DD153893A1 - Verfahren zur nucleotidsequenzklonierung des virus der enzootischen rinderleukose(blv) - Google Patents

Abstract

Es liegt die Aufgabe zugrunde, die bisher bekannten Klonierungstechniken so weiterzuentwickeln, dass BLV-Nucleotidsequenzen unterschiedlicher laenge u. aus verschiedenen Genom-Bereichen aus heterogener oder homogener Population mit guter Ausbeute kloniert werden koennen. Erfindungsgemaess wird von BLV-Desoxyribonucleinsaeure (BLV-DNS) unterschiedlicher Herkunft ausgegangen. Die Kopplung erfolgt m. einer Vektor-DNS zur Rekombinanten-DNS nach a) der Synthese homopolymerer Einstrangenden (terminale Transferasereaktion) b) dem Anfuegen von kurzen, doppelstraengigen Sequenzen mit bestimmten Restriktionsorten (Adaptersequenzen) oder c) dem Ausnutzen natuerlicher Restriktionsorte in der BLV-DNS unter Anwendung von Restriktionsendonucleasen. Anschliessend wird ein Transfer der Rekombinanten-DNS in fuer die Klonierung bestimmte Wirtszellen durchgefuehrt und die BLV-Klone werde selektiert.

Description

1 8 3 A -*-

Dr. Liebscher (DDR)

Dr. Kettmann (BB) ·

Prof. Burny (BE)

Prof«, S. Rosenthal (DDR) . .

Verfahren zur Hucleotidsequenzklonierung des Virus der enzootischen Rinderleukose (BLV) .·

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Klonierung von JTucleotidsequenzen des Virus der enzootischen Rinderleukose (BLV)_β Das Verfahren ist in der mikrobiologisch-pharniakologi-Bchen Industrie nutzbar, und die Erfindung hat Bedeutung für die Medizin, die Veterinärmedizin und die .Landwirtschaft«

Ch^aj^k.teristjLk .der bekannt en technischen Lösungen

Die Klonierung von eukaryontischen Uukleotidsequenzen als biologische Informationsträger in prokaryontisehen Empfängern wie z. B. Escherischia coli ist eine seit 1975 in zunehmendem Maße international angewendete Methodik (Xit_e T₉ Maniatis et al·. Cell 8 (2), 163 (1976)), die verschiedene gentechnische Lösungen (Übersicht in W. A. Scott und R. Werner " (Hrsg«), Molecular cloning of recombinant DITA, Ac ad. Press, ITew York 1977; Klingmüller, Genmanipulation und Gentherapie, Springer-Verlag Heidelberg 1976) umfaßt. Diese Möglichkeiten werden in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial (MS, einsträngige DNS, doppelsträngige DUS), vom Vektor (Plasmid-, Phagen-, Virus-DHS), vom Ort der Integration und vom Klonierungsziel (z. B₀ Expression der fremden Information im Empfänger oder nur Replikation der DIiS) ausgewählt·«

Die RIiS-Sequenzen des Rinderleukämievirus (A« Burn3r et al_e, BLV-molecular biology and epidemiology, in: Viral oncology, ed« G, Klein, Raven Press, Hew York 1980) wurden bislang nicht kloniertc Das Virus-Genom hat eine Länge von etwa

10 !!!},! inriii .' ,·:

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9 000 - 10 000 Nukleotiden, deren Sequenz unbekannt ist {Die Länge der Sequenzen wird bei einsträngigen Uucleinsäureabschnitten bzw« einsträngigen Nucleinsäuren in Nukleotidansahlj bei doppelsträngigen Nucleinsäureabschnitten in Basenpaaren (Bp) angegeben). Eine Restriktionskarte des BLV-Virus-Genoms ist bislang nicht veröffentlicht worden. Dagegen ist die Klonierung von Hukleotidseqüenzen einiger anderer RUS-Viren wie z. B, Influenza (J_e S« Emtage et al,, lature 2§2 (.5743) »..171 (1979) und M₀ J. Sleigh et al., Nucl» Acid. Res; Ulis 879 (1979) und vesiculäres Stomatitis-Virus (J* K. Rose und L, Iverson_? J* Virol. £2J£X_S 404 (1979) gelungen«, Auch RUS-Tumorvirus-Sequenzen (Moloney Sarkomvirus) wurden nach restriktions-endonukleolytischem Aussclineiden der Provirus-DHS-Sequenzen aus der Y/irts-DUS kloniert (G„ I«'« Van de Woude et al·, Proo* Nati;· Acad_e Sei, USA J& (9)·, 4464

Die Klonierung von Uukleotidsequenzen der RNS-Tumorviren ist im'Gegensatz zur Klonierung von DITS-Vireny z» B. Hepatitis-B-Virus kompliziertj da die Ausgangsmaterialien (Virus-RITS, integrierte Provirus-DliS oder nicht-integrierte Virus-DITS) nur in außerordentlich begrenzten Mengen zur Verfugung stehen» V/eitere Schwierigkeiten ergeben sich, weil 100 %ige Reinigungen des Ausgangsmaterials praktisch nicht möglich sind. Außerdem treten bei den Reinigungsschritten Nukleinsäurebrüche auf« Für die Kloni&rung von Uukleotidsequensen, die auf dem Wege der Umkehrtranskription gewonnen v/erden, ist eine Vorauswahl relativ langer Doppelstrang-cDITS-Moleküle aus einer heterogenen Population erforderlich. Diese Vorfraktionierung nach Größe mittels Gelelektrophoresen oder Dichtegradienten (Villa-Komaroff et al., Prooν Natl. Acad. Sei. USA 22» y 727 - 3 731 (1978)) ist arbeitsaufwendig und hat Verluste an'· eingesetztem Material zur Folge. Im DD - Patent

