DD265427A1 - Verfahren zur herstellung von synthetischen dns-bloecken - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von synthetischen DNS-Bloecken groesserer Laenge. Sie verfolgt das Ziel, derartige Bloecke mit hoeherer Effektivitaet herzustellen. Die diesem Ziel zugeordnete Aufgabe wird geloest, indem im ersten Schritt des Verfahrens in beiden pro Block bereitzustellenden Oligonukleotiden am 3-Ende hilfsweise ein Zwischenbereich, der jeweils wenigstens einen Strang der Erkennungssequenz fuer einen Restriktase-Spaltort enthaelt, vorgesehen sowie an dieses Ende der Oligonukleotide wechselweise ein Poly-G- bzw. ein Poly-C-Schwanz angeheftet wird. Nach erfolgter Hybridisierung (einschliesslich enzymatischer Auffuellung unter Einbeziehung des Klenow-Enzyms) und Klonierung in einem bakteriellen Wirts-Vektor-System, vorzugsweise einem E. coli-System, wird im zweiten Schritt des Verfahrens aus dem dann als Plasmid-Insert vorliegenden doppelstraengigen DNS-Rohduplex der hilfsweise eingefuegte G-C-Abschnitt eliminiert, und abschliessend wird die hierbei gewonnene liniearisierte Plasmid-DNS, gegebenenfalls nach Einsatz des Enzyms S1-Nuklease, durch einen Ligationsschritt wieder zirkularisiert, wobei der DNS-Block in seinem gewuenschten Design erhalten wird. In einem Ausfuehrungsbeispiel wird die Zweckmaessigkeit der Erfindung fuer den Fall der Herstellung eines etwa 120 bp langen DNS-Blockes demonstriert.

Description

-2 26B427

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung von synthetischen DNS-Blöcken größerer Länge, wie sie in Gentechniklabors in zunehmendem Maße benötigt werden.

Das Anwendungsgebie t der Erfindung liegt in der genteclinologischon Forschung und Entwicklung sowie nachgelagert damit in jenen Bereichen der biotechnologischen Industrie, die gontechnisch modifizierte Mikroorganismen bzw. Zellinien zur Produktgewinnung einsetzen.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Als ein Hauptverfahren zur Bereitstellung von funktionellen DNS-Sequenzen hat sich in Gentechniklabors die Gensynthese aus mehreren doppelaträngigen DNS-Blöcken, die ihrerseits aus entsprechend komplementären Oliyonukleotiden aufgebaut werden, etabliert. Für die Herstellung solcher synthetischer DNS-Blöcke ist seit Ende der 6Oor Jahre die nunmehr bereits klassische KHORANA-Methode bekannt (N. K. GUPTA et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 60,1968,1338-1344; H. G. KHORANA et al., J. Molec. Biol.. vol. Ti, 1972,209-217).

In diesem frühesten Syntheseverfahren für D' . Blöcke werden kurze Oligonukleotidu, deren Länge im Normalfall 12 bis 40 Nukleotide beträgt, an ihrem 5'-Ende durch eine Polynukleotidkinase-Reaktion phosphoryliert und durch ein Temperatur-Regime hybridisiert (sog. „Annealing"). Der Überlappungsbereich von komplementären Oligonukleotiden umfaßt dabei etwa 9 bis 10 NuV leotide. Durch die hohe Anfangstemperatur heim Annealing (etwa 90C) wird die Entstehung von Mißhybridisierungen zwischen nicht oder nur partiell komplementären Oligonukleotiden weitgehend unterdrückt. Durch das Annealing entsteht Jn partieller DNS Duplex mit sog. „Nicks", da die Oligonukleotide innerhalb eines Stranges noch nicht miteinander verknüpft sind. Das Schließen der Nicks erfolgt auf enzymatischem Woge in einer nachfolgenden l.igationsreaktion unter Zusatz von T4-DNS-Li(jnse. Der im KOHRANA-Verfahren entstehende doppelsträngige DNS-Block wird nach seiner Reinigung, ι. B. über Polyacrylamid- Elektrophorese, in geeigneten Vektoren Moniert. Da bei dieser Methode nur kurze Oligonukleotide eingesetzt werden, ist ihre Anwendung mit dem Nachteil verbunden, daß fOr die Synthese einer funktionellen DNS-Sequenz eine vergleichsweise große Anzahl von Ausgangs-Oligonukleotiden bereitzustellen ist.

