DE102007013950A1

DE102007013950A1 - Eine neue Protease für industrielle Anwendungen

Info

Publication number: DE102007013950A1
Application number: DE102007013950A
Authority: DE
Inventors: Smita Shrikant Nilegaonkar; Vasudeo Pandharinath Zambare; Pradnya Pralhad Kanekar; Prashant Kamalakar Dhakephalkar; Seema Shreepad Sarnaik; Narasimhan Kannan Chandra Babu; Baddipudi Ramaniah; Rama Rajaram; Thirumalachari Ramasami; Yegnisettipalli Krishnaiah Saikumari; Padmanabhan Balaram
Original assignee: MACS AGHARKAR RES INST; MACS-AGHARKAR RESEARCH INSTITUTE; Council of Scientific and Industrial Research CSIR; Indian Institute of Science IISC
Current assignee: MACS AGHARKAR RES INST; MACS-AGHARKAR RESEARCH INSTITUTE; Council of Scientific and Industrial Research CSIR; Indian Institute of Science IISC
Priority date: 2006-11-17
Filing date: 2007-03-23
Publication date: 2008-07-17
Also published as: US20080220499A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine extrazelluläre Enzym-Protease, erhalten durch die Anzucht einer Kultur von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327, isoliert aus kompostiertem Bergwerksboden und hinterlegt beim MTCC, IMTECH, Chandigarh mit der Benennung MTCC 5270, in einem Produktionsmedium von pH 7,0; enthaltend Sojabohnenmehl und Trypton als Ausgangsmaterialien, bei 30°C für 72 Stunden. Der Organismus war auch in der Lage, eine Protease unter Verwendung verschiedener landwirtschaftlicher Produkte/Nebenprodukte als Proteinquellen zu produzieren. Die teilweise aufgereinigte nicht-kollagenolytische, kalziumunabhängige Protease mit einem Molekulargewicht von 60 kDa zeigt Aktivität im pH-Bereich von 6,0-11,0 und Temperaturbereich von 25-65°C; Stabilität im pH-Bereich von 6,0-10,0 und Temperaturbereich von 25-45°C. Die Proteaseaktivität konnte im Falle der Lagerung bei Raumtemperatur für 8 Monate beibehalten bleiben. Das durch Ammoniumsulfat gefällte Enzym war in der Lage, tierische Häute und Felle ohne Chemikalien wie Kalk, Natriumsulfid und Kalzium vollständig zu enthaaren.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Protease für industrielle Anwendungen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere eine neue Protease, hergestellt von einem Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 Bakterien-Stamm, hinterlegt beim MTCC, IMTECH, Chandigarh, Indien und bezeichnet als MTCC 5270.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Proteasen sind vom industriellen Standpunkt her die wichtigsten Enzyme. Die Protease der vorliegenden Erfindung besitzt eine enorme Anwendungsmöglichkeit in der lederverarbeitenden Industrie als eine umweltfreundliche Alternative zur Enthaarung von Häuten und Fellen ohne die Verwendung jeglicher Chemikalien. Sie kann auch zu Einweichprozessen bei der Lederherstellung verwendet werden. Weiterhin hat das Enzym Anwendungsmöglichkeit als Zusatz in Reinigungsmitteln und auch bei der Wiedererlangung von Silber aus gebrauchten Röntgen- und Fotografiefilmen. Sie kann auch für Zusammensetzungen von Proteinhydrolysaten verwendet werden. Noch eine weitere Anwendungsmöglichkeit der Protease der vorliegenden Erfindung liegt in den pharmazeutischen Industrien und der Lebensmittel-verarbeitenden Industrie.
BESCHREIBUNG DES STANDS DER TECHNIK
Proteasen werden üblicherweise von verschiedenen Mikroorganismen, pflanzlichen Quellen und tierischen Quellen produziert. Die kommerzielle Produktion einer Protease bakteriellen und mykotischen Ursprungs hat jedoch aufgrund ihrer extrazellulären Produktion, der flüssigen Kultivierung, der hohen Ausbeute und kurzen Dauer der Produktion sowie einer einfachen Gewinnung des Enzyms stark an Bedeutung gewonnen.
Verschiedene Bakterien produzieren eine Protease, und die Hauptproduzenten gehören zum Genus Bacillus. Viele Pilze, die zu den Arten Aspergillus, Cephalosporium, Fusarium, Paecilomyces, Penicillium etc. und Spezies wie Chrysosporium keratinophilum, Conidiobolus coronatus, Entomophthora coronata, Rhizopus oryzae, Scedosporium apiospermum, Tritirachium album etc. gehören, produzieren eine Protease, wie von Ganesh Kumar und Takagi, berichtet (Biotechnology Advance 17, 561–594, 1999). Chitte et al., (Letters in Applied Microbiology 28, 131–136, 1999); Yang und Wang (Botanical Bulletin of Academia Sinica 40, 259–265, 1999) und Bressollier et al., (Applied and Environmental Microbiology 65 (6), 2570–2576, 1999) haben die Protease-Produktion aus Streptomyces Spezies und deren biotechnologische Anwendungen berichtet.
Es gab einige Berichte über die verschiedenen Eigenschaften der Proteasen, die der Öffentlichkeit zugänglich sind. Sie sind unten zusammengefasst.
Optimaler pH und optimale Temperatur
Viele Proteasen besitzen eine hohe thermale und breite pH-Stabilität, insbesondere im alkalischen pH-Bereich, einhergehend mit der Stabilität des Enzyms in Bleichmitteln, Lösungsmitteln, Reinigungsmitteln und Tensiden, wie von Joo und Chang (Process Biochemistry 40, 1263–1270, 2005), Ramani et al., (Process Biochemistry 40, 3352–3359, 2005), Chauhan und Gupta (Process Biochemistry 39, 2115–2122, 2004), Joo et al., (Process Biochemistry 39, 1441–1447, 2004) berichtet.
Der optimale pH-Bereich von alkalischen Proteasen liegt üblicherweise zwischen pH 9 und 11, wie von Kanekar et al., (Bioresource Technology 85, 87–93, 2002); Nilegaonkar et al., (World Journal of Microbiology and Biotechnology 18, 785–789, 2002); Kanekar et al., (Indian Patent 188072) berichtet; mit ein paar wenigen Ausnahmen von höheren pH-Optima von 11,5 nach Yum et al., (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 58, 470–474, 1994); Takami et al., (Applied Microbiology and Biotechnology 33, 519–523, 1990), pH 11–12, wie berichtet von Horikoshi (Agricultural and Biological Chemistry 35, 1407–1414, 1971); pH 12.3, wie berichtet von Kobayashi et al., (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 473–481, 1995).
Die optimale Temperatur von alkalischen Proteasen reicht von 50 bis 70°C. Das Enzym aus einem alkalophilen Bacillus sp. B189 zeigt jedoch eine außergewöhnlich hohe optimale Temperatur von 85°C. Alkalische Proteasen aus Bacillus sp., Streptomyces sp. und Thermus sp. sind bei hohen Temperaturen ziemlich stabil und die Zugabe von CaCl₂ erhöht ferner die Enzym-Thermostabilität.
Molekulare Massen
