DD266273A1 - Verfahren zur herstellung bakterieller antigene - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung bakterieller Antigene des Genus Bordetella. Ausgangspunkt ist ein durch Faellung, Abeluierung und Konzentrierung gewonnener Rohextrakt, der erfindungsgemaess einer Glyceroldichtegradientenzentrifugation unterzogen wird. Die dabei erhaltenen konzentrierten und gereinigten protektiven Antigene, die frei von Endotoxinen sind, werden gegebenenfalls nachfolgend als wirksame Komponenten fuer pharmazeutische Praeparate in der Human- und Veterinaermedizin angewendet und nach einer ueblichen Aufarbeitung als Impfstoff, der eine hohe Schutz- und kaum Nebenwirkungen zeigt, eingesetzt.

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung protektiver bakterieller Antigene des Genus Bordetella, die als pharmazeutisches Präparat und Impfstoff Anwendung in der Human- und Veterinärmedizin finden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Präparate, die zur aktiven Immunisierung bzw. Immunprophylaxe eingesetzt werden, enthalten entweder lebende, abgeschwächte Erreger oder abgetötete pathogene Keime oder deren Toxine. Totimpfstoffe werden beim Menschen, ζ. Β. zur Schutzimpfung gegen Keuchhusten, eingesetzt. Sie haben den Nachteil, daß nicht nur die protektiven Antigene des abgetöteten Erregers in den Organismus gelangen, sondern darüber hinaus noch viele andere Bestandteile der pathogenen Organismen, was zu unerwünschten Nebenwirkungen, schweren Erkrankungen und, wenn auch In seltenen Fällen, zum Tode führen kann. Deshalb arbeitet man, z. B. bei der Keuchhustenprophylaxe, an einer Ablösung des Vollkeimimpfstoffes durch eine azelluläre Vakzine, die bei gleicher bzw. höherer Protektivität, wesentlich weniger Impfkomplikationen hervorruft und nach einem einfachen, effektiven und kostengünstigen Verfahren hergestellt werden kann.

Die meisten der gegenwärtigen Studien zur Entwicklung einer azellulären Pertussisvakzine beschäftigen sich mit der Isolierung und Reinigung von zwei Proteinen von Bordetella pertussis, dem leukocytosestimulierenden Faktor (LPF) und dem f ilamentösen Hämagglutinln (FHA), die die wesentlichen protektiven Antigene von Bordetella pertussis darstellen. A!c Ausgangspunkt für die Gewinnung von LPF und FHA dienen Rohextrakte von B. pertussis. Solche Rohextrakte können hergestellt werden, indem entweder ein Gesamtzellaufschluß, ζ. B. mittels Ultraschall (SU-Patent 975020) oder Lysozym (US-Paient 4.474.758) erfolgt, oder die Bakterienzellen abzentrifugiert und eine anschließende Extraktion der Cboriiächenantigene mit den unterschiedlichsten Mitteln erfolgt, z. B. mit Harnstoff (Helting, T. B, et al., Acta path, microb. scand. Sect. B., 89 [1981], 93-101), Tensiden (Robinson, A. et al., FEMS Microb. Lett., 5 (1979], 131-134; US-Patent 4.248.852), Natriumchlorid (Irons, L.I. et al., J. Gen. Microbiol., 129 [1983], 2769-2778) oder Natriumacetat (Askelöf, P., J. et al., Med. Mlcrobiol., 15 [1982], 73-83).