794- ' ' wurde als prinzipielle Lösung vorgeschladurch differenziertes Schwänzen von Doppelstrang-cDUS-¹Molekülen die längsten Moleküle aus einer' heterogenen Population, zu selektieren. ·

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, Klone mit Nucleotidsequenzen des BLV von unterschiedlicher Länge und aus verschiedenen Genom-Bereichen herzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die bisher bekannten· Klonierungstechniken so.weiterzuentwickeln, daß BLV-Hu- · cleotidsequenzen unterschiedlicher Länge und aus verschiedenen Genom-Bereichen aus heterogener oder homogener Population mit guter Ausbeute kloniert werden können. . Das erfinduhgsgemäße Verfahren zur Klonierung von Nucleotidsequenzen der enzootischen Rinderleukose ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine BLV-Desoxyribonucleinsäure (BLV-DlS) für die Kopplung mit einer Vektor-DITS, ggf. nach Spalten von im BLV-DlIS-Molekül vorhandenen Kopplungsstellen oder Aufbau . neuer Kopplungsstellen am BLV-DHS-Molekül vorbereitet, mit einer. Vektor-DNS zur Rekombinanten-DNS koppelt, die Rekombinanten-DNS in Wirtszellen transferiert, dort kloniert und die BLV-Klone selektiert.

Die Erfindung geht von BLV-Desoxyribonucleinsäure (BLV-DITS) unterschiedlicher Herkunft aus;

. a) von einer homogenen oder heterogenen Population komplementärer doppelsträngiger BLV-DE^-S, die durch Umkehrtranskription von BLV-Ribonucleinsäure (BLV-RNS) gewonnen wird

oder b) von in einer Wirtszelle vorhandenen, im Wirtszellgenom nichtintegrierter BLV-DNS in replikativer Form (unter replikativer Form versteht man sowohl zirkuläre als auch lineare Formen der BLV-DNS)

oder c) von Virus-transformierter BLV-DNS, die nach Integration aus einem Wirtsgenom wieder herausgeschnitten wird.

Die so erhaltene DNS variiert in ihrer Länge innerhalb des Bereiches von 50-10 000 Basenpaaren.

' : - 4 - 22 18 3 4

Diese DHS wird durch

04) die Synthese homopplymerer Einstrangenden (terminale . Transferasereaktion), ß) das Anfügen von kurzen doppelsträngigen Sequenzen mit

bestimmten Restriktionsorten (Adaptersequenzen) bzwo ^) durch das Ausnutzen natürlicher Restriktionsorte in der BLV-DHS unter Anwendung von Restriktionsendonucleasen

für die Kopplung mit einem Vektor zur Rekombinanten-DHS vorbereitet. Die in vitro gebildete Rekombinanten-DHS wird anschließend in für die Klonierung bestimmte Wirtszellen, vorzugsweise E.coli-Zellen, transferiert, wonach die BLV-Klone selektiert werden.

Die Umkehrtranskription von BLV-DHS.und die DoppelstrangcDHS-Synthese erfolgen nach an sich bekannten Techniken. Man erhält eine heterogene Population von Doppelstrang-c'DHS-Molekülen, die entweder unmittelbar für die nächsten Schritte (Vorbereitung der Kopplung) eingesetzt oder zunächst nach Molekulargewichten mittels Dichtegradienten oder durch Gelelektrophorese vorfraktioniert wird. Dafür ist allerdings eine ausreichende Menge an Doppelstrang-cDHS-Molekülen notwendig. Ausgehend von einer heterogenen Population von DoppelstrangcDHS-Molekülen wird das Verfahren erfindungsgemäß so geführt, daß nach der Transferasereaktion durchschnittlich relativ lange homopolymere Einstrangenden mit durchschnittlichen Längen von '50 bis 220 nucleotiden entstehen. (Der Wert von 50 für die durchschnittliche Länge der homopolymeren Einstrangenden bedeutet in Grenzwerten einerseits sehr kurze Enden (10 - 20 nucleotide) an relativ langen Doppelstrang-cDHS-Molekülen, andererseits sehr lange Enden (100 - 200 nucleotide) ein relativ kurzen Doppelstrang-cDHS-Molekülen. Der Wert von 220 bedeutet entsprechende Grenzwerte von 10-20 bzw, 300 400 nucleotiden. Die Ursache für diese Längenverteilung besteht.in der Abhängigkeit der Aktivität-der Transferase von der Länge der Doppelstrang-cDHS-Moleküle. Bei kürzeren Doppelstrang-cDHS-Molekülen ist die Aktivität höher und führt

- 5 - 2 2 1 8 3 A

daher zu relativ langen.Einstrangenden an diesen Molekülen und umgekehrt). Anschließend wird die auf diese Weise verlängerte Doppelstrang-cDEfS mit einem linearen Plasmidvektor, der nach der Transferasereaktion kurze homopolyme.re komplementäre Einstrangenden mit einer durchschnittlichen Länge von nur 8 12 nucleotiden besitzt, über die Enden aneinandergelagert und in mit CaCl₂ behandelte Zellen von Escherischia coli Bakterien transferiert. Aus Sicherheitsgründen sind Zellen von E₀coli p£ 1776 besonders geeignet.

