DE3431023A1 - Promotor - Google Patents
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Description
Promotor
Die Erfindung betrifft einen Promotor, der zur Darstellung der Funktion eines Strukturgens als die eine
Hälfte oder Seite eines DNA-Gens teilnimmt. Insbesondere betrifft die Erfindung einen von einer Pflanze abstammenden
Promotor.
Ein Promotor bildet eine Seite oder Stelle einer DNA, bei der eine RNA-Polymerase in dieser Lage eine
Transkription beginnt, wobei das Vorkommen dieser Seite oder Stelle zur Darstellung eines Strukturgens in einem
Operon unentbehrlich ist, zu dem es gehört.
Analysen von Genen sind hauptsächlich an Prokaryonorganismen
oder Prokaryonten, z.B. an Bakterien oder Phagen, bevorzugt an Bakterien, insbesondere an Escherichia coli,
durchgeführt worden. Daher sind vorwiegend Promotoren von Prokaryonten untersucht worden, wobei bereits viele Promotoren,
z.B. von Iac (Lactose-Operon von E. coli), trp
(Tryptophan-Operon von E. coli) und von ara (Arabinose-Operon
von E. coli) bekannt sind.
Es wird allgemein angenommen, daß ein Promotor einer eukaryontischen Zelle nicht in einer prokaryontischen Zelle
reagiert. Wenn daher ein Prokaryont als Gast bei einer Transformation oder einem ähnlichen Vorgang benutzt wird,
ist es erforderlich, einen Promotor eines Prokaryonten, z.B. einen solchen eines Bakteriums oder Phagen, zu benutzen.
Im Gegensatz zu diesem allgemeinen Wissen ist bei den Untersuchungen der vorliegenden Erfindung schon festgestellt
worden, daß eine Fraktion (Fragment) mit einer Größe von etwa 5,1 kbp unter den durch Digestion mit
Eco RI erhaltenen Fraktionen einer Chloroplast-DNA von
Marchantia polymorpha L. als ein Eukaryont wie ein Promotor in E. coli reagiert, die ein Prokaryont ist
(8th Symposium of Tissue Culture of Plants). Der Ausdruck "Fraktion" wird hier mit dem Begriff "Fragment" austauschbar
verwendet.
Die Intensität des Promotors, das heißt die Häufigkeit der Transkription bei der Bildung einer RNA von
einer DNA oder die Aktivität des Promotors, variiert mit der Art des Promotors, und wenn die DNA mit einem Promotor
als ein Organismus (vector) für ein Molekularauswaschen (molecular bleeding) benutzt wird, ist ein Promotor mit
einer höheren Aktivität vorteilhaft. Überdies wird es, wenn ein Passagier als eine exogene DNA dem Organismus
zugesetzt wird, vorgezogen, daß die Größe des Promotors klein ist. Dementsprechend kann eine DNA mit einem Promotor von kleiner Größe leicht benutzt und hantiert werden,
so daß die Entwicklung eines neuen Promotors stets erstrebenswert ist.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, diesem Verlangen nach Entwicklung eines Promotors Rechnung
zu tragen.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des kennzeichnenden Teils des Anspruchs 1 gelöst.
Gemäß der Erfindung soll insbesondere ein Promotor mit einer DNA vorgeschlagen werden, die die gleiche
Basensequenz wie ein DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 1,1 kbp hat, wobei der Promotor durch Digestion eines
Restriktionsenzyms Bam HI einer DNA-Fraktion gewonnen
wird, die alle Teile eines 16SrRNA-Gens und einen Teil
eines 23SrRNA-Gens hat, wobei die DNA-Fraktion durch Digestion eines Restriktionsenzyms Eco RI einer Chloroplast-DNA
von Marchantia polymorpha L. erhalten wird.
Der Promotor der Erfindung tritt, wie bei üblichen Promotoren, an der einen Seite von DNA auf, wobei die Erfindung
ein Beispiel einer solchen DNA liefert.
Insbesondere enthält die Hybrid-DNA der Erfindung eine Fraktion (A), und zwar einen Promotor mit einer DNA,
die die gleiche Basensequenz wie diejenige einer DNA-Fraktion mit einer Größe von etwa 1,1 kbp hat, welcher
durch Digestion mit einem Restriktionsenzym Bam HI einer DNA-Fraktion gewonnen wird, die alle Teile eines 16SrRNA-Gens
und einen Teil eines 23SrRNA-Gens aufweist, wobei die DNA-Fraktion durch Digestion eines Restriktionsenzyms
Eco RI einer Chloroplast-DNA von Marchantia polymorpha L.
erhalten wird; und eine Fraktion (B) mit einer DNA, die die gleiche Basensequenz wie diejenige von einem Prokaryonten
gebildete DNA hat.