Nach Verfügbarwerden von DNS-Synthase-Automaten fand eine modifizierte Version der KHORANA-Methode Eingang in die Labortechnik, bei der Oligonukleotide mit einer Länge von 30 bis 50 Nuklm ^liden eingesetzt werden. Das Prinzip dieser Modifikation bestoht darin, zwei jeweils komplementäre Oligonukleotide mit i'nem viel größeren Überlappungsbereich sooarat zu hybridisieren. Der doppelsträngige C\S-Block wild anschließend aus mehreren kurzen doppolsträngigen Teilblöcken zusammengesetzt, und diese werden wiederum unter Zuhilfenahme von T4· DNS-Ligase zu der jeweils angestrebten funktionellen DNS-Sequenz miteinander verknüoft.

Dar generelle Nachteil des KHORANA-Verfahrens einschließlich der modifizierten Variante besteht darin, daß der aufzubauende DNS-Block, da er voll synthetisiert werden muß, in hohem Maße Oligonukleotid-Synthesekopazität ir'ndet. Seit 1982 ist weiter eine von ITAKURA erarbeitete Methode zum Verknüpfen synthetischer Oligonukleotide bekennt (K. ITAKURA, Trends Biochem. Sei., vol. 7,1982,442-445). Dieses Verfuhren setzt ebenfalls die Verfügbarkeit eines Synthese-Automaten voraus. Im Unterschied zur KHORANA-Mothode, bei der die gesamte Sequenz eines DNS-Doppelblockes synthetisier; werden muß, wird beim ITAKURA-Veriahren diese Sequenz nu' noch partiell synthetisiert, und die verbleibenden Lücken („Gaps") werden anschließend enzymatisch aufgefüllt.

Dio iTAKUKA-Methode ist inzwischen in 2 Varianten entwickelt worden. Bei der ersten Variante werden mehrere Oligonukleotide analog zum KHORANA-Vorfahren phosphoryiiert und einem Annealing unterzogen, in dessen Verlauf ein partieller DNS-Block (Duplex) mit dazwischenliegenden Einzelstra">g-Abschnitten entsteht. Durch eine Reaktion mit dem Klenow-Enzym, d.h. mit einer Untereinheit der DNS-Polymerase I, wolche eine templete-abhängige 5'-3'-Polymerasefunktion aufweist, sowie unter Zusatz von Nukleotiden worden die Gaps dann geschlossen, Der entstandene vollständige DNS-Duplex wird abschließend noch mit Restriktusan geschnitten, um geeignete überhängende Block-Enden zum Inserieren in jeweils ausgewählte Klonierungavektoren zu schaffen.

In dei zweiten Variante der ITAKURA-Methode werden lediglich 2 hinreichend lange Oligonukleotide herangezogen, wobei beide Oligonukleotide am 3'-Ende oinen Überlappungsbereich aufweisen müssen. Nach einer Annealing-Reaktion, bei der die beiden Oligonukleotide am 3'-Ende miteinander hybridisieren, werden die beiden einzelsträngiyen Abschnitte durch die template-gerichtete Polymerasefunktion des Klenow-Enzyms aufgefüllt. Ein Nachscnneirlen des entstandenen DNS-Duplexes mit Restriktasen ist ijleichfalls erforderlich.

Der Nachteil beider Varianten des ITAKURA-Verfahrens besteht darin, daß durch Mißhybridisierungon im Überlappungsbereich der Oligonukleotide relativ viele Sequenz-Fehler entstehen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung vorfolgt das Ziel, synthetische DNS-Blöcke größerer Länge auf effektivere Weise zur Verfugung zu stellen.

Darlegung de· Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes, einfach handhabbares Verfahren zu beschreiben, mit dom in wenigen enzymatischen Schritten bereitgestellte Oligonukleotide unter Vermeid < on Hybridisierungsfehlern zu synthetischen Blöcken größerer Länge zusammengefügt werden können.