Beim Vergleich der erfindungsgemäßen Klonierung mit durchschnittlich, relativ lang geschwänzten Doppelstrang-eDNS-Molekülen (durchschnittliche Länge etwa 200 Nucleotide) mit der Klonierung von Doppelstrang-cDnS-Molekülen, die nur mit durchschnittlich 15-25 nucleotiden geschwänzt werden, zeigt sich die höhere Effektivität der neuen Verfahrensweise

Aus der durchschnittlich relativ lang (200 nucleotide) geschwänzten heterogenen Population werden.-etwa viermal häufiger lange Doppelstrang-cDUS-Abschnitte (mehr als 6OO Basenpaare) erhalten.

Wenn von einer homogenen Population von Doppelstrang-cDnS-Molekülen ausgegangen wird, ist es erfindungsgemäß ausreichend, wenn kurze homopolymere Einstrangenden mit durchschnittlichen Längen von nur 8-10 nucleotiden enzymatisch angehängt werden. Die v/eitere Verfahrensführung erfolgt dann wie oben beschrieben.

Die Charakterisierung der erhaltenen Plasmidrekombinanten erfolgt durch Bestimmung des Molekulargewichts und durch Restriktionsanalyse, Man erhält nach dem erfindungsgemäßen Verfahren 3 Gruppen von Rekombinanten, die entv/eder

- einen EcoRI-Spaltort,

- einen HindlH-Spaltort oder

- weder einen EcoRI- noch einen HindllI-Spaltort aufwei- sen.

BLV-DlS enthält nur einen einsigen EcoRI-Spaltort, der 400 ~ 800 Basenpaare vom 3'-Ende des BLV--Genoms entfernt ist. Rekorabinanten mit einem EcoRI-Spaltort enthalten demzufolge

- 6 ~ 22 183 4

-Abschnitte des' 3'-Endes. Ein weiterer unikaler Spaltort ist der Hindlll-Spaltort in der Mitte des Genoms. Die auf diese Weise erhaltenen Plasmidrekombinanten enthalten BLV-DlTS-Fragmente mit einer Länge bis zu 1 400 Bp. Sie können jederzeit ohne besonderen Aufwand in E.coli ^ 1776-Stamme transferiert werden.

Zur Gewinnung von BLV-Klonen mit vorzugsweise sehr großen Fragmenten bis zum vollständigen Genom wird eine Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, gewählt, die von einer in einer Wirtszelle vorhandenen, im Wirtszellgenom nichtintegrierten BLV-DNS in replikativer -Porm bzw. von Virus-transformierter BLV-DNS, die nach Integration aus einem Wirtsgenom wieder herausgeschnitten wird, ausgeht. Im ersten Fall liegt die BLV-DHS als Gesamtgenom in zirkulärer oder .!.linearer Form vor« An die BLV-DHS werden gegebenenfalls nach öffnen der zirkulären Form Adaptersequenzen angefügt, d_e h, kurze doppelsträngige Sequenzen von 8 - 20 Basenpaaren, die einen Restriktionsort enthalten, der auch in den vorgesehenen Vektormolekülen vorhanden ist. Bevorzugte Restriktionsorte sind EcoRI-, Hindlll-, Sail-, Pstl- und BamHI-Orte. Die Kopplung von ' BLV-DHS und Vektor erfolgt über die kohäsiven Enden, die nach der Behandlung mit Restriktionsendonukleasen an den Restriktionsorten entstehen. Das Anfügen von Adaptersequenzen zur Vorbereitung einer Kopplung mit Plasmid-DHS ist auch dann möglich, wenn eine homogene Population doppelsträngiger komplementärer BLV-DHS vorliegt, die durch Umkehrtranskription von genomischer BLV-RHS- und anschließende Fraktionierung gewonnen wird.

Ebenso ist die Anwendung der Homopolymeren-Technik zur KIonierung der ·nichtintegrierten linearen Form geeignet. Aller- dings ist auf Grund der Gesamtlänge des BLV-DHS-Moleküls (10 kBp) mit- Einstrangbrücken zu rechnen. Obwohl eine Population von Molekülen homogener Länge vorliegt, muß daher die terminale Transferaaereaktion so geführt werden, daß allein bezogen auf terminale Molekülenden eine