Fine weitere Methode zur Gewinnung von Rohextrakten besteht darin, daß die Antigene aus dem Kulturüberstand, den man nach Abzentrifugation der B. pertussis-Zellen erhält, mittels z. B. Ammoniumsulfat ausgefällt werden (GB-Patent 2.083.358 A, US-Patent 4.247.452). Als günstigste Methocii zur verlustarmen Gewinnung der protektiven Antigene ist eine Gesamtsäurefällung anzusehen, die sich unmittelbar an eine Submeiakultlvierung eines Stammes des Genus Bordetella anschließt (Blom. J. ot al., Inf. Immun., 42 [1983], 308-317; GB-Patent 1.537.849) da hier sowohl sich an der Oberfläche der Zellen befindende als auch ins Kulturmedium abgegebene Antigene in den Rohextrakt übergehen. Ein Verfahren zur Isolierung und Hochreinigung der protektiven Antigene von B.pertussis ist iiie Affinitätschromatographie. Dabei können für die Reindarstellung von LPF u.a. Haptoglobin-Sepharose4B (US-Patent 4.P47.452), eine Fetuin-Affinitätsmatrix (Askelöf, P. et al., Inf. Immun., 3β [1982], 958-961) oder Ceruloplasinin als Ligand (EP¹J 0.140.386) eingesetzt werden. Das Prinzip der Methode besteht darin, daß alle genannten Liganden Glykoproteine sind, die Sialinsäure enthalten, welche eine spezifische Bindung mit LPF eingeht. Für die Hochreinigurig von LPF und FHA mittels einer Affinitätschromatographie können weiterhin u. a. Hydroxylapatit (Sato Y., et al. Inf. Immun., 41 [1983], 313-320) ooorPolysaccharidschwefelsäureestergelefJP-Patent 6153224; JP-Patent 60-237027[A]; EPU 0.159.003) angewandt werden.

Alle bisher zum Einsatz kommenden Verfahren zur Reindarstellung von LPF und FHA sind für eine Überführung in die Großproduktion mit dem Ziel der Herstellung einer azellulären Pertussisvakzine zu zeit- und materialaufwendig. Außerdem besteht für die Herstellung der genannten Vakzine nicht die Notwendigkeit, Reinstantigene anzuwenden. Es hat sich sogar

herausgestellt, daß eine geeignete Kombination der zwei wesentlichen protektlven Antigene von B. purtiiRsin ninn höhere Schutzwirkung zur Folge hat. 1981 wurde ein erster azellulärer Impfstoff gegen Keuchhuste.) In Japan eingeführt, dor gegenüber der herkömmlichen Vollkeimvakzine bedeutende Vorteile aufweist (Aoyama, T. et al., J. of 'ediatrics, 107(1985), 180-183; Noble, G.R„ JAMA, 257 [1987), 1351-1356).

Die Vorteile liegen in einer weitaus geringeren Reaktogenität dos Impfstoffes gegenüber tor Vollkeimvakzine, verbunden mit einem gleichen oder höheren Antikörperspiegel im Serum als nach Erkrankung. Das Prinz ρ der Herstellung dieser azellulären Vakzine beruht darauf, daß der Kulturüberstand von B. pertussis mit Ammoniumsulfat fraktioniert gefällt wird, sich eine Extraktion der Antigene mit einor Natrlumchlorld-Lösung hoher Konzentration anschließt, gefolgt von einer Laccharosedlchtegradientenzentrlfugatlon (Sato, Y. et al., Lancet, 8369 [1984], 122-126). Die nach der Dlchtegradientenzentrifugation gepoolte Antigenfraktion enthält sowohl LPF als auch FHA, ist nahezu frei von Endotoxinen und kann nach entsprechender Aufarbeitung als Impfstoff Anwendung finden.

Der Nachteil dieser Methode bezüglich ihres Einsatzes in der Großproduktion von Impfstoffen ist, daß dabei ein kontinuierlicher Gradiont bebraucht w.'rd, dessen Herstellung, im Vergleich zu einem stufenförmig vorgeschichteten Gradienton, komplizierter und zeitaufwendiger Ist.