Eriinu· ngsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug wie folgt gelöst:

Auf dem Synthese-Automaten werden pro herzustellendem doppelsträngigern DNS-Block zunächst zwei hinreichend lange Ofigonukleotide (Oligonukleoti ie A und B; letzteres für den Gegenstrang des Blockes) bereitgestellt. Diese Oligonukleotido A, B

tragen in ihrer Nukleotidsequenz (vom 5'-Ende her gesehen) das im Hinblick auf die jeweils zu erzeugende Gosamt-ONS gewünschte Design; am 3'Ende jedoch weisen sie in Leserichtung einen vorläufigen Hilfsbereich auf, der wenigstens die Erkennungssequenz für den Spaltort einer Restrikiase X bzw. eines Paares zueinander kompatibler Restriktasen X1, X2 enthalt. An dieses Ende beider Oligonukleotide wird in Verfahrensschritt I auf enzymatischem Wege wechselweise ein PoIy-G- '>zw. Poly-C-Schwanz angeheftet bzw. durch den DNS-Syntheseauiomaien ansynthetisiert.

Der nach Hybridisierung sowie enzymatischor Auffüllung erhaltene doppelsträngige Roh-DNS-Block wird anschließend in einem bakteriellen Wirts-Vektcr-System kloniert, und, eingebettet in die rekombinanto Vektor-DNS, wird aus dem Roh-DNS-Block dann der hilfsweise eingefügte G-C-Abschnitt mit Hilfe dor Restriktase(n) bzw. X1, X 2 entfernt (Verfahrensschritt II). Nach diesem Abschnitt des Gesamtverfahrens befinden sich d>e Stücke des herzustellenden DNS-Blockes an den Enden der linearisierten Vektor-DNS. Durch abschließende Zirkularisierung dieser rekombinanten Voktor-DNS (Ligationsschritt) werden hiernach die vorliegenden Blockstücke, gegebenenfalls nach Einsatz des Enzyms S1 -Nuklease, zum synthetischen DNS-Block in seiner endgültigen Struktur zusammengefügt (Verfahrensschritt IM).

Dieser Grundzug wird in Schritt I des Verfahrens nun dahingehend weiter ausgestaltet, da3 Oligonukleotide A, B mit je einem Hilfsbereich arn 3'Endti bereitgestellt werden, der in Leserichtung die Struktur

— Erkennungssequon/ für Restriktase-Spältort X bzw. X1 oder X2 (Komponente 1) und

— Verlängerungsstück, enthaltend zwei G- bzw. C-Nukleotido, (Komponente 2) besitzt.

Als vorteilhaft erweist es sich in diesem Zusammenhang, im Hilfsbereich des Oligonukleotids A bzw. B als Komponente 1 die Erkennungssequenz füi einen im Block-Design sowie im herangezogenen Klonierungsvektor unikalen Restriktase-Spaltort, vorzugsweise für einen unikalen Spaltort mit überhängenden Enden, aufzubauen. Insbesondere wird in diesem Teilschritt im Hilfsberreich der beider Oligonukleotide eine unikale Spaltstelle für eine der in der nachstehenden Gruppe E

(Accl, BamHI Bell, BgIII, CIaI, Sail, Xbal, Xhol) genannten Rostriktasen geschaffen.

Erfindungswesontlich ist in diesem Zusammenhang, in den Oligonukleotiden A und B eine entsprechend unikalo Spaltstelle für jeweils dieselbe oder für 2 zueinander kompatible unikale Restriktase(n) anzulegen. Die bevorzugt genutzten Grupp E-Rest'iktasen lassen es auch zu, in den zwei Oligonukleotiden beispielsweise eine unikale Spaltstolle für folgernde zueinander kompatible Restriktase Paare zu generieren:

BamHI —BgIII, Bell —BgIII

BamHI —Bell oder Sail —Xhol.