Die Erfindung sieht ferner ein Ausführungsbeispiel eines Organismus vor, bei dem der zuvor genannte Promotor
die eine Seite davon einnimmt. Der erfindungsgemäße Organismus weist eine Hybrid-DNA auf, die die zuvor genannten
Fraktionen (A) und (B) enthält.
Wie aus dem folgenden Ausführungsbeispiel hervorgeht, hat der Promotor der Erfindung eine hohe Aktivität.
Insbesondere weist der erfindungsgemäße Promotor mit etwa 1 ,1 kbp eine höhere Aktivität als der Vorläuferpromotor
mit einer Größe von 5,1 kbp auf. Der Promotor der Erfindung entspricht einem Restanteil nach Entfernen von etwa 4/5
des vom Vorläuferpromotor gelieferten Aufstromanteils, so
daß nicht zu erwarten ist, daß die Aktivität des Promotors durch diese Behandlung verbessert wird.
Da der Promotor der Erfindung eine hohe Aktivität und eine Größe von etwa 1,1 kfcp hat, kann es vorteilhaft
sein, den Promotor in Form eines Organismus zum Einführen eines exogenen Gens in eine prokaryontische Zelle (beispielsweise
in eine solche von E. coli) oder in eine Pflanzenzelle (beispielsweise in eine eines Protoplasten
von Marchantia polymorpha L.) zu benutzen und mittels Molekularauswaschung des exogonen Gens zu offenbaren.
Ein Beispiel der Hybrid-DNA der Erfindung ist Plasmid pMP9O4, das durch Einsetzen dieses Promotors DNA
in pMC14O3 gebildet ist, das heißt ein von E. coli abgeleitetes
Plasmid darstellt. Dieses Hybridplasmid weist jeweils ein Paar von drei Restriktionsenzym-Abspaltungsseiten
(Bam HI, Eco RI und Sma I) mit dem dazwischen
geschalteten Promotor der Erfindung einschließlich der endständigen Bam HI- und Eco RI-Abspaltungsseiten des
erfindungsgemäßen Promotors (Fig. 3) auf. Demgemäß kann ein Strukturgen leicht in das Hybridplasmid eingeführt
werden, wobei das Hybridplasmid leicht als ein Organismus benutzbar ist. überdies kann die Abspaltung des Promotors
der Erfindung von diesem Hybridplasmid und die Einführung des so erhaltenen Promotors in einen anderen Organismus
leicht durchgeführt werden.
Weitere Merkmale, Vorteile und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von
bevorzugten Ausführungsbeispielen sowie anhand der Zeichnung. Es zeigen:
F I G. 1 ein Restriktions-Abspaltungsdiagramm einer Chloroplast-DNA von Marchantia polyniorpha L., das die Lage
des Promotors der Erfindung auf dem Diagramm und in welchem ein rRNA-Pfeil die Lage und Richtung vom rRNA-Gen
anzeigt;
F I G. 2 ein Restriktions-Abspaltungsdiagramm vom Abschnitt in der Nähe der Basensequenz des erfindungsgemäßen
Promotors in der Chloroplast-DNA von Marchantia polymorpha L., welches die Positionen einer DNA-Fraktion
von 5,1 kbp und einer DNA-Fraktion von etwa 1,1 kbp gemäß der Erfindung veranschaulicht und
F I G. 3 ein Diagramm, das ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Promotors darstellt.
In Fig. 2 stellen K, Bg, E und B jeweils Abspaltungsseiten
von Restriktionsenzymen Kpn I, BgI II, Eco RI und Bam HI bzw. lac' Z, lac Y und Apr einen Promotor mit fehlendem ß-Galaktosidase-Gen, ein ß-Galaktosidpermease-Gen
und ein Ampicillinwiderstands-Gen dar.
Der Promotor der Erfindung weist eine DNA auf, die die gleiche Basenseguenz wie die einer DNA-|Fraktion mit
einer Größe von etwa 1,1 kbp hat, wobei der! Promotor durch
Abspaltung eines Restriktionsenzyms Bam HI einer DNA-Fraktion
gewonnen wird, die alle Teile eines 16SrRNA-Gens und einen Teil eines 23SrRNA-Gens ("Vorläuferpromotor")
enthält, wobei diese DNA-Fraktion durch Abspaltung von einem Restriktionsenzym Eco RI von Chloroplast-DNA
von Marchantia polymorpha L. erhalten wird, wobei es unnötig ist zu sagen, daß kbp ein idiomatischer Ausdruck
für 10 Basenpaare ist.
Das Restriktions-Abspaltungsdiagramm von Chloroplast-DNA von Marchantia polymorpha L. ist von den Erfindern
der vorliegenden Erfindung in der Zeitschrift
Mol. Gen. Genet., 189, 1-9, 1983, auf dem zuvor erwähnten
Symposium offenbart worden. Dieses Restriktions-Abspaltungsdiagramm ist in Fig. 1 gezeigt.