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scheinbare Länge von 50 bis 500 Nukleotiden polymerisiert wird. Auf Grund der zusätzlichen inneren 3'-Enden tritt jedoch' eine Verringerung der scheinbaren Länge ein, so daß die v/irkliche durchschnittliche Länge der homopolymeren Blöcke bezogen auf innere und terminale 3'-Enden zwischen'8 - 20 Nukleotiden liegt. Beim Vorliegen von. in einer Wirtszelle vorhandener, im Wirtszellgenom nicht integrierter BLV-DUS -in replikativer Form oder von Virus-transformierter BLV-DüTS, die nach Integration aus einem Wirtsgenom wieder herausgeschnitten wird, können gemäß der Erfindung auch in den terminalen Regionen der BLV-DlJS (sie entsprechen dem 3^f~ bzw. 5'-Ende des einsträngigen BLV-RIiS-Genoms) vorhandene Restriktionsorte, vorzugsweise der EcoRI-Ort, ausgenutzt werden. Man spaltet die BLV-DNS-und einen Vektor, der denselben Restriktionsort enthält, mit der entsprechenden Restriktionsendonuklease und führt die Kopplung in an sich bekannter Weise durch. Es · kann auch vorteilhaft sein, Doppelspaltungen an 2 einmaligen Restriktionsorten innerhalb des BLV-Moleküls, die sich nahe der Molekülenden befinden, z. B₉ Sail (5'-Ende) und EcoRI (3'~Ende), durchzuführen und diese Fragmente direkt, z."B. in .den EcoRI-Sall-Bereich von pBR322 zu klonieren. Diese Möglichkeit bietet sich sowohl für integrierte als auch nichtintegrierte BLV-DlTS an.

Mit den zuletzt genannten Ausgangsmaterialien werden BLV-Klone mit vorzugsweise sehr großen Fragmenten bis zum vollständigen Genom erhalten»

Somit lassen sich in Abhängigkeit von der Längenzusammensetzung des Ausgangsmaterials mit dem erfindungsgemäßen Verfahren BLV-Klone bis zur vollen Genomlänge erhalten. Wirtsorganismen, insbesondere E.coli-Stämrne, die große Fragmente des BLV-Genoms enthalten, einschließlich des vollständigen BLV-^ Genoms, dienen zur technologisch einfachen Gewinnung des BLV-Genoms. und großer 'Teile d.avone Diese Klone können vermehrt und für diagnostische Aufgabenstellungen (nachweis, integrierter Provirus-DlS, Nachweis von viraler RIiS, Nachweis nichtintegrierter viraler DKS) verwendet werden. Eine andere Ein-

_₈_

satzmöglichkeit besteht in der Selektion einzelner DUS-Spezies unterschiedlicher Länge aus einem heterogenen Gemisch. Die Klone können außerdem für die Konstruktion esprimierender Klone und Gewinnung spezifischer Proteine eingesetzt werden. Dabei kann es vorteilhaft sein, die klonierten DNS-Fragmente, die verschiedene Bereiche des BLV-Genoms kodieren, mit Hilfe überlappender Sequenzen neu (nicht natürliche Folgen) zusammenzufügen (z. B₆ unter Ausnutzung natürlicher Restriktionsorte).

Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Ausführungsbei spi ele

1... Klonierungvon BLY-dscDUS

a) Herstellung yon doppelsträngiger oDNS (ds-oDHS)· BLV-RHS, die als 7O-RITS-Komplex im Saccharosedichtegradienten fraktioniert, danach Hitze denaturiert und an oligo-dT-Cellulose gereinigt wurde und die etwa 5 000 bis 10 000 Nucleotide lang ist, wird mit AMV-Umkehrtranskriptase in komplementäre DlTS (cDUS) in einem 40 axX. Ansatz, der 87,5 /Ug/ml BLV-RNS, 20 /Ug/ml oligo CdT)₁₂_₁₈, 50 mM

. Tris/HCl pH 8,2, 50 mM KCl, 5 mM Mg-acetat₂, 10 mM DTT,

1 mM dGTP, 1 mM dTTP, 1 mM dATP, 0,5 mM ³H-dCT.P . (750 /UCi/ml), 40 ,ug/ml Actinomycin D, 1 mg/ml Ifflase-Hemmstoff (von G'. Vassart) und 1 500 Einheiten/ml AMV-Umkehrtranskriptase (von V/. Beard) enthält, in 30 Min. bei 44⁰O in 0.875 Mg cDUS (5_S26 χ 10⁵ cpm) umgeschrieben. Im alkalischen linearen Saccharosegradienten (5 - 20 % Saccharose, 0,33 M HaOH, 0,5-M HaCl, 20 mM EDTA, 4⁰C, " 39 000 U/min, Beckman SW41-Rotor) ergibt dieses Material ' einen einheitlichen Pik, der eine durchschnittliche Länge des Materials von etwa 4 000 bis 5 000 Nucleotiden repräsentiert (15· und 16. Fraktion vom Boden aus, insgesamt Fraktionen; die 9S»Standard-Globin-cDHS befindet sich in der 19. und 20. Fraktion). Auf Grund der Einheitlichkeit des Piks wurde die uhfraktionierte cDltfS nach alkalischer

2 2 1 8 3 A

Hydrolyse der RITS direkt zur Doppelstrang-cDNS-Synthese in einem 125 /Ul Ansatz mit 2,24 /Ug/ml cDITS, 30 mM Tris/HCl pH 7,5, 8 mM Mg-acetatg, 5 mM DTT, 70 mM KCl, 0,5 mM eines jeden dNTP (G, C, A, T) und 120 Einheiten/ml Klenow-Pragment der DiTS-Polymerasel (Fa* Boehringer) eingesetzt und 9,5 Std. bei 20⁰C inkubiert.