Die Bildung einer entsprechenden zeitweiligen Restriktase-Spaltstelle kann bei jedem b iliebigen AT-, TA-, GC- oder CG-Dinukleot'd, welches am 3'Ende der bereitzustellenden Oligonukleotide vorkommt, eingeleitet werden. Beispielsweise läßt sich in dem Dinukleotid GC (urch Einfügen d , Tetranukleotids GATC eine Spaltstelle für die Restriktase BamHI aufbauen. Kommt in der zu erzeugenden funktioneilen Gesamt-DNS ,. natürlicherweise" eine entsprechend unikale Restriktase-Spp'¹ stelle X vor, werden die bere [zustellenden Oligonukleotide A, B zweckmäßigerweiso so gewählt, daß diese Spaltstello an den Anfang des am T-F.ndo jeweils anzurichtenden Hilfsbereichs zu liegen kommt.

Bei der Synthese dos Verlängerungsstückes im Hilfsbr reich eines jeden Oligonukleotids ist verfahrensgemäß weiterhin folgende Relation einzuhalten: Werden am 3'-Ende des Α-Stranges die beiden Nukleotido -G-G ansynthetisiert, so sind am 3'-Ende des B-Genenstranges die boiden Nukleotide-C-C anzufügen und umgekehrt.

Mit der Anfügung des Ve.'ängerungssuickes wird in dor vorliegenden Methode In Verbindung mildern inschließenden Verfahrensschritt auf günstige Weise jener Störeinfluß eliminiert, de, davon ausgeht, daß es bei der Synthese langer Oligonukleotide un.nöölich ist, das gewünschte Einzelstrangelemen·. (der Länge N) kon.plett von seinen Synthese-Vorstufen (dor Längen N-1 und N-2) abzutrennen.

Wie im Resume zu Verfnhrensschritt I somit festzuhalten ist, werden durch die Oligonukleotidsynthese verfahrensgemäß zwei Einzelstrangelemente geliefert, die — abgesehen von den angehefteten minimalen sog. Verlängerungsstücken — noch keinen Üborlappungsbereich aufweisen.

In Fortführung von Verfahrensschritt I wird in der weiteren Ausgestaltung der Erfindung an das 3'Ende der beiden so vorbereiteten Oligcnukleotide mit Hilfe des Enzyms Terminale Transferase unter Zusatz von dGTP bzw. von dCTP zum jeweils schon bereitgestellten Verlängerungsstück ein PoIy-G- bzw. Poly-C-Schwanz mit einer Länge von jeweils mindestens 8 bis 10 Nukleotiden angehängt (Tailing). Auf diese Weise wird im vorliegenden Verfahren der Überlappungsbereich für die anschließende Hybridisierung beider Oligonukleotide zu einem partiellen DNS-Duplex geschaffen.

Verfügt das Oligonukleotid A nach dom anfänglichen Teilschritt an seinem 3'Ende etwa über ein Verlängerungsstück -G-G (und ·· das Oligonukleotid B somit über ein Verlängerungsstück -C-C), so wird ihm rr.-neis Torminaler Transferase unter dGTP-Zusatz also ein Poiy-G-Schwanz (und dem Oligonukleotid B für den Gegenstrang unter ilCTP-Zusatz entsprechend ein Poly-C-Schwanz) angeheftet. Im allgemeinen sind durch orientierende Vorversuche hierbei jenu Verfahrensbedingungen hinsichtlich Enzymzugabe, Nu. leotidkonzentration und Reaktionszeit zu ermitteln, welche die Anfügung eines 8 bis 10 Nuklootide langen Schwonztoilos gewährleisten.

Nach der Transfernse-Reaktion werden die boiden so komplettierten Oligonukleotide in an sich bekannter Weise einem Temperatur-Rogime unterworfen, welches zu ihrei Haybridisierung r.vischen PoIy-G- und Poly-C-Ende führt (Verfahrensschritt II, Annealing). Für den in diesem Schritt entstehenden partiellen DNS-Block (C'iplox) mit langen Einzelstrang Abschnitten am 5'- und am 3' Ende ist ein Hybridisigrungsbereich größerer Stabilität kennzeichnend, denn dieser Bereich besteht verfuhrensgemäß ausschließlich aus G-C-Paaren, zwischen der on pro f Jukleotid- bzw. Basenpaar bekanntlich jeweils 3 Wasserstoff-Brückenbindungen gebildet worden.

