DD227982A1

DD227982A1 - Verfahren zur abtrennung von mikroorganismen vorzugsweise hefen aus fermentationsloesungen

Info

Publication number: DD227982A1
Application number: DD26890284A
Authority: DD
Inventors: Eberhard Lippert; Ronald Schulz
Original assignee: Humboldt Uni
Priority date: 1984-10-31
Filing date: 1984-10-31
Publication date: 1985-10-02

Abstract

Das Verfahren sieht eine Abtrennung von Mikroorganismen, vorzugsweise Hefen, aus Fermentationsloesungen derart vor, dass erfindungsgemaess durch Zugabe einer Saeure ein p H-Schock auf 3,0 im fermentierten Medium ausgeloest wird, wodurch eine sofortige Flockulation der Mikroorganismen einsetzt, der eine rasche Sedimentation folgt. Das auf diese Weise in kurzer Zeit sedimentierte, biologisch aktive Zellmaterial, welches eine hohe Dichte aufweist, kann mittels einfacher Trennverfahren wie zum Beispiel Dekantation vom Ueberstand, der das Hauptfermentationsprodukt beinhaltet, getrennt werden.

Description

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[DE-OS 2 642 944), sowie ein Verfahren zur Abtrennung von Bakterienbiomasse durch Erhöhung des pH-Wertes auf pH 8-11, Erwärmung der Suspension auf 50-200⁰C, pH-Erniedrigung auf pH 2-5 und anschließend notwendiger Zellseparation [GB 1 381 306).

Ein anderes, für eine aerobe Kultivierung von Bakterien und Wuchshefen auf der Basis von Kohlenwasserstoffen (z. B. n-Paraffine Dder Gasöl) geltendes Verfahrensprinzip (GB 1 213 651, DE-OS 1 642 602) sieht zwar eine pH-Senkung auf unter pH 4 vor, jedoch /vird hierbei die wäßrige Phase durch Dekantation abgetrennt und das restliche Gemisch (obere Phase) zur Herabsetzung des spezifischen Gewichts mit einem sauerstoffhaltigen organischen Lösungsmittel (Alkohol oder Keton) behandelt und zur endgültigen ^trennung der Mikroorganismen zentrifugiert. Diese Verfahrenslösung schließt grundsätzlich eine Anwendbarkeit auf zur Ethanolbildung verwendete Hefen aus.

Für methylotrophe Bakterien der Gattungen Methylococcus und Micrococcus wird zur beschleunigten Sedimentation der Bakterienbiomasse ein Zusatz von Kationenaustauscherharzen zur Herabsetzung des pH-Wertes der Suspension auf pH 2-4 vorgeschlagen (SU 1 054 410). Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil des hohen Verbrauchs an wertvollem Austauscherharz (10-20 g/l Bakteriensuspension), eine Rückgewinnung des Austauscherharzes (d. h. Trennung von der Biomasse) einschließlich nachfolgender Regenerierung ist dabei nicht vorgesehen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist eine einfache Abtrennung von Mikroorganismen, insbesondere von Hefen, ohne Einsatz üblicher Flockungsmittel beziehungsweise Anlegen eines künstlichen Schwerefeldes.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Mikroorganismen aus Fermentationslösungen nach erfolgter Produktbildung zur Flockulation anzuregen und das gewonnene Sediment mittels einfacher Trennverfahren vom Überstand zu trennen. Durch den gesamten Vorgang soll eine Teilrückführung von Biomasse ermöglicht werden.

Erfindungsgemäß wird durch plötzliche Änderung des pH-Wertes im Fermentationsmedium bei Umgebungstemperatur in einem breiten Ethanolkonzentrationsbereich eine spontane Flockulation ausgelöst, die ohne Zunahme der Azidität bei nichtflockulierenden Mikroorganismen nicht auftreten würde.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß die gewöhnlich zur industriellen Ethanolfermentation auf der Basis zuckerhaltiger Substrate verwendete Hefe Saccharomyces cerevisiae nach beendeter Fermentation bei einem pH-Wert von 2,5—3,0 ein Sedimentationsmaximum aufweist und der Sedimentationsvorgang innerhalb sehr kurzer Zeit abläuft.

Die Einstellung des für die Sedimentation der Hefebiomasse optimalen pH-Wertes wird mittels einer Mineralsäure, vorzugsweise mit Schwefelsäure oder beispielsweise mit Perchlorsäure, Salpetersäure, Salzsäure oder Phosphorsäure vorgenommen. Mit organischen Säuren wie zum Beispiel Ameisensäure, Milchsäure oder Essigsäure läßt sich prinzipiell die gleiche Wirkung einer Flockenbildung erzielen.