Der Vorläuferpromotor tritt in den Gebieten I und II in Fig.1 auf. Da diese Chloroplast-DNA zwei Sätze von
rRNA-Genen (16S und 23S) in entgegengesetzten Richtungen hat, gibt es dementprechend auch zwei Sätze des Vorläuferpromotors.
Die DNA in den Gebieten I und II der DNA von Marchantia polymorpha L. hat eine Promotoraktivität, über
die von den Erfindern in den zuvor genannten Zeitschriften berichtet worden ist.
Der erfindungsgemäße Promotor weist eine DNA auf, die die gleiche Basensequenz wie diejenige einer DNA-Fraktion
mit einer Größe von etwa 1,1 kbp hat, wobei der Promotor durch Abspaltung des Restriktionsenzyms Bam HI
vom Vorläuferpromotor (mit einer Größe von etwa 5,1 kbp) gewonnen wird. In der Erfindung und in den Ansprüchen betrifft
der Wortlaut "Promotor mit einer DNA, die die gleiche Basensequenz wie diejenige einer DNA-Fraktion mit
einer Größe von etwa 1,1 kbp hat" nicht nur einen Promotor, der von einer Chloroplast-DNA von Marchantia polymorpha L.
abgeleitet ist, sondern auch einen solchen, der durch die chemische Gesamtsynthese mit üblichen Verfahren für die
Synthese von Nucleinsäuren erhalten wird. Hierzu gehören auch die zwischen diesen beiden Extremen liegenden Promotoren,
die durch eine halbchemische Synthese/Semibiosynthese gewinnbar sind.
Der Promotor der Erfindung entspricht einer durch schraffierte Positionen in den Gebieten I und II gekennzeichneten
DNA in Fig. 1.
Fig. 2 ist eine vergrößerte Ansicht des Gebietes I in Fig. 1. Die Linie 1 mit den Symbolen K, E, Bg und B
zeigt einen Strang der Chloroplast-DNA von Marchantia
polymorpha L. an, der die Restriktions-Abspaltungsseiten von Restriktionsenzymen Kpn I, Eco RI, BgI II bzw. Bam HI
hat sowie ein 16SrRNA-Gen und ein 23SrRNA-Gen in Positionen darstellt, die durch die Linien 2 und 3 angegeben sind. Die
DNA-Fraktion (Linie 4), die durch Abspaltung von Eco RI dieser DNA (1) gewonnen wird, ist ein Vorläuferpromotor
mit einer Größe von etwa 5,1 kbp, der alle Teile eines 16SrRNA-Gens und einen Teil vom 23SrRNA-Gen enthält. Der
Promotor der Erfindung entspricht der Linie 5 und hat auf dem einen Ende die Restriktions-Abspaltungsseite von
Eco RI, die dem Vorläuferpromotor innewohnt, und auf dem anderen Ende die von Bam HI neu gebilde Restriktions-Abspaltungsseite.
15 Hybrid-DNA/Organismus
Da ein Promotor eine DNA-Fraktion ist, die an einer bestimmten Stelle einer Gen-DNA-Kette auftritt,
liegt der Promotor der Erfindung normalerweise auch in Form einer Hybrid-DNA mit einem Anteil jener DNA vor
und hat noch eine Fraktion einer anderen DNA. In diesem Falle sind die Beispiele der Fraktion der anderen DNA
Fraktionen der DNA, die von Bakterien, Viren, Pflanzenzellen, Mammalien und ähnlichen abgeleitet sind, wobei
die DNA-Fraktionen die gleiche Basensequenz wie diejenige
25 dieser DNA-Fraktionen haben.
Ein Beispiel dieser Hybrid-DNA weist (A) eine Fraktion des erfindungsgemäßen Promotors und (B) eine
Fraktion mit der gleichen Sequenz wie der DNA von einem Prokaryonten auf. Wie zuvor in Bezug auf den Promotor der
Erfindung beschrieben worden ist, betrifft der Wortlaut "DNA mit der gleichen Basensequenz wie die einer DNA
von einem Prokaryonten" nicht nur eine von jenem Organismus stammende DNA, sondern auch eine solche, die durch
eine chemische Gesamtsynthese erhalten wurde. Als ein
bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Hybrid-DNA dieses Typs kann eine DNA angeführt werden, in welcher mindestens
ein Teil der "von einem Prokaryonten stammenden DNA" wenigstens ein Plasmid von E. coli aufweist.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Hybrid-DNA mit den Fraktionen (A) und (B) ist ein Plasmid mit einer
Kreisstruktur. Ein Beispiel dieses Plasmids ist ein im einzelnen noch zu erläuterndes pMP9O4, das durch Einsetzen
in Plasmid pMC14O3 gebildet ist, welches wiederum von E. coli des erfindungsgemäßen Promotors sowie von der
aus mehreren Basen bestehenden, vom Plasmid stammenden DNA abgeleitet ist. Wie bereits ausgeführt wurde, enthält
Plasmid pMP9O4/ein Paar von jeder Abspaltungsseite
von drei Restriktionsenzymen (E, S und B) mit dem dazwischengeschalteten,
vorteilhaften Promotor der Erfindung.