Anschließend werden (weiterhin Verfahronsschritt II) die einzelsträngigon Abschnitte dieses partiellen DNS-Duplexes unter Einbozug dos Klenov-Enzyms in an sich bekannter Weise enzyma'isch aufgefüllt (Schließung der Gaps), und es entsteht ein vollständiger doppelsträngiger Roh-DNS-Block, der nach Schneiden en den Blockenden mit einer bzw. zwei Restriktase(n) mittels

Ligation unverzüglich in jeweils einen ausgewählten oakteriellen Klonierungsvektor, vorzugsweise in einen Polylinker-tragenden Klonierungsvektor, inseriert wird. Für das Schneiden an den Duplexenden wc'den zweckmäßig solche Restriktasen herangezogen, für die einerseits im Innern des jeweilis konstruierten doppelrrträngigen Blockes keine weiteren Restriktionsorte bestehen und für die der ausgewählte Vektor andererseits eine singuläre Spulstelle bzw. — etwa i ι einem Polylinker-Bereich — auch zwei singuläre Spaltstellen besitzt, d. h. es werden hier (X bzw. X1, X2)-fremde Restriktasen verwendet.

Als bakterielle KId lierungswirte werden in diesem Schritt des Gesamtverfahrens vorzugsweise E. coli-Vektoren der pBR-Famiiie, so pBR322, o-"er d.τ oUC-Familie, so pUC18 bzw. pUC19, eingesetzt, und die Klonierung wird in E. coli-Rezipienten wie Stamm HB101, Stamm JM101 bzw. Stamm TG1 durchgeführt.

Nach erfolgter Klonierung wird aus dem nunmehr in der rekombinanten Voktor-DNS enthaltenden Roh-DNS-Block der hilfsweise eingefügte G-C-Abschnitt entfernt. Dazu wird in der weiteren Ausgestaltung des vorliegenden Verfahrens innerholb des rekombinanten Vektors der Block an seinen beiden zeitweiligen inneren Restriktionsorten (vgl. Verfahrensschritt I) mit der bzw. mit den entsprechenden unikalen Gruppe E-Restriktcsen X bzw. X1, X 2 aufgeschnitten und der G-C-Bereich abgetrennt.

Anschließend werden die üborhängenden Enden dieser Restriktionsspaltstellen unter Einsatz des Enzyms S.1-Nukleaie abverdaut. An den entstandenen glatten Enden wird die rekombinante Vektor-DNS dann wiederum zirkularisiert (ü(iationsschritt), wobei gleichzeitig der synthetische DNS-Block zu seiner endgültigen Struktur, d. h. zu dem in Hinblick auf die jeweils zu erzeugende funktioneile Gesamt-DNS gewünschten Design, zusammengefügt wird (Vorfahrensschritt III).

Konnte in Verfahrensschritt I bei der Einfügung des Hilfsbereiches in die Oligonuktootide A, B auf einen „natürlicherweise" im Block-Design vorkommenden unikalen Restriktase-Spaltort zurückgegriffen werden, so entfällt in Schritt III die S1 -Nuklease-Renktion.

Vorteile der Erfindung

Ein erster Vorteil, den die Erfindung im Vergleich zu den bekannten technischen Lösungen aufweist, wird darin gesehen, daß die Synthese-Leistung für bereitzustellende Oligonukleotide weiter reduziert wird.

Darüber hinaus wird durch das Herausschneiden des Überlappungsbereiches, d. h. des G-C-Hilfsabschnittes, eine wesentliche Quelle für das Entstehen von Sequenzfehlern in synthetischen DNS-Blöcken beseitigt.

Weiterhin wird im vorliegenden Verfahren, wie im Zusammenhang mit der Darstellung von Schritt I bereits erwähnt, je ~τ Störeinfluß ausgeschaltet, der sonst von der Schwierigkeit ausgeht, in langen Oligonukleotiden eii: Einzolstrangelemeru , Jer Länge N) von seinen Synthese-Vorstufen (der Längen N-1 und N-2) abzutrennen.