Versuche, bei denen ein vorgeschichteter Cäsiumchlorid-Gradient benutzt wurde, führten nicht zum Ziel, da Reinigung und Konzentrierung der Antigene unbefriedigend waren (Sato,^v. et al., Inf. Immun., 7 [1973), 992-998), sich weitere Reinigungsschritte anschließen müßten (Morse, S. I. et al., J. Exp. Med., 143 [1976), 1483-1502) und Cäsiumchlorid die Koston der Herstellungstechnologie wesentlich erhöhen würde.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bekämpfung und Diagnose von Infektionskrankheiten und die Therapie bei Stoffwechselkrankheiten.

Darlegung des Wesens dor Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein kostengünstiges, großtechnisch anwendbares Verfahren zur Herstellung von protektiven Antigenen des Genua-Bordetella zu entwickeln.

Die Antigene, die in pharmazeutischen Präparaten, insbesondere als azelluläre Pertusslsvakzine, Anwendung finden, müssen über eine hohe Reinheit und eine gute Schutzwirkung verfügen und dürfen nur geringe Nebenwirkungen bei ihrer Anwendung zeigen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch charakterisiert, daß ein Rohextrakt, gewonnen nach Submerskultivierung eines Stammes des Genus Bordetella, Gesamtsäurefällung, Abelulerung und Konzentrierung der Antigene, einer Glyceroldichtegradientenzentrifugatlon unterzogen wird und gegebenenfalls nachfolgend eine Weiterverarbeitung zum pharmazeutischen Präparat erfolgt. Dazu dient ein vorgeschichteter, stufenförmiger Gradient, wobei die stufenförmige Vorschichtung des Glycerols im Konzentrationsbereich von 15-35% erfolgt. Die Dichtegradientenzentrifugation wird vorzugsweise bei 250000g über 24h durchgeführt.

Die erfindungsgemäße Anwondung eines stufenförmig vorgeschichteten Glycerolgradienten ermöglicht eine bedeutende Vereinfachung der Herstellungstechnologie mit einer Substanz, die die Materialkosten der Saccharose nicht übersteigt.

Die gewünschto Anreicherung und Reinigung der protektiven Antigene wird erreicht, die gepoolte Antigenfraktion hat eine 12- bis 24fach höhere spezifische Aktivität an protektivem Antigen im Vergleich zum durch Fällung, Abeluierung und Konzentrierung gewonnenen Rohextrakt und ist nahezu frei von Endotoxlnen.

Die Reinheit der nach der erfindungsgemäßen Glyceroldichtegradientenzentrifugati m gepoolten Antigenfraktion von

B. pertussis, die mit sowohl LPF als auch FHA die beiden wichtigsten protektiven Antigene enthält, zeigt sich in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese nach Laemmli (Laemmli, U. K., Nature, 227 [1970), 680-685). Beide Antigene haben die für sie charakteristischen Proteinbanden. Die mittels der Glyceroldichtegradientenzentrifugation erhaltene Antigenfraktion erfüllt somit alle Anforderungen, um, nach Detoxifizierung, Anlagerung an einen Mineralträger und gegebenenfalls nach dem Hinzufügen vo ι Antigenen anderer Spezies, als Impfstoff eingesetzt zu werden, der eino hohe Immunogenität und geringe Toxizität hat und weniger Impfkomplikationen als eine Vollkeimvakzine hervorruft. Auch besitzen die so aufgereinigten Antigene die entsprechende Qualität, um, nach Anlagerung an einen polymeren Träger, für die Diagnostik, z. B. mittels ELISA, eingesetzt zu werden.

Die Erfindung soll nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel

Zu 4Ol einer Pertussis-Kelmsuspension wird soviel konzentrierte HCI zugegeben, daß der pH-Wert 3,8-4,0 beträgt. Diese Suspension bleibt über Nacht bei 4⁰C stehen. Danach wird der Überstand abesaugt und verworfen, das Sediment wird bei 3000g 1 h zentrifugiert. Das nach der Zentrifugation erhaltene Pellet wird in 200ml Puffer A (5OmM Tris-HCI pH9,55; 1M NaCI; 5mM EDTA) resuspendiert und 24h mit einem Magnetrührer bei 4°C zwecks Antigenextraktion gerührt. Anschließend wird die Extraktion mit 100ml Puffer A wiederholt.

