DD234003A1 - Verfahren zur herstellung von phageninhibitorisch wirkenden 2-aryl-4-alkyl/aryl-5-alkylaminomethyl-1,2,3-2h-triazolen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2-Aryl-4-alkyl/aryl-2-alkylaminomethyl-1,2,3-2H-triazolen durch reduktive Alkylierung von 2-Aryl-4-alkyl/aryl-5-cyano-1,2,3-2H-triazolen. Die neuen Triazolderivate weisen phageninhibitorische Wirksamkeit gegen Bakteriophagen des DNA- oder RNA-Typs auf und koennen daher gegebenenfalls zusammen mit Loesungsvermittlern und/oder weiteren Formulierungshilfsmitteln in mikrobiologischen Fermentationsprozessen zur Phagenbekaempfung eingesetzt werden.

Description

R¹

worin R¹ und R² die gleiche Bedeutung haben wie in Formel I zu Verbindungen vom Typ I, wo R³ = i-Propyl, sek. Butyl bedeuten, durch reduktive Alkylierung in Gegenwart eines aliphatischen Ketons über PtO₂ umgesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhafterweise bei normalem Druck und bei normaler oder schwach erhöhter Temperatur durchgeführt werden.

Der besondere Vorteil der erfindungsgemäßen Lösung besteht darin, daß stets nur sekundäre Amine gebildet werden und die Entstehung tertiärer Amine ausgeschlossen wird.

Als weiterer besonderer Vorteil ist zu ersehen, daß die Alkylierung von Aminen mit aufwendigen Operationen bei Anwendung von Alkylierungsmittelnumgangen wird.

Die mit den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten erfindungsgemäßen Verbindungen zeichnen sich durch ihre Aktivität sowohl gegenüber sehr unterschiedlichen Phagen vom DNA- und RNA-Typ als auch gegenüber gleichen Phagen in unterschiedlichen Wirtsstämmen aus wie auch durch ihre Unschädlichkeit gegenüber Wirtsstämmen in Konzentrationen, die phagenhemmend wirken. Die erfindungsgemäße Anwendung erfolgt dadurch, daß Mittel zur biologischen Prozeßführung eingesetzt werden, die Verbindungen der allgemeinen Formel I enthalten und außerdem Lösungsvermittler und/oder weitere Formulierungshilfsmittel enthalten können. Die Mittel werden, um die Schadwirkung von Phagen in Flüssigkulturen (Fermentationsbrühen) von Bakterien-Produktionsstämmen (Stagnieren bzw. Abnahme der Zellkonzentration) aufzuheben, in solchen Mengen den Kulturmedien zugesetzt, daß sich eine Konzentration der erfindungsgemäßen Verbindungen von 10~⁶ bis 10~³ g/ml ergibt. Wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen alternierend mit anderweitigen antiphagalen Substanzen zum Einsatz kommen, kann die Ausbildung präparateresistenter Phagenstämme verhindert werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

2-(4-Methylphenyl)-4-methyl-5-(N-isopropylaminomethyl)-1,2,3-2H-triazol-hydrochlorid 3,96 g 2-{4-Methylphenyl)-4-methyl-5-cyano-1,2,3-2H-triazol werden in 100 ml Eisessig gelöst und nach Zugabe von 11,6 g Aceton und 500 mg PtO₂ bei 2O⁰C unter Normaldruck hydriert. Nach Aufnahme von 1,34 I Wasserstoff wird der Katalysator abfiltriert, 10 ml Isopropanol-HCI zugegeben und abgesaugt. Aus dem Rückstand lassen sich mit Äther 0,5 g Ausgangsprodukt zurückgewinnen.

Anschließend wird aus Isopropanol umkristallisiert. Es werden 3,5 g des salzsauren sekundären Amins in einer Ausbeute von 63% mit einem F. von 231,5⁰C gewonnen.

Beispiel 2

2-(4-Methylphenyl)-4-methyl-5-(N-isobutylaminomethyl)-1,2,3-2H-triazol-hydrochlorid 7,32 g 2-(4-Methylphenyl)-4-methyl-5-cyano-1_/2,3-2H-triazol werden in 100 ml Eisessig gelöst und nach Zugabe von 500 mg PtO₂ und 36 ml Butanon bei 50°C hydriert. Nach Aufnahme der benötigten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Nach Aufarbeitung entsprechend Beispiel 1 werden 4 g Ausgangsprodukt zurückgewonnen. Es werden 5,5 g des Triazolhydrochlorids vom

F. 203-4⁰C entsprechend einer Ausbeute von 86% erhalten.

Beispiel 3

2-(4-8romphenyl)-4-phenyl-5-(N-isopropylaminomethyl)-1,2,3-2H-triazol-hydrochlorid 6,5 g 2-(4-Bromphenyl)-4-methyl-5-cyano-1,2,3-2H-triazol werden wie in Beispiel 1 beschrieben in 250 ml Eisessig und 11,6 g Aceton über 500 mg PtO₂ bei 5O⁰C hydriert. Nach Aufnahme von 1,34 I Wasserstoff wird die Hydrierung abgestellt, die Lösung aufgearbeitet und 4,9 g Hydrochlorid mit F. 266-9°C erhalten.