Ausführungsbeispiel

Funktionsweise und -fähigkeit des beschriebenen Verfahrens werden nachstehend >m Zusammenhang mit der Herstellung des DNS-Blockes

Xbal Hindill

5'-TCT AGA CTT ATG ATT AAA AGA AGC ITA TTA TTT TTA ACT GTT TTA· 3'-AGA TCT GAA TAC TAA TTT TCT TCG AAT AAT AAA AAT TGA CAA AAT

CIaI

TTG TTA TTA TTC TCA TTT TCA TCG ATT ACT AAT GAG GTA AGT AAC AAT AAT AAG AG T AAA AGT AGC TAA TGA TTA CTC CAT TCA

GCG TCG AC-3' CGCAGCTG-5'

näher ausgeführt bzw. belegt.

Die zwei zur Herstellung dieses DNS-Blockes benötigten Oligonukleotide wiesen dabei das folgende Design auf: An der mit * gekennzeichneten Stelle wurde der Hilfsbereich eingeführt, und zwar über einen unikalen zeitweiligen Bglll-Spaltort. Aus klonierungstechnischen Gründen wurde vor dem Xbal-Spaltort iin zusätz'icher EcoRI-Spaltort eingebaut.

Die bereitgestellten synthetisierten Oligonukleotide hatten also folgendes Aussehen:

EcoRI Xbal Hindlll

A: B'-TTTTTGAAnCTCTAGACTTATGATTAAAAGAAGCTTATTATTTTTAACTGTTTT

BgIII AGATCTGG-3'

Sail B: 5'-CTGGACGTCGACGCACTTACCTCATTAGTAATCGATGAAAATGAGAATAATAACa

BgIII AGATCTCC-3'

Die verfahrensgemiiße weitere Verarbeitung dieser Oligonuklootid erfolgte nach folgendem Ablauf:

1. Anfügen de· Poly-dG- bzw. Poly-dC-Schwanze»

0,3 OD des Oligonukleotides A wurde' mit Poly(dG) geschwänzelt, eine entsprechende Meng» des Oügonukieotids B mit Poly(dC). Die Reaktion wurde in 25μΙ Roaktioiisvolumen in folgendem Puffer durchgeführt

120mMNa'-Kakodylat 0,1 mM Dithiotreitol 10 MCi Ia-³²PIdGTP bzw. [a-³²P]dCTP SOOpg/ml Rinderserumalbumin 1 mM CoCI₂ Die Reaktion wurde initiiert durch das Hinzufügen von terminaler Transferase (22 U/pmol von 3'-Enden). Die Reaktion wurde bei 37⁰C für 20min durchgeführt. Vorversuche hatten gezeigt, daß unter diesen Bedingungen pro Ende etwa 10-15 dG- bzw. dC-Reste angefügt werden.

Die Proben wurden nach (er reaktion einmcl mit Phenol/Chloroform (gleiches Volumen) und zweimal mit Ether extrahiert und anschließend durch Hiiizjfügon von Vu V 3M-Na-Aceiat, 10pg tRNS und 2 V Ethanol gofällt.

2. Hybridisierung

Die vereinigten Proben wurden auf 90°C erhitzt und anschließend erfolgte ein langsames (etwa 3h) Abkühlen auf 30⁰C. Nach orfolgter Precipitation und Zsntrifugation wurden die Proben in jeweils 10gl ii0mMTris-HCI,pH7,2 1OmMMgCI₂ 0,1 mM DTE gelöst und anschließend vereinigt.

3. Klenow-Reaktlon

Die Proben wurden anschließend mit 3μ110 χ Klenow-Puffer (0,BM Tris-HCI, pH 7,2,0,1 M MgCI₂,1 mM DTE) sowie 2,5μΙ 250ng/ml Rinderserumalbumin 2,5pl4mMdATP 2,5MUmMdTTP 2,5MUmMdGTP 2,5MUmMdCTP 11,5MlHiO

aufgefüllt und mit 10U Klenow-Enzym versetzt. Die Reaktion wurde bei 30°C für 30 min durchgeführt und durch ein lOminütiges Inkubieren bei 7O⁰C abgostoppt. Anschließend wurde der aufgefüllte synthetische Roh DNS-Block umgefällt.

4. Nachspalton der Enden mit Restriktasen

Das erhaltene DNS-Pellet wurde in 8mI5x high-Puffer 28 M< aqua bidest.