Dieses Material wird anschließend mit S.-Nuklease zur Entfernung der übriggebliebenen Einstrangbereiche in einem 380 /Ul Ansatz mit 0,5 /Ug/ml DNS (als Bezugsgröße dient die radioaktive Markierung der οDITS), 70 mM Ua-acetat pH 4,5, 250 mM UaCl, 2 mM ZnSO, und 1 Einheit/ml S₁-ITuklease (von R. Kettmann) 10 Min. lang bei 37°C inkubiert* Die Resistenz betrug nach Doppelstrangsynthese 57 %, der Kontrolliert für cDITS vor dieser -Synthese dagegen nur 24j4 %. Aus dem Resistenzwert ergibt sich eine durchschnittliche Länge von etwa 2 000 Basenpaaren für die DlTS-Doppelstrang-Moleküle, die als Ausgangsmaterial für die Synthese durchschnittlich relativ langer homopolymerer Einstrangenden an die ds-cDlTS dienen.

b) Synthese hpmppolymerer 3'-Enden an dpjpj) el strängiger PITS 3 Ansätze werden mit je 3,32 /Ug/ml ds-cDUS (diese Konzentration entspricht 5 mM 3'-Enden auf der Berechnungsgrundlage einer durchschnittlichen Länge der ds-cDIIS-Moleküle . von 2 000 Bp), 1 mM CoCl₂, 250 mM Hepes-Puffer pH 7,1, 170 Einheiten/ml'terminaler Transferase (von D₀-H. Lieböcher) und mit jeweils unterschiedlichen "Nucleotidkonzentrationen von 50, 143 bzw. 500 /UM ³²P-dCTP (60 Ci/mMol) 5 Min. lang bei 37°C inkubiert. Auf diese V/eise entstehen homopolymere Einstrangenden mit einer Länge von 22 (zum' Vergleich durchgeführt), 58 bzw. 204 nucleotiden pro 3'-= Ende.

Zur Klonierung wird als Vektor das Plasmid pBR32.2 (Bolivar et al·, Gene, 2 (1977), S₀ 95 - 113) verwendet. Nach Linearisierung des 'Vektors mit Hilfe der Restriktionsendonuklease Pstl, die das Plasmid nur einmal und zwar im Ampi-• cillin-Gen (dieses Gen kodiert für eine ß--Lactamase, die

ίο -

Ampicillin unwirksam macht und die damit die Ampicillinresistenz des'Plasmid-tragenden Bakteriums bewirkt) spaltet, wird an dessen 3'-Enden dG mit terminaler Transferase synthetisiert. Der Ansatz enthält 5 mM 3'-Enden des Plasmids, 0,15 M Hepes-Puffer pH 7,1, 1 mM GoGl₂ und 102 Enzymeinheiten/ml. Für die Synthese des kurz-geschwänzten Vektors (mit dG_1Q) wird nur 20 /UM ³H-dGTP (8 Ci/mMol) eingesetzt. Die entsprechende Inkubationszeit bei 37'⁰O wird unmittelbar vorher analytisch bestimmt und betrug 5 Minuten

jHffbridisati.onderEndenund TransfprmatjLon Uach Synthese der homopolymeren Einstrangenden werden in 3 getrennten Ansätzen (a 133 /öl) jeweils 45 ng Vektor-DITS und 22 ng BLV-ds-cDNS-dO (n = 22, 58 bzw. 204 nucleotide) in einem 10 BaM Tris/HCl-Puffer (pH 7,5, 100 mM -JIaCl, 0,2 mM EDTA) zunächst 3 Min. bei 64⁰C, danach 2 Std. bei 43°C inkubiert und schließlich in einem Zeitraum von 3 Std. auf 25⁰C langsam abgekühlt. Unter diesen Bedingungen lagern sich die homopolymeren komplementären Einstrangenden der verschiedenen DNS-Moleküle (Vektor- und ds-cDUS-Moleküle in äquimolaren Konzentrationen im Ansatz) aneinander. Diese Mischung·wird unmittelbar zur Transformation von CaClp-behandelten Έ.οοίί ^ 1776-Bakterien (unter Anwendung der Methode von Uorgard et al., Gene₅ 2. (1977), S. 279 -.292) eingesetzt

d) Charakterisierung der Klone

Die Tabelle 1 zeigt die charakteristischen Daten der gewonnenen Transformanten (Klone). Aus der Tabelle wird ersichtlich, daß bei gleichen ds-cDHS-Mengen (in jedem An^- satz 22 ng ds-cDNS) im Pail von ds-cDNS-dC_20/, 4-mal häufi-. ger stark hybridisierende Klone (in-situ-Hybridisation nach Grünstein und Hogness, Proc. Uatl. Acad. Sei USA 7j2 (1975). S; 3961 - 3965) im Vergleich mit dem Ansatz von ds-cDIS-dC22 gefunden v/erden. Mit Hilfe des durchschnittlich relativ langen Schwänzens an ds-cDUS werden lange dscDlTS-Moleküle (mit kürzeren Schwänzen) "bevorzugt" durch den Vektor pBR322-Pst-dG₁₀ selektiert.