Beispiel 4

2-Phenyf-4-methyl-5-isopropylaminomethyl-1,2,3-2H-triazol-hydrochlond

9,4 о 2-Phenyl-4-methyl-5-cyano-1,2,3-2H-triazol werden in 150 ml Aceton bei 20⁰C über 500 mg PtO₂ hydriert. Nach Aufnahme von 1,2 I Wasserstoff wird vom Katalysator filtiert und aus der Lösung des Hydrochlorid mit Isopropanol-HCI gefällt. Nach Umkristallisation aus Isopropanol werden 10 g mit F. 202—3⁰C erhalten.

Kennzeichnung der inhibitorischen Wirkung erfindungsgemäßer Verbindungen gegenüber DNA-Phagen bei gleichzeitiger Indifferenz gegenüber den Wirtsstämmen

Es wurde der Plaquehemmtest mit Agar-Kulturen (Diffusions-Lochplatten) eingesetzt. Als Testsysteme wurden zwei sehr unterschiedliche Bakteriophagen, die bei der Enzymproduktion mit Bacillus subtilis als Schadfaktoren aufgetreten waren, sowie zwei unterschiedliche Wirtsstämme, von denen einer als Produktionsstamm Verwendung findet, benutzt.

Bakteriophage PZ-A: morphologische Gruppe C, Nukleinsäuretyp DNA, virulent Bakteriophage PZ-B: Morphologische Gruppe A, Nukleinsäuretyp DNA, virulent Wirtsstamm Bacillus subtilis 168/3, kein Produktionsstamm

Wirtsstamm Bacillus subtilis 4, Produktionsstamm.

Der Plaquehemmtest wurde als Agardiffusions-Lochtest ausgeführt. Zur Herstellung der Doppelschichtplatten wurde der noch flüssige Deckschichtagar bei 48°C mit Phagen und Bakterien beimpft und auf die bei 37⁰C für 30 min vorgetrocknete Grundschicht aufgegossen.

-з- 726

In die Nährböden wurden nach ihrem Erstarren Löcher von 10 mm Durchmesser gestanzt und mit 0,05 ml einer 0,1-molaren Lösung der erfindungsgemäßen Verbindungen gefüllt. Nach einstundiger Diffusionszeit bei Zimmertemperatur wurden die Platten bei 28⁰C inkubiert. Durch die Diffusion der Testverbindungen im Agarsubstrat bildet sich in radialer Richtung ein Konzentrationsgradient aus, in dessen wirksamen Bereich eine Phagenhemmung als plaquefreie Zone bzw. Zone mit weniger und/oder kleineren Plaques erkannt werden kann. Die Auswertung erfolgt durch Ausmessen der radialen Breite dieser Plaquehemmzonen. Eventuelle Hemmwirkungen gegenüber dem Wirtsbakterium können an bakterienfreien Höfen um die Stanzlöcher erkannt werden. Alle Ansätze bestanden aus drei Parallelen und wurden meist mehrfach wiederholt.

Die in der beschriebenen Weise durchgeführten und ausgewerteten Versuche (Tabellen 1 bis 4) zeigen, daß erfindungsgemäße Verbindungen plaque- und somit phagenfreie Zonen von beachtlicher Breite hervorgerufen und somit sowohl gegen PZ-A- als auch gegen PZ-B-Phagen erhebliche antiphagale Wirkungen entwickelt haben. Gleichzeitig geht daraus die Indifferenz der Verbindungen in phageninhibitorischen Konzentrationen gegenüber den Wirtsbakterien und die Wirksamkeit gegen Phagen unabhängig vom Wirtsstamm hervor.

Tabelle 1

Plaquehemmzonen ohne Wirtsbeeinflussung im System PZ-A/Bacil!us subtilis 168/3 nach Applikation erfindungsgemäßer Verbindungen

Verbindung Plaquehemmzonen (mm)

gesamt davon völlig davon mit vermin-

plaquefrei dertem Wirtswachstum

2-Phenyl-4-methyl-5-(N-isopropyl-

aminomethyl)-1,2,3-2H-triazol-

hydrochlorid 11,0 8,3 0

2-{4-Methylphenyl)-4-methyl-5-

N-isopropylaminomethyl-1,2,3-

2H-triazol-hydrochlorid 8,0 8,0 0

2-(4-Methylphenyl)-4-methyl-5-

(N-isobutylaminomethyl)-i ,2,3-

2H-triazol-hydrochlorid 5,7 5,7 0

Tabelle 2

Plaquehemmzonen ohne Wirtsbeeinflussung im System PZ-B/Bacillus subtilis 168/3 nach Applikation erfindungsgemäßer Verbindungen