Die vereinigten Überstände werden mit Ammoniumsulfat bei einer Sättigung von 70% über Nacht bei 4⁰C gefällt, anschließend 0,5h be^! 4000g zentrifugiert, das erhaltene Ammoniumsulfatpellet in 30ml Puffer A resuspondiert und 24h mit einem Mapnetrührer bei 4°C zwecks Extraktion gerührt. An diese erste Extraktion schließen sich noch zwei weitere mit jeweils 10 ml Puffer A unter den gleichen Bedingungen an.

Did vereinigten Überstände werden 3mal gegen ein zehnfaches Volumen Puffer B (5OmM Tris-HCI pH8,1; 0,5 M NaCI) dialysiert und abschließend durch Ultrafiltration eingeengt.

Dt/r ί· ι erhaltene Rohextrakt wird einer Glyceroldichtegradientenzentrifugation unterzogen.

Dazu wird ein stufenförmiger Glycerolgradient mit, z. B. folgenden Mengen und Konzentrationen vorgeschichtet:

1,0ml 16% Glycerol 1,0ml 20% Glycerol 1,0ml 26% Glycerol 1,0ml 30% Glycerol 0,6 ml 35% Glycerol

Anschließend wird auf diesen Gradienten 0,5mg des Rohextraktes aufgetragen und es erfolgt eine Zentrifugatlon In einem SW-50.1-Rotor bei 260000g über 24h. Das Austropfen des Grodionten erfolgt in Fraktionen zu je 180 μΙ. Ausgewählte Fraktionen werden auf ihre Aktivität an FHA (Ar ai, H. et al., BBA, 444 (1976], 766-782) in der Mikrohämagglutinatlon und auf ihre LPF-Aktivität im CHO-Test geprüft (Gillenius, P. et

al., J. Biol. Stand., 13 [1985], 61-66). Weiterhin er'olgte elno Proteinbestimmung nach der Lowry-Methode. Die Ergebnisse sindin Abb. 1 dargestellt.

Gepoolt wurden die Fraktionen 11 bis 17. Mit diesem gereinigten Material wurde nach Detoxifizlerung mittels Formalin ein Mäuseprotektlvtest durchgeführt, in dem es sich als hochproduktiv erwies. Mit dem Wägetest an Mäusen konnte gezeigt werden,

daß die mittels einer Glyceroldiclitegradiontenzentrifugation gewonnene Antigenfraktion nahezu frei von Endotoxinon ist.

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Claims (6)

1. -ι- Zfl«273 Patentanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung bakterieller Antigene des Genus Bordetella durch Submerskultivierung, anschließende Gesamtfällung der die Bakterien enthaltenden Kulturflüssigkeit, Abeluierung und Konzentrierung der Antigene zum Rohextrakt, dadurch gekennzeichnet, daß dieser Rohextrakt einer Glyceroldichtegradientenzentrifugation unierzogen wird und gegebenenfalls nachfolgend eine Weiterverarbeitung zum pharmazeutischen Präparat erfolgt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein vorgeschichteter, stufenförmiger Gradient Anwendung findet.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß die stufenförmige Vorschichtung des Glycerolgradienten im Konzentrationsbereich von 15-35% erfolgt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß die Dichtegradientenzentrifugation bei 250000g über 24h erfolgt.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Weiterverarbeitung zum Impfstoff nach Detoxifizierung und Anlagerung an einen Mineralträger, gegebenenfalls unter Hinzufügung von Antigenen anderer Spezies, erfolgt.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Weiterverarbeitung der Antigenpräparationen für diagnostische Zwecke, z. B. ELISA, di ^h Anlagerung an einen polymeren Träger erfolgt.