DD236554A1

DD236554A1 - Indikatorsystem zur bestimmung von hydroperoxiden und peroxidatisch wirkenden substanzen

Info

Publication number: DD236554A1
Application number: DD27551085A
Authority: DD
Inventors: Wolfgang Goedicke; Ingrid Goedicke
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1985-04-24
Filing date: 1985-04-24
Publication date: 1986-06-11

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Indikatorsystem zur Bestimmung von Hydroperoxiden und peroxidatisch wirkenden Substanzen. Das erfindungsgemaesse Indikatorsystem besteht aus einem Katalysator mit peroxidatischer Aktivitaet, 4-Aminoantipyrin und erfindungsgemaess einer 3-Alkoxy-4-hydroxybenzoesaeure oder deren Salz. Unter Einfluss von Wasserstoffperoxid oder peroxidatisch wirkenden Substanzen entsteht ein sehr stabiler Farbstoff, dessen Konzentration spektralfotometrisch bestimmt wird. Anwendungsgebiet ist die medizinische Diagnostik.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Indikatorsystem zur Bestimmung von Hydroperoxiden und peroxidatisch wirkenden Substanzen sowie von Substanzen, aus denen Hydroperoxide freigesetzt werden oder die die Bildung von Hydroperoxiden katalysieren. Besonderes Interesse gilt dabei der quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid, das u.a. bei derenzymatischen Oxidation von biologisch interessanten Stoffwechselprodukten gebildet wird. Beispiele hierfür sind: Glucose, Cholesterol, Harnsäure, Glycerol, Aminosäuren, Xanthin, Cholin. Bei Einsatz dieses Indikatorsystems erfolgt in der medizinischen Diagnostik.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Ein bekanntes Verfahren zur Bestimmung des Wasserstoffperoxids ist die oxidative Kupplung von 4-Aminoantipyrin (4-Amino-2,3-dimethyl-1-phenyl-3-pyrazolin-5-on) mit Phenol durch Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase. Die Extinktion des gebildeten roten Chinöniminfarbstoffes ist der vorhandenen Konzentration an Wasserstoffperoxid proportional und kann fotometrisch gemessen werden.

Die beschriebene Reaktion wird in der Klinischen Chemie mehrfach genutzt. Anstelle des Phenols können chlorierte Phenolsulfonsäuren oder Anilinderivate eingesetzt werden. Ein großer Nachteil dieser Indikatorsysteme ist die geringe Stabilität der erzielten Farbe sowie zum Teil beträchtliche Verfärbungen der Reagenzlösungen bereits nach kurzzeitiger Einwirkung von Luftsauerstoff. Hinzu kommt, daß einige dieser Substanzen physiologisch nicht unbedenklich sind, geruchsbelästigend wirken und sich nicht in einem Stoffgemisch lagern lassen.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Indikatorsysteme zur Bestimmung von Hydroperoxiden, peroxidatisch wirkenden Substanzen und Substanzen,aus denen Hydroperoxide freigesetzt werden oder die die Bildung von Hydroperoxiden katalysieren, weiterzuentwickeln, wobei die zeitliche Stabilität des gebildeten Farbstoffes verbessert werden soll, so daß die Auswertung auch nach längerer Zeit erfolgen kann.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Indikatorsystem zu entwickeln, das auf der peroxidatischen Bildung eines zeitlich stabilen Farbstoffes beruht.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß das Indikatorsystem aus einem Katalysator mit peroxidatischer Aktivität, z. B. Peroxidase, 4-Aminoantipyrin und erfindungsgemäß einer 3-Alkoxy-4-hydroxybenzoesäure oder deren Salz besteht. Unter Einwirkung von Wasserstoffperoxid oder peroxidatisch wirkenden Substanzen entsteht ein sehr stabiler Farbstoff, dessen Konzentration spektralfotometrisch bestimmt wird.

Bevorzugt wird 3-Methoxy-4-hydroxybenzoesäure (Vanillinsäure) als Kupplungskomponente eingesetzt. So ist der aus Vanillinsäure und 4-Aminoantipyrin gebildete Chinoniminfarbstoff mit einem Absorptionsmaximum bei 497 um besonders stabil. Unter den Versuchsbedingungen bleibt die Extinktion der Meßlösung über 20 Stunden unverändert. Es besteht eine lineare Abhängigkeitzwischen der erzielten Extinktion und der ursprünglich vorhandenen Konzentration an Wasserstoffperoxid mindestens bisO,12mmol/l Meßlösung.

Daraus ergibt sich neben dem qualitativen und quantitativen Nachweis von Wasserstoffperoxid die Möglichkeit zur besseren Bestimmung einer Reihe von physiologisch und diagnostisch wichtigen Substanzen, die unter Einwirkung entsprechender Enzyme Wasserstoffperoxid bilden.

Das neue Indikatorsystem kann als Feststoffgemisch haltbar gelagert und vor Anwendung gelöst werden oder man setzt es an geeigneten Trägermaterialien fixiert ein.

Das erfindungsgemäße Indikatorsystem hat den Vorteil, daß die bevorzugt verwendete Kupplungskomponente 3-Methoxy-4-hydroxybenzoesäure (Vanillinsäure) ein Stoffwechselprodukt des menschlichen Organismus ist und die beschriebenen Mangel der bekannten Komponenten nicht zeigt. Sie ist nahezu geruchlos und im Gemisch mit einer Reihe von Reaktionspartnern und Puffersubstanzen ausgezeichnet haltbar.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens:

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Beispiel 1

Bestimmung von Wasserstoffperoxid 20 Teile Reagenzlösung A werden mit1 Teil einer Wasserstoffperoxid-Lösung (maximale Konzentration: 2,52 mmol/l) gemischt und 15 Min. bei 37⁰C inkubiert. Anschließend mißt man die Extinktion im Bereich von 480-520 nm gegen den Leerwert und errechnet die Wasserstoffperoxidkonzentration mit Hilfe eines Wasserstoffperoxid-Standards.