Eine pH-Erniedrigung des Mediums unter pH 2,5 ergibt keine Zunahme des sedimentierten Biomasseanteils und wirkt sich deutlich negativ auf die Vitalität des biologischen Materials aus.

Die pH-Einstellung kann entweder im Fermentor oder vor Eintritt der Fermentationslösung in einen Absetzbehälter oder in diesem selbst erfolgen.

Im Verlauf der Sedimentation der Mikroorganismen erfolgt eine zunehmende Kompression des Bodensatzes. Das Sediment mit einer sehr hohen Mikroorganismendichte kann leicht durch bekannte Verfahren wie zum Beispiel Dekantation vom Überstand getrennt werden.

Das Sediment kann als quasiimmobilisierte Phase technologisch genutzt werden und die Maßnahmen zur Begünstigung der Flockulation bewirken gleichzeitig eine Herabsetzung des Kontaminationsgrades im gewonnenen Sediment.

Ausführungsbeispiele

1. Beispiel

Ein ausgewählter Hefestamm (Brennereihefe) der Art Saccharomyces cerevisiae wurde auf der Basis von geklärter Rohrrohzucker-Raffineriemelasse in einer 24stündigen, partiell belüfteten batch-Kultur mit dem Ziel der Ethanolgewinnung im Labormaßstab gezüchtet. Das Fermentorvolumen betrug 3,0 I, die Milieubedingungen waren folgende: Substratkonzentration: S₀ = 200 g/l (reduzierende Substanzen) Biomassekonzentration: X₀ = 5,0 g HTS/I Anfangsethanolgehalt: P₀ = 2,0 Vol.-% Nährsalze: 3,11 g (NH₄J₂SO₄ p. a./l

0,253 ml H₃PO₄ (85%ig) p. a./l Temperatur: T = 38⁰C

Belüftungsrate: V₁. = 0,22 wm

pH-Wert: pH = 4,8 (Korrektur mit 3 N NaOH)

Eine Homogenität des Mediums wurde durch die schwache Belüftung, die vom Boden des Fermentors ausging, erreicht. Nach einer Fermentationszeit von 24 h, wonach ein Ethanolgehalt von 11,69 Vol.-% vorlag, wurde der gesamte Fermentorinhalt in ein zylindrisches Sedimentationsgefäß (Höhe der Flüssigkeit 0,42 m) geleitet und durch Zugabe von 56,8 ml 10%iger H₂SO₄ (= 3,44 ml 96%ige H₂SO₄ p. a.) pro I Fermentationsflüssigkeit ein pH-Schock auf 3,0 unter intensiver Durchmischung der Flüssigkeit ausgelöst. Anschließend wurde die Rührung eingestellt, bereits nach sehr kurzer Zeit konnte eine Flockenbildung beobachtet werden. Zur vollständigen Sedimentation des flockulierenden Teils der Biomasse wurde eine Sedimentationszeit von maximal 0,5 h gewählt. Als Ergebnis dieser Behandlung wurden 45% der in der Fermentationslösung vorhandenen Biomasse abgetrennt. Der sich deutlich vom Überstand abgrenzende Bodensatz wies eine Dichte von X_sed = 117 g HTS/I Bodensatz auf.

Im Bodensatz wurde im Vergleich zum Zeitpunkt vor dem pH-Schock eine Reduzierung der Anzahl von Kontaminationsorganismen festgestellt.

Ein Parallelversuch ohne Erhöhung der Azidität der Fermentationsflüssigkeit nach beendeter Fermentation ergab nach mehreren Stunden keine Flockenbildung und eine sich daran anschließende Sedimentation der Hefebiomasse.

2. Beispiel

Ein weiterer, sich vom erstgenannten unterscheidender Brennereihefestamm der Art Saccharomyces cerevisiae wurde unter gleichen Milieubedingungen kultiviert, so daß nach 24 h ein Ethanolgehalt von 10,59 Vol.-% im Medium erreicht werden konnte.

Durch Zusatz von 50,4 ml 10%iger H₂SO₄ (= 3,05 ml 96%ige H₂SO₄ p. a.) pro I Fermentationsflüssigkeit wurde ein pH-Schock auf pH = 3,0 entsprechend Beispiel 1 ausgelöst.

Nach einer Sedimentationszeit von 0,5 h waren 50% der Hefebiomasse abgetrennt, was erneut durch eine sichtbare Phasengrenze angezeigt wurde. Die Dichte der abgetrennten Phase betrug X_sed = 105 g HTS/I Sediment.