2mIEcoRI(20U) ?plSall (20U) gelöst und für 2h bei 37°C inkubiert. Der 5 χ high-Puffer besteht aus 50OmM NaCI 25OmM Tris-HCI, pH 7,6 5OmMMgO₂ 5mMDTE

Danach wurde die Reaktion einmal mit Phenol und einmal mit Chloroform extrahiert und umgefällt. Das Pellet wurde in 20 μΙ 1OmM Tris-HCI, pH7,6,1 mM EDTA aufgenommen.

5. Ligation in pBR322

10μΙ des synthetischen Roh-DNS-Blocks wurden mit ?Mg gespaltenem Vektor pBR322 (EcoRI-S'ail-gespalten und über Agarose-Elektrophorese gereinigt) versetzt und ligiert. Die Ligation wurde in SOmM Tris-HCI, pH 7,6 1OmM MgCI₂ 5mMDTE

1 mM ATP 10UT4-Ligase über Nacht bei *4 'C durchgeführt. Anschließend wurde die Reaktion durch lOminütiges Erhitzen auf 70T gestoppt.

β. Transformation in E. coll HB101 Dio Transformation des Ligationsyemisches erfolgte nach einer Standardmethode (CaCI₂, Hitzeschock) in <ism E. coli-Stamm HBI01. Die Transformanten wurden zunächst auf Ampicilün-Resistenz (40My Ap/ml) selektiert und anschließend auf Tetrazyklin-Sensivität (12,5 Mg Tot/ml) überprüft. Alle tctrazyklin-selek*iven Kolonien wurden weiter untersucht. A'js ihm η wurden die Plasmide isoliert: und auf unikale Restriktionsorte, die normalerweise in pBR322 nicht vorhanden sind, getestet (Xbal, BgIII, CIaI).

Die Plasmid-DNS eines Klones, der über die 3 zusätzlichen OrIe vo "igte, wurde sequenziert, wobei gezeigt we'den konnte, daß die gewünschte Sequenz des o. a. DNS-Blockes fehlerfrei vorlieg

7. Entfernung des Hilfebereichs

2Mg der DNS des o. a. pBR322-Derivals wurden in 5OmMNaCI 10mMTris-HCI,pH7,5 1OmMMgCI₂

1 mM DTE

mit 10 U RgIM für 2 h bei 37⁰C inkubiert und nach Kontrolle der Spaltung einmal mit Phenol und einmal mit Chloroform extrahiert. Nach erf> Igtor Ethanol-Präzipitation wurdo das Pellet in 50μΙ S 1-Nuklease-Puffer:

0,2MNiCI 5OmM N triumacetat, pH 4,5

1mM2r.SO₄

0,5% Glycerol

gelöst und mit ÖL) S 1-Nukleaso für 30min bei 37⁰C inkubiert. Nach erfolgter Reaktion wurde diese wiederum durch eine einmalige Phenol-Extraktion und eine anschließende Chloroform-Extraktion abgestoppt. Danach wurde die DNS umgefällt. Die DNS wurde daran anschließend in 20μΙ 50mMTris-HCI,pH7,6 1OmMDTE

I mM ATP

gelöst und mit 10U T4-Ligase versetzt. Die Ligation erfolgte wiederum über Nacht bei 14°C. Transformiert wurde anschließend wiederum in den E. coli-Stamrrv HB101.

Unter den erhaltenen Triinsformanten konnten in jedem Versuchsansatz solche aufgefunden werden, deren plasmidische DNS keinon Bglll-Spaltort mehr aufwies. Durch einfache Xbal-Sall-Restriktionsspaltiing konnte aus dieser DNS der o. a. DNS-Block in der benötigten Men /β isoliert werden.