Die Hybrid-DNA oder das Plasmid mit dem erfindungsgemäßen
Promotor kann als Organismus zum Einleiten einer exogenen DNA in eine geeignete Gastzelle
durch einen Rekombinanten mit einer darin eingesetzten exogenen DNA benutzt werden. In dem einen Beispiel
des Organismus ist die Fraktion nebem dem erfindungsgemäßen Promotor eine DNA mit der gleichen Basenseguenz
wie diejenige einer von einem Prokaryonten abgeleiteten DNA. Das heißt, daß der Organismus der Erfindung eine
Hybrid-DNA mit den zuvor erwähnten Anteilen (A) und (B) aufweist. Ein Beispiel des Organismus dieses Typs ist ein
Organismus, in welchem die von einem Prokaryonten stammende DNA mindestens einen Teil des Plasmids von
E. coli und/oder einen Organismus in der Form eines Plasmids
mit einer Kreisstruktur aufweist. Ein Beispiel dieses Plasmids ist die Substanz pMP9O4, die noch im einzelnen
zu erläutern ist.
E. coli K12 MC1O61 mit einem Plasmid pMP9O4 wurde
beim Fermentationsforschungsinstitut, Agentur für Industriewissenschaft und Technologie,mit der Nummer
FERM BP-562 hinterlegt.
Verwendung des erfindungsgemäßen Promotors
Der erfindungsgemäße Promotor hat eine den Promotoren innewohnende Verwendungsmöglichkeit, wie sie beim
Vorläuferpromotor oder anderen üblichen Promotoren gegeben ist.
Insbesondere wird eine Chimäre oder eine Rekombinant-DNA oder ein Plasmid, das durch Bindung eines Gens
eines Prokaryonten im Abstromteil (d.h. an der Abspaltungsseite durch Eco RI) des Promotors der Erfindung
(normalerweise als eine Hybrid-DNA oder ein Hybrid-Plasmid) gewonnen wird, vorteilhaft für die Darstellung
jenes Gens in einer geeigneten Gastzelle verwendet.
Normalerweise dominiert in der Darstellung von Genen eines Prokaryonten, beispielsweise im Falle eines
Lactose-Operons, ein Promotor über eine Serie von nachfolgenden Strukturgenen. Im Gegensatz dazu ist bei der
Darstellung von Genen eines Eukaryonten ein Promotor für jedes Gen erforderlich, wobei die Darstellung eines
von einer eukaryontischen Zelle abgeleiteten Gens ermöglicht wird, wenn ein Promotor vor diesem Gen angeordnet
ist. Dementsprechend kann, wenn die DNA-Basensequenz des erfindungsgemäßen Promotors bestimmt ist, der
erfindungsgemäße Promotor für die Darstellung von Genen
eines Eukaryonten durch Binden der exogenen DNA-Fraktion an einer Integrationsseite stromabwärts eines Einführungscodons
auf der DNA-Fraktion des erfindungsgemäßen Promotors effektiv benutzt werden.
Der erfindungsgemäße Promotor wird gemäß einem Verfahren hergestellt, welches im Prinzip die Isolierung
einer Chloroplast-DNA von Marchantia polymorpha L. und
eine zweistufige Restriktionsenzymbehandlung beinhaltet. Bevorzugt wird der erfindungsgemäße Promotor durch Wahl
eines passenden Plasmids und ein geeignetes Durchführen von Standardvorgängen, wie Restriktionsabspaltung,
Ligation und Transformation hergestellt, um den Promotor in Form eines Rekombinanten mit dem Plasmid zu gewinnen.
Diese Standardvorgänge werden in üblicher Weise durchgeführt und sind beispielsweise im "Experimental Manual
of Genetic Manipulations" von Kodansha, 1982, oder in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory, 1982, beschrieben. Wenn die Basensequenz dieses Promotors bekannt ist, kann der Promotor
durch Gesamtsynthese hergestellt werden.
Wie bereits ausgeführt wurde, ist der Vorläuferpromotor mit einer Größe von etwa 5,1 kbp des erfindungsgemäßen
Promotors bekannt. Eine Ausführungsform des Verfahrens
zur Herstellung dieses Vorläuferpromotors und des erfindungsgemäßen Promotors in Form eines Hybrid-Plasmids
wird jetzt anhand der Reaktionsschritte in Fig. 3 beschrieben.