Reagenzlösung A:

100 mmol/l Phosphatpuffer pH 2 mmol/l 3-Methoxy-4-hydroxybenzoesäure 0,79 mmol/l 4-Aminoantipyrin 400 U/l Peroxidase

Reagenzlösung Ai und A₂ werden im Verhältnis 1 + 1 gemischt. Haltbarkeit bei +4°C mindestens 3 Wochen.

Reagenzlösung Αι:

100 mmol/l Phosphatpuffer pH 1,58mmol/l 4-Aminoantipyrin

800 U/l Peroxidase Haltbarkeit bei +4⁰C mindestens 6 Wochen.

Reagenzlösung A₂:

100 mmol/l Phosphatpuffer pH 7

4mmol/l 3-Methoxy-4-hydroxybenzoesäure Haltbarkeit bei +4⁰C mindestens 3 Monate.

Beispiel 2

Bestimmung der Harnsäure 100 Teile Reagenzlösung B werden mit 10 Teilen einer Harnsäure-Lösung (maximale Konzentration: 0,714mmol/l) und 1 Teil Uricase-Lösung gemischt. Nach einer.lnkubation von 15 Min. bei 37°C mißt man die Extinktion wie unter Beispiel 1 beschrieben und errechnet die gesuchte Harnsäurekonzentration mit Hilfe eines Harnsäurestandards.

Reagenzlösung B:

100 mmol/l Phosphatpuffer pH

0,25mmol/l 4-Aminoantipyrin 1 000 U/l Peroxidase

3,6 mol/l 3-Methoxy-4-hydroxybenzoesäure Reagenzlösung B₁ und B₂ werden im Verhältnis 1 + 1 gemischt. Haltbarkeit bei +4⁰C mindestens 3 Wochen.

Reagenzlösung B¹:

100 mmol/l Phosphatpuffer pH

0,5mmol/l 4-Aminoantipyrin 2000 U/l Peroxidase Haltbarkeit bei'+4°C mindestens 6 Wochen.

Reagenzlösung B₂:

100 mmol/l Phosph'atpufferpH

7,2mmol/l 3-Methoxy-4-hydroxybenzoesäure Haltbarkeit bei +4⁰C mindestens 3 Monate.

Uricase-Lösung:

18000U/IUricase

Beispiel 3:

3.1 Bestimmung von Glucose

20 Teile Reagenzlösung C werden mit 1 Teil Glucose-Lösung (Konzentrationsbereich: 0 bis 2,52mmol/l), bzw. Glucose-Standard, bzw. Wasser(Leerwert) gemischt und 15 Min. bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die Extinktion gegen den Leerwert gemessen und die gesuchte Konzentration mit Hilfe des Standards berechnet.

3.2 Bestimmung der Glucose im Blut Methode I:

1 Teil Blut wird mit 10 Teilen Uranylacetat (3,77 mmol/l) enteiweißt und zentrifugiert. Der Überstand wird wie unter beschrieben anstelle der Glucose-Lösung eingesetzt.

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Reagenzlösung C:

100 mmol/l Phosphatpuffer pH 0,79mmol/l 4-Aminoantipyrin 2 mmol/l 3-Methoxy-4-hydroxybenzoesäure 9 200 U/l Glucoseoxidase

400 U/l Peroxidase Reagenzlösung C₁ und C₂ werden im Verhältnis 1 + 1 gemischt. Haltbarkeit bei +4⁰C mindestens 3 Wochen.

Reagenzlösung C₁:

100 mmol/l Phosphatpuffer pH

1,58mmol/l 4-Aminoantipyrin 18400 u/e Glucoseoxidase Haltbarkeit bei +4°C mindestens 4 Wochen.

Reagenzlösung C₂:

100 mmol/l Phosphatpuffer pH

Methode!!:

Ein Gemisch aus

Na₂HPO₄ · 2H₂O (6,12mmol) KH₂PO₄ (3,88 mmol) 4-Aminoantipyrin (0,079mmol) 3-Methoxy-4-hydroxybenzoesäure (0,2mmol) Glucoseoxidase (920U) und Peroxidase (40U)

wird bei Bedarf in 100ml bidest. Wasser gelöst. 20 Teile dieser Lösung werden mit 1 Teil Glucose-Lösung gemischt und wie unter 3.1 beschrieben, behandelt.

Claims

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Erfindungsanspruch:

1. Indikatorsystem zur Bestimmung von Hydroperoxiden und peroxidatisch wirkenden Substanzen sowie von Substanzen, aus denen Hydroperoxide freigesetzt werden oder die die Bildung von Hydroperoxiden katalysieren, unter Verwendung von 4-Aminoantipyrin, dadurch gekennzeichnet, daß es eine 3-Alkoxy-4-hydroxybenzoesäure, bzw. deren Salz enthält.
2. Indikatorsystem nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß es 3-Methoxy-4-hydroxybenzoesäure (Vanillinsäure) enthält.
3. Anwendung des Indikatorsystems nach Punkt 1 + 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer Lösung eingesetzt wird.
4. Anwendung des Indikatorsystems nach Punkt 1 +2, dadurch gekennzeichnet, daß es als Feststoffgemisch gelagert oder an Trägermaterialien fixiert wird.