Claims (10)

1. Patentansprüche:

   1. Verfahren zur Herstellung von synthetischen DNS-Blöcken unter Rückgriff auf je 2 Oligonukleotide pro Block (Oligonukleoatide A, B; letzteres für den Gegenstrang des Blockes), die in ihrer

   * Nukleotidsequenz das in Hinblick auf die jeweils zu erzeugende funktioneile Gesamt-DNS

   gewünschte Design tragen, gekennzeichnet dadurch, daß man

   — Oligonukleotide A, B mit je einem Hilfsbereich am 3'-Ende bereitstellt, der wenigstens die Erkennungssequenz für den Spaltort einer Restriktase X bzw. einos Paares zueinander kompatibiler Restriktasen X1, X2 enthält, sowie an dieses Ende der Oligonukleotide auf enzymatischem Wege wechselweise einen PoIy-G- bzw. Polyc-C-Schwanz anheftet (Schritt I),

   — den nach Hybridisierung sowie enzymatischer Auffüllung erhaltenen doppelsträngigen Roh-DNS-Block in einem bakteriellen Wirts-Vektor-System Moniert sowie nunmehr aus der rekombinanten Vektor-DNS den hilfweise eingefügten G-C-Abschnitt mit Hilfe der Rostriktase(n) X bzw. X1, X 2 entfernt (Schritt II) und

   — hiernach die vorliegenden Blockstücke, gegebenenfalls nach Einsatz des Enzyms S1 -Nuklease, durch abschließende Zirkularisierung der Vektor-DNS zum synthetischen DNS-Block in seiner endgültigen Struktur zusammenfügt (Schritt III).
2. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dvdurch, daß man in Schritt I Oligonukleotide A, B mit J9 einem Hilfabereich bereitstellt, der in Lese¹ richtung die Struktur

   — Erkennungssequenz für Restriktaso-Spaltort X bzw. X1 oder X2 und

   — Verlängerungsstück, enthaltend zwei G- bzw. C-Nukleotide, aufweist.
3. 3. Verfahren gemäß Anspruch 2, gekennzeichnet daduro i, daß man im Hilfsbereich des Oligonukleotids A bzw. B die Erkennungssequenz für einen im Block-Design unikalen Restriktase-Spaltort aufbaut.
4. 4. Verfahren gemäß Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß man im Hilfsbereich des Oligonukleotids A bzw. B die Erkennungssequenz für einen unikalen Spaltort einer Restriktase mit überhängenden Enden aufbaut.
5. 5. Verfahren gemäß Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß man im Hilfsbereich des Oligonukleotids A bzw. B die Erkennungssequer.z fü ainen unikalen Spaltort einer Restriktase aus der'Gruppo (Acd, BomHI, Bell, BgIII, CIuI, Sail, Xbal, Xhol) aufbaut (Gruppe E-Restriktasen).
6. 6. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß man Oligonukleotide A, B bereitstellt, deren Hilfsbereich an den Beginn der Erkennungssquenz für einen im Block-Design natürlicherweise vorkommenden Restriktase-Spaltort X gelegt ist.
7. 7. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt I mit Terminaler Transferase unter Zusatz von dGTP bzw. von dCTP konform zum jeweiligen Verlängerungsstück an das Olinukleotid A bzw. B einen PoIy-G- bzw. Poly-C-Schwanz von 8 bis 10 Nukleotiden Länge anhängt.
8. 8. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt Il

   — den vollständigen doppelsträngigen Roh-DNS-Block durch Schneiden mit einer bzw. mit zwei X- bzw. X1, X2-fremden Restrikasen für die Insertion in einen bakteriellen Klonierungsvektor vorbereitet,

   — als Klonierungsvektor ein E. coli-Plasmid der pBR-Familie bzw. ein PolyliM<er-tragendes E. coli-Plafimid der pUC-f-amilie verwendet sowie

   — dieKlonierung in E. coli-Rezipienten wie Stamm HB101, Stamm JM101 bzw. Stamm "Io 1 durchführt.
9. 9. Verfahren gemäß Anspruch 8, gekennzeichnet dadurch, daß man in Schritt Il Plasmid pBR3.?2 oder Plasmid pUC18 bzw. Plasmit pUC19 als Klonierungsvektor verwendet.
10. 10. Verfahren gemäß Anspruch 1,2 und 6, gekennzeichnet dadurch, daß in Schritt III die S1 -Nuklease-Reaktion entfr'H, wenn man bei der Einfügung des Hilfsbereichcs in die Oligonukleotide A, B auf einen im Block-Design natürlicherweise vorkommenden Restriktase-Spaltort zurückgreifen kann.