. - 11 - 22 1 8 3-4

Da die BLV- P-cDNS, mit der· die Klone rückhybridisiert wer-• den, das gesamte BLV-Genom einheitlich repräsentiert, ist die·Hybridisationsstärke ein Maß der Länge der integrierten BLV-DNS im jeweiligen Klon. Von den stark hybridisierenden Klonen (13 Klone) wurden in 8 Fällen die relative

Mobilität (P) der Rekombinanten-DNS im Vergleich mit dem Vektor pBR322 (4361 Bp) festgestellt und der Quotient 1 /F gebildet«, Dieser Quotient ist für· die stark hybridisierenden Klone untereinander ähnlich. Nach Behandlung mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI oder Hindlll wird die Rekombinanten-DUS entweder nur linearisiert (1 Spaltort jeweils nur im Vektormolekül vorhanden) oder in Spaltstükke zerlegt (nahe dem 3^f~Ende der genomischen BLV-RlIS befindet sich'ein EcoRI-Spaltort, im Zentrum des Genoms ein HindIII-Ort). Es ergeben sich Insertiängen von etwa 600 1 400 Bp. Die.Rekombinanten-Plasmide pLK29 (3820 + 1200 = 5020 Bp, Insertlänge etwa 660 Bp) und pLK232 (4250 + 1320= 5570 Bp, Insertlänge etwa 1210 Bp) tragen einen .EcoRI-Spaltort im Insertbereich und repräsentieren daher den 3'-terminalen Bereich des BLV-RNS-Genoms, Das Rekombinanten-Plasmid pLK42-453 trägt einen Hindlll-Spaltort im

' Insertbereich (3800 + 1900 = 5700 Bp, Insertlänge etwa 1340 Bp) und repräsentiert daher den mittleren Bereich des Genoms. Es enthält gleichzeitig einen internen Pstl-Ort«, . Ein weiteres Plasmid pLKi66 enthält, einen BamHI und BgII-Ort innerhalb eines 400~Bp-Inserts_e Andere Plasmide enthalten Fragmente, die entweder durch die genannten Plasmide'in der kloniertenNukleotidsequenz mit hoher Wahrscheinlichkeit bereits repräsentiert sind oder die keinen internen Restriktionsort, sofern untersucht, besitzen.

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Tabelle 1, Charakterisierung der molekularen Klonierung von BLV-ds-cDHS in E_ecoli

Klonierungs-	pBR322-Pst~dG10	χ BLV-ds-cDHS-dCn	1,065 1,075	204	,9
dCn (n)	22 (Vergleich)	58	1,075	137	IM. 1,078 1,052
Anzahl Tcr-	85	83.			1,131
Transformanten				8	1,131
""" "" o1^ — — ~ Davon mit -^ P- BLV-cDITS stark hybridisierende Klone';	2	3		- - 5	1,07
~ ~ ~ ~ T&fo~ ~ '	- 2 J ------	"377		• pLK 422 425	1,07
Quotient der rela- pJJK 1_/Φ tiven Mobilität (F) OCto -i -i-2-i der pLK-DHS der - ^ jU stark hybridisieren- 235 1,075	£M 29 138		42-453	1,131
den Klone '	166	456	1,15
		465
		488
		493
		522

Erläuterungen:

' Stark hybridisierende Klone schwärzen den

Röntgenfilm bereits nach 20 Min. Exposition tief schwarz. · .·

' im Vergleich mit der Mobilität von nativen · pBR322 in der Agarosegel-Elektrophorese pLK Plasinid des BLV-Rekombinantenldons Hr. WH Tc^r Tetracyclin-resistent (Eigenschaft des Plasmids) .

- 13 - 2 2 1 83 4

2. Klonierung von nichtintegrierter BLV-DHS

a) Bereitstellung des Ausgangsmaterials

Hach Anzüchtung von BLV-infizierten FLK-Zellen in 12 Roller-Gefäßen wurden 2 mg DHS mittels HIRT-T.echnik extra-! . hiert. Das Material enthielt nur etwa 3 ng BLV-DIiS, analytisch durch spezifische RlTS-DUS-Hybridisation bestimmt. Das entspricht einem Anreicherungsverhältnis von ca. 1 : 10 bzw. einem Verhältnis von durchschnittlich weniger als 1 Virus-DUS-Molekül pro Zellgenom. Dieser ermittelte Wert entscheidet über die notwendige Anzahl zu selektierender Klone,· um mit hoher Wahrscheinlichkeit BLV-Klone in einer Rekombinanten-Bank zu entdecken.