In einem Parallelversuch ohne pH-Änderung konnte die ansonsten nichtflockulierende Eigenschaft dieses Hefestammes nachgewiesen werden.

3. Beispiel

Ein nichtflockulierender Hefestamm (Backhefe) der Art Saccharomyces cerevisiae wurde analog Beispiel 1 kultiviert und der pH-Wert der Fermentationsflüssigkeit anschließend durch Zugabe von 70%iger HCIO₄ puriss, auf pH = 2,5 eingestellt. Nach 0,5 h wurde der gleiche, unter Verwendung von H₂SO₄ beschriebene Trenneffekt erzielt.

4. Beispiel

Derselbe, in Beispiel 3 genannte Hefestamm wurde gleichermaßen kultiviert, durch Zugabe von CH₃-COOH p. a. bis zu einem pH-Wert von 2,5 konnte nahezu die gesamte Hefebiomasse zur Sedimentation gebracht werden.

Claims

-1- 689 02

Erfindungsansprüche:

1. Verfahren zur Abtrennung von Mikrorganismen, vorzugsweise Hefen, aus Fermentationslösungen, dadurch gekennzeichnet, daß nach erfolgter Produktbildung im fermentierten Medium durch Zugabe einer Mineralsäure oder einer organischen Säure ein pH-Schock auf S 3,0 ausgelöst wird, wodurch eine sofortige Flockulation sonst nicht flockulierender Mikroorganismenstämme induziert wird, der eine rasche Sedimentation folgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mineralsäure vorzugsweise Schwefelsäure wie auch beispielsweise Perchlorsäure, Salpetersäure, Salzsäure oder Phosphorsäure beziehungsweise als organische Säure vorzugsweise Ameisensäure wie auch beispielsweise Milchsäure oder Essigsäure eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das sedimentierte biologische Material, welches eine hohe Dichte aufweist, mittels bekannter Trennverfahren (beispielsweise Dekantation) vom produkthaltigen Überstand getrennt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das sedimentierte, biologisch aktive Material als immobilisierte Phase direkt zur weiteren Fermentation einsetzbar ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß durch kurzzeitige Einwirkung des niedrigen pH-Wertes ohne Zusatz bakteriostatischer oder bakteriozider Reagenzien der Kontaminationsgrad im sedimentierten Material erheblich vermindert wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Mikroorganismen aus Fermentationslösungen nach erfolgter Produktbildung. Das Verfahren ist hauptsächlich auf diskontinuierliche, halbkontinuierliche und kontinuierliche Ethanolfermentationen auf der Basis zuckerhaltiger Lösungen mit Hilfe von Saccharomyces-Hefen anzuwenden, betrifft jedoch ebenfalls Labor- und technische Fermentationen weiterer konventioneller und nichtkonventioneller Substrate mittels dieser sowie anderer Mikroorganismen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Eine Trennung der festen Phase (Biomasse) von der flüssigen Phase (produkthaltiges Medium) ist bei vielen aeroben und anaeroben Fermentationsprozessen notwendig und kann auf verschiedenen Wegen (Filtration, Sedimentation, Zentrifugation, Flotation u. a.) durchgeführt werden (SVAROVSKY, L; Chem. Eng. 86,1979./14/ 62-76,/15/ 93-105 U./16/ 69-78).

In der Gärungsindustrie wird der natürliche Sedimentationsvorgang zum Beispiel bei der Herstellung von Bier oder Wein zur Abtrennung des Hauptteiles der Hefebiomasse ausgenutzt, infolge des geringen Dichteunterschiedes zwischen Biomasse und fermentiertem Medium verläuft die Sedimentation der Mikroorganismen jedoch sehr langsam.

Bei der reinen Ethanolfermentation auf der Basis zuckerhaltiger oder anderer Rohstoffe, bei der im Gegensatz zu den oben genannten Verfahren vorwiegend andere Hefespecies zum Einsatz gelangen, wird die Hefebiomasse gewöhnlich unter Ausnutzung eines künstlichen Schwerefeldes, das heißt mit Hilfe von Separatoren, vom ethanolhaltigen Medium getrennt, welches anschließend weiteren Aufarbeitungsschritten zugeleitet wird.