Die molekularen Massen von alkalischen Proteasen reichen von 15 bis 30 kDa, wie von Gupta et al. berichtet (Applied Microbiology and Biotechnology 59, 15–32, 2002), mit einigen Berichten von höheren molekularen Massen als 31.6 kDa; wie von Freeman et al. berichtet (Biochemistry Journal 295, 463–469, 1993), 33 kDa wie von Larcher et al. berichtet (Biochemistry Journal 315, 119–126, 1996); 36 kDa, wie von Tsujibo et al. berichtet (Journal of Applied Bacteriology 69, 520–529, 1990) und 45 kDa, wie von Kwon et al. berichtet (Biotechnology Letters 16, 413–418, 1994). Ein Enzym aus Kurthia spiroforme hatte jedoch ein extrem geringes Molekulargewicht von 8 kDa, wie von Steele et al. (Enzyme and Microbial Technology 14, 358–360, 1992) Kobayashi et al., (Applied Microbiology and Biotechnology 45, 63–71, 1996) berichtet.
Metallionenbedarf und Inhibitoren
Alkalische Proteasen benötigen ein zweiwertiges Kation wie Ca⁺², Mg⁺², und Mn⁺² oder eine Kombination dieser Kationen für die maximale Aktivität. Man nimmt an, dass diese Kationen das Enzym gegen die thermale Denaturierung schützen und eine lebenswichtige Rolle bei der Beibehaltung der aktiven Konformation des Enzyms bei hohen Temperaturen spielen, wie von Steele et al., berichtet (Enzyme and Microbial Technology 14, 358–360, 1992). Zusätzlich sind spezifische Ca⁺²-Bindungsstellen abgesehen von der katalytischen Stelle für Proteinasen beschrieben, die die Proteinaktivität und Stabilität beeinflussen, wie von Bajorath et al., berichtet (European Journal of Biochemistry 176, 441–447, 1988). In einigen der Untersuchungen wurde die katalytische Aktivität durch Hg-Ionen inhibiert, wie von Rahman et al., berichtet (Applied Microbiology and Biotechnology 40, 822–827, 1994).
Substratspezifität
Obwohl alkalische Proteasen gegenüber vielen synthetischen Substraten wie auch gegenüber nativen Proteinen aktiv sind, variieren die Reaktionsgeschwindigkeiten über einen weiten Bereich. Für die alkalischen Proteasen und/oder Subtilisine wurde gefunden, dass sie aktiver gegenüber Kasein als gegenüber Hämoglobin oder Rinderserumalbumin sind.
Ogino et al., (Journal of Bioscience and Bioengineering 87 (1), 61–68, 1999) beobachteten, dass die Protease aus P. aeruginosa PST-01 Elastin und Elastase-spezifische Substrate wie Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide, Succinyl-Ala-Pro-Ala-p-nitroanilide, Succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide und Glutaryl-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide bei einer schnelleren Geschwindigkeit hydrolysierte. Die enzymatische Spaltung von Keratin kann von einer simultanen Reduktion von Disulfid-Brücken begleitet werden. Eine thermostabile alkalische Protease aus einem alkalophilen Bacillus sp. no. AH-101 mit keratinolytischer Aktivität zeigte einen Abbau von Keratin aus menschlichem Haar mit 1%iger thioglykolischer Säure bei pH 12 und 70°C. Gleichermaßen wurde ein erhöhter Keratinabbau nach der Zugabe von DTT auch von Böckle et al. berichtet (Applied and Environmental Microbiology 61, 3705–3710, 1995) sowie für alkalische Proteasen von Streptomyces sp.
Die Stabilität der Protease gegenüber verschiedenen organischen Lösungsmitteln (wie Methanol, 1-Propanol, 2-Propanol, Ethylenglykol, Ethylacetat, Aceton, Xylol, Toluol, Benzol) in einer Reaktionsmischung jedes Lösungsmittels wurde von Najafi et al., (Electronic Journal of Biotechnology 8 (2), 197–203, 2005) bei 55°C für 20 Minuten unter der Verwendung von Kasein als Substrat untersucht. Das Enzym zeigte eine 80–90%ige Stabilität für 20% Methanol, Ethylenglykol, Xylol und Toluol. Die Stabilität und Aktivität des Enzyms in organischen Lösungsmitteln kennzeichnet seine Verwendung bei der Synthese von Peptidbindungen, wie von Ogino et al. berichtet (Journal of Bioscience and Bioengineering 88 (5), 513–518, 1999).
Die Protease findet in der Lederindustrie aufgrund ihrer breiten pH-Aktivität und Stabilität (pH 6–10), Substratspezifität gegenüber Kasein, Elastin, Albumin, Globulin, aber nicht gegenüber Keratin und Kollagen Anwendung. Die Entfernung der Epidermisschicht geschieht aufgrund der Hydrolyse der zementierenden Substanz, die zwischen den Epidermis- und Dermisschichten der Haut/des Fells vorhanden ist. Eine neue Keratinase aus Bacillus subtilis mit möglicher Enthaarungsaktivität in Zusammenhang mit Ziegenfell wurde von Alexandre et al. berichtet (Applied and Environmental Microbiology 71, 594–596, 2005). In diesem Fall war die Enthaarung in 9 Stunden bei pH 9.0, 24°C, mit 4.8 U g^–1 Fell ohne Natriumsulfid abgeschlossen. Sie besitzt hohe Keratinase-, aber keine Kollagenase-Aktivität. Nilegaonkar et al. (Bioresource Technology 2006, in press) berichteten von einer Protease des nicht- Kollagenase-Typs aus Bacillus cereus MCM B-326 zur Enthaarung von Büffelfell in Leitungswasser mit 1% Enzym bei Raumtemperatur (28 ± 2°C). Eine aus Conidiobollus coronatus erhaltene Protease besitzt Potential beim Einweichen, Enthaaren und Verringern von Tierfell/Tierhaut, wie von Laxman et al. berichtet ( US Patent 6777219 ). Eine aus Streptomyces griseus erhaltene Mischung proteolytischer Enzyme wurde verwendet, um Rinderfellstücke durch eine 30-minütige Vorbehandlung der Stücke mit Carbonatpuffer wie von Gehring et al. berichtet (Journal of American Leather Chemists Association 97, 406–411, 2002) zu enthaaren. Yeshodha et al. (Leather Science, 25, 36–45, 1978) entwickelten einen Prozess zur Herstellung von Narbenbildbekleidungsleder unter der Verwendung der Protease der Jawaseepflanze, die aus Blättern und Rinde des Jawaseestrauchs erhalten wurde.
Wie von Bayoudh et al. berichtet (Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 24, 291–295, 2000), besitzt die Protease aus Pseudomonas aeruginosa industrielle Anwendung bei Reinigungsmitteln aufgrund der breiten pH- und Temperaturaktivität sowie der Stabilität. Wang und Chio (Enzyme and Microbial Technology 22, 629–633, 1998) berichteten über proteolytische Enzyme aus P. aeruginosa K-187, um Shrimps und Schalenabfälle zu deproteinieren. Auch auf Najafi et al. (Electronic Journal of Biotechnology 8 (2), 197–203, 2005) kann verwiesen werden, der eine Protease aus Pseudomonas aeruginosa produzierte. Die resultierende Protease war in der Lage, Kuhfell innerhalb von 2.30–3 Stunden bei 50°C zu enthaaren, allerdings verdaute sie nach weiterer Inkubation das Fellkollagen aufgrund ihrer hohen kollagenolytischen Aktivität, die in der Lederindustrie nicht wünschenswert ist.
Die größten Einschränkungen, die mit enzymatischen Prozessen assoziiert sind, beziehen sich auf die folgenden Parameter, die mit den industriellen Anforderungen in Übereinstimmung gebracht werden müssen.