Um das relativ schlechte Anreicherungsverhältnis zu verbessern, wurde die DHS mittels präparativer Agarosegelelektrophorese (horizontale Elektrophorese, 20 χ 40 cm, 1 mg DHS pro Gel) getrennt und die DHS im 10 kBp-Bereich " (entspricht 6 χ 10 D), der auf Grund des Molekulargewichts der linearen BLV-DHS das Virus-DHS-Material enthält, nach Ausschneiden der Gelbande wiedergewonnen. Die Wiedeifindung der DHS nach Agaröse-Behandlung der Gelbande betrug etwa 60 % der jeweiligen Fraktion. Die Anreicherung war etwa 35fach (2 ng BLV-DHS unter 40 ,ng Gesamt-DHS) im Vergleich zum ursprünglichen Material. Daraus resultierte, daß etwa 1 spezifischer BLV-Klon unter 20 000 Rekombinanten-Klonen auffindbar sein sollte. Das Material war ausreichend, um in der Folge 45 000 Klone isolieren zu können.

b) Synthese homopolymerer 3'-Enden an doppelsträngiger DHS Die effektivste Kopplung wurde mit unterschiedlich lang gesciiwänzten BLV-DHS- und Plasmidmolekülen (Pstl-lineari-

-siertes Plasmid pBR322) analytisch vorbestimmt und danach zur Rekombinantenerzeugung eingesetzt. BLV-DHS-dCorQ oder -dOg₅ wurde mit pBR322~PstI-dG^, -dG₁₇ oder -dG^ hybridisiert und anschließend in E.coli }£ 1776 transformiert. Die Reaktion mit terminaler Tranafera.se erfolgte im Prinzip wie im Beispiel 1 dargelegt mit den in Tabelle 2 ange-

gebenen Abweichungen. Die unterschiedlichen durchschnittlichen Längen wurden im wesentlichen durch Variation der Uukleotidkonzentration im Reaktionsgemisch erzeugt.

Tabelle 2. Synthese homopolymerer Enden an BLV- und pBR322-DHS

Konzentration der 3'-Enden	Nukleotid- konzentratibn-	Enzymkonz	Inkub. zeit	Längen
(nM)	(/UM)	(U/ml)	(min)	(B)
A. BLV-DNS
8,5	90	28	15	350
9	50	14	12·	65
9	.25-	14	14	42
B. pBR322~DNS
10	50	28	12	a) 11 b) 17
(pBR322 wurde	durch 2 aufeinanderfolgende	Reaktionen	erzeugt)

Die Konzentration der 3'-Enden ist allein auf die terminalen Enden, d. h. auf die DNS-Molekülenden, bezogen. Die Länge (B) ist als durchschnittliche Basenzahl, pro Molekülende angegeben. .

Die Aneinanderlagerung der DNS-Moleküle erfolgte wie im Beispiel 1 bereits beschrieben. Wie erwartet, unterschieden sich die Klonierungseffektivitäten. .

/β.«, Übersicht der Klonierungseffektivitäten Kombination der Transformationseffektivität DNS-Moleküle · c.f,u.//Ug Plasmid

in %

pBR322 (allein,Kontrolle) pBR322-PstI-dG₁₁ (Vektor)

3 χ ιο

χ P-

BLV-dC £ ρ- χ 1"-ανχ, *

BLV-dC_35O.x PhIG₁₁ BLV-dC;,-- χ P-dG,

Ί1

BLV-dC BLV-dC

42 x P-dG

χ P-dG

11 17

ί oo

10 13

. - ¹⁵ - 22 1 834

Alle Ansätze warden unter identischen Bedingungen zusammengestellt und bearbeitet.

Aus den Daten ergibt sich die Schlußfolgerung, daß das isolierte DUS -Material Einstrangbrüche aufweisen muß in einem Bereich von etwa 4 bis 8 Brüchen pro DNS-Molekül, so daß zusätzliche Verzweigungen nach, der terminalen Transferasereaktion entstanden, die die durchschnittliche Länge der homopolymeren Enden bezogen auf terminale und interne 3'-Enden eines BNS-Moleküls senken. BLV-DNS-dCgj- enthält dementsprechend ca. 4 bis S Einstrangbrüche mit homopolymeren Enden im Längenbereich von 11 bis 6 Basen

o) Selektion und Charakterisierung der.BLV-Klone Alle erzeugten Rekombinanten-Klone wurden isoliert und mit der üblichen in-situ-Hybridisationsmethode nach Grunstein und Hogness (s. Beispiel 1) zwecks Selektion der BLV-Re- . kombinanten analysiert. Unter 45 000 Klonen wurden 2 BLV-Klone nachgewiesen und die. betreffenden Rekombinantenklpne aus dem Depot P5-H4 und aus dem Depot P47-F7 angezüchtet. Nach Reinigung der Plasmide und nach SOUTHERN-Transfer (J. Mol. Biol. £8, 503 (1975)) ergab sich für den spezifischen BLV-Klon aus Depot P5-H4 eine Insertlänge von etwa 800 Bp.

Die Lokalisation der klonierten BLV-DNS im natürlichen BLV-Genom wird durch Restriktionsanalyse und Vergleich mit den im Beispiel 1 beschriebenen Rekombinanten durchgeführt.

Claims (11)

22 183 4 -^- Srfindunffsanspruch :

1, Verfahren zur Klonierung von Nucleotidsequenzen des Virus der enzootischen Rinderleukose (BIV), dadurch gekennzeichnet, daß man eine BLV-Desoxyribonucleinsäure (BLV-DNS) für die.