Verbindung Plaquehemmzonen (mm)

gesamt davon völlig davon mit vermin-

plaquefrei dertem Wirtswachstum

2-Phenyl-4-methyl-5-(N-isopropyl-

aminomethyl)-1,2,3-2H-triazol-

hydrochlorid

2-(4-Methylphenyl)-4-methyl-5-

(N-isopropylaminomethyl)-i ,2,3-

2H-triazol-hydrochlorid

2-(4-Methylphenyl)-4-methyl-5-

(N-isobutylaminomethyl)-i ,2,3-

2H-triazol-hydrochlorid 4,7 4,7 0

Tabelle 3

Plaquehemmzonen ohne Wirtsbeeinflussung im System PZ-A/Bacillus subtilis 4 nach Applikation erfindungsgemäßer Verbindungen Verbindung Plaquehemmzonen (mm)

gesamt davon völlig davon mit vermin-

plaquefrei dertem Wirtswachstum

2-Phenyl-4-methyl-5-(N-isopropylamino-

methyl)-1,2,3-2H-triazol-hydrochlorid 4,3 4,3 0

2-(4-Methylphenyl)-4-methyl-5-(N-tso-

propylaminometnyi)-1,2,3-2H-triazol-

hydrochlorid 4,3 4,3 0

2-(4-Methylphenyl)-4-methyl-5-(N-iso-

butylaminomethyl)-1,2,3-2H-triazol-

hydrochlorid 2,3 2,3 0

8,3	8,3
6,0	6,0
4,7	4,7

-4- 726

Tabelle 4

Plaquehemmzonen ohne Wirtsbeeinflussung im System PZ-B/Bacillus subtiiis 4 nach Applikation erfindungsgemäßer Verbindungen Verbindung Plaquehemmzone (mm)

gesamt davon völlig davon mit vermin-

plaquefrei dertem Wirtswachstum

2-Phenyl-4-methyl-5-(N-isopropylaminomethyl)-1,2,3-2H-triazol-

hydrochlorid 8,7 4,7

2-(4-Methylphenyl)-4-methyl-5-(N-isopropylaminomethyl)-1,2,3-

2H-triazol-hydrochlorid 9,7 2,7 1,3

2-(4-Methyiphenyl)-4-methyl-5-(N-isobutylaminomethyl)-1,2,3-

2H-triazol-hydrochlorid 6,7 2,0

Kennzeichnung der inhibitorischen Wirkung erfindungsgemäßer Verbindungen gegenüber RNA-Phagen Die Wirksamkeit erfindungsgemäßer Verbindungen gegenüber RNA-Phagen wurde unter Verwendung von Agardoppelschichtplatten im Lochtest geprüft. Zu diesen Untersuchungen wurden folgende RNA-Phagen und Bakterienstämme als Virus/Wirt-Systeme ausgewählt:

M12/Escherichia coli W 1665f⁺ f2/Escherichia coli K 1046 Qß/Escherichia coli AB 301.

Die Auswertung erfolgte nach 20stündiger Inkubation der Kulturen anhand der Plaquebildung. Die Breite von Zonen verringerter Plaquezahl bzw. von plaquefreien Zonen wurde gemessen und wird als Mittelwert, errechnet aus 5 Einzelwerten, angegeben.

Tabelle 5

Verbindung Plaquehemmzone

(radiale Ausdehnung in mm) M12 f2 Qß

2-(4-Bromphenyl)-4-phenyl-5-(N-isopropylaminomethyl)-

2H-1,2,3-triazol-hydrochlorid 2,5 3

2-Phenyl-4-methyl-5-(N-isopropylaminomethyl)-1,2,3-2H-

triazol-hydrochlorid 3,5 2,5

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung phageninhibitorisch wirkender г-АгуІ-ФаІкуІ/агуІ-б-аІкуІатіпоте^уІ-і ,2,3-2H-triazole der Formel I

HN-OH₂-C

^n—ν -

-OH₂-C

und ihrer Säureadditionsverbindungen, worin R¹ = Alkyl oder Aryl R² = ggf. substituiertes Aryl R³ = i-Propyl, sek. Butyl

bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß 2-Aryl-4-alkyl/aryl-5-cyano-1,2,3-2H-triazole der allgemeinen Formel Il