Gemäß Fig. 3 weist das Plasmid pMP9O3 eine Fraktion (schraffierter Abschnitt) des Vorlauferpromotors mit einer
Größe von etwa 5,1 kbp auf, während ein Plasmid pMP9O4 eine Fraktion (schraffierter Abschnitt) des erfindungsgemäßen
Promotors mit einer Größe von etwa 1,1 kbp hat.
Zufälligerweise hat das Plasmid pMC14O3 ein Strukturgen
lac Z, aber einen fehlenden Promotorbereich (Z. Bacteriol, 143, Nr. 2, Seiten 971 - 980, 1980).
(i) Herstellung von Plasmid pMP9O3
Chloroplast-DNA wird isoliert und von Kulturzellen
von Marchantia polymorpha L. in der stationären Stufe
entsprechend dem Verfahren von Ohyama et al (Agric. Biol.
Chem., 4j5, 137, 1982) gereinigt. Diese DNA wird vom
Restriktionsenzym Eco RI aufgenommen. Plasmid pMC14O3
von E. coli (welches ein Strukturgen lac Z hat, dem aber
ein Promotorbereich fehlt) wird vom Restriktionsenzym
Eco RI getrennt aufgenommen und einer alkalischen Phosphatasebehandlung unterworfen. Diese DNA-Verbindungen
sind durch T4 Ligase gebunden. Durch das gebildete Rekombinantplasmid wird E. coli MC 1061 (lac~~) umgebildet,
und auf einem Agar-Nährboden mit Ampicillin von MacConkey (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold
Spring Harbor, 1972, Seite 48) wird ein Ampicillin-Widerstandsrekombinant
mit einer ß-Galactosidase-Aktivität erhalten. Wenn das Plasmid dieses Rekombinanten extrahiert
und die Struktur geprüft wird, wird ein Restriktions-Abspaltungsdiagramm, wie im mittleren Teil von Fig. 3
gezeigt ist, erhalten. Wie zu sehen ist, gibt es eine Fraktion von Chloroplast-DNA von Marchantia polymorpha L.,
die eine Größe von etwa 5,1 kbp hat.
(ii) Annahme der Position der den Promotor enthaltenden Fraktion von 5,1 kbp, die durch Digestion von
Eco RI im Abspaltungsdiagramm von Chloroplast-DNA von Marchantia polymorpha L. gebildet ist.
Die Position der durch Digestion von Eco RI gebildeten Fraktion wird als eine bekannte Ribosomal-RNA-Gen
enthaltene Position auf der Chloroplast-DNA von Marchantia polymorpha L. entsprechend dem Verfahren festgestellt,
welches diese Fraktion als eine Vergleichsprobe
benutzt. Aus dem detaillierten Restriktions-Abspaltungsdiagramm (Fig. 1) von Chloroplast-DNA von Marchantia
polymorpha L. ist zu entnehmen, daß die obige Position in den Bereichen I und II in Fig. 1 liegt. Da bekanntlich
diese Bereiche in entgegengesetzten Richtungen liegen, erscheint die gleiche Basensequenz an zwei Punkten, wie
in Fig. 1 gezeigt ist.
(iii) Herstellung von Plasmid pMP9O4
Das so erhaltene Plasmid pMP9O3 wird vom Restriktionsenzym
Bam HI abgespalten. Hiervon getrennt wird das Plasmid pMC14O3 vom Restriktionsenzym Bam HI aufgenommen
und einer alkalischen Phosphatasebehandlung unterworfen. Diese DNA-Verbindungen werden durch T4 Ligase
gebunden, und E. coli MC1061 wird durch das gebildete
Rekombinant transformiert.Auf dem Nährboden von MacConkey wird ein Ampicillin-Widerstandsrekombinant mit einer
ß-Galactosidase-Aktivität erhalten. Ein vom Anfangsplasmid pMP9O3 sich unterscheidendes Plasmid wird in dem Rekombinanten
erhalten. Das Restriktions-Abspaltungsdiagramm dieses Plasmids ist gemäß dem unteren Teil von Fig. 3
ausgebildet. Das Plasmid pMP9O4 weist eine von durch Abspaltung von Bam HI - Eco RI der Chloroplast-DNA von
Marchantia polymorpha L. erhaltene Fraktion von 1,1 kbp, also den erfindungsgemäßen Promotor, auf.
25 Ausführungsbeispiel
1) Gewinnung der Chioroplast-DNA
Zellen von Marchantia polymorpha L. wurden bei 250C für 5 Tage in 2 Litern eines 1M51C-Nährbodens
(Plant Sei. Lett., Jj4, 225, 1979) kultiviert. Die Zellen
wurden gesammelt und mittels einer französischen Presse homogenisiert,wobei eine rohe Chloroplastfraktion nach
üblichen Verfahren gesammelt wurde. Die rohe Chloroplastfraktion
wurde nach dem 20- und 40%igen zweischichtigen Sucrose-Dichtegradienten-Zentrifugationsverfahren
fraktioniert, um eine Chloroplastfraktion zu erhalten. Die Chloroplastfraktion wurde in einer TE-Pufferlösung
(10 mM 3-Hydrochloridpufferlösung - 1 mM EDTA mit pH 8,0)
mit 3% Sarkosyl NL97 aufgelöst und durch Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation
fraktioniert, um 30 μg einer Ring-Chloroplast-DNA zu erhalten.
10 2) Struktur von pMP9O3
Von dieser Chloroplast-DNA wurde 1 μg mit zehn
Einheiten von Eco RI in einer Lösung, die 10 mM 3-Hydrochlorid-Pufferlösung
(pH 7,6), 7 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 7 mM 2-Mercaptoäthanol enthielt,
für 1 Stunde bei 37°C zur Reaktion gebracht, worauf sich eine Phenolbehandlung und ein Ausfällen mit Äthanol anschloß
.
Hiervon getrennt wurde 1 ug von Plasmid pMC14O3
durch Eco RI unter den gleichen zuvor beschriebenen Bedingungen abgespalten, nachdem die Phenolbehandlung und
die Ausfällung mit Äthanol ausgeführt worden war. Die Ausfällung wurde in einer TE-Pufferlösung (pH 8,0) aufgelöst
und unter Zusatz von 1 Einheit einer E. coli alkalischen Phosphatase zur Lösung bei 370C für 30 Minuten zur
Reaktion gebracht, worauf eine Phenolbehandlung und Ausfällen mit Äthanol folgte.
Die so behandelte Chloroplast-DNA-Fraktion und das
Plasmid pMC14O3 DNA wurden in Wasser aufgelöst und einer Bindungsreaktion unterworfen. In 50 μΐ der Reaktionsflüssigkeit
waren 1 mM ATP-66 mM 3-Hydrochlorid-Pufferlösung (pH 7,6), 6.6 mM Magnesiumchlorid, 20 mM Dithiothreitol
und 0,1 Einheit von T4 Ligase enthalten. Die
Reaktion wurde bei 12°C für 16 Stunden ausgeführt und daran eine Phenolbehandlung und Ausfällen mit Äthanol
angeschlossen. Die Ausfällung wurde in 10 μΐ von TE (pH 8,0) aufgelöst.
Die Transformation von E. coli MC1O61 (Iac") wurde
durch Verwenden des gesamten Lösungsteils entsprechend der Calciummethode ausgeführt, so daß E. coli zu
kompetenten Zellen umgewandelt wurde. Die nach dem zuvor beschriebenen Verfahren hergestellte DNA wurde den
kompetenten Zellen zugesetzt und die Mischung bei O0C während 20 Minuten gehalten und dann bei 43,5°C für 2
Minuten lang erhitzt. Die behandelte Mischung wurde mit dem gleichen Anteil eines 2 χ L - Nährbodens gemischt
(d.h. mit einer Lösung mit einem pH von 7,5, die durch Auflösen von 20 g Polypepton, 10 g Hefeextrakt und
10g NaCl in 1 Ltr. Wasser gebildet wurde), worauf sich
eine Inkubation bei 370C für 60 Minuten lang anschloß. Das
Inkubationsprodukt wurde auf einen Agar-Nährboden nach MacConkey gestreut, der 50 mg/Liter Ampicillin enthielt,
welches durch Auflösen von 10 g des von Difco Co. gelieferten Nährbodens in 100 ml Wasser gebildet wurde.
Stationäres Kultivieren wurde über Nacht bei 37°C vorgenommen, um 200 Ampicillin-WiderStandsstämme zu erhalten,
von denen 3 Widerstandsstämme als rote Kolonie ausgebildet waren. Dieses Plasmid wurde entsprechend der Alkalimethode
extrahiert und von den Restriktionsenzymen Eco RI, Bam HI,
Sma I und BgI II abgespalten, um ein Restriktions-Abspaltungsdiagramm
(Fig. 3) zu bilden. Wie in Fig. 3 gezeigt ist, wurde festgestellt, daß eine Fraktion von
Chloroplast-DNA von Marchantia polymorpha L. mit einer
Größe von 5,1 kbp in die Abspaltungsseite von Eco RI im Plasmid pMCi4O3 eingesetzt war. Das so erhaltene
Plasmid wurde als pMP9O3 bezeichnet.
3) Aufbau von pMP9O4
Es wurde gefunden, daß eine Fraktion von Chloroplast-DNA von Marchantia polymorpha L. mit einer Größe von
5,1 kbp im Plasmid pMP9O3 enthalten war und daß eine
RNA-Transkription von dieser DNA-Fraktion begonnen wurde, um ß-Galactosidase zu erzeugen (8th Symposium of Tissue
Culture of Plants).
Um ferner diese Promotorseite zu begrenzen, wurde
pMP9O4 hergestellt. Das heißt, daß, nachdem Plasmid pMP9O3
durch die Alkalimethode wiedergewonnen war, 1 μg der DNA
durch 10 Einheiten von Bam HI entsprechend dem zuvor beschriebenen
Verfahren aufgenommen wurde. Hiervon getrennt wurde in ähnlicher Weise 1 μg von Plasmid pMCi4O3 durch
10 Einheiten von Bam HI zersetzt und dann der alkalischen
15 Phosphatasebehandlung unterworfen.
Diese DNA-Fraktionen wurden durch T4 Ligase gebunden und danach eine Transformation von E. coli MC1O61
durch das gebildete Rekombinantplasmid ausgeführt, um 100 Klons als Amicillinwiderstandsstämme zu bilden, von
denen 16 Klons eine ß-Galactosidase-Aktivität hatten. Drei Klons unter diesen aktiven Klons enthielten eine Fraktion
der Chloroplasmid-DNA von Marchantia polymorpha L. mit
einer Größe von 1,1 kbp (die restlichen Klons waren die gleichen wie Plasmid pMP9O3). Dieses Plasmid wurde extrahiert
und ein Restriktions-Abspaltungsdiagramm gebildet (unterer Teil von Fig. 3) .
Dieses Plasmid wurde "pMP9O4" genannt. Es wurde angenommen, daß der Promotor in der Fraktion von 1,1 kbp
vorhanden ist, die von Eco RI und Bam HI umgeben war.
Ein Rekombinant der DNA-Fraktion von 1,1 kbp mit
dem erfindungsgemäßen Promotor und einem Plasmid, das ein ß-Galactosidase-Gen aufwies, wurde hergestellt. Es
wurde gefunden, daß der vorliegende Promotor zur Darstellung von ß-Galactosidase wirkungsvoll war, eine etwa
1,2fache Aktivität eines Lactosepromotors hatte und zur Darstellung der Aktivität des Promotors in einer Fraktion
geeignet war, die eine Größe von etwa 5,1 kbp hatte.
Insbesondere wurde durch ß-Galactosidase erzeugte Aktivität des durch Transformation mit Plasmid pMC9O4
gewonnenen Stammes (erhalten vom Beispiel) von E. coli mit fehlendem ß-Galactosidase-Gen verglichen, und zwar
mit der (1) von E. coli., vom wilden Stamm W311O, welche
in der Lage waren, ß-Galactosidase durch einen Lactosapromotor zu erzeugen; (2) vom nicht transformierten
E. coli MC1O61; (3) eines durch Transformation von E. coli
MC1O61 mit Plasmid pMC14O3 gebildeten Stammes, der ein
ß-Galactosidase-Gen, aber keinen Promotor aufwies; und mit der (4) eines durch Transformation von E. coli MC1061
mit Rekombinant-Plasmid pMC9O3 gebildeten Stammes, der eine DNA-Fraktion mit einer Größe von 5,1 kbp und ein
ß-Galactosidase-Gen aufwies. Die durch ß-Galactosidase erzeugte Aktivität jedes Stammes wurde nach der Miller-Methode
gemessen (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, 1972, Seite 352).
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 angeführt
.
(in E. coli)
| Gast | Z) | Plasmid | ß-Galactosidase-Aktivität (Einheiten) | IPTG nicht zugesetzt | |
| Z) | - | IPTG* zugesetzt | 11 0 |
||
| W3110 MC1061 |
(lac+) (Alac |
Z) Z) |
PMC14O3 (lac1 Z) | 338 0 |
0 |
| MC1061 | (Alac | pMP9O3 pMC9O4 |
0 | 336 404 |
|
| MC1061 MC1061 |
(Älac | - | |||
* IPTG: Isopropylthiogalactosid
Aus den angeführten Ergebnissen kann leicht entnommen werden, daß, da die DNA-Fraktion von 1,1 kbp mit
dem Promotor der Erfindung als ein Promotor reagiert, selbst wenn dieser in die Rekombinant-DNA eingesetzt ist,
und da diese DNA-Fraktion eine ß-Galactosidase erzeugende Aktivität von etwa dem 1,2fachen des Lactose-Promotors
und der DNA-Fraktion von 5,1 kbp aufweist, die DNA-Fraktion von 1,1 kbp des erfindungsgemäßen Promotors
einen hohen Wert hat.