Um die natürlichen Sedimentationseigenschaften der Hefe als billige Zeilgewinnungsmethode dennoch für den Anwendungszweck der Ethanolfermentation ausnutzen zu können, wurden in jüngster Zeit umfangreiche theoretische als auch praktische Untersuchungen zur Sedimentation der Hefe Saccharomyces cerevisiae in verschiedenen Absetzblättern vorgenommen (JAYANATA, Y.; Diss. 1983, TU Berlin). Als Lösungen für den großtechnischen Maßstab einer Ethanolfermentation wurden bereits Absetzbehälter großer Fläche beziehungsweise mit sehr geringer Absetztiefe (shallow-depth sedimentation) vorgeschlagen (WALSH, T. J., & BUNGAY, H. R.; Biotechnol. Bioeng. 21,1979,1081-1084).

Es ist eine Reihe von Verfahren bekannt, bei denen Mikroorganismen dauerhaft oder zeitweilig verbesserte Sedimentationseigenschaften aufweisen können. So werden beispielsweise Prozesse beschrieben, welche die Anwendung von flockulierenden Hefestämmen (z. B. DE-OS 2 354 556, DE-OS 2 917 411 u. DE-OS 2 938 339) oder Bakterien (DE-OS 3 148 329) zum Gegenstand haben, die ein verändertes Sedimentationsverhalten aufweisen. Dieses Verhalten, das als Autoflockulation bezeichnet wird, ist eine dauerhafte, genetisch bedingte Stammeigenschaft der Mikroorganismen.

Ferner wurde gezeigt, daß durch die Wahl des Mediums eine Flockenbildung mit anschließender Sedimentation bei der Hefe Schizosaccharomyces pombe induziert werden kann (HSIAO, H.-Y., & al.; Biotechnol. Bioeng. 25,1983, 363-375). Mit den sedimentierten Hefezellen wurde eine kontinuierliche Fermentation im Labormaßstab durchgeführt.

Durch Applikation von speziellen Flockungsmitteln kann ebenfalls eine Flockulation von ansonsten nicht flockulierenden Mikroorganismen induziert werden. Der Grad der Flockulation beziehungsweise die daraus resultierende Sedimentation der Mikroorganismen sind von der Art sowie der Konzentration des verwendeten Flockungsmittels abhängig. Zum Beispiel erfolgte der Einsatz anionischer oder kationischer Polyelektrolyte oder eine Behandlung mit Alkalien an der bei einem pH-Wert von 3,0 kultivierten Wuchshefe Candida intermedia (GASNER, L, & WANG, D. I. C; Biotechnol. Bioeng. 12,1970, 873-887). Bei einer auf ähnliche Weise, das heißt durch Zugabe von synthetischen Polyelektrolyt-Flockungsmitteln, induzierten Flockulation von Mikroorganismen werden Polyelektrolyt-Zell-Aggregate erhalten, die anschließend durch Trocknung oder andere Verfahren aufgeschlossen werden (US 3 989 596 u. US 3 989 597). Dabei ist ein Wiedereinsatz des toten Zellmaterials mit einer erhalten gebliebenen Enzymaktivität zu Fermentationszwecken zwar möglich, jedoch ist die für langer andauernde Prozesse an lebende Zellen gebundene Reproduzierbarkeit der enzymatischen Aktivität nicht gegeben.

Auf dem Gebiet der Ethanolfermentation ist lediglich bekannt, daß eine Flockulation der Hefe Saccharomyces cerevisiae durch Zugabe von Nickel als Flockungsmittel mit Erfolg induziert werden kann (WEEKS, M. G., &al.; Biotechnol. Bioeng. 25,1983,687-697

Möglichkeiten induzierbarer Flockulation wurden ebenfalls durch Änderung des für den jeweiligen Organismus optimalen pH-Wertes im Medium aufgezeigt. Als erstes bekannt gewordenes Verfahren gilt diesbezüglich die Zugabe von Alkalien zu Hefesuspensionen zur Herabsetzung der H⁺-Ionenkonzentration nach vorhergerigem Zusatz von Salzen zweiwertiger Metallionen (DE 826 914). Dieses Verfahren war jedoch durch eine lange Absetzzeit sowie eine geringe Dichte des Sedimentes gekennzeichnet, wodurch sich zusätzliche Separationsschritte als notwendig erwiesen.

Weiterhin sind Verfahren bekannt, die infolge der wechselseitigen Veränderung des pH-Wertes im Medium (durch Lauge- und anschließende Säurebehandlung) Bakterien zur Koagulation bringen können, so zum Beispiel ein Trennvorgang für auf Methanol wachsende Bakterien, der durch eine Alkalisierung mit anschließender Säurebehandlung und Elektroflotation gekennzeichnet ist