Kopplung mit einer Vektor-DNS, ggf. nach Spalten von im BLV-DITS-Molekül vorhandenen Kopplungssteilen oder Aufbau neuer Kopplungssteilen am BLV-DNS-Molekül, vorbereitet, mit einer Vektor-DNS zur Rekombinanten-DNS koppelt, die Rekombinanten-DNS in Wirtszellen transferiert, dort kloniert und die BLV-Klone selektiert.

2_e Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als BLV-DNS eine homogene oder heterogene Population doppelst rängiger, komplementärer BLV-DNS verwendet, die durch Umkehrtranskription von BLV-Ribonucleinsäure (BLV-RNS) gewonnen wurde» *

3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als BLV-DNS eine in einer Wirtszelle vorhandene\ im Wirtszellgenom nicht integrierte BLV-DNS in replikativer Porin verwendet.

4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als BLV-DNS eine virus-transformierte BLV-DNS verv/endet, die nach Integration aus einem Wirtsgenom wieder herausgeschnitten wurde. .

5. Verfahren nach Punkt 1-4» dadurch-gekennzeichnet, daß die Vorbereitung der BLV-DNS zur Kopplung durch Synthese homopolymerer Einstrangenden (terminale Transferasereaktion) erfolgt.

6. Verfahren nach Punkt 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorbereitung der BLV-DNS zur Kopplung durch Anfügen von kurzen doppelsträngigen Sequenzen mit Restriktionsorten (AdapterSequenzen) und deren Spaltung mit Restrik™ tionsendonucleasen erfolgt. "

7'. Verfahren nach Punkt 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß

die Vorbereitung der BLV-DNS zur Kopplung durch Spaltung • von im BLV-DNS-MoIekül vorhandenen Restriktionsorten mit Res-triktionsendonucleasen erfolgt.

-?- 22 183 Λ

8. Verfahren nach Punkt 1, 2 und 5» dadurch gekennzeichnet, daß von einer heterogenen Population doppelsträngiger, komplementärer BLV-DHS, die durch Umkehrtranskription von genomischer BLV-MS gewonnen wird, ausgegangen wird, lange hoin'opolymere Einstrangenden mit durchschnittlichen Längen von 50 "bis 220 Nucleotiden.enzymatisch angehängt werden, anschließend mit einem linearen Plasmidvektor, der nach der Transferasereaktion kurze homopolymere komplementäre Einstrangenden mit einer durchschnittlichen Länge von nur 8-12 Nucleotiden besitzt, über die Enden aneinandergelagert und in mit CaCIp behandelte E.coli-Bakterien transferiert wird.

9. Verfahren nach Punkt 1, 2 und 5, .dadurch gekennzeichnet, daß von einer nach Molekulargewichten getrennten nahezu homogenen Population doppelsträngiger komplementärer BLV-DlTS bzw. von einer in einer Wirtszelle im Wirtsgenom nicht integrierter BLV-DNS in replikativer Form bzw. von Virustransformierter BLV-DNS, die nach Integration aus einem Wirtsgenom wieder herausgeschnitten wird, ausgegangen wird, homopolymere Einstrangenden mit durchschnittlichen Längen von 8-20 Nucleotiden enzymatisch angehängt werden, anschließend mit einem linearen Plasmidvektor, der nach der Transferasereaktion kurze homopolymere komplementäre Einstrangenden mit einer durchschnittlichen Länge von nur 8-12 Nucleotiden besitzt, über die Enden aneinander-

' gelagert und in mit CaCl₂ behandelte E.coli-Bakterien transferiert wird.

10.Verfahren nach Punkt 1 bis 4 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß von einer nach Molekulargewichten getrennten nahezu homogenen Population doppelsträngiger komplementärer BLV-DNS bzw. von einer in einer Wirtszelle im Wirtsgenom nicht integrierter BLV-DNS in replikativer Form bzw. von Virus-transformierter -BLV-DNS, die nach Integration aus einem Wirtsgenom wieder herausgeschnitten wird, ausgegangen wird, kurze doppelsträngige. Sequenzen von 8-20 Ba-

senpaaren, die einen Restriktionsort enthalten, der auch in den zur Rekombination vorgesehenen Vektormolekülen vorhanden ist, vorzugsweise EcoRI, Hindlll, BamHI, Sail oder Pstl, angehängt werden und die Kopplung über die kohäsiven Enden, die nach der Behandlung mit Restriktionsendonukleäsen an den Restriktionsorten entstehen, erfolgt.

11„Verfahren nach Punkt 1, 3, 4 und.7> dadurch gekennzeichnet, daß von einer in einer Wirtszelle im Wirtszellgenom nicht integrierter BLV-DIS in replikativer Form oder von Virus-transformierter BLV-DHS, die nach Integration aus einem Wirtsgenom wieder herausgeschnitten wird, ausgegangen wird', in der Endregion der BLV-DHS-Moleküle vorhandene Restriktiohsorte, vorzugsweise der EcoRI-Ort in der 3'~Re~ gion, mit Restriktionsendonukleasen gespalten werden, Vektormoleküle mit denselben Restriktionsorten ebenfalls gespalten und mit der BLV-DUS in an sich bekannter Weise gekoppelt werden. .