a) Substratspezifität: beispielsweise ist das Enzym aus Pseudomonas aeruginosa, berichtet im Stand der Technik durch Najafi et al. (Electronic Journal of Biotechnology 8 (2), 197–203, 2005), kollagenolytisch und daher nicht für die Lederindustrie geeignet.
b) Sparsamkeit der Anwendung: beispielsweise benötigt das Enzym aus Pseudomonas aeruginosa, berichtet im Stand der Technik durch Najafi et al. (Electronic Journal of Biotechnology 8 (2), 197–203, 2005), eine höhere Temperatur (50°C) zur Enthaarung von Fell und ist damit nicht wirtschaftlich.

Die aus dem Stand der Technik berichteten Proteasen aus anderen Organismen benötigen Puffer zur Anwendung in der Lederindustrie. Einige benötigen auch chemische Unterstützung. Viele der berichteten Enzyme besitzen spezifische Anwendungen und können nur für bestimmte Industriezweige genutzt werden.
Von daher besteht auch heute immer noch das Bedürfnis nach einer Protease, die einen breiten Anwendungsbereich besitzt und demnach bei vielen industriellen Aktivitäten nützlich ist.
ZIELSETZUNGEN DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Der Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine neue Protease für industrielle Anwendungen zur Verfügung zu stellen, die die oben genannten Limitierungen vermeidet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine Protease zur Verfügung zu stellen, die keine kollagenolytische Aktivität besitzt.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine Protease zur Verfügung zu stellen, die bei einem breiten pH- und Temperaturbereich aktiv ist und Lagerungsstabilität bei Raumtemperatur aufweist.
Noch ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine Protease zur Verfügung zu stellen, die mit billigen Substraten produziert wird, um die Produktionskosten zu reduzieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine Protease zur Verfügung zu stellen, die in Anwesenheit von SDS, Natriumtripolyphosphat, Natriumtetraborat, Tween 80, Triton X100 stabil ist, wobei die genannten Stoffe Inhaltsstoffe von gewerblichen Reinigungsmitteln und Tensiden sind. Sie ist auch in gewerblich geschützten Reinigungsmitteln wie Tide^®, Ariel^®, Nirma^®, Rin Shakti^® und Surf excel^® aktiv.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine Protease zur Verfügung zu stellen, die in ihrer Aktivität und/oder Stabilität unabhängig von Kalzium-Ionen ist.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine Protease zur Verfügung zu stellen, die beim Enthaaren von Tierhäuten und Tierfellen, als ein Zusatzstoff in Reinigungsmitteln, in Zusammensetzungen von Proteinhydrolysat und bei der Wiedererlangung von Silber aus Röntgen- und Fotografiefilmen verwendet werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine Protease zur Verfügung zu stellen, die die Lederqualität verbessert, den Verschmutzungsgrad des Gerbereiabflusses reduziert und Gesundheitsrisiken für die Gerbereiarbeitern vermeidet.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine Protease zur Verfügung zu stellen, die zum Enthaaren von tierischem Haupthaar führt, was intaktes Haar ergibt, das als ein Nebenprodukt verwendet werden kann.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine Protease zur Verfügung zu stellen, die Albumin hydrolisiert und daher beim Einweichen eines Tierfells verwendet werden kann.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, einen Prozess zur Herstellung einer Protease aus einem bakteriellen Stamm, Pseudomonas aeruginosa MCM B-327, isoliert aus kompostiertem Bergwerksboden, Pune, Maharashtra, Indien und hinterlegt beim MTCC, IMTECH, Chandigarh mit der Kennzeichnungsnummer MTCC 5270, zur Verfügung zu stellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt demnach eine neue Protease aus einem Bakterienstamm von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327, hinterlegt beim MTCC, IMTECH, Chandigarh, Indien und bezeichnet als MTCC 5270, zur Verfügung, die ein Molekulargewicht im Bereich von 55 bis 70 kDa besitzt; wobei die genannte Protease eine Spezifität gegenüber dem globulären Typ von Proteinen hat; die besagte Protease Stabilität im pH-Bereich von 6.0 bis 10.0 und in einem Temperaturbereiche von 25 bis 45 Grad C besitzt; Aktivität im pH-Bereich von 6,0 bis 11,0 und in einem Temperaturbereich von 25 bis 65 Grad C aufweist; wobei die genannte Protease für ihre Aktivität und/oder Stabilität unabhängig von Kalzium-Ionen ist; die genannte Protease durch die Metalle Cu⁺², Zn⁺², Hg⁺¹ und Lösungsmittel inhibiert wird; und die genannte Protease weiterhin inert gegenüber Kollagen ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen Prozess zur Herstellung einer neuen Protease zur Verfügung, wobei die Schritte des Prozesses umfassen:

a) Anzucht von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327, hinterlegt beim MTCC, IMTECH, Chandigarh und bezeichnet als MTCC 5270 in einem Produktionsmedium, das im Wesentlichen eine Proteinquelle, eine organische Stickstoffquelle enthält, gehalten bei einem pH im Bereich von 6.0 bis 9.0, in Flüssigkulturbedingung, bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 40 Grad C, und unter Schütteln, um eine Kulturbrühe zu erhalten;
b) Ernte der aus Schritt [a] erhaltenen Kulturbrühe nach einer Zeitspanne im Bereich von 48 bis 72 Stunden gefolgt von der Abtrennung des Enzyms in wässriger Phase durch eine Aussalz-Methode, um die neue Protease zu erhalten.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der verwendete bakterielle Stamm aus kompostiertem Bergwerksboden aus Pune, Maharashtra, Indien isoliert.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die für das Produktionsmedium verwendete Proteinquelle ausgewählt werden aus landwirtschaftlichen Produkten/Nebenprodukten wie etwa entöltem Erdnusskuchen, Distelsamenkuchen, Rapssamenkuchen, Sojabohnenkuchen, Sojamehl, Sojabohnenmehl, Kichererbsenmehl, Weizenkleie, entweder einzeln oder in jeder Kombination.
In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die für das Kulturmedium verwendete organische Stickstoffquelle ausgewählt werden aus Rinderextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Trypton und Kasein, entweder einzeln oder in jeder Kombination.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die verwendete Trennungsmethode z. B. eine Ammoniumsulfat-Fällung sein.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Arten von Proteinen, die Spezifität gegenüber der Protease aufweisen, solche wie Kasein, Rinderserumalbumin (BSA), Gelatine, Azokasein, Azoalbumin, Azocoll sein.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Stabilität der Protease unabhängig von zweiwertigen Metallionen wie Ca⁺², Mg⁺².
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Metall, das Inhibierung in Bezug auf die Protease zeigt, eines wie Cu⁺², Zn⁺², Hg⁺¹ sein.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Lösungsmittel, die Inhibierung im Hinblick auf die Protease zeigen, solche wie Methanol, Benzol, 1-Pentanon und Ethanol sein.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das fibröse Protein Kollagen, gegenüber dem die Protease inert ist.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Produktionsmedium zur Herstellung der Protease wird unter der Verwendung von im Wesentlichen einer Proteinquelle und einer organischen Stickstoffquelle hergestellt. Das Medium wird bei einem pH im Bereich von 6.0 bis 9.0 gehalten. Der Bakterienstamm von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327, hinterlegt beim MTCC, IMTECH, Chandigarh, der die Hinterlegungsnummer MTCC 5270 hat, wird in besagtem Produktionsmedium für eine Periode von 48–72 Stunden in Flüssigkulturbedingung unter Schütteln gezüchtet. Das Medium wird durch Zentrifugation bei 13.000 x g geerntet. Die Proteaseaktivität des Überstandes wurde durch kaseinolytische Versuche wie folgt bestimmt. Der zellfreie Überstand (1 ml) wurde mit 4 ml Kasein (0,625% w/v) gemischt und bei 37°C für 30 Min. inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 5 ml einer 5%igen Trichloressigsäure gestoppt. Enzymatisch hydrolysiertes Kasein wurde durch die modifizierte Folin Ciocalteu-Methode bestimmt, gegenüber mit inaktivem Enzym behandeltem Kasein als Nullwert. Eine Standardkurve wurde unter der Verwendung von Standardtyrosin-Lösungen von 5–50 μg ml^–1 hergestellt. Eine Einheit der Proteaseaktivität wurde definiert als die Menge des Enzyms, die 1 μg Tyrosin pro Minute bei 37°C freisetzte. Das Enzym wurde durch 80%ige Sättigung der Ammoniumsulfat-Fällungsmethode teilweise aufgereinigt, um die neue Protease zu erhalten.
Die Kasein-hydrolisierende Aktivität des Enzyms ist im Hinblick auf Tyrosinäquivalente definiert. Das teilweise aufgereinigte Enzym ist in einem pH-Bereich von 6–11 und einem Temperaturbereich von 25–65°C stabil. Wenn das Ammoniumsulfat-gefällte Enzym bei Raumtemperatur (28 ± 2°C) für 8 Monate gelagert wurde, wurde eine 100%ige Aktivität beibehalten.
Das Erfinderische der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass eine Protease des Molekulargewichts von so hoch wie 60 kDa zur Verfügung gestellt wird, die keine kollagenolytische Aktivität besitzt.

Im folgenden werden vergleichende Daten zur Verfügung gestellt, die sich auf die Protease der vorliegenden Erfindung und die von Najafi et al (Electronic Journal of Biotechnology 8, 2005) aus einem anderen Stamm von Pseudomonas aeruginosa hergestellte beziehen. Vergleichende Beschreibung der Protease aus P. aeruginosa im Hinblick auf seine Produktion, Eigenschaften und Anwendung.

Sr. No.	Eigenschaften	Das Enzym in Bezug auf P. aeruginosa PD100 des Stands der Technik	Enzym in Bezug auf P. aeruginosa MTCC 5270 der vorliegenden Erfindung
1	Produktionsmedium	CYKN (Kasein, Hefeextrakt, K₂HPO₄, NaCl)	ST (Sojabohnenmehl, Trypton), & Grammehl-Sojamehl
2	Produktions-pH-Wert	7.5	6.0–9.0, optimal 7.0
3	Produktionstemperatur	Nicht erwähnt	25–40°C, optimal 30°C
4	Produktionszeit	24 Stunden	48 bis 72 Stunden
5	Optimaler pH für die Aktivität	8.0	8..0
6	pH-Stabilität	6.5–11	6–11
7	Optimale Temperatur für die Aktivität	60°C	37°C
8	Temperaturstabilität	55°C	25–65°C
9	Substratspezifität	Kollagen, Fibrin, Azokasein, Kasein, Hämoglobin, BSA, Ovalbumin, Elastin	Kasein, Azokasein, Azocoll, Azoalbumin, BSA, Gelatine
10	Inhibitoren	Ag⁺², Ni⁺² _, Cu⁺², Zn⁺², β-ME, DTNB, DEPC, Jodoacetamid, HNBB, NEM	Hg⁺¹, Cu⁺², Zn⁺², DTT, H₂O₂
11	Aktive Stelle	Das Enzym besitzt eine Thiol-Gruppe an der aktiven Stelle	Das Enzym besitzt keine Thiol- oder Seringruppe an der aktiven Stelle
12	Molekulargewicht	38–36 kDa	~ 60 kDa
13	Anwendung	Enthaarung von Kuhfell	Enthaarung von Büffelfell, Kuhfell, Ziegenhaut, Schafhaut
14	Anwendungs-pH	Alkalisch (pH 8.0)	Neutral (pH 7,0)
15	Anwendungstemperatur	50°C	Raumtemperatur (10–40°C)
16	Anwendungslösungsmittel/Puffer	Tris-HCl Puffer	Wasser
17	Anwendungszeit	2.30–3 Stunden	5–21 Stunden
18	Nebeneffekt	Abbau der Haut aufgrund der kollagenolytischen Aktivität	Keiner, da die isolierte Protease keine kollagenolytische Aktivität besitzt
19	Weitere Anwendungen	Abfallbehandlung, Reinigungsmittel	Reinigungsmittel, Wiedererlangung von Ag aus gebrauchtem Fotofilm, Herstellung von Proteinhydrolysat

Die folgenden Beispiele dienen nur der Illustration und sollten deshalb nicht als Limitierung der Reichweite der vorliegenden Erfindung betrachtet werden.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel stellt die Herstellung der Protease unter der Verwendung von Sojabohnenmehl und Trypton (HiMedia) im Schüttelkolben-Maßstab dar. Zellen von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 wurden aus der Glycerol-Stammlösung (1 Behältnis von 1 ml) in 10 ml Nährmedium (Pepton, Rinderextrakt, Hefeextrakt, Natriumchlorid) überführt und unter Schüttelkulturbedingung 21–24 Stunden bei 30°C inkubiert. Ein ml der Zelllösung wurde dann in 150 ml Nahrungsagar überimpft und bei 30°C für 21–24 Stunden inkubiert. Die gewachsenen Zellen wurde in 15 ml steriler Salzlösung resuspendiert und 1 ml (10⁹ Zellen ml^–1) wurde in 100 ml Produktionsmedium, hergestellt durch das Einbringen von 1 g Sojabohnenmehl + 1 g Trypton in 100 ml destilliertes Wasser mit einem pH von 7,0, überimpft. Das Medium wurde bei 30°C für 72 Stunden unter Schüttelbedingung (150 rpm) inkubiert. Die Proteaseaktivität wurde durch die kaseinolytische Versuchsmethode bestimmt. Für Aktivität des zellfreien Überstandes wurde ein Wert von 324 U ml^–1min^–1 bei 72 Stunden gefunden.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel stellt die Herstellung der Protease unter der Verwendung von käuflich erhältlichem Sojabohnenmehl im Schüttelkolben-Maßstab dar. Zellen von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 wurden aus der Glycerol-Stammlösung (1 Behältnis von 1 ml) in 10 ml Nährmedium (Pepton, Rinderextrakt, Hefeextrakt, Natriumchlorid) überführt und unter Schüttelkulturbedingung 21–24 Stunden bei 30°C inkubiert. Ein ml der Zelllösung wurde dann in 150 ml Nahrungsagar überimpft und bei 30°C für 21–24 Stunden inkubiert. Die gewachsenen Zellen wurde in 15 ml steriler Salzlösung resuspendiert und 1 ml (10⁹ Zellen ml^–1) wurde in 100 ml Produktionsmedium, hergestellt durch das Einbringen von 1 g käuflich erhältlichem Sojabohnenmehl in 100 ml destilliertes Wasser mit einem pH von 7,0, überimpft. Das Medium wurde bei 30°C für 72 Stunden unter Schüttelbedingung bei 150 rpm inkubiert. Die Proteaseaktivität wurde durch die kaseinolytische Versuchsmethode bestimmt. Die Aktivität des zellfreien Überstandes betrug 296 U ml^–1min^–1 bei 72 Stunden.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel stellt die Herstellung der Protease unter der Verwendung von Kichererbsen-Mehl im Schüttelkolben-Maßstab dar. Zellen von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 wurden aus der Glycerol-Stammlösung (1 Behältnis von 1 ml) in 10 ml Nährmedium (Pepton, Rinderextrakt, Hefeextrakt, Natriumchlorid) überführt und unter Schüttelkulturbedingung 21–24 Stunden bei 30°C inkubiert. Ein ml der Zelllösung wurde dann in 150 ml Nahrungsagar überimpft und bei 30°C für 21–24 Stunden inkubiert. Die gewachsenen Zellen wurde in 15 ml steriler Salzlösung resuspendiert und 1 ml (10⁹ Zellen ml^–1) wurde in 100 ml Produktionsmedium, hergestellt durch das Einbringen von 1 g Kichererbsen-Mehl in 100 ml destilliertes Wasser mit einem pH von 7,0, überimpft. Das Medium wurde bei 30°C für 72 Stunden unter Schüttelbedingung (150 rpm) inkubiert. Die Proteaseaktivität wurde durch die kaseinolytische Versuchsmethode bestimmt. Die Aktivität des zellfreien Überstandes betrug 181 U ml^–1min^–1 bei 72 Stunden.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel stellt die Herstellung der Protease unter der Verwendung von Kichererbsen-Mehl + Weizenkleie im Schüttelkolben-Maßstab dar. Zellen von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 wurden aus der Glycerol-Stammlösung (1 Behältnis von 1 ml) in 10 ml Nährmedium (Pepton, Rinderextrakt, Hefeextrakt, Natriumchlorid) überführt und unter Schüttelkulturbedingung 21–24 Stunden bei 30°C inkubiert. Ein ml der Zelllösung wurde dann in 150 ml Nahrungsagar überimpft und bei 30°C für 21–24 Stunden inkubiert. Die gewachsenen Zellen wurde in 15 ml steriler Salzlösung resuspendiert und 1 ml (10⁹ Zellen ml^–1) wurde in 100 ml Produktionsmedium, hergestellt durch das Einbringen von 1 g Kichererbsen-Mehl + 1 g Weizenkleie in 100 ml destilliertes Wasser mit einem pH von 7,0, überimpft. Das Medium wurde bei 30°C für 72 Stunden unter Schüttelbedingung (150 rpm) inkubiert. Die Proteaseaktivität wurde durch die kaseinolytische Versuchsmethode bestimmt. Die Aktivität des zellfreien Überstandes betrug 196 U ml^–1min^–1 bei 72 Stunden.
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel stellt die Herstellung der Protease unter der Verwendung von Kichererbsen-Mehl + Trypton im Schüttelkolben-Maßstab dar. Zellen von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 wurden aus der Glycerol-Stammlösung (1 Behältnis von 1 ml) in 10 ml Nährmedium (Pepton, Rinderextrakt, Hefeextrakt, Natriumchlorid) überführt und unter Schüttelkulturbedingung 21–24 Stunden bei 30°C inkubiert. Ein ml der Zelllösung wurde dann in 150 ml Nahrungsagar überimpft und bei 30°C für 21–24 Stunden inkubiert. Die gewachsenen Zellen wurde in 15 ml steriler Salzlösung resuspendiert und 1 ml (10⁹ Zellen ml^–1) wurde in 100 ml Produktionsmedium, hergestellt durch das Einbringen von 1 g Kichererbsen-Mehl + 1 g Trypton in 100 ml destilliertes Wasser mit einem pH von 7,0, überimpft. Das Medium wurde bei 30°C für 72 Stunden unter Schüttelbedingung (150 rpm) inkubiert. Die Proteaseaktivität wurde durch die kaseinolytische Versuchsmethode bestimmt. Die Aktivität des zellfreien Überstandes betrug 309 U ml^–1min^–1 bei 72 Stunden.
BEISPIEL 6
Dieses Beispiel stellt die Herstellung der Protease unter der Verwendung von Kichererbsen-Mehl + entfettetem Sojabohnenkuchen im Schüttelkolben-Maßstab dar. Zellen von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 wurden aus der Glycerol-Stammlösung (1 Behältnis von 1 ml) in 10 ml Nährmedium (Pepton, Rinderextrakt, Hefeextrakt, Natriumchlorid) überführt und unter Schüttelkulturbedingung 21–24 Stunden bei 30°C inkubiert. Ein ml der Zelllösung wurde dann in 150 ml Nahrungsagar überimpft und bei 30°C für 21–24 Stunden inkubiert. Die gewachsenen Zellen wurde in 15 ml steriler Salzlösung resuspendiert und 1 ml (10⁹ Zellen ml^–1) wurde in 100 ml Produktionsmedium, hergestellt durch das Einbringen von 1 g Kichererbsen-Mehl + 1 g entfettetem Sojabohnenkuchen in 100 ml destilliertes Wasser mit einem pH von 7,0, überimpft. Das Medium wurde bei 30°C für 72 Stunden unter Schüttelbedingung (150 rpm) inkubiert. Die Proteaseaktivität wurde durch die kaseinolytische Versuchsmethode bestimmt. Die Aktivität des zellfreien Überstandes betrug 341 U ml^–1min^–1 bei 72 Stunden.
BEISPIEL 7
Dieses Beispiel stellt die Herstellung der Protease unter der Verwendung von Weizenkleie + Trypton im Schüttelkolben-Maßstab dar. Zellen von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 wurden aus der Glycerol-Stammlösung (1 Behältnis von 1 ml) in 10 ml Nährmedium (Pepton, Rinderextrakt, Hefeextrakt, Natriumchlorid) überführt und unter Schüttelkulturbedingung 21–24 Stunden bei 30°C inkubiert. Ein ml der Zelllösung wurde dann in 150 ml Nahrungsagar überimpft und bei 30°C für 21–24 Stunden inkubiert. Die gewachsenen Zellen wurde in 15 ml steriler Salzlösung resuspendiert und 1 ml (10⁹ Zellen ml^–1) wurde in 100 ml Produktionsmedium, hergestellt durch das Einbringen von 1 g Weizenkleie + 1 g Trypton in 100 ml destilliertes Wasser mit einem pH von 7,0, überimpft. Das Medium wurde bei 30°C für 72 Stunden unter Schüttelbedingung (150 rpm) inkubiert. Die Proteaseaktivität wurde durch die kaseinolytische Versuchsmethode bestimmt. Die Aktivität des zellfreien Überstandes betrug 385 U ml^–1min^–1 bei 72 Stunden.
BEISPIEL 8
Dieses Beispiel stellt die Herstellung der Protease unter der Verwendung von Rinderextrakt im Schüttelkolben-Maßstab dar. Zellen von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 wurden aus der Glycerol-Stammlösung (1 Behältnis von 1 ml) in 10 ml Nährmedium (Pepton, Rinderextrakt, Hefeextrakt, Natriumchlorid) überführt und unter Schüttelkulturbedingung 21–24 Stunden bei 30°C inkubiert. Ein ml der Zelllösung wurde dann in 150 ml Nahrungsagar überimpft und bei 30°C für 21–24 Stunden inkubiert. Die gewachsenen Zellen wurde in 15 ml steriler Salzlösung resuspendiert und 1 ml (10⁹ Zellen ml^–1) wurde in 100 ml Produktionsmedium, hergestellt durch das Einbringen von 1 g Rinderextrakt in 100 ml destilliertes Wasser mit einem pH von 7,0, überimpft. Das Medium wurde bei 30°C für 72 Stunden unter Schüttelbedingung (150 rpm) inkubiert. Die Proteaseaktivität wurde durch die kaseinolytische Versuchsmethode bestimmt. Die Aktivität des zellfreien Überstandes betrug 196 U ml^–1min^–1 bei 72 Stunden.
BEISPIEL 9
Dieses Beispiel stellt die Herstellung der Protease unter der Verwendung von Hefeextrakt im Schüttelkolben-Maßstab dar. Zellen von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 wurden aus der Glycerol-Stammlösung (1 Behältnis von 1 ml) in 10 ml Nährmedium (Pepton, Rinderextrakt, Hefeextrakt, Natriumchlorid) überführt und unter Schüttelkulturbedingung 21–24 Stunden bei 30°C inkubiert. Ein ml der Zelllösung wurde dann in 150 ml Nahrungsagar überimpft und bei 30°C für 21–24 Stunden inkubiert. Die gewachsenen Zellen wurde in 15 ml steriler Salzlösung resuspendiert und 1 ml (10⁹ Zellen ml^–1) wurde in 100 ml Produktionsmedium, hergestellt durch das Einbringen von 1 g Hefeextrakt in 100 ml destilliertes Wasser mit einem pH von 7,0, überimpft. Das Medium wurde bei 30°C für 72 Stunden unter Schüttelbedingung (150 rpm) inkubiert. Die Proteaseaktivität wurde durch die kaseinolytische Versuchsmethode bestimmt. Die Aktivität des zellfreien Überstandes betrug 127 U ml^–1min^–1 bei 72 Stunden.
BEISPIEL 10
Dieses Beispiel stellt die Herstellung der Protease unter der Verwendung von Pepton im Schüttelkolben-Maßstab dar. Zellen von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 wurden aus der Glycerol-Stammlösung (1 Behältnis von 1 ml) in 10 ml Nährmedium (Pepton, Rinderextrakt, Hefeextrakt, Natriumchlorid) überführt und unter Schüttelkulturbedingung 21–24 Stunden bei 30°C inkubiert. Ein ml der Zelllösung wurde dann in 150 ml Nahrungsagar überimpft und bei 30°C für 21–24 Stunden inkubiert. Die gewachsenen Zellen wurde in 15 ml steriler Salzlösung resuspendiert und 1 ml (10⁹ Zellen ml^–1) wurde in 100 ml Produktionsmedium, hergestellt durch das Einbringen von 1 g Pepton in 100 ml destilliertes Wasser mit einem pH von 7,0, überimpft. Das Medium wurde bei 30°C für 72 Stunden unter Schüttelbedingung (150 rpm) inkubiert. Die Proteaseaktivität wurde durch die kaseinolytische Versuchsmethode bestimmt. Die Aktivität des zellfreien Überstandes betrug 211 U ml^–1min^–1 bei 72 Stunden.
BEISPIEL 11
Dieses Beispiel stellt die Herstellung der Protease unter der Verwendung von Trypton im Schüttelkolben-Maßstab dar. Zellen von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 wurden aus der Glycerol-Stammlösung (1 Behältnis von 1 ml) in 10 ml Nährmedium (Pepton, Rinderextrakt, Hefeextrakt, Natriumchlorid) überführt und unter Schüttelkulturbedingung 21–24 Stunden bei 30°C inkubiert. Ein ml der Zelllösung wurde dann in 150 ml Nahrungsagar überimpft und bei 30°C für 21–24 Stunden inkubiert. Die gewachsenen Zellen wurde in 15 ml steriler Salzlösung resuspendiert und 1 ml (10⁹ Zellen ml^–1) wurde in 100 ml Produktionsmedium, hergestellt durch das Einbringen von 1 g Trypton in 100 ml destilliertes Wasser mit einem pH von 7,0, überimpft. Das Medium wurde bei 30°C für 72 Stunden unter Schüttelbedingung (150 rpm) inkubiert. Die Proteaseaktivität wurde durch die kaseinolytische Versuchsmethode bestimmt. Die Aktivität des zellfreien Überstandes betrug 100 U ml^–1min^–1 bei 72 Stunden.
BEISPIEL 12
Dieses Beispiel stellt die Substratspezifität der aus Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 isolierten Protease gegenüber Kasein dar, wenn der Stamm in Sojabohnenmehl-Trypton (HiMedia) Medium angezogen wurde. Der zellfreie Überstand wurde zur Ammoniumsulfat-Fällung (80% Sättigung) der Protease benutzt. Das Enzym wurde gegen 50 mM Tris-HCl Puffer des pHs 8,0 dialysiert. Das dialysierte Enzym hydrolysierte Kasein mit einer Aktivität von 2427 U ml^–1min^–1.
BEISPIEL 13
Dieses Beispiel stellt die Substratspezifität der aus Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 isolierten Protease gegenüber Rinderserumalbumin (BSA) dar, wenn der Stamm in Sojabohnenmehl-Trypton (HiMedia) Medium angezogen wurde. Der zellfreie Überstand wurde zur Fällung der Protease benutzt. Das Enzym wurde gegen 50 mM Tris-HCl Puffer des pHs 8,0 dialysiert. Das dialysierte Enzym hydrolysierte Rinderserumalbumin (BSA) mit einer Aktivität von 773 U ml^–1min^–1.
BEISPIEL 14
Dieses Beispiel stellt die Substratspezifität der aus Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 isolierten Protease gegenüber Azocasein dar, wenn der Stamm in Sojabohnenmehl-Trypton (HiMedia) Medium angezogen wurde. Der zellfreie Überstand wurde zur Fällung der Protease benutzt. Das Enzym wurde gegen 50 mM Tris-HCl Puffer des pHs 8,0 dialysiert. Das dialysierte Enzym hydrolysierte Azocasein mit einer Aktivität von 121 U ml^–1min^–1.
BEISPIEL 15
Dieses Beispiel stellt die Substratspezifität der aus Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 isolierten Protease gegenüber Azocoll dar, wenn der Stamm in Sojabohnenmehl-Trypton (HiMedia) Medium angezogen wurde. Der zellfreie Überstand wurde zur Ammoniumsulfat-Fällung der Protease benutzt. Das Enzym wurde gegen 50 mM Tris-HCl Puffer des pHs 8,0 dialysiert. Das dialysierte Enzym hydrolysierte Azocoll mit einer Aktivität von 384 U ml^–1min^–1.
BEISPIEL 16
Dieses Beispiel stellt die Substratspezifität der aus Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 isolierten Protease gegenüber Azoalbumin dar, wenn der Stamm in Sojabohnenmehl-Trypton (HiMedia) Medium angezogen wurde. Der zellfreie Überstand wurde zur Ammoniumsulfat-Fällung der Protease benutzt. Das Enzym wurde gegen 50 mM Tris-HCl Puffer des pHs 8,0 dialysiert. Das dialysierte Enzym hydrolysierte Azoalbumin mit einer Aktivität von 77 U ml^–1min^–1.
BEISPIEL 17
Dieses Beispiel stellt die Substratspezifität der aus Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 isolierten Protease gegenüber Gelatin dar, wenn der Stamm in Sojabohnenmehl-Trypton (HiMedia) Medium angezogen wurde. Der zellfreie Überstand wurde zur Ammoniumsulfat-Fällung der Protease benutzt. Das Enzym wurde gegen 50 mM Tris-HCl Puffer des pHs 8,0 dialysiert. Das dialysierte Enzym hydrolysierte Gelatin mit einer Aktivität von 698 U ml^–1min^–1.
BEISPIEL 18
Dieses Beispiel stellt die massenspektroskopische Analyse des Kollagenasesubstrats I zur Detektion der Kollagenaseaktivität im Rohenzym von P. aeruginosa MCM B-327 unter der Verwendung von MALDI-MS dar.
Kollagenasesubstrat I
Das Fluoreszenzexperiment wurde in Triethanolamin-Puffer (TEA), pH 8 bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Versuchsansatz enthielt üblicherweise 294 μl TEA Puffer 100 mM, pH 8, mit einer Substratkonzentration von 1.6 μM (5 μl einer 80 mM Stammlösung). Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 5 μl des Rohenzyms nach 10-facher Verdünnung gestartet. Die Anregungswellenlänge war 340 nm und die Fluoreszenzintensität wurde bei der Emissionswellenlänge von 490 nm zu verschiedenen Zeitintervallen gemessen.
Das Rohenzym wurde auf echte Kollagenaseaktivität gegenüber Kollagenasesubstrat I untersucht und es wurde gefunden, dass es inaktiv ist, was zeigt, dass das Enzym vom nicht-Kollagenase-Typ ist.
BEISPIEL 19
Dieses Beispiel stellt die Produktion der Protease unter der Verwendung eines 10 l Glasfermentors dar. Zellen von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 wurden aus der Glycerol-Stammlösung (1 Behältnis von 1 ml) in 10 ml Nährmedium (Pepton, Rinderextrakt, Hefeextrakt, Natriumchlorid) überführt und unter Schüttelkulturbedingung bei 30°C inkubiert. Nach 21–24 Stunden wurde die Kulturlösung zu 700 ml Nährlösung überführt und unter denselben Bedingungen inkubiert. Die Kulturlösung (700 ml) wurde zu 7 l Produktionsmedium überführt, welches (g/l) Sojabohnenmehl-10 und Trypton-10 enthielt. Der Fermentor wurde bei 30°C für 48 Stunden mit einer Agitation von 250 rpm und einer Sauerstoffsättigung von 0,75 vvm betrieben. Die Aktivität im zellfreien Überstand lag bei 769 U ml^–1min^–1 bei 48 Stunden. Die spezifische Aktivität des Ammoniumsulfat-gefällten Enzyms lag bei 1017 U mg^–1 Protein.
BEISPIEL 20
Dieses Beispiel stellt den Effekt des pH auf die Aktivität und Stabilität der Protease isoliert aus Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 dar, wenn der Stamm in Sojabohnenmehl-Trypton (HiMedia) Medium angezogen wurde. Die Protease aus dem zellfreien Überstand wurde durch Salz gefällt und ihre Aktivität wie auch Stabilität bei verschiedenem pH wurde untersucht. Der optimale pH für die Proteaseaktivität war 8.0, bestimmt bei 37°C. Die Aktivität nahm nach pH 8.0 ab und lag bei 85% bzw. 70% des Maximums bei pH 10.0 bzw. 11.0. Das Enzym war sogar bei pH 12 aktiv (1).
Die pH-Stabilität der Protease wurde durch Inkubation des Enzyms für 30 Minuten und 3 Stunden bei einem pH-Bereich von 5 bis 12 bestimmt. Die in 2 gezeigten Daten zeigen, dass das Enzym in einem pH-Bereich von 6–10 stabil war. Das Enzym behielt 85% bzw. 70% seiner Aktivität bei 37°C bei pH 9.0 bzw. 10.0 bis zu 3 Stunden.
BEISPIEL 21
Dieses Beispiel stellt den Effekt der Temperatur auf die Aktivität und Stabilität der Protease isoliert aus Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 dar, wenn der Stamm in Sojabohnenmehl-Trypton (HiMedia) Medium angezogen wurde. Der zellfreie Überstand wurde durch Salz gefällt und für die Temperaturaktivität wie auch die Stabilität benutzt. Die optimale Temperatur für die Proteaseaktivität wurde durch Variieren der Reaktionstemperatur bei pH 8,0 bestimmt. Die Aktivität des Enzyms wurde zwischen 25 und 80°C untersucht. Das Temperaturoptimum für die proteolytische Aktivität lag bei 37°C. Das Enzym hatte 90% bzw. 75% der maximalen Aktivität bei 50°C bzw. 65°C (3) mit einer starken Abnahme der Aktivität nach 65°C.
Die thermale Stabilität der Protease wurde durch Inkubation des Enzyms für 30 Minuten und 3 Stunden bei verschiedenen Temperaturen in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) bestimmt. Die in 4 gezeigten Daten zeigen, dass das Enzym stabil bis zu 45°C war, gefolgt von einem schnellen Verlust der Aktivität nach 55°C. Das Enzym behielt mehr als 75% und 50% Aktivität bei 55°C für 30 Minuten bzw. 3 Stunden. Das Enzym war jedoch bei 80°C komplett inaktiviert.
BEISPIEL 22

Dieses Beispiel stellt den Effekt von Metallionen auf die Aktivität der Protease isoliert aus Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 dar, wenn der Stamm in Sojabohnenmehl-Trypton (HiMedia) Medium angezogen wurde. Der zellfreie Überstand wurde durch Salz gefällt und für diese Untersuchung in Tris-HCl Puffer, pH 8.0 bei 37°C verwendet. Das Enzym war resistent gegenüber einer Inhibierung durch Ca⁺⁺, Fe⁺⁺, Na⁺, Mg⁺⁺ und Mn⁺⁺; Cu⁺⁺, Zn⁺⁺ und Hg⁺ beeinflussten jedoch die Aktivität des Enzyms maßgeblich. Das Enzym braucht kein Kalzium-Ion für seine Aktivität und/oder Stabilität (Tabelle 1). Tabelle 1. Effekt von Metallionen auf die Proteaseaktivität

Metallionen	Enzymaktivität (U/mg gefälltes Enzym)
Keine	42.77
CaCl₂	42.34
CuSO₄	10.69
ZnSO₄	12.40
FeSO₄	37.64
NaCl	41.06
MgSO₄	42.77
MnSO₄	37.21
HgCl₂	9.83 & 6.84
Alle Metallionen bei 5 mM Konzentration und HgCl₂ bei 1 & 5 mM

BEISPIEL 23

Dieses Beispiel stellt den Effekt von Inhaltsstoffen von Reinigungsmitteln auf die Aktivität der Protease isoliert aus Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 dar, wenn dieser im Sojabohnenmehl-Trypton (HiMedia) Medium angezogen wurde. Der zellfreie Überstand wurde durch Salz gefällt und für diese Untersuchung in Tris-HCl Puffer, pH 8.0 bei 37°C verwendet. Das Enzym und die Inhaltsstoffe der Reinigungsmittel wurden für 30 inkubiert, und zwar vor der Enzymbestimmung. Das Enzym war stabil in Reinigungsmittel-Inhaltsstoffen, wohingegen 20% durch SDS inhibiert wurden. Detergenzien wie Tween 80 und Triton X100 hatten keinen inhibitorischen Effekt auf die Proteaseaktivität (Tabelle 2). Tabelle 2. Effekt von Inhaltsstoffen von Reinigungsmitteln auf die Proteaseaktivität

Inhaltsstoffe der Reinigungsmittel (1%)	Enzymaktivität (U/mg präzipitiertes Enzym)
Keine	42.77
SDS	34.21
Natriumtripolyphosphat	44.05
Natriumtetraborat	41.91
Tween 80	43.62
Triton X100	41.49

BEISPIEL 24
Dieses Beispiel stellt den Effekt von käuflich erhältlichen Reinigungsmitteln auf die Aktivität der Protease isoliert aus Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 dar, wenn dieser im Sojabohnenmehl-Trypton (HiMedia) Medium angezogen wurde. Der zellfreie Überstand wurde durch Salz gefällt und für diese Untersuchung in Tris-HCl Puffer, pH 8.0 bei 37°C verwendet. Das Enzym und die käuflich erhältlichen Reinigungsmittel (1:5 Verhältnisse) wurden für 30 Minuten inkubiert, und zwar vor der Enzymbestimmung. Das Enzym zeigte 69–92%ige Aktivität in käuflich erhältlichen Reinigungsmitteln wie Tide^®, Ariel^®, Nirma^®, Rin Shakti^® und Surf excel^® (Tabelle 3). Tabelle 3. Effekt von käuflich erhältlichen Reinigungsmitteln auf die Proteaseaktivität

Käuflich erhältliche Reinigungsmittel (1%) Enzymaktivität (U/mg gefälltes Enzym)

Keines 15.49

Tide^® 10.69

Ariel^® 11.15

Nirma^® 11.46

Rin Shakti^® 13.16

Surf excel^® 14.25
BEISPIEL 25

Dieses Beispiel stellt den Effekt von Inhibitoren auf die Aktivität der Protease isoliert aus Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 dar, wenn dieser im Sojabohnenmehl-Trypton (HiMedia) Medium angezogen wurde. Der zellfreie Überstand wurde durch Salz gefällt und für diese Untersuchung in Tris-HCl Puffer, pH 8.0 bei 37°C verwendet. Das Enzym und der Inhibitor wurden 30 Minuten inkubiert, und zwar vor der Enzymbestimmung. Das Enzym wurde vollständig durch DTT inhibiert. Das Enzym wurde zu 25–30% durch PMSF und EDTA bei 5 mM Konzentration inhibiert (Tabelle 4). Tabelle 4. Effekt von Inhibitoren auf die Proteaseaktivität

Inhibitoren	Konzentration	Enzymaktivität (U/mg gefälltes Enzym)
Keiner	-	42.77
EDTA	2 & 5 mM	32.93 & 30.36
PMSF	1 & 5 mM	40.20 & 31.65
Jodoacetamid	1 & 5 mM	44.05 & 43.62
DTT	1 & 5 mM	0
Trypsininhibitor	100 μg	37.21

(EDTA-Ethylendiamintetra-Essigsäure; PMSF-Phenylmethylsulfonylfluorid, DTT-Dithiothreitol)

BEISPIEL 26

Dieses Beispiel stellt den Effekt von organischen Lösungsmitteln auf die Aktivität der Protease isoliert aus Pseudomonas aeruginosa MCM B-327 dar, wenn dieser im Sojabohnenmehl-Trypton (HiMedia) Medium angezogen wurde. Der zellfreie Überstand wurde durch Salz gefällt und für diese Untersuchung in Tris-HCl Puffer, pH 8.0 bei 37°C verwendet. Das Enzym zeigte mehr als 60% Aktivität in n-Hexan, Isooktan und m-p-Xylol bei 50% v/v Konzentration nach 30-minütiger Inkubation. Das Enzym wurde zu 51% durch Toluol inhibiert, zu 70–75% durch Methanol, Aceton, Benzol, 1-Pentanon und, zu 91% durch Ethanol (Tabelle 5) inhibiert.

Organische Lösungsmittel (50%)	Enzymaktivität (U/mg gefälltes Enzym)
Keines	42.77
n-Hexan	26.94
Isooktan	28.65
m-p-Xylol	28.65
Toluol	20.95
Methanol	14.11
Aceton	13.68
Benzol	11.54
1-Pentanon	11.54
Ethanol	3.84

Table 5. Effekt von organischen Lösungsmitteln auf die Proteaseaktivität

BEISPIEL 27
Dieses Beispiel stellt die Anwendung des Proteaseenzyms zur Enthaarung von Ziegenfell dar. Nass gesalzenes Ziegenfell von 1,5 kg wurde zur Enthaarung verwendet. Das Voreinweichen wurde mit 300% Wasser in einer Pit-Methode ausgeführt. Das eingeweichte Fell wurde zweimal in einer Stunde behandelt. Das Enzym, 1% (w/w des Fells) wurde mit 10% Wasser gemischt und auf die Fleischseite des Fells aufgebracht. Nach 15–18 Stunden wurde die Enthaarung unter der Verwendung eines stumpfen Messers ausgeführt.
Visuelle Inspektionsuntersuchungen des durch das Enzym enthaarten Fells ergaben die komplette Entfernung von Haaren. Das Fell war weißer in der Farbe im Vergleich zu einer Kontrolle, bei welcher die Enthaarung unter der Verwendung konventioneller chemischer Methoden durchgeführt wurde. Physikalische Testergebnisse ergaben, dass das unter der Verwendung der Protease erhaltene Leder vergleichbar zu dem war, das durch Kalk und Sulfid erhalten wurde. Histopathologische Untersuchungen des unter der Verwendung der Protease enthaarten Fells ergaben, dass die Epidermis total entfernt war, mit einer teilweisen Öffnung von Kollagenfasern mit leeren Follikeln, wohingegen die konventionelle Enthaarung Haarfollikel und dicke Kollagenbündel zeigte.
BEISPIEL 28
Dieses Beispiel stellt die Anwendung des Proteaseenzyms zur Enthaarung von Büffelfell dar. Nasses gesalzenes Büffelfell von ungefähr 5 kg wurde zur Enthaarung verwendet. Stücke der Nackenregion des Tieres, die eine höhere Dicke des Fells zeigen, wurden auch mit einbezogen. Das Voreinweichen wurde mit 300% Wasser in einer Pit-Methode durchgeführt. Das eingeweichte Fell wurde periodisch bis zu 24 Stunden behandelt. Die Paste von 3% Enzym in 10% Wasser wurde auf die Narbenseite des Fells aufgebracht. Nach 18–21 Stunden wurde die Enthaarung unter der Verwendung eines stumpfen Messers durchgeführt.
Visuelle Inspektionsuntersuchungen des durch das Enzym enthaarten Fells ergaben die vollständige Entfernung von Haaren. Das Fell war weißer als eine Kontrolle, bei der die Enthaarung unter der Verwendung einer konventionellen chemischen Methode durchgeführt wurde. Physikalische Testergebnisse zeigten, dass das unter der Verwendung der Protease erhaltene Leder vergleichbar war zu denen, die durch Kalk und Sulfid erhalten wurden. Histopathologische Untersuchungen des unter der Verwendung der Protease hergestellten enthaarten Fells ergaben, dass die Epidermis komplett entfernt war, mit teilweise geöffneten Kollagenbündeln mit leeren Follikeln, wohingegen die konventionelle Enthaarung Haarfollikel und dicke Kollagenbündel zeigte.
VORTEILE
Die Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung sind die folgenden:

a) Die Protease der vorliegenden Erfindung wird mit billigen Substraten hergestellt, um die Produktionskosten zu reduzieren.
b) Die Protease der vorliegenden Erfindung ist in einem weiten pH-Bereich von 6–11 und Temperaturbereich von 25–65°C aktiv.
c) Für die Protease der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass sie stabil in der Präsenz von SDS, Natriumtripolyphosphat, Natriumtetraborat, Tween 80, Triton X100 ist, welche Inhaltsstoffe von käuflich erhältlichen Reinigungsmitteln und Detergenzien sind. Sie ist auch aktiv in käuflich erhältlichen Reinigungsmitteln wie Tide^®, Ariel^®, Nirma^®, Rin Shakti^® and Surf excel^®.
d) Für die Protease der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass sie für ihre Aktivität und/oder Stabilität unabhängig von Kalzium-Ionen ist.
e) Für die Protease der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass sie zur Enthaarung von tierischen Häuten wie auch Fellen geeignet ist.
f) Enzymatisch hergestelltes nasses blaues und Platten-Leder waren von mit Kontrollen vergleichbarer Qualität.
g) Die Protease der vorliegenden Erfindung kann die Lederqualität verbessern, die Verunreinigungsmenge der Gerbereiabfälle reduzieren und Gesundheitsrisiken für die Gerbereiarbeiter vermeiden.
h) Die vorliegende Protease führt zur Enthaarung von tierischem Fell von Haupthaar, was zu intakten Haaren führt, die als ein Nebenprodukt verwendet werden können.
i) Für die Protease der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass sie Albumin hydrolysiert, und demnach beim Einweichen eines tierischen Fells verwendet werden könnte.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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- Rahman et al., berichtet (Applied Microbiology and Biotechnology 40, 822–827, 1994) [0010]
- Ogino et al., (Journal of Bioscience and Bioengineering 87 (1), 61–68, 1999) [0012]
- Böckle et al. berichtet (Applied and Environmental Microbiology 61, 3705–3710, 1995) [0012]
- Najafi et al., (Electronic Journal of Biotechnology 8 (2), 197–203, 2005) [0013]
- Ogino et al. berichtet (Journal of Bioscience and Bioengineering 88 (5), 513–518, 1999) [0013]
- Alexandre et al. berichtet (Applied and Environmental Microbiology 71, 594–596, 2005) [0014]
- Nilegaonkar et al. (Bioresource Technology 2006, in press) [0014]
- Gehring et al. berichtet (Journal of American Leather Chemists Association 97, 406–411, 2002) [0014]
- Yeshodha et al. (Leather Science, 25, 36–45, 1978) [0014]
- Bayoudh et al. berichtet (Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 24, 291–295, 2000) [0015]
- Wang und Chio (Enzyme and Microbial Technology 22, 629–633, 1998) [0015]
- Najafi et al. (Electronic Journal of Biotechnology 8 (2), 197–203, 2005) [0015]
- Najafi et al. (Electronic Journal of Biotechnology 8 (2), 197–203, 2005) [0016]
- Najafi et al. (Electronic Journal of Biotechnology 8 (2), 197–203, 2005) [0016]
- Najafi et al (Electronic Journal of Biotechnology 8, 2005) [0044]

Claims

Eine neue Protease, erhalten aus einem bakteriellen Stamm von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327, hinterlegt beim MTCC, IMTECH, Chandigarh, Indien und bezeichnet als MTCC 5270, mit den folgenden Eigenschaften: [a] Molekulargewicht im Bereich von 55 bis 70 kDa; [b] Spezifität gegenüber Proteinen des globulären Typs; [c] Stabilität im pH-Bereich von 6,0 bis 10,0 und Temperaturbereich von 25 bis 45°C; [d] Aktivität im pH-Bereich von 6,0 bis 11,0 und Temperaturbereich von 25 bis 65°C; [e] die Aktivität und/oder Stabilität der genannten Protease ist unabhängig von Kalzium-Ionen; [f] die genannte Protease wird durch die Metalle Cu⁺², Zn⁺², Hg⁺¹ und Lösungsmittel inhibiert; [g] die genannte Protease ist inert gegenüber Kollagen.
Eine neue Protease gemäß Anspruch 1, wobei ihre Substrate ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Kasein, Rinderserumalbumin, Gelatine, Azokasein, Azoalbumin, Azocoll.
Eine neue Protease gemäß Anspruch 1, wobei die Protease inert gegenüber fasrigem Protein-Kollagen ist.
Eine neue Protease gemäß Anspruch 1, wobei die Stabilität der Protease unabhängig von zweiwertigen Metallionen wie Ca⁺² und Mg⁺² ist.
Eine neue Protease gemäß Anspruch 1, wobei sie in der Anwesenheit von Metallen wie Cu⁺², Zn⁺², Hg⁺¹ Inhibition zeigt.
Eine neue Protease gemäß Anspruch 1, wobei sie in der Anwesenheit von Lösungsmitteln wie Methanol, Benzol, 1-Pentanon und Ethanol Inhibition zeigt.
Eine neue Protease gemäß Anspruch 1, wobei die genannte Protease zur Enthaarung von tierischen Häuten und Fellen, als Zusatzstoff in Reinigungsmitteln, zur Herstellung von Proteinhydrolysat und Wiedererlangung von Silber aus Röntgen- und Fotografiefilmen anwendbar ist.
Ein Verfahren zur Herstellung der neuen Protease gemäß Anspruch 1, wobei das genannte Verfahren umfasst: a) Anzucht von Pseudomonas aeruginosa MCM B-327, hinterlegt beim MTCC, IMTECH, Chandigarh und bezeichnet als MTCC 5270 in einem Produktionsmedium im Wesentlichen enthaltend eine Proteinquelle, eine organische Stickstoffquelle, gehalten bei einem pH-Bereich von 6,0 bis 9,0, in Flüssigkulturbedingungen, bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 40°C, unter Schüttelbedingungen, um eine Kulturlösung zu erhalten; b) Ernte der durch Schritt [a] erhaltenen Kulturbrühe nach einer Zeitspanne im Bereich von 48 bis 72 Stunden, gefolgt von der Abtrennung des Enzyms in flüssiger Phase durch eine Aussalzmethode, um die neue Protease zu erhalten.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der verwendete bakterielle Stamm aus kompostiertem Bergwerksboden, Pune, Maharashtra, Indien isoliert ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die für das Produktionsmedium verwendete Proteinquelle ausgewählt ist aus landwirtschaftlichen Produkten/Nebenprodukten, so wie entöltem Erdnusskuchen, Distelsamenkuchen, Rapssamenkuchen, Sojabohnenkuchen, Sojamehl, Sojabohnenmehl, Kichererbsen-Mehl, Weizenmehl, entweder einzeln oder in jeder Kombination.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die für das Produktionsmedium verwendete organische Stickstoffquelle ausgewählt ist aus Rinderextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Trypton und Kasein, entweder einzeln oder in jeder Kombination.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die zur Abtrennung der Protease verwendete Methode z. B. eine Ammoniumsulfatfällung ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei jeweils 1% von Sojabohnenmehl und Trypton als Ausgangsmaterialien im Produktionsmedium zur Herstellung der Protease bei einem pH von 8,0, einer Inokkulationsdichte von 10⁹ CFU/ml von P. aeruginosa MTCC 5270, bei einer Temperatur von 30 Grad C für einen Zeitspanne von 72 Stunden unter Schüttelkulturbedingungen verwendet werden.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die genannte Protease zur Enthaarung von tierischen Häuten und Fellen, als ein Zusatzstoff in Reinigungslösungen, zur Herstellung von Proteinhydrolysat und Wiedererlangung von Silber aus Röntgen- und Fotografiefilmen verwendbar ist.