II

worin R¹ und R² die obige Bedeutung haben, reduktiv in Gegenwart eines Katalysators alkyliert werden.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Alkylierungsmittel symmetrische und unsymmetrische Ketone eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Katalysator PtO₂ eingesetzt wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2-Aryl-4-alkyl/aryl-5-alkylaminomethyl-1,2,3-2H-triazolen und deren Anwendung als Mittel zur Bakteriophagenbekämpfung in mikrobiologisch-technischen Produktionsprozessen, die mit Bakterien oder anderen phagengefährdeten Mikroorganismen durchgeführt werden. Diese Triazolderivate können ferner in der Farbstoffherstellung Verwendung finden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß Triazole, die am C⁵-Atom eine CN-Gruppe und am N²-Atom einen gegebenenfalls substituierten Arylkern tragen, durch cyclisierende Oxidation aus den entsprechenden Arylazo-ß-amino-zimtsäurenitrilen bzw. butyronitrilen gewonnen werden (B. Hirsch DD-PS 36 137, DE-PS 1.226.591; CH-PS 444.873).

Es sind aber bisher noch keine Triazole beschrieben worden, die am C⁴-Atom eine sekundäre Amino-methyl-Gruppe tragen. Ebenso ist die Anwendung von 2-Aryl-4-a!kyl/aryl-5-alkyl-aminomethy!-1,2,3-2H-triazolen als Mittel zur Bakteriophagenbekämpfung in mikrobiologisch-technischen Produktionsprozessen noch nicht beschrieben worden. Die durch Phagen in derartigen Fermentationsverfahren bedingten Ausfälle und Störungen sind bisher nicht sicher beherrschbar. Lösungsvorschläge, wie Kultur unter sterilen Bedingungen oder Einsatz phagenresistenter Produktionsstämme sind entweder nicht generell anwendbar oder nicht voll wirksam (z. B. S. Seto, T. Osawa und S. Yamamoto, Agr. Biol. Chem. 32, 261 -266,1968; T. Oki und A. Ozaki, ebenda 320-328). Das gleiche gilt für die Anwendung von chemischen Phageninhibitoren (T. Ukita und K. Kusai, JP-PS No. 32-1097,1957; B. Kiesel et al., DD-PS 146 469 [C 12 N-1/28], 1981), da diese einerseits mehr oder weniger phagenspezifisch wirken, also nicht gegen alle potentiell auftretenden Phagen eingesetzt werden können und andererseits durch die Entwicklung hemmstoffresistenter Phagen mit der Aufhebung der Inhibitorwirkung gerecht werden muß. Für die Reduzierung des Phagenrisikos können deshalb nur integrierte Maßnahmen angewendet werden, wofür u. a. die Verfügbarkeit eines größeren Spektrums von Phageninhibitoren mit günstigem Wirkungsbereich, die keinen negativen Einfluß auf die Produktionsstämme ausüben, notwendig ist.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung und Anwendung phageninhibitorisch wirkender Triazolderivate sowie ihre Herstellung nach einem technologisch einfachen Verfahren. Dabei sollen unter einfachen Reaktionsbedingungen in einer vorteilhaft als Eintopfreaktion verlaufenden Umsetzung unter Verwendung leicht zugänglicher Ausgangsverbindungen die gewünschten Produkte in hoher Reinheit und guter Ausbeute und frei von Nebenprodukten entstehen. Durch die Anwendung dieser Verbindungen als neuartige Phageninhibitore:. jull das bei mikrobiellen Produktionsverfahren bestehende Phagenrisiko sowohl bezüglich der Phagen mit DNA als genetischem Material als auch bezüglich solcher mit RNA als genetischem Material weiter verringert werden. Die Mittel sollen insbesondere die Produktionsstämme nicht in ihrem Wachstum beeinträchtigen, phageninhibitorisch auch bei Einsatz unterschiedlicher Wirtstämme und gegen unterschiedliche Phagen vom DNA- und RNA-Typ wirken und somit eine breite Anwendung im Rahmen integrierter Maßnahmen zur Phagenbekämpfung in der technischen Mikrobiologie ermöglichen.

Darstellung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, in einem technologisch einfachen Verfahren auf der Grundlage leicht herstellbarer Ausgangsverbindungen sekundäre 2-Aryl-4-alkyl/aryl-5-alkylaminomethyl-1,2,3-2H-triazole der Formel I

N-N-R₂ HN - CH₀ - ^ I

-1- 726

Erfindungsanspruch:

-2- 726 70

worin R¹ = Alkyl, Aryl,

R² = ggf. subst. Aryl,

R³ = i-Propyl, sek. Butyl

sind und ihre Säureadditionsverbindungen zu schaffen und diese Verbindungen bezüglich ihrer phageninhibitorischen Wirksamkeit und ihrer Eignung zur Verhinderung von phagenbedingten Ertragsausfällen in mikrowellen Syntheseprozessen zu prüfen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß 2-Aryl-4-alkyl/aryl-5-cyano-1,2,3-2H-triazole der allgemeinen Formel Il

N-NR₀

NC - C^

C=N