DD150743A1 - Verfahren zur hydrolyse von c-terminalen estern von peptiden - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Anwendung von Enzymen zur selektiven Esterhydrolyse von Peptidesterderivaten als einer Methode der Peptidsynthese. Das Verfahren dient der Gewinnung reiner, optisch-aktiver Peptide bzw. Peptidderivate in hoher Ausbeute unter guenstigen oekonomischen Bedingungen. Die Erfindung beinhaltet die Ausnutzung der Esteraseaktivitaet von alkalischen Serin-Proteasen aus thermophilen Mikroorganismen im pH-Bereich 7 bis 9. Die Arbeit bei hoeheren Temperaturen steigert die Loeslichkeit der oft schwerloeslichen Peptidesterderivaten und vergroeszert die Reaktionsgeschwindigkeit. Polare organische Loesungsmittel koennen in hohen Konzentrationen zugesetzt werden, wobei zusaetzlich die Gefahr der Spaltung von Peptidbindungen unterdrueckt wird. Das Enzympraeparat kann auch an einen hochmolekularen loeslichen oder unloeslichen Traeger gebunden eingesetzt werden.

Description

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Titel der Erfindung

Verfahren zur Hydrolyse von C-terminalen Estern von Peptiden

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren der Peptidsynthese, in deren Verlauf die Hydrolyse C-terminaler Ester von Peptiden oder Peptidderivaten als Methodik der Abspaltung von Carboxylschutzgruppen angewendet wird.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Methodik der Peptidsynthese bedient sich in vielen Fällen der Kupplung aktivierter Carboxy!komponenten von N-geschützten Aminosäureöder Peptidderivaten mit Aminosäure- oder Peptide stern. Die Estergruppierungen stellen in diesem Sinne Schutzgruppen der Carboxylfunktion der Aminkomponente dar (E. Wünsch (Herausg.), "Synthese von Peptiden" in Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl) XV/1 und XV/2 Stuttgart 1974-). Zur Verlängerung der Peptidkette am C-Terrainus oder zur Gewinnung der C-terminalen freien Carboxylfunktion müssen die Estergruppierungen selektiv abgespalten v/erden. Da als Estergruppierungen vorzugsweise Methyl-, Ethyl- und auch Benzylester verwendet werden, kommt als Abspaltungsmethode bevorzugt die alkalische Hydrolyse zur Anwendung. Diese Methode zeigt bei einigen Peptidderivaten Nebenreaktionen und RaceEiisierung und versagt bei schwerlöslichen und längerkettigen Peptidderivaten häufig, (E.Wünsch, l.c,XV/1; Haslam in "Pro-

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tective Groups in Organic Chemistry ^H.(Ed. McOmie) , London 1973, ρ, 183 ff;.Agarwal et, al. J.Chera.Soc. (C) 1968, 1384; Kenner et, al. J. Amer. Chem. Soc. £4, 3259 (1972); McDermott et. al. in "Chemistry and Biology of Peptides" Ann Arbor 1972, p. 369)· Der Einsatz von proteolytischen Enzyme mit Esteraseaktivität zur Überwindung dieser Mängel ist bisher nur für vereinzelte, durch die relativ hohe Seitenkettenspezifität der Enzyme begrenzte, Fälle mittels.Trypsin und Chymotrypsin erfolgreich gewesen (Walton et. al. J.Org. Chem. 27_, 2255 (1962); Kloss et. al. Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. .3j£, ²^⁸ (1964·); DE-OS 15 18 343 (12q 6/01); Gattner in Semisynthetic Peptides and Proteins "London 1978, p.181). Als Mängel erweisen sich ferner die niedrige Reaktionstemperatur, die damit verbundene geringe Löslichkeit der Peptidester in den überwiegend wäßrigen Reaktionsmedien, die nur begrenzt durch Zusatz organischer Lösungsmittel aufgebessert werden kann, sowie die Gefahr der Spaltung von Peptidbindungen, da der Esterase/Peptidase-Quotient bei diesen Enzymen nur in der Größenordnung von 100 ist.

Ziel der Erfindung . - -

Ziel der Erfindung ist die Gewinnung hochreiner,optischer aktiver Peptide oder Peptidderivate aus ihren C-terminalen Estern bei hoher Ausbeute, kurzen Reaktionszeiten und bei geringem ökonomischen Aufwand.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Enzyme zur Verseifung der Peptidester einzusetzen und die Mängel bisheriger Verfahrensweise, die durch die Eigenschaften der bisher verwendeten Enzyme bedingt sind, zu überwinden.

Merkmale der Erfindung sind deshalb 1. der Einsatz einer alkalischen Serin- Protease mit extrem hoher Esteraseaktivität, die zusätzlich die Esterhydrolyse bei erhöhter Temperatur katalysieren kann und von organischen Lösungsmitteln in ihrer Wirkung wenig beeinträchtigt wird, 2. der Einsatz eines solchen Enzyms auch in immobilisierter Form, um die Abtrennung von den Reaktionsprodukten zu erleichtern bzw. um das Enzym einer Wiederverwendung zuzuführen. Es zeigt sich weiterhin, daß

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das Substrat nicht unbedingt vollständig gelöst vorliegen muß. Erfindungsgemäß wird das Peptidesterderivat in Wasser oder in einem polaren organischen Lösungsmittel gelöst und im pH-Bereich 7 bis 9 bei Temperaturen zwischen 293 K und 3^3 K mit der wäßrigen Lösung einer gereinigten alkalischen Serin- Protease aus einem thermophilen Mikroorganismus, z.B. Thermitase, inkubiert, wobei der Anteil des polaren organischen Lösungsmittels 0 bis 70 fs betragen kann. Die Esterhydrolyse kann mit bekannten Methoden analytisch leicht verfolgt werden. Nach Beendigung wird nach bekannten Verfahren aufgearbeitet.

Ausführungsbeispiele

1) Z- GIu (OBu )- AIa-OMe (Abkürzungen nach IUPAC-IUB-Regeln),welcher bei alkalischer Verseifung Nebenprodukte bildet, wird mit z.B. Dimethylformamid gelöst und durch Verdünnen mit einer wäßrigen Lösung von gereinigter Thermitase zu einer Endkonzentration von 0,2 bis 0,02 mo1/1 gebracht, wobei der Anteil des organischen Lösungsmittels 2 bis 20 % beträgt und das Substrat zum Teil ungelöst vorliegt. Im pH-Bereich 7 bis 9 wird bei einer Temperatur zwischen 303 und 333 K bis zu 90 Minuten in Gegenwart von 5· 10 mol Ca /1 ihkubiert, wobei der pH-Wert konstant gehalten wird. Das.Enzym-Sutetrat-Verhältnis beträgt dabei etwa Λ : 100 000 auf Molbasis. Z- GIu (OBu )-Ala-0H wird aus dem Ansatz nach Ansäuern, Extraktion und Salzbildung mit Dicyclohexylamin in 80$ iger Ausbeute nach Rekristallisation rein erhalten, Fp 431 bis 43A- K.

2) Ansatz wie 1), jedoch mit Anteil des organischen Lösungsmittels von 20 bis 5Q?S, wobei das Substrat vollständig gelöst vorliegt.

3) Ansatz wie unter 2), jedoch unter Verwendung von Thermitase, die nach an sich bekannten Verfahren an einen makromolekularen löslichen oder unlöslichen Träger gebunden war. Die Aufarbeitung nach 1) erfolgt nach Abtrennung des immobilisierten Enzyms in bekannter l/eise.

4) Der schwerlösliche und alkalisch nicht verseifbare Hexapeptidester Nps-Ser(Bzl)-His-Leu-VaI-GIu(OBu )-Ala-OMe wurde in 5OJ5 iget« wäßrigen Dimethylformamid zu einer Konzentration von 4- bis 8 mmol/1 suspendiert

und mit Thermitase im Molverhältnis 1 : 10 000 in Gegenwart von Ca -

Ionen innerhalb von 90 Minuten bei 323 ibis. 333 K im pH-Bereich 8 bis vollständig hydrolysiert. Nach bekannten Verfahren wurde die reine Verbindung Nps-Ser(Bzl)-His-Leu-Val-G Iu(OBi^)-AIa-OH, Fp.503 bis 508 K

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(Zers.) in 85% iger Ausbeute isoliert.

5) Boc- Pro- GIy- OMe wurde in 10 bis 20% igem wäßrigen Dimethylformamit zu einer Konzentration von 0,2 bis 0,4 mol/1 gelöst und bei 303 bis 3I8 K in Gegenwart von Ca - Ionen mit Thermitase im pH- Bereich 7 bis 9 inkubiert. Das Molverhältnis beträgt etwa 1 j 50 000. Nach Beendigung der Reaktion wurde Boc- Pro- GIy- OH in reiner Form nach bekannten Verfahren in 75% iger Ausbeute erhalten, Pp 442 bis 444 K.

6) Z- Leu- VaI- GIu(OBu )- Ala- OMe wird einmal in 10% igem wäßrigen Dimethylformamid (Ansatz A), zum anderen in 50% igem Dimethylformamid (Ansatz B) suspendiert und in einer Konzentration von etwa 10 bis 25 mmol/1 mit Thermitase im Molverhältnis 1: 10 000 in Anwesenheit von Ca - Ionen bei 323 bis 333 K im pH- Bereich 8 bis 9 inkubiert. Im Ansatz A trat als Nebenreaktion eine Spaltung von Peptidbindungen auf, bevor die C- terminale Esterspaltung beendet war. Im Ansatz B konnte eine Peptidbindungsspaltung erst nach Ablauf der Esterspaltung beobachtet werden·

Claims (7)

220579 -s- Erfindungsansprüche

1. Verfahren zur Hydrolyse von C- terrainalen Estern von Peptiden der allgemeinen Formel I

-NH-CH-C

I X- A₁-A₂- ...A_n-NH-CH-COOR

in der X=H oder einen Rest darstellt, der eine N-Schutzgruppe darstellt oder die N- terminale Gruppe anderweitig substituiert, A^J Ap, ...A saure, neutrale oder basische Aminosäuren darstellt, deren funktioneile Gruppen in den Seitenketten ungeschützt, teilgeschützt oder vollgeschützt sein können, wobei n£1 ist. E = Niedrigalkyl, Alkylaryl oder Aryl sowie deren Substitutionsprodukte bedeuten und

R¹ die Seitenkette der C- terminalen L- Aminosäure ist, die ebenfalls geschützt vorliegen kann

gekennzeichnet dadurch, daß die Hydrolyse durch eine alkalische Serin- Protease mit extrem hoher Esteraseaktivität, gewonnen aus einem thermophilen Mikroorganismus, katalysiert wird.

2. Verfahren nach Punkt 1 gekennzeichnet dadurch, daß die gereinigte alkalische Serin- Protease vorzugsweise aus Thermoactinomyces vulgaris gewonnen wird.

3· Verfahren nach Punkt 1 gekennzeichnet dadurch, daß die gereinigte alkalische Serin- Protease aus thermophilen Mikroorganismen in Lösung oder in immobilisierter Form eingesetzt wird.

4, Verfahren nach Punkt 1 bis 3 gekennzeichnet dadurch, daß die enzymatisch katalysierte Hydrolyse der C- terminalen Estergruppe im Temperaturbereich von 293 K bis 34-3 K und. im pH- Bereich 7 bis 9 durchgeführt wird.

5» Verfahren nach Punkt 1 gekennzeichnet dadurch, daß die zu hydrolysierende Esterverbindung in Lösung oder in Suspension vorliegt.

6. Verfahren nach Punkt 1 bis 5 gekennzeichnet dadurch, daß die Esterhydrolyse in wäßriger Lösung oder in Mischungen von Wasser mit organischen Lösungsmitteln erfolgt.

7. Verfahren nach Punkt 1 gekonnzeichnet dadurch, daß zur Vermeidung einer Spaltung von Peptidbindungan ein Zusatz von organischen Lösungsmitteln die Peptidaseaktivität gegenüber der Esteraseaktivität unterdrückt.