pJS 127) E. coli L W1655 F (plus) (pJS 127) E. coli LW1655 F(minus) (pJS 127)

E. coli LCBIpJS 127)
Staph.aureusL66(pJS127)
Staph. aureus L 61 (pJS 127)
Bac.subtilisLi70(pJS127)
Bac.subtilisL1997(pJS127)
Strep, griseus L86 (pJS 127)
Th.vulgarisLK481(pJS127)
Pr.mirabilis¹ VI(pS636)
Pr. mirabilisLD52(pS636)

Bac. subtilis L 1997 (pS 636)

als rekombinanten L-Form-Klon mit hoher Genexpression sowie hoher extrazellulärer Produktbildungsrate auswählt.

34. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 33, gekennzeichnet dadurch, daß man die erhaltenen rekombinanten L-Form-Klone nach ihrer Adaptation an Wachstum in flüssigen Nährmedien in einem Fermentationsmedium unter technischen Kultivierungsbedingungen zur Expression anregt.

35. Verfahren gemäß Anspruch 34, gekennzeichnet dadurch, daß man die erhaltenen rekombinanten L-Form-Klone in technischer Submersfermentation zur Expression anregt.

36. Verfahren gemäß Anspruch 33 bis 35, gekennzeichnet dadurch, daß man

— zur Adaptation der erhaltenen rekombinanten L-Form-Klone flüssiges LFS-Medium einsetzt, bestehend aus

Fleischbouillon

Hefeextrakt 0,3%bis1,0%

Saccharose 5,0% bis 10%

Pferdeserum 2,0% bis 10%,

sowie gegebenenfalls in Mikrogramm-Mengen mit Selektivantibiotikum supplementiert,

— die L-Form-Klone als submerse Schüttelkulturen in Mengen von 20ml bis 100ml in diesem Medium bei Temperaturen von 32°C bis 37°C für die Dauer von 12 Stunden bis 48 Stunden steril und aerob fermentiert und

— die extrazelluläre sowie gegebenenfalls auch die intrazelluläre Produkt-Konzentration bestimmt.

37. Verfahren gemäß Anspruch 33 bis 36, gekennzeichnet dadurch, daß man

— zur Kultivierung der erhaltenen rekombinanten L-Form-Klone im Rührfermentor komplexe Nährmedien auf Fleischextrakt oder Gewebeextraktbasis mit Zusätzen von Pepton (0,5% bis 1,0%), Hefeextrakt (0,5% bis 1,0%), Saccharose (2,0% bis 10%) sowie Pferdeserum (2% bis 10%) einsetzt und

— in Medien dieser Zusammensetzung die Fermentation der rekombinanten L-Form-Stämme unter sterilen Bedingungen bei Temperaturen von 32°C bis 37°C bei Aziditäten von pH 6,0 bis pH 8,0 bei Rührgeschwindigkeiten zwischen 100U/min und 400U/min sowie bei Belüftungsraten von 1 bis 2 Volumenteilen Luft pro 1 Volumenteil Medium durchführt.

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen