DD243715A1 - Enzymatische gewinnung von proteinhydrosaten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Proteinhydrolysaten fuer kosmetische Zubereitungen. Im speziellen Anwendungsfall wird das Verfahren fuer Hydrolysate aus auf Kollagen oder Gelatine basierenden Rohstoffen beansprucht. Ziel des Verfahrens ist es, Proteinhydrolysate innerhalb gewuenschter Molmassebereiche mit geringem Anteil an freien Aminosaeuren herzustellen. Als geeignetes Enzym erwies sich alkalische Serinprotease aus Bacillus licheniformis ZIMET 10 911 mit hoher proteolytischer und begrenzter kollagenolytischer Aktivitaet sowie eines Wirkungsoptimums ueber p H 8. Bei Verwendung chromgegerbter kollagenhaltiger Substrate stellt die Wirkung und Stabilitaet der Protease bei p H 9 bis 12 die Voraussetzung fuer eine effektive Hydrolyse bei Anwesenheit von Chromionen dar. Die Reaktion erfolgt unter p H-Statierung bei Temperaturen von 0 bis 70C, vorzugsweise bis 50C. Die vollstaendige Verwertung restlichen Ausgangsmaterials wird in einem Recycling-Verfahren oder in einem zweiten Schritt zu Produkten mit Molekulargewichten 3 000 erreicht.

Description

Anwendungsgebietder Erfindung.

Die Erfindung betrifft die enzymatische Gewinnung von Proteinhydrolysaten aus naturlichen Proteinen oder proteinhaitigen Rohstoffen mit alkalischer Serinprotease aus Bacillus iicheniformis ZIMET10911. Die Hydrolyseprodukte finden bevorzugt Anwendung in kosmetischen Zubereitungen_fwie Cremes, Badezusätzen, Haarpflegemitteln u.a..

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Verwendung kollagenhaltiger Materialien für die Herstellung von Proteinhydrolysaten durch bakterielle, tierische und pflanzliche Proteasen ist bekannt (DE-OS2252281, DE-OS 2709035, DE-OS 2643012, DE-OS 2705671, US-PS 3683939). Neben dem allgemeinen Hinweis auf ProteasenausBacillus (DE-OS 2252281, DE-OS2643012, DE-OS 270567T, DE-OS 2709035, DE-OS2705670) werden folgendeBacillus-Arten aufgeführt: Bl alcalofilus, B. firmus_r Bi subtilis, Bi cereus, B. mycoides, B. licheniformis ist nur in zwei Patenten (DE-OS 2643012, DE-OS 2705671) zur Kollagenhydrolyse beschrieben. Dieser Bacillus-Stamm wird weiterhin zur Hydrolyse keratinhaltiger (DE-OS 2705669) und elastinhaltiger Rohstoffe (DE-OS 2705670) angeführt. In den DE-OS 26430T2bzwi 2705670 wird ein Verfahren zum Auflösen von kollagenhaltigen Abprodukten der Lederindustrie unter Verwendung alkalischer Proteasen aus Bacillus-Stämmen mit einem Wirkungsoptimum zwischen pH 9 und 13 in Gegenwart von 0,01 bis 1,0 Mol Harnstoff/l beschrieben. Das Hauptziel dieser Erfindung: besteht in der vollständigen undschnellen abfallarmen Beseitigung von Abprodukten der Lederindustrieu.dgl.

Zum weitgehenden Abbau wird die Hydrolyse unter Anwendung von nichtkollagenaseartigen Proteasen in zwei Stufenim zunächst alkalischen Medium und schließend sauren Milieu mit neutralen oder/und sauren Proteasen bei Anwesenheit von Harn stoff durchgeführt; Dasmit diesem Verfahren erzielte mittlere Molekulargewicht liegt sehr niedrig (Peptide mit Kettenlängen < 10, IViG < 1000) und die Produkte sind für einen Einsatzin kosmetischen Zubereitungen nicht besonders geeignet. In DD-WP 212983 ist die enzymatische Gewinnung von Proteinhydrolysaten für kosmetische Zwecke beschrieben, bei dem eine Serinprotease mit begrenzter kollagenolytischer Aktivität verwendet wird, die ausThermoactinomyces vulgaris stammt Das Verfahren führt zu gleichmäßiger Produktbildung. Durch geeignete Reaktionsführung lassen sich Proteinhydrolysate im Molekulargewichtsbereich von 500 bis 10000 herstellen.

Bedingt durch die Spezifitätder Protease^ enthält das Hydrolysat definierte Anteile (> 1 %) an freien Aminosäuren, diefür den vorgesehenen Anwendungszweck nicht erwünscht sind;:

Die Verwendung chromgegerbter Abprodukte wird nur in den DE-OS 2643012, DE-OS 2705671 und DE-OS 225228Tfür ein enzymatisches Verfahren genannt.

Ziei der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es. Proteinhydrolysate aus auf Kollagen und Gelatine basierenden Rohstoffen, vorzugsweise zur Verwertung gegerbter kollagenhaltiger Abfälle, mit relativ geringem Energieaufwand und ohne Zusatz von weiteren Wirkstoffen oder anderen Enzymen mit den für kosmetische Formulierungen geforderten Eigenschaften herzustellen.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine geeignete Protease unter solchen Bedingungen einzusetzen, daß Proteinhydrolysate ohne weitere Wirkstoffzusätze mit für den Einsatz in hochwertigen Kosmetika erforderlichen Eigenschaften hergestellt werden. .

Erfindungsgemäß wird alkalische Serinprotease 41 ρ aus B. licheniformis ZIMET10911 mit hoher proteolytischer und geringer kollagenolytischer Aktivität eingesetzt.

Die Herstellung des Präparates ist in DD-WP C12N/251783 beschrieben (Aktivitätsbestimmung nach TGL 29170/02 an Hämoglobin bei pH 10,25⁰C).

Der B. licheniformis ZIMET10911 unterscheidet sich in seinen taxonomischen Eigenschaften von den in der Patentliteratur angeführten Bacillus-Arten. In wesentlichen taxonomischen Eigenschaften unterscheidet er sich auch von den patentierten B.

licheniformis-Proteasebildnern (DE-OS 2618451, DE-OS 2121397, DE-OS 2044101, DE-OS 2063988, DE-OS 2925427, DE-OS 2551742).

Der in den DE-OS 2643012 bzw. DE-OS 2705671 aufgeführte B. licheniformis wird nicht näher charakterisiert. Eine anders als kollagenolytische Wirkung wird betont.

Das vorliegende Verfahren zur Herstellung von Proteinhydrolysaten beinhaltet die Verwendung aller auf Kollagen oder Gelatine basierenden Rohstoffe bzw. Abprodukte, vorzugsweise gegerbte kollagenhaltige Materialien.

Die alkalische Serinprotease aus B. licheniformis ZIMET10911 ist auf Grund ihrer Spezifität, ihres Wirkungsoptimums im alkalischen pH-Bereich und ihrer pH-Stabilitätfür eine Hydrolyse im alkalischen Milieu bei pH 8 bis 12, vorzugsweise9bis 12, besonders geeignet.

Bei Einsatz chromgegerbter Hautabfälle ist eine thermische Vorbehandlung in Gegenwart von Alkalien erforderlich, um das-Substrat dem Enzym zugänglich zu machen.

Es warüberraschend, daß die hohe Alkalistabilität des Enzyms bei Anwesenheit von Cr-Ionen einen Abbau des Kollagens ermöglichte. Durch diese Alkalistabilität konnte während der Hydrolyse der pH auf >8 statiert, vorzugsweise 9, und durch die enzymatische Hydrolyse freigesetztes Cr³⁺ als Cr(OH)₃ ausgefällt werden, so daß es die Enzymwirkung nicht beeinflußte.

Erfindungsgemäß erfolgt die enzymatische Hydrolyse bei Anwesenheit der Chromionen bei dem Enzym entsprechenden optimalen Bedingungen in einer Einschritt-Reaktion. Die pH-Statierung stellt neben der Alkalistabilität des Enzyms die entscheidende Voraussetzung für eine optimale Wirkung in einem Einstufenverfahren ohne weitere Wirkstoffzusätze dar. Das ausgefällte Chromhydroxid läßt sich nach Abbruch der enzymatischen Reaktion leicht mechanisch abtrennen.

Durch die erfindungsgemäße Verwendung der alkalistabilen und chromunempfindlichen Protease (in Konzentrationen bis 10~¹ M Cr³⁺) aus B. licheniformis ZIMET10911 ist es möglich, in einem Recycling-Prozeß restliches unhydrolysiertes Material bei Anwesenheit von Cr(OH)₃ vollständig als Hydrolysat zu gewinnen.

Das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung der alkalischen Serinprotease aus B. licheniformis ZIMET10911 führt zu einer gleichmäßigen Produktbildung, wobei die Reaktionsbedingungen so gewählt werden (Enzymkonzentration, Hydrolysezeit), daß Hydrolysate in einem Molekulargewichtsbereich von 1000 bis 5000, vorzugsweise mit mittlerem Molekulargewicht von 2500 bis 3500, und einem Gehalt an freien Aminosäuren < 1 % erhalten werden.

In einem Recycling-Verfahren oder einer zweiten Aufschlußstufe kann die vollständige Verwertung zu Produkten mit einem Molekulargewicht unter 3000 erfolgen.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

100g Gelatine oder Knochenleim werden mit 900ml Leitungswasser30min gequollen und bei 40⁰C gelöst. Die Reaktionstemperatur beträgt 4O⁰C bis 70°C, vorzugsweise 5O⁰C. Der mit NaOH eingestellte pH-Wert beträgt 8 bis 10, vorzugsweise pH 8. Es werden Aktivitäten von 100 bis 50000 TE_Hb/100g Substrat hinzugefügt (Aktivität des Enzyms 1000 TE_Hb/ml).

Während der Reaktionszeit von 10min bis 24h, vorzugsweise 3 bis 5h, wird kontinuierlich gerührt.

Reaktionszeit und Enzymkonzentration können je nach gefordertem Abbaugrad variiert werden. Ein Abbruch der Enzymreaktion wird durch Erhitzen des Ansatzes auf 9O⁰C erreicht.

Nach der Filtration der Probe erfolgt eine Konzentrierung auf 40 bis 50% TS.

Der Gehalt an freien Aminosäuren beträgt < 1 %. Es wird ein honigfarbenes Produkt mit enger Molekulargewichtsverteilung und hohem Reinheitsgrad erhalten. Die Molmasse beträgt je nach Reaktionsbedingungen 1000 bis 10000.

Beispiel Z

1 kg gegerbte, unzugerichtete Lederabfälle werden im Verhältnis 1:10 (m/v) mit einer Lösung von 0,25 bis 1 % Calciumhydroxyd, Calciumoxid oder Natronlauge in Leitungswasser versetzt und 20 bis 60min, vorzugsweise 30min, gekocht. Nach Abkühlen des Ansatzes auf 90°C bis 4O⁰C, vorzugsweise 50⁰C, erfolgt die Enzymzugabe. Die zur Anwendung kommende Enzymmenge richtet sich nach der Aktivität des Enzyms und dem gewünschten Abbaugrad. Sie liegt, bezogen auf das Gewicht des Substrates, bei 1000 bis 100 000 TE_Hb/100 g Su bstrat.

Der pH-Wert des Ansat.es wird durch pH-Statierung mit NaOH auf 8 bis 12, bevorzugt 9, gehalten. Das Enzym ist bei diesem pH-Wert stabil und besitzt hier seine optimale Aktivität. Gleichzeitig kann durch die Hydrolyse freigesetztes Chrom als Cr(OH)₃ ausgefällt werden.

Die Reaktionstemperatur liegt im Bereich von 25°C bis 7O⁰C, soll jedoch bevorzugt 50⁰C betragen.

Die Reaktionsdauer der enzymatischen Reaktion beträgt 10 min bis 24h in Abhängigkeit vom gewünschten Hydrolysegrad.

Ein Abbruch der Enzymreaktion kann durch Erhitzen des Ansatzes über 9O⁰C erreicht werden. Die Aufarbeitung der Hydrolysate erfolgt nach den üblichen Methoden der Abtrennung von Chromhydroxid und fester Bestandteile durch Filtration sowie Konzentrierung, Sprüh- und Gefriertrocknung.

Beispiel 3

10 kg Chromlederfalzspäne werden mit 1001 Leitungswasser und 0,5 kg CaO 30 min gekocht. Nach Abkühlung auf 50°C erfolgt die Zugabe von 40 ml Konzentrat alkalische Protease aus B. licheniformis ZIMET10911 (1000 TEm/ml). Die Reaktionszeit beträgt 3 h bei einer Reaktionstemperatur von 20⁰C bis 50⁰C, bevorzugt 45°C. Der pH des Ansatzes wird auf pH 8 bis 12, bevorzugt pH 9, mit NaOH statiert. Nach Reaktionsstop durch Erhitzen (10min) auf 100⁰C wird der Überstand abgesaugt und separiert. Die Aufarbeitung erfolgt in der in Beispiel 2 angegebenen Weise.

Das Produkt besitzt eine enge Molekulargewichtsverteilung und ein mittleres Molekulargewicht von 3000, ermittelt durch Gelfiltration. Es ist klar und honigfarben. Der Gehalt an freien Aminosäuren beträgt < 1 %.

Nichthydrolysiertes Substrat wird nochmals mit Leitungswasser und 200 ml Enzymkonzentrat versetzt und wie oben angegeben vollständig hydrolysiert.

Es resultiert ein Produkt, das einen hohen Abbaugrad und ein mittleres Molekulargewicht von 1000 aufweist.

Eine vollständige Verwertung des eingetragenen Proteins wird erzielt.

Claims (5)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Enzymatische Gewinnung von Proteinhydrolysate!! für kosmetische Zwecke, dadurch gekennzeichnet, daß alkalische Serinprotease aus B. licheniformis ZIMET10911 mit hoher proteolytischer und begrenzter kollagenolytischer Aktivität zur Hydrolyse natürlicher Proteine oder proteinhaltiger Rohstoffe verwendet wird.
2. 2. Enzymatische Gewinnung von Proteinhydrolysaten nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß bevorzugt kollagenhaltige oder auf Gelatine basierende Materialien hydrolysiert werden.
3. 3. Enzymatische Gewinnung von Proteinhydrolysaten nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung chromgegerbter kollagenhaltiger Rohstoffe die Hydrolyse bei pH 9 bis 12 unter pH-Statierung in Gegenwart von Chromionen ohne ihre vorherige Abtrennung in einem Einschritt-Verfahren erfolgt.
4. 4. Enzymatische Gewinnung von Proteinhydrolysaten nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Hydrolysate in einem Molekulargewichtsbereich von 1000 bis 5000, bevorzugt mit einem mittleren Molekulargewicht von 2500 bis 3500, hergestellt werdem
5. 5. Enzymatische Gewinnung von Proteinhydrolysaten nach Punkt 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet; daß in einem ersten Hydrolyseschritt die vorrangige Herstellung von Produkten mit einem mittleren Molekulargewicht von 2500 bis 3500 erfolgt und in einem Recycling-Verfahren bzw. in einem zweiten Schritt die vollständige Verwertung des Ausgangsmaterials zu Produkten mit Molekulargewichten unter 3000 vollzogen wird.