Ii
- Leerseite
Claims (7)
1. Promotor,
gekennzeichnet durch
gekennzeichnet durch
eine DNA, die die gleiche Basensequenz wie diejenige einer DNA-Fraktion mit einer Größe von etwa 1,1 kbp hat, welcher
durch Abspaltung von einem Restriktionsenzym Bam HI einer DNA-Fraktion gewonnen wird, die alle Teile eines 16SrRNA-Gens
und einen Teil eines 23SrRNA-Gens enthält, wobei die DNA-Fraktion durch Abspaltung von einem Restriktionsenzym
Eco RI einer Chloroplast-DNA von Marchantia polymorpha
L. erhalten wird.
2. Hybrid-DNA,
gekennzeichnet durch
gekennzeichnet durch
eine Fraktion (A) mit einem Promotor mit einer DNA, die die
gleiche Basensequenz wie diejenige einer DNA-Fraktion mit einer Größe von etwa 1,1 kbp hat, welcher durch Abspaltung
eines Restriktionsenzyms Bam HI von einer DNA-Fraktion gewonnen wird, die alle Teile eines 16SrRNA-Gens und einen
Teil eines 23SrRNA-Gens enthält, wobei die DNA-Fraktion durch Abspaltung von einem Restriktionsenzym Eco RI einer
Chloroplast-DNA von Marchantia polymorpha L. erhalten wird; und eine Fraktion (B) mit einer DNA, die die gleiche
Basensequenz wie diejenige von einem Prokaryonten abgeleitete
DNA hat.
3. Hybrid-DNA nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die von einem Prokaryonten abstammende DNA eine Säure ist, die mindestens einen Teil eines Plasmids von
Escherichia coli aufweist.
4. Hybrid-DNA nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Hybrid-DNA als Plasmid vorliegt.
5. Organismus,
10 gekennzeichnet durch
eine Hybrid-DNA mit einer Fraktion (A), die einen Promotor mit einer DNA aufweist, die die gleiche Basenseguenz wie
diejenige einer DNA-Fraktion mit einer Größe von etwa 1,1 kbp hat, welcher durch Abspaltung eines Restriktionsenzyms
Bam HI von einer DNA-Fraktion gewonnen wird, die alle Teile eines 16 SrRNA-Gens und einen Teil eines
23SrRNA-Gens enthält, wobei die DNA-Fraktion durch Abspaltung von einem Restriktionsenzym Eco RI einer Chloroplast-DNA
von Marchantia polymorpha L. erhalten wird; und
mit einer Fraktion (B) einer DNA, die die gleiche Basensequenz wie diejenige von einem Prokaryonten abgeleitete
DNA hat.
6. Organismus nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß die von einem Prokaryonten abstammende DNA eine Säure ist, die mindestens einen Teil eines Plasmids von
Escherichia coli aufweist.
7. Organismus nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
30 daß die Hybrid-DNA als Plasmid vorliegt.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58154270A JPS6047683A (ja) | 1983-08-24 | 1983-08-24 | プロモ−タ− |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3431023A1 true DE3431023A1 (de) | 1985-03-07 |
| DE3431023C2 DE3431023C2 (de) | 1987-08-13 |
Family
ID=15580492
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19843431023 Granted DE3431023A1 (de) | 1983-08-24 | 1984-08-23 | Promotor |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4710461A (de) |
| JP (1) | JPS6047683A (de) |
| DE (1) | DE3431023A1 (de) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| GB9923306D0 (en) * | 1999-10-01 | 1999-12-08 | Isis Innovation | Diagnostic and therapeutic epitope, and transgenic plant |
| GB0212885D0 (en) * | 2002-06-05 | 2002-07-17 | Isis Innovation | Therapeutic epitopes and uses thereof |
| ES2322140T3 (es) * | 2003-08-11 | 2009-06-17 | Greenovation Biotech Gmbh | Secuencias promotoras de la expresion de liquines y sus utilizaciones. |
| US10105437B2 (en) | 2004-04-28 | 2018-10-23 | Btg International Limited | Epitopes related to coeliac disease |
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| NZ571115A (en) | 2006-03-02 | 2011-11-25 | Athenix Corp | Method and compositions for improved enzyme activity in transgenic plant |
-
1983
- 1983-08-24 JP JP58154270A patent/JPS6047683A/ja active Pending
-
1984
- 1984-08-20 US US06/642,191 patent/US4710461A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-08-23 DE DE19843431023 patent/DE3431023A1/de active Granted
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| Agric.Biol.Chem., 46, 137, 1982 * |
| KODANSHA: Experimental Manual of Genetic Manipulation, 1982 * |
| MILLER: Experiments in Molecular Genetics, 1972, S. 48 u. 352 * |
| Mol.Gen.Genet., 189, 1-9, 1983 * |
| Molecular Clonine-a Laboratory Manual, 1982 * |
| Plant Sci.Lett., 14, 225, 1979 * |
| Z.Bacteriol., 143, Nr. 2, 1980, 971-980 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4710461A (en) | 1987-12-01 |
| JPS6047683A (ja) | 1985-03-15 |
| DE3431023C2 (de) | 1987-08-13 |
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