DD146289A1 - Verfahren zur herstellung von somatostatin und somatostatinanaloga - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Somatostatin und Somatostatin-Analoga der allgemeinen Formel I H-Ala-Gly-X-Lys-Asn-Phe-Y-Cys-Thr-Phe-Thr-Ser-X-OH worin X fuer Cystein oder Selenocystein und Y fuer L-oder D-Trp steht. Diese Verbindungen koennen zur Behandlung von Akromegalie, Angiopathie und beim Diabetes mellitus sowie zu diagnostischen Zwecken verwendet werden.

Description

-a- 21 5 85

Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung von Somatostatin und S omat ο st at i nanaloga

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Somatostatin und seiner Analoga. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Darstellung von Diseleno-D-

Trp -Somatostatin sowie bei der Synthese verwendeter Zwischenprodukte.

Das erfindungsgemäß hergestellte Somatostatin bzw. seine Analoga können für die klinische Pharmakologie hinsichtlich der Behandlung von Akromegalie, der Angiopathie und beim Diabetes mellitus sowie zu diagnostischen Zwecken Verwendung finden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt, daß Somatostatin und seine Analoga sowohl konventionell /"Vgl. beispielsweise D. Sarantakis und Wc A. Mekinley, Biochem. Biophys. Bes. Cornmun. 54, (1973)? H. U. Immer et al., HeIv. Chim. Acta £7, 730 (1974)_7 ^als auch am polymeren Träger /"Vgl. beispielsweise J. Eivier, J. Amer. Chem. Soc £6, 2986 (I974)j

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Ρ· Brazeau et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 6£, 1202 (1974)j J. Rivier et al., C. E. Acad. Sei 276, 2737 (1973)5 D. Sarantakis et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 538 (1973)5 D· Sarantakis et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 72S₅ 336 (1976)_7 nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden kann. ·

Bei vielen der bisher in der Literatur beschriebenen Somatostatin-Synthesen kam die Festphasen-Technik zur Anwendung. Diese Methode ist jedoch nicht ohne Bedenken auf die Darstellung längerkettiger Peptide anwendbar. Infolge nicht Quantitativer Umsatzraten bei jedem Synthesecyclus können Rumpf- und Fehlsequenzen entstehen, wodurch sich eine wesentliche Komplizierung bei der Reinigung des Endproduktes ergibt. Darüber hinaus erfordert die Festphasen-Technik auf Grund des hohen Überschusses an Acylierungskomponente bei jedem Reaktionscyclus einen maximalen Schutz der Sei— tenkettenfunktionen bei genügend hoher Stabilität gegenüber den sich wiederholenden Deblockierungsschritten zur Freisetzung der c6-Aminofunktion. Am Ende der Synthese können diese Seitenkettenschutzgruppen teilweise nur unter relativ drastischen Bedingungen wieder entfernt werden, wobei eine Schädigung des Moleküls und damit verbunden eine Herabsetzung der biologischen Aktivität nicht auszuschließen ist*

Dem gegenüber besteht bei der konventionellen Verfahrenstechnik die Möglichkeit einer kontrollierbaren Synthese (Zwischenproduktcharakterisierung und -reinigung). Die in vielen Fällen bei konventionellen Synthesen gewählte

7 ft Hauptschnittstelle zwischen Phe und Trp hat den Uaehteil, daß aoidolytische Deblockierungsschritte am Trp zu Uebenreaktionen führen können /""vgl. beispielsweise M. Louw et al·, Hoppe-Seyler¹s Z. Physiol. Chem. 2§S» 1643 (1978); W. Bauer und J. Pless, Peptides 1975 Proc. IV Amer. Pept· Symp._7 ct. R. Welk und I. lieienhofer, Ann. Arbor, Michigan 48106 S. 341_7

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Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren aufzuzeigen, das folgende Vorteile aufweist:

Unterteilung der Tetradecapeptidsequenz des Somatostatins in geeignete Fragmente, deren genereller Einsatz auch für die Synthese von Analoga unter geringem präparativen Aufwand möglich ist. In den Eahmen der vorliegenden Erfindung fällt insbesondere ein Verfahren zur Synthese von

Diseleno-D-Trp -Somatostatin,

4 215

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Somatostatin und seiner Analoga unter Anwendung der Fragmentkondensation aufzuzeigen. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch 1· Verlagerung der Hauptschnittstelle zwischen Phe ⁺'

7 und Phe , wobei die Notwendigkeit der direkten Acidolyse am Tryptophan in Position 8 (Reduzierung der Nebenreaktionen) entfällt,

2. die Unterteilung der Tetradecapeptidsequenz des Somatostatins in geeignete erfindungsgemäße Fragmente, woduroh eine Synthese von Somatostatin-Analoga unter geringem präparativen Aufwand ermöglicht wird,

3. die bevorzugte Anwendung der Aktivestermethode zur Darstellung der Teilfragmente, womit die generelle Anwendung der Taktik des Minimalschutzes der Seitenkettenfunktionen ermöglicht wird,

gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren/- ermöglicht eine einfache Synthese der potentiell pharmakologisch bedeutungsvollen

Verbindung Diseleno-D-Trp -Somatostatin, die bisher auf andere Weise nioht dargestellt werden konnte, z. B. mit dem Ziel der Untersuchung der Bedeutung der Disulfidbrücke des Somatostatins für dessen biologische Aktivität.

Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellten Verbindungen sind durch die Formel (I)

I i

H-Ala-Gly-X-Lys-Asn-Phe-Phe-Y-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X-OH (i)

gekennzeichnet,

worin X für Cystein oder Selenocystein steht und Y die Bedeutung L-Trp- oder D-Trp besitzt.

-{-) Abkürzungen für Aminosäure- und Peptidderivate, vgl. JUPAG-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, J. Biol. Chem. 247, 977 (1972)

Eine bevorzugte erfindungsgemäße Verbindung ist durch Formel (l) dargestellt, worin X für Selenocystein steht und Y die Bedeutung von D-Trp besitzt.

Die Verbindungen der Formel (i), worin X und Y wie zuvor definiert sind, werden nach einem Verfahren hergestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das geschützte Peptid der Formel (II)

S-Ala-Gly-X(T)-Lys(U)-Asn-Phe-Phe-Y-Lys(ü)-Thr~Phe-Thr-V (II)

in die beiden Hauptfragmente der Formel (III) S-Ala-Gly-X(T)-Lys(U)-Asn-Phe-W (III)

und (IV) H-Phe-Y-Lys(U)-Thr~Phe-Thr-Ser-X(T)-V (iv)

unterteilt, deren Verknüpfung vorzugsweise nach Hydrazinolyse des Peptides der Formel III über die Acid-Methode, aber auch nach alkalischer Hydrolyse unter Verwendung von OCCI/Additiv-Verfahren die Verbindungen der Formel II ergibt, in denen

S für tert. Butyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-,

p-Methoxybenzyloxycarbonyl- T für Benzyl; p»Methoxybenzyl U für Benzyloxycarbonyl, p-Chlorobenzyloxycarbonyl;

o-Chlorbenzyloxycarbonyl V für Benzyl·-; p-Nitrobenzylester und W für Methyl? Äthyl-; Benzylester

stehen.

Die beiden Hauptfragmente der Formeln III und IV (Sequenz C und Sequenz L), worin S, T, U, V, W, X, Y wie oben definiert sind, lassen sich für Formel III (Sequenz C) durch Verknüpfung der Teilfragmente der Sequenzen A und B und für Formel IV (Sequenz L) durch Verknüpfung der Teilfrag-

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mente der Sequenzen D, E, P "bzw., D, E, G und X in unterschiedlicher Reihenfolge nach den üblichen Methoden der Peptidchemie (E. Wünsch, Synthese von Peptiden im Houben-Weyl Bd. 1^/11, Methoden der org. Chemie (Ed. E. Müller) Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974) entsprechend dem allgemeinen Syntheseschema 1 aufbauen.

Zur temporären Blockierung der Jj -Aminogruppe diente der tert. Butyloxycarbonyl-Rest, dessen acidolytische Abspaltung mit Hilfe von HCl/Eisessig, HCl/Dioxan, Ameisensäure, 0,12 U HCl/Ameisensäure, Trifluoressigsäure, Trifluoressigsäure/CHoClo (1:1) vorzugsweise mit HCl/Dioxan auf Grund der freien Hydroxyfunktionen des Thr und Ser erfolgte.

Zum Aufbau der Teilfragraente A, B, D, E, F, G wurden die in der Peptidchemie üblichen Knüpfungsmethoden - DCCI, DCCI/Additiva, Mischanhydrid, aktivierte Ester, Azid, Säurechlorid - eingesetzt. Vorzugsweise erfolgte der Aufbau über die Methode der aktivierten Ester, wobei vorwiegend die entsprechenden Pentafluorphenyl- und N-Hydroxysuocinimidester eingesetzt werden.

Auf der Stufe des Dipeptides Asn-Phe zum Aufbau der Sequenz B führte die Verwendung von Z-Asn-oPfp im Vergleich zum Boc-Derivat zu ca. 60 <& höherer Ausbeute.

Die Verknüpfung der Teilfragmente zu den beiden Hauptfragmenten (Sequenz C und L) erfolgte vorzugsweise durch Verwendung des DCCI/Additiv-Verfahrens, der Acidkupplung und der Methode der gemischten Anhydride.

Die sich an die Fragmentkondensation (Sequenz C und Sequenz L) zur Darstellung der geschützten Tetradecapeptide der Formel II (Sequenz M) anschließende Deblockierungsreaktion, d. h. die Umwandlung der geschützten Mercapto- bzw. Seleno-, Amino- sowie Carboxylgruppen in freie Gruppen wurde nach bekannten Methoden durch Behandlung mit Natrium/flüssigem Ammoniak, Fluorwasserstoff/Anisol oder Bortris-(trifluoracetat)/Thioanisol durchgeführt.

Die Oxydation der Mercapto- bzw. Selenogruppen in den Positionen 3 und 14 zu der Disulfid- bzw. Diselenidbrücke kann mittels Sauerstoff oder Kaliumferrieyanid erfolgen. Anschließend werden die Endprodukte an Sephadex G- 25 F durch Gel- und Verteilungschromatographie gereinigt.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung soll nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden

Es werden folgende Abkürzungen verwendet:

Aminosäuresymbole entsprechend JUPAC-JUiB Commission on Biochemical Nomenclature, Sec steht für Selenocystein

AcOH	Essigsäure
Boc	tert. Butyloxycarbonyl
BTFA	Bortris (trifluoracetat)
BzI	Benzyl
CAiBE	Chlorameisensäureisobutylester
DC	Dünnschichtchromatogramm,
	— chromatogra.phisch
DCCI	N,NI-Dicyclohexylcarbodiimid
DMP	Dimethylformamid
EE	Essigester
HOBt	H-Hydroxybenzotriazol
HV	Hoohvakuum
i. Vak.	im Vakuum
LM	Lösungsmittel
Mb zl	p-Methoxybenzyl
MeOH	Methanol
OBzI	Benzylester
OMe	Methylester
ORB	p-Hitrobenzylester
OHSu	N-Hydroxysuccinimidester
OPfp	Pentafluorphenylester
PA'	Petroläther
ET	Raumtemperatur
TÄA	Triethylamin
TFA	Trifluoressigsäure

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TEF Tetrahydrofuran

Z Benzyloxycarbonyl

Z(oCl) o-Chlorbenzyloxycarbonyl

Z(pCl) p-Chlorbenzyloxycarbonyl

Methode Δ : Misohanhydrid-Methode Methode B : DCCI/HOBt-Verfahren Methode C : Methode der aktivierten Ester C I : Kupplung mit U-Acyl-aminosäure-

H-hydroxysuccinimidester C II: Kupplung mit H-Acyl-aminosäure-

pentafluorphenylester

Methode D : Honzel-Rudinger-Variante der Azid-Methode Methode E : alkal. Hydrolyse der Peptidester

Allgemeine Vorschriften zu den Kupplungsmethoden A bis D siehe E, Wünsch, Synthese von Peptiden im Houben-Y/eyl Bd. 1J5/II Methoden der organ. Chemie (Ed. E. Müller), Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart 1974.

Unter "übliche Aufarbeitung" versteht man:

Nach beendeter Kupplungsreaktion mit Hilfe der Methoden A bis D wird das jeweilige Hohprodukt in Essigester aufgenommen und die Lösung nacheinander zweimal mit Wasser (NaCl-gesättigt), dreimal mit 10 #iger Citronensäurelösung, dreimal mit Wasser, dreimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Na^SCK getrocknet und das Rohprodukt durch Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum isoliert.

Handelt es sich um Peptide, die sich nicht in Essigester lösen, wird der nach dem Abrotieren des Lösungsmittels verbleibende ölige Rückstand mit Wasser oder Essigester zum Pestprodukt verrieben und dieses anschließend durch Waschen auf der Fritte mit Y/asser, 10 #iger Citronensäurelösung, Wasser, gesättigter Hatriumhydrogencarbonatlösung und nochmals mit Wasser gewaschen.

Man kristallisiert abschließend aus einem geeigneten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch und trocknet das Produkt i. Vak. über Phosphorpentoxid. Abweichungen von dieser allgemeinen Vorschrift werden vermerkt.

Folgende Laufraittelsysteme (in Volumenteilen) zur Dünnschichtchromatographie auf Silicagel-Pertigplatten (Silufol ÜV 254, CSSE) wurden verwendet:

2-Butanol-Ameisensäure-Wasser 75 + 13,5 + 1 1-Butanol-Essigsäure-Wasser I-Butanol-Essigsäure-Wasser 1-Butanol-Pyridin-Essigsäure-

Wasser 40+10+10+20

Chloroform-Methanol Essigester-Methanol 2~Propanol~25 #iges Ammoniak-Wasser 70+10+10

Bei den Aminosäureanalysen wurden die Werte für Tryptophan und Cystein nicht bestimmt, die mit ' gekennzeichnete Aminosäure stellt den Bezugswert dar·

B	A	W	1
B	E	W	2
B	E	W	W
B	P	E
C	M
E	M
P	A	W

75 η	,5 +
60 π	+ 20
80 ^	+ 20
40 η	+ 10
70 η
50 η
ι- 13
h 20
r'20
h 10
ι- 20
r 50

ίο

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Beispiel I - /"Sec^*¹*,D-Trp⁸^ - Somatostatin

1.1,. Z-Asn-Phe-OMe (Methode G II)

4,32 g (10 mMol) Z-Asn^-OPfp und 2,37 g (11 mMol) H-Phe-OMe^HCl in 40 ml Dioxan wurden bei 0 ⁰C unter Rühren mit 1,54 ml (11 mMol) TlS versetzt. Das Eeaktionsgemisch wurde 0,5 h bei 10 ⁰C und über Macht bei ST gerührt, anschließend das Lösungsmittel i. Vak· abdestilliert. Mit Wasser ließ sich der ölige Rüokstand zum Feststoff verreiben, der auf der Pritte mit Wasser, heißem Isopropanol und Methanol gründlich gewaschen wurde» Nach Umkristallisieren aus Methanol wurde ein DC einheitliches Produkt isoliert.

Ausbeute	* •	»76	C	C	S	-	(88 fo d.	Th.)	, CM	9	,83
Pp:		199	C	61.	09	199,5 0C		,42)	9	,81
	S	+'	61,	in	0 (c=1, AcOH)	N
	I6,	>2H	25	BAW, BEW2,
DC: einheitlich	,82		IT3O6 (4273
	,77		H 5,90
Ber.	H 5,94
Gef.

H-Asn-Phe-OMe · HCl

Die Entfernung der Z-Schutzgruppe von I₁.1.. gelang durch katalytische Hydrierung mittels Palladiumschwarz-Katalysator. Zu diesem Zweck wurden 3,2 g (7,5 mMol) Z-Asn-Phe-OMe in 100 ml Methanol-Essigsäure (1:1) gelöst und in Gegenwart von Palladiumschwarz und 1,25 ml 6 W HCl (7,5 mMol) hydriert. Kach beendeter Kohlendioxid-Entwicklung (Ausbleiben der ^wBariumcarbonat-Reaktion^t!) wurde vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat i. Vak. bis zur Trockene eingeengt. Each Lösen des öligen Rückstandes in wenig MeOH konnte das Produkt durch Zugabe von Äther ausgefällt werden.

Ausbeute: 2,35 g (95 K> Th.) r<J%° = +13,37° Coal, IMF)

DC: einheitlich in BM, BEW1, CE, PAW

O₄ (329,76)

Ber. C 50,99 H 6,11 N 12,74 Gef. C 50,81 H 6,15 ir" 12,65

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1.3. Boc-Lys/"z(oCl)_7-Asn-Phe-0Me (Methode C II)

3,49 g (6 mMol) Boc-Lys/~Z(oCl)J7-0Pfp und 2,08 g (6,3 mMol) H-Asn-Phe-OMe»HCl wurden in 20 ml DMP gelöst und nach Abkühlen auf 0 ⁰C mit 0,88 ml (6,3 mMol) TÄA versetzt, 0,5 h bei 0 ⁰C und über Nacht bei RT belassen. Die übliche Aufarbeitung durch Waschen auf der Pritte und Kristallisation aus Me0H/H₂0 oder MeOH lieferte das gewünschte Peptid.

Ausbeute: 3,56 g (86 # d, Th.) Pp: 159 - 161 ⁰C

ßoj^ = -3,72° (c=1, DMP)

C₃₃H₄₄ClU₅O₉ (690,15)

Ber. C 57,43 H 6,43 N 10,15 Gef. C 57,12 H 6,48 N 10,02

1.4. H-Lys/""z(oCl)_7-Asn-.Phe-0Me .HCl

3,04 g (4,4 mMol) Boc-Lys/"z(oCl)_7-Asn-Phe-0Me wurden in 10 ml 3,8 N HCl/Dioxan gelöst. Nach 30 min verdampfte man das Lösungsmittel teilweise am Rotationsverdampfer und versetzte den Rest mit Äther. Das Produkt wurde abfiltriert, mit Äther gewaschen und über Pp^s und KOH getrocknet.

Ausbeute: 2,76 g (quantitativ) Pp: 215 - 218 ⁰C

DC: einheitlich in BAW, BEW2, CM

C₂₈H₃₇Cl₂Ii₅O₇ (626,50)

Ber. C 53,68 H 5,95 Ii 11,18 Gef. C 53,40 H 6,02 U 10,95

«. 215 85 9

Boc-Sec(Bzl)-NH-im,

2,22 g (4,5 mMol) Boc-Seo(Bzl)-ONB, dargestellt nach Theodoroponlos et al., wurden in 7,5 ml MeOH-DMI¹ (2:1) gelöst und mit 1,45 ml Hydrazin-Hydrat versetzt. Nach 24 h bei ET war die Reaktionslösung stark gelb gefärbt. Das Produkt wurde mit Wasser ausgefällt, abgesaugt und mit Wasser und Äther gründlich gewaschen, wobei es sich entfärbte.

Nach Kristallisation aus MeOH erhielt man ein DC einheitliches Produkt in Form feiner Nadeln.

Ausbeute: 1,39 g (83 % d. Th.) Pp: 130 - 132 ⁰C

ßcj^ = -6,68° (c=1, DMP) DC: einheitlich in BAW, BEW2, CM

C₁₅H₂₃N₃O₃Se (372,32)

Ber. C 48,39 H 6,23 N 11,29 Gef. C 48,42 H 6,54 N 11,02

Boc-Sec(Bzl)-Lys/~Z(oCl)_7-Asn-Phe-0Me (Methode D)

745 mg (2 mlol) Boc-Sec(Bzl)-NHNH₂ wurden in 10 ml DMP gelöst, auf -20 ⁰C abgekühlt und nacheinander mit 1,9 ml 4,2 W HCl/Dioxan (8 mMol HCl) und 0,25 ml (2,1 mMol) tert.-Butylnitrit versetzt. Nach 15 min bei -15 ⁰C wurden 1,19 g (1,9 mMol) 1.4. und 0,266 ml (1,9 mMol) TÄA, gelöst in 5 ml DMP, zum Reaktionsgemisch gegeben. Zur Neutralisation der Salzsäure wurden weitere 1,12 ml (8 mMol) TÄA zugetropft (Vermeiden eines Basenüberschusses —-^ p_H-Kontro He ! ). Die Re

p_H

aktionslösung wurde 1 h bei -15 ⁰C weitergerührt, dann langsam a.uf 0 ⁰C erwärmt und während weiterer 20 h bei dieser Temperatur belassen.

Nach Beendigung der Reaktion wurde das DMP im HV verdampft, der ölige Rückstand mit Wasser zum Pestprodukt verrieben und durch Yifasehen auf der Pritte wie

ι* 215 85 9

üblich aufgearbeitet. Nach Umkristallisieren aus DMF/EE-Ä'ther (1:1) konnten .1,5 g (1,61 mMol = 85 % d. Th.) r.jS. isoliert werden, die jedoch noch geringe Mengen Ausgangsverbindung 1^.4. enthielten. Zur weiteren [Reinigung wurde das Tetrapeptid in wenig MP gelöst, mit einer heißen Lösung aus MeOH-H₂O (1:2) ausgefällt und nach Abfiltrieren mehrmals mit warmem Wasser, EE und Äther gewaschen. Abschließend wurde das Produkt nochmals in wenig DMF aufgenommen und mit einem Gemisch aus EE und MeOH (1:1) ausgefällt.

Ausbeute: 0,87 g (49 # d. Th.) Fp: 195 - 196 ⁰C

£(jl° = -4,0° (c=1, DMP) DG: einheitlich in BAW, BEW2, GM

C₄₃H₅₅ClN₆O₁₀Se (930,31)

Ber. C 55,51 H 5,96 N 9,03 Gef. C 55,19 H 5,82 N 8,79

1.8. Boc-Ala-Gly-Sec(Bzl)-Iys^f"Z(oCl)_7-Asn-Phe-0Me

(Methode B)

222 mg (0,9 mMol) Boc-Ala-Gly-OH, 676 mg (0,78 mMol) 1.7. und 116 mg (0,86 mMol) HOBt löste man in 20 ml DMF, kühlte die Lösung auf 5 ⁰C,und versetzte sie nacheinander mit 1 (0,78 mMol) N-Methylmorpholin und 177 mg (0,86 mMol) DCCI (gelöst in 2 ml DMF). Nach 2 h bei -5 ⁰C und 12 h bei ET wurde vom angefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Lösungsmittel Vak. abgedampft und der ölige Rückstand mit Essigester zum Feststoff verrieben. Waschen auf der Fritte und Kristallisation an DMF/Äther und DMF/EE lieferte das gewünschte Peptid.

Ausbeute: 712 mg (86 # d. Th.) Fp: 194 - 200 ⁰C (Zers.)

£ = -13,37° (o=1, B») DCi einheitlich in BAW, BPEW

C₄₈H₆₃ClIT₈O₁₂Se (1058,44)

Ber. C 54,47 H 6,00 N 10,59 Gef. C 54,30 H 6,36 N 10,52

I.£. Boc-.Ala-&ly-Sec(Bzl)-Iys/~Z(oCl)_>_7~Asn-Phe-MIM₂ 635 mg (0,6 mMol) I..8. wurden in 5 ml DMP gelöst, bei 0 ⁰C mit 4 ml Hydrazin-hydrat versetzt«, Man beließ 20 min bei 0 ⁰C und 2 Tage bei ET. Anschließend wurde das Produkt mit Wasser angefällt, abfiltriert, auf der Pritte gründlich mit Wasser, Methanol und Äther gewaschen und über H₂SO₄ i. Yak. getrocknet.

Ausbeute: 612 mg (97 # d. Th.) Pp: 218 - 225 ⁰C (Zers.) GG^ = -20,33° (ο*1, DMP) DC: einheitlich in BAW, BEW2, BPEW

Aminosäuren-Analyse:

AIa(I)⁺ 1,00 GIy(I) 0,96 Lys(i) 1,00 Asp(O 0,94 Phe(O 1 ,10

I.JhO.Boc-Thr-Phe-Olie (Methode Cl)

3,23 g (15 mMol) H-Phe-OMe-HCl wurden in 30 ml DMP und 30 ml THP gelöst und mit 4,74 g (15 mMol) Boc-Thr-ONSu versetzt. Nachdem sich alles klar gelöst hatte, gab man bei 0 ⁰C 2,1 ml (15 mMol) TÄS zu und rührte die Lösung 3 h bei 0 bis 5 ⁰C und weitere 48 h bei ET. Das Produkt wurde wie üblich aufgearbeitet und aus EE/PÄ sowie Me0H/H₂0 umlcristallisiert.

Ausbeute: 5,16 g (90,5 % d. Th.) Pp: 89 - 90 ⁰C

²^ = +5,6.8° (c=1, DMP) DC: einheitlich in BAW, BEWI, CE

	C	19H	28Ν2(	)6 (380	,42)	H	7,	36
Ber.	C	59	,98	H 7,	42		7,	17
Gef.	59	,99	H 7,	55

I.1i..H-Thr-Phe-0Me'HCl

Die Boc-Gruppe wurde mit 4 N¹ HCl/Dioxan (1 h bei ET) abgespalten und das resultierende Hydrochlorid mit Äther ausgefällt, abfiltriert und aus THP/ Äther umkristallisiert.

Ausbeute:	0	C	96 %	- d.	Th	(	.	, DMP	)
Pp:		C	148	- 149	IF	0C	(316	,78)
C°ü\	+34,	42°	6	C=1 j	H	8,84
	C14	H21C	6	2°4	H	8,68
Ber.	53,08	H	,68
Gef.	53,30	H	,71.

. Boc-Lys/~Z(pCl)J^r-Thr-Phe-OMe (Methode C II)

5,81 g (10 mMol) Boc-Lys/~Z(pClXJT-OPfρ wurden in 20 ml THP gelöst und bei 0 ⁰C mit 3,48 g (11 mMol) I.1J_. und 1,54 ml (11 mMol) TÄA versetzt. Das nach Aufarbeitung und Umkristallisieren aus EE/PÄ bzw« EE in 97 $iger Ausbeute erhaltene Produkt war DC einheitlich, zeigte jedoch eine schwach gelbliche Par— bung. Uochmalige Kristallisation aus Me0H/H₂0 lieferte ein schneeweißes Existallisat.

Ausbeute: 6,26 (92,5 % d. Th.) Pp: 93 - 96 ⁰C

βζβ*. = -4,56° (o-1, DMP) DC: einheitlich in BATi, BEW2, CM

C₃₃H₄₅ClIT₄O₉ (677,17)

Ber. C 58,53 K 6,70 ΪΓ 8,27. Gef. C 58,33 H 6,60 N 7,88

17 21 585 9

1.12· H-Lys/~Z(pCl)_7-Thr-Phe-0Me· HCl

Zur Abspaltung der Boc-Gruppe wurden 5,9 g (8,71 mMol) 1.12. in 25 ml 4,2 N HCl/Dioxan gelöst, das LM nach 30 min i. Vak. abgedampft und das Produkt mit Äther quantitativ ausgefällt. Kristallisation aus MeOH/Äther lieferte das gewünschte Peptid-Hydrochlorid in 92 #iger Ausbeute.

Ppi 185 -192 ⁰C (Zers.) £^J^ - +11,16° (c=1, DMP) DC: einheitlich in BAW, BEW2, PAW

Ι·Μ· Boc-Phe-D-Trp-OMe (Methode A)

Zu einer Lösung von 2,65 g (10 mMol) Boc-Phe-OH, 1,4 ml (10 mMol) TÄA und 1,3 ml (10 mMol) Ca, BA in 30 ml THP wurde nach einer Aktivierungszeit von 6 min bei -15 ⁰C eine Lösung von 2,54 g (10 mMol) H-D-Trp-0Me«HCl und 1,4 ml TÄA in 20 ml THP gegeben. Übliche Aufarbeitung und Umkristallisieren aus EE führte zum DC einheitlichen Produkt.

Ausbeute: 4,28 g (92 $ d. Th.) Pp: 128,5 - 129 ⁰C

CoQ²^ = +3,00° (c=1, DMP) DC: einheitlich in BAW,-BEW2, CM C₂₆H₃₁N₃O₅ (465,53)

Ber. C 67,08 H 6,71 N 9,03 Gef. C 66,89 H 6,70 Έ 8,86

Boc-Phe-D-Trp-HHIHg

2,8 g (6 mMol) 1.14. wurden in 5 ml DMP und 10 ml MeOH gelöst. Bei 0 °C gab man 3 ml Hydrazin-Hydrat zu und beließ das Eeaktionsgemisch weitere 24 h bei 0 ⁰C in der Dunkelheit, wobei das Peptid-hydrazid auskristallisierte. Durch Zuga.be von Wasser wurde es vollständig ausgefällt, mit Wasser und Äther gewaschen, aus DMP/MeOH umkristallisiert und im HV

is 21 585 9

über H₂SO₄ getrocknet.

Ausbeute: 2,65 g (95 % d. Th.) Pp: 224 - 225 ⁰C

/PQ^- = +17,83° (0*1, BMP) DC: einheitlich in BAW, BEW2, CM C₂₅H₃₁N₅O₄ (465,54)

Ber. C 64,49 H 6,71 N 15,04 Gef. C 64,88 H 6,85 N 15,04

-Thr-Phe-OMe (Methode D)

1,86 g (4 mMol) I.1J5. wurden in 20 ml DMP gelöst, auf -20 ⁰C gekühlt und mit 4 ml (16 mMol) 4 N HCl/ Dioxan und 0,52 ml (4,4 mMol) tert.-Butylnitrit versetzt. Nach 15 min Kühren bei -20 ⁰C gab man zunächst 2,24 ml (16 mMol) TlA und anschließend eine Lösung von 2,45 g (4 mMol) 1-12· und 0,56 ml (4 mMol) TlA in 8 ml DMP zu und beließ nach kurzzeitigem Rühren bei -20 ⁰C über Nacht bei 0 ⁰C. Anschließend wurde das LM im HV abdestilliert, der ölige Rest mit Wasser ausgefällt, auf der Pritte wie üblich gewaschen und aus DMP/EE umkristallisiert.

Ausbeute: 2,75 g (68 % d. Th.) Pp: 131 - 133 ⁰C

Γ€7ΐ° = +3,72° (ο=1, DMP)

DC: einheitlich in BAW, BEW2, BPEW, Aminosäuren-Analyse:

Phe(2)⁺ 2,0 Lys(i) 1,2 Thr(i) 1,0

C₅₃H₆₄ClN₇O₁₁ (1010,55)

Ber. C 62,99 H 6,38 N 9,70 Gef. C 62,38 H 6,49 N 9,45

19 21 5 85 9

1.12· Boc-Phe-D-Trp-Lys/"Z(pCl)J7-Thr-Phe-0H (Methode E)

Zur Verseifung wurden 5 g (4,95 mMol) I.IjS. in 50 ml Dioxan und 10 ml DMP gelöst und mit 6 ml in NaOH versetzt, wobei die Reaktionszeit 12 h betrug. Danach wurde das LM i. Vak. abgezogen und der ölige Rest bei 0 ⁰C mit 10 #iger Citronensäure-Lösung zum Pestprodukt verrieben (Rohprodukt war nicht mehr in EE löslich). Nach Absaugen über eine Pritte wurde das Peptid mit Wasser, EE, wenig MeOH und Äther gewaschen und aus DMP/EE umkristallisiert.

Ausbeute: 3,82 g (77,5 % d. Th.) Pp: 140,5 - 142 ⁰C

/"^7ß° - +8,67° (c=1, DMP) DCj einheitlich in BAW, BEW2, CM

C₅₂H₆₂ClN₇O₁₁ (996,53)

Ber. C 62,67 H 6,27 N 9,84 Gef. C 62,43 H 6,39 N 9,62

JE.JjB. Boc-The-Sec-OMe (Methode C II)

1,93 g (5 mMol) Boc-Thr-OPfp wurden zusammen mit 0,85 g (5,5 mMol) H-Ser-OMe-HCl in 10 ml THP suspendiert. Nach Abkühlen auf 0 ⁰C gab man zunächst 0,7 ml (5 mMol) und nach 30 min nochmals 0,07 ml (0,5 mMol) TÄA zu, rührte die Lösung eine weitere Stunde bei 0 ⁰C und über Nacht bei RT und arbeitete wie üblich auf. Das in BAW, BEW2 und CM DC einheitliche Produkt (Öl) fiel in 95 #iger Ausbeute (1j52 g) an und wurde ohne Zwischencharakterisierung sofort in sein Hydrochiorid überführt

1.19;. H-Thr-Ser-OMe»HCl

Das ölige Produkt Ι·1_8· konnte durch Reaktion mit 10 Äquivalenten 4 U HCl/Dioxan entacyliert und in sein Hydrochlorid überführt werden. Nach 30 min bei RT wurde das LM i. Vak. abdestilliert und der

20 215859

Rückstand durch Ätherzugabe zur Kristallisation gebracht, wobei ein stark hygroskopisches Produkt resultierte.

Ausbeute: 85 # d. Th

L%jl° - +3,69° (o-1, IMP) BC: einheitlich in BAW, BEW2, CM

Boc-Phe-Il-Trp-Lys/'Z^Cl^-Thr-Phe-Thr-Ser-OMe

(Methode B)

Zu 4,19 g (4,2 BiMoI) 1.17. ¹»*1 S (5,5 mMol) 1.1^. und 0,62 g (4,6 mMol) HOBt in 30 ml MP gab man bei -5 ⁰C 0,61 ml (5,5 mMol) IT~Methylmorpholin und 0,95 g (4,6 mMol) OCCI (gelöst in 2 ml IMF). Man ließ 2 h bei 0 ⁰C und über lacht bei ET rühren und arbeitete wie üblich durch Waschen auf der Pritte auf. Das Produkt wurde anschließend nochmals in wenig OMF gelöst und mit EE-Äther (1:1) gefällt, filtriert und mit Äther, EE und wenig MeOH gewaschen.

Ausbeute:	4,6	β (91	10	Ber.	# d. Th.	)	Ly s	Thr	Ser
Fp:	147	- 149	10	Gef.	0C		1	2	1
ßü2v -	-1,<	DO0 (o		C60H76ClH	=1, DMF)		1,2	1,9	1,0
	Aminosäuren-Analyse:		,52	Phe+	98,73)
		,34	2
			2,0
		9O15 (11
Ber. Ή
Gef. N

1.21· p/(p)_7

(Methode E)

4,44 g (3,7 mMol) 1.20. wurden in 10 ml DlF und 20 ml MeOH gelöst und durch Zugabe von insgesamt 4,2 ml 1 N ETaOH innerhalb von 12 h verseift. Die entstandene zitronengelbe Lösung wurde i. Yak. eingeengt und der

ölige Rückstand rait EB zum Pestprodukt verrieben, wobei sich der EE stark gelb färbte. Nach Filtrieren und gründlichem Waschen mit Citronensäure-Lösung, HoO, EE und Äther kristallisierte man aus MeOH-DMF (3:1)/H₂O.

Ausbeute: 3,6 g (82 % d. Th.) Pp: 165 - 170 ⁰C (Zers.) /JkJl⁰ -. +2,35° (c=1, MP) DO: einheitlich in BAW, BEW2

Aminosäuren-Analyse:	Ber.	Phe+	(1	Ly s	Thr	Ser
	Gef.	2		1	2	1
	C60H76C:	2,0		1,2	1,9	1,0
	10,52		198,	73)
Ber. N	10,34
Gef. N

1.2J_-. Boc-Phe-D-Trp-Lys/'zCpCl^-Thr-Phe-Thr-Ser-OH

(Methode E)

4,44 g (3,7 mMol) 1.20. wurden in 10 ml EMF und 20 ml MeOH gelöst und durch Zugabe von insgesamt 4,2 ml 1 H" NaOH innerhalb von 12 h verseift. Die entstandene zitronengelbe Lösung wurde i* Vak. eingeengt und der ölige Rückstand mit EE zum Pestprodukt verrieben, wobei sich der EE stark gelb färbte. Nach Filtrieren und gründlichem Waschen mit Citronensäure-Lösung, HpO, EE und Äther kristallisierte man aus MeOH-DMP (3:1)/H₂O.

Ausbeute: 3,6 g (82 <fo d. Th.) Pp: 165 - 170 ⁰C (Zers„) {pgf = +2,35° (ο*1, DMP) DC: einheitlich in BAW, BE?/2 Aminosäuren-Analyse: Phe

Ber. 2

Gef. 2,0

Lys+	Thr	Ser
1	2	1
1,0		1,0

22 21 5 85 9

Ber. N 10,64 Gef. N 10,12

1.22. H.Sec(Bzl)-ONB»HCl

Die Boc-Schutζgruppe von Boc-Sec(Bzl)-ONB wurde mit 4 N HCl/Dioxan (30 min bei 5 ⁰C) abgespalten. Nach Ausfällen mit Äther konnte man das Hydrochlorid quantitativ isolieren. Das Produkt wurde anschließend aus CH₂Cl₂ oder THP umkristallisiert. Ausbeute: 91 # d. Th

Pp: 87 - 90 ⁰C

^ = -2,84° (c=1, DMP) DC: einheitlich in AC, BEW2, BPEW, CM C₁₇H₁₉N₂O₄SeCl (429,76)

Ber. C 47,51 H 4,46 N 6,52 Gef. C 47,73 H 4,60 N 6,39

. Boc-Phe-D-Trp-Lys/~Z(pCl)_iJ7-Thr-Phe-Thr-Ser-Sec(Bzl)-ONB (Methode B)

2,6 g (2,2 inMol) 1.21,., 1,5 g (3,5 mMol) H-Sec(Bzl)-ONB-HCl sowie 3,24 mg (2,4 mMol) HOBt in 25 ml DMP wurden mit 0,39 ml (3,5 mMol) N-Methylmorpholin und 495 mg DCCI (in 3 ml DMP) bei -5 ⁰C versetzt. Man ließ 1 h bei -5 ⁰C, über Nacht bei +4 ⁰C und danach 4 h bei ET rühren. Nach Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffs wurde das DMP im HV abgezogen, der ölige Rückstand in EE aufgenommen und mit 10 %iger Citronensäure- und NaCl-Lösung gewaschen. Da das Produkt beim Ausschütteln der EE-Phase mit NaHCO-,-Lösung bereits teilweise ausfiel, wurde der Niederschlag abfiltriert und das Piltrat i. Vak. eingeengt. Das zurückgebliebene Öl verrieb man mit NaHCOo-Lösung zum Peststoff und vereinigte mit dem bereits abgesaugten Produkt. Es wurde dann auf der Pritte mit NaHCOn-Lösung, Wasser und Äther gewaschen. An-

23 21585

schließend wurde I.£2· in wenig DMP gelöst, dieses im HV wieder abdestilliert, wobei ein öliger Rückstand resultierte, der sich gut in EE löste und nach Zugabe von Pl kristallisierte.

Ausbeute: 3,03 g (88 # d. Th.) Pp: 1.51 - 154 ⁰C (Zers.) PJl⁰ « -4,7° (o-i, DMP) BC: einheitlich in BAW, BEW2, BPlW

₁O₁₈Se (1559,98)

Ber. C 58,51 H 5,82 IT 9,88 Gef. C 57,87 H 5,96 Έ 9,72

1.24. H~Phe~I)-Trp-Lys/XpCl)J7-Thr-Phe-Thr-Ser-Sec(Bzl)-ONB»TPA

Zur Abspaltung der Boc-G-ruppe wurden 1,3 g (0,83 mMol) 1.23,. unter Zusatz von 0,94 g (8 mMol) Indol und 0,87 ml (8 mMol) Anisol in 6 ml Methylenchlorid und 15 ml TPA gelöst. Nach 15 min bei 0 ⁰C und 30 min bei RT wurde das LM i. Vak. abdestilliert und der ölige Rückstand dreimal in MeOH aufgenommen und jeweils wieder am Rotationsverdampfer eingeengt. Das Produkt ließ sich aus MeOH/Äther Umkristallisieren, wurde gründlich mit üther gewaschen und im HV über P₂O₅ und KOH getrocknet.

Ausbeute: 1,02 g (78 % d. Th.) Pp: 117 - 122 ⁰C (Zers.) /P£7^° = -12,66° (o=1, DMP) DC: einheitlich in BAW, BEW2, BPEW Aminosäuren-Analyse: Phe Lys⁺ Thr Ser

Ber. 2 1 2 Gef. 2,04 1,00 1,98 0,93

215 85 9

1.25. Boc-Ala-Gly-Sec(Bzl)-Lys/"z(oCl)._-7-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys/""Z(pCl)_7-2iir-Phe-Thr-SeivSec(Bzl)-0HB

(Methode D)

Uach Darstellung des Hexapeptid-azids aus 582 mg (0,55 mMol) I..9. 0,60 ml (2,2 mMol) 3,7 Ii HCl/Dioxan und 78,5 frl (0,66 mMol) tert.-Butylnitrit in 10 ml DMF wurde bei -20 ⁰C mit 308 J^ 1 TlA neutralisiert und anschließend mit einer Lösung von 866 mg (0,55 mMol) 24. und 77^,1 (0,55 mMol) TiA in 3 ml DMI¹ versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 2 h bei -25 ⁰C, 24 h bei.0 ⁰C und 5 h bei RT wurde das DMP im HV teilweise abdestilliert. Aus dem Rückstand ließ sich das Rohprodukt mit EE und PA* ausfällen und anschließend durch Waschen auf der Fritte aufarbeiten.

Anschließend wurde es mit MeOH ausgekocht (

Abtrennen einer Verunreinigung - nach DC I.2_4.) und gründlich mit MeOH, EE und Äther gewaschen.

Ausbeute: 860 mg (63 # d. Th.) Pp: 195 - 220 ⁰C (Zers.) ßöfi£ = -17,34° (C=VDMF) DC: einheitlich in BAW, BEW2, BPEW

Aminosäuren-Analyse:

AIa⁺ GIy Ber. 1 1 Gef. 1,00 0,98

Lys	Asp	Phe	Thr	Ser
2	1	3	2	1
2,17	1,05	3,21	1,82	0,91

1.26,. H-Ala-Gly-Sec-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-

Thr-Ser-Sec-OH (Diseleno-D-Trp⁸-SS)

Zur Abspaltung der Schutzgruppen wurde das geschützte Tetradecapeptid 1.2J^. zunächst mit Bor tris (trifluorazetat) unter Zusatz von Thioanisol (geschütztes Peptid: Thioanisol: BTI¹A = 1:50:50) und anschließend mit Natrium in flüssigem Ammoniak behandelt: 746 mg (0,3 mMol) 1.2^. und 1,76 ml (15 mMol) Thioanisol wurden bei 0 ⁰C in 15 ml TFA gelöst. Dazu gab man 30 ml (15 mMol) 0,5 M BTFA in 15 ml TFA gelöst.

Dazu gab man 30 ml (15 mMol) 0,5M BTPA in TPA und ließ die Mischung 1 h bei RT schütteln. Anschließend wurde i. Vak. eingedampft, der Rückstand mehrmals in wenig MeOH suspendiert und jeweils wieder i. Vak. eingeengt.

Zu dem öligen Rückstand gab man Äther, verrieb zum Peststoff und zentrifugierte. Der Äther wurde vorsichtig abgegossen und das Produkt i. Vak. getrocknet. 690 mg dieses bereits teilv/eise deblookierten Tetradecapeptids wurden nun in 50 ml flüssigem Ammoniak (frisch destilliert über Natrium) suspendiert und unter intensivem Rühren mit metallischem Natrium in kleinen Portionen bis zur bleibenden Blaufärbung versetzt. Dabei ging das Peptid vollständig in Lösung. Uach Entfärben der Lösung durch Zusatz der äquivalenten Menge Ammoniumchlorid wurde das Ammoniak verdampft und die letzten Reste im HV entfernt. Es resultierte ein leicht rötliches Pestprodukt. Man löste das deblockierte Peptid in 10 ml AoOK und verdünnte mit 1,5 1 Wasser. Die Lösung wurde nun mit 10 tigern UH^OH auf einen p_H-Wert von 6,5 eingestellt und über eine Zeitdauer von 72 h bei RT im Dunklen gerührt, wobei kontinuierlich Luft durch die Lösung gesaugt wurde. Anschließend konzentrierte man die Lösung nach Abfiltrieren polymeren Materials auf einer Amberlite ISC-50~Säule (3,5 x 15 cm) bei einer Pließgeschwindigkeit von 30 ml/h. Das Peptid wurde mit dem Lösungsmittelsystem Pyridin-AcOH-E^O (30:4:66) eluiert und die einzelnen Fraktionen (je 10 ml) DC auf ihren Peptidgehalt untersucht. Die das Produkt enthaltenden Praktionen vereinigte man und verdampfte das Elutionsmittel i. Vak. Der Rückstand wurde in 2M AcOH gelöst (Abtrennen einer geringen Menge eines unlöslichen Materials, das im DC nicht angefärbt wurde) und lyophilisiert, wobei man etwa 600 mg eines stark hygroskopischen gelblichen Peststoffes isolieren konnte.

²⁶ 215 85 9

Um noch vorhandene Verunreinigungen zu entfernen, löste man das Peptid in 20 ml 1M AcOH und extrahierte viermal mit EE, Dabei konnte die wäßrige Phase weitgehend entfärbt werden. Sie wurde mit Wasser verdünnt und erneut lyophilisiert.

Das erhaltene Rohprodukt wurde in 4 ml 2M AcOH gelöst und auf einer Sephadex C-25 F-Säule (3,0 χ 95 cm) mit 2M AcOH als Elutionsmittel Chromatograph! ert. Man sammelte Fraktionen von ;je 7,5 ml, deren Absorption bei 254 nm gemessen wurde,

DO: einheitlich in BPEW (Schwanzbildung) Hj₁: 0,43

ß0l° = -26,76°

Die Fraktionen 30-46 lieferten nach Lyophilisierung ein in BPEW dünnschicht chromatographisch einheitliches Produkt (Rp: 0,43).

Ausbeute: 82 rag

PJ^ = -26,76° (c=0,5, 1M AcOH) Aminosäuren-Analyse:

Ala GIy Sec Ly s Asp Phe Thr Ser

Ber. 112 2 13 2

Gef. ^₁O <\8 4₄S O^ 3.0 A₁S O

27 215859

Beispiel II - /~D-Trp J - Somatostatin

II .1,. Boc-Cys(Mbzl)-Lys^f"Z(oCl)_7-Asn-Phe-0Me (Methode A)

1,71 g (5 mMol) Boc-Cys(Mbzl)-OH in 20 ml THP wurden bei -15 ⁰C mit 0,7 ml (5 mMol) TÄA und 0,65 ml (5 mMol) CAiBE und nach der Aktivierung mit einer Lösung von 3,13 g (5 mMol ^ä) und 0,7 ml TÄA in 10 ml THP und 10 ml DMF versetzt. Die Reaktionslösung wurde 0,5 h bei -15 ⁰C und weiter über Nacht bei ET gerührt, wie üblich aufgearbeitet und anschließend aus DMP/EE umkristallisiert.

Ausbeute: 3,56 g (78 % d. Th.) Fp: 194 - 196 ⁰C ßdj^ = -3,72° (c=1, DMP) DC: einheitlich in BAW, BEW2, CM

C₄₄H₅₇ClEr₆O₁₁S (913,44)

Ber. C 57,85 H 6,29 K 9,20 Gef. C 57,85 H 6,32 Ν 9,12

*) H-Lys/~Z(oCl)_7-Asn-Phe-0Me»HCl (1.4)

II.2. H-CyS(MbZl)-LyS^fZ(OCl)JP-ASn-PiIe-OMe-HCl

Die Boc-Abspaltung von Ι,.Ι,. wurde mit 3,8 N HCl/Dioxan durchgeführt.

Ausbeute: quantitativ Pp: 177 - 187 ⁰C (Zers.) CQ^ = +8,67° (e=1, DMF) DC: einheitlich in BAW, BEW2, CM

C₃₉H₅₀Cl₂N₆O₉S (849,82)

Ber. C 55,12 H 5,93 Έ 9,89 Gef. C 54,91 H 5,94 N 9,82

₂₈ 21 5859

II. 3, Boc-Ala-GIy-Cys(Mbzl )-Lys/"Z(oCl)J7-Asn-Phe-0Me

(Methode B)

Zur Verknüpfung von 0,66 g (2,7 mMol) Boc-Ala-Gly-OH mit 2,12 g (2,5 mMol) II«2. in 25 ml DMP wurden 0,37 g (2,75 mMol) HOBt und bei -15 ⁰C nacheinander 0,278 ml N-Methylmorpholin und 0,57 g (2,75 mMol) DCCI (gelöst in 2 ml DMP) zur Reaktionslösung gegeben. Die weiteren Arbeitsschritte waren identisch mit den für I..8. beschriebenen. Das Produkt wurde anschließend gründlich mit EE und 50 #iger wäßriger Methanol-Lösung gewaschen.

Ausbeute: 2,2 g (85 fo d. Th.) Pp: 197 - 200 ⁰C (Zers.)

D&fi£ = -13,37° (c=1, DMP) DC: einheitlich in BAY/, BEW2 Aminosäuren-Analyse: AIa(I)⁺ 1,0 Gly(1) 1,0

Lys(i) 1,0 Asp(i) 1,2

Phe(i) 1,2

C₄₉H₆₅ClN₈O₁₃S (1041,60)

Ber» C 56,50 H 6,29 N 10,76 Gef. C 56,09 H 6,38 N 10,34

II .4. Boo-Alar-Gly-Cys<Mbzl)-Lys/f"Z(₂ 2,083 g (2 mMol) II.3. wurden in 8 ml DMP gelöst und bei 0 °C mit 1,16 ml (20 mlfcl) Hydrazin-Hydrat versetzt. Man beließ 20 min bei 0 ⁰C und 2 Tage bei RT. Anschließend wurde mit Wasser ausgefällt, abfiltriert, auf der Pritte gründlich mit Wasser, MeOH und Äther gewaschen und über HgSO^ im HY getrocknet.

Ausbeute: 1,96 g (94 fo d. Th.) Pp: 231 - 234 ⁰C (Zers.) ßQ^Ü ^a -27,01° (c-1, DMP) DC: einheitlich in BAW, BEW2

29 21 5

Boc-Ser-Cys(Mbzl)-OBzl (Methode C II)

Entsprechend der allgemeinen Vorschrift für C II ließ man 1,86 g (5 mMol) Boc-Ser-OPfp mit 2,02 g (5,5 mMol) H-Cys(Mbzl)-OBzl.HCl und 0,77 ml (5,5 mMol) TÄA in 15 ml THP reagieren und arbeitete wie üblich auf. Vor dem Umkristallisieren aus EE/PÄ* wurde das Produkt in EE gelöst und in der Wärme mit Aktivkohle behandelt.

Ausbeute:	2,0	g	(77 ίο	d.	Th.)
Pp:	41	- 42	0C
	-37	,14°	(0-1	f	DMP)

DC: einheitlich in BAW, BEY/2, CM

^C26^H34^M2°7^S (518,62) Ber. C 60,21 H 6,61 H 5,40 Gef. C 59,78 H 6,44 H 5,26

II.6. H-Ser-Cys(Mbzl)~OBzl»HCl

Zur Entaoyiierung löste man 1,76 g (3,4 mMol) II.J5· In 10 ml 5,.8 IT HCl/Dioxan und ließ 30 min reagieren. Das Hydrochlorid wurde aus MeOH/Äther umkristallisiert.

Ausbeute: 1,45 g (94 S& d· Th.) Pp: 100 - 120 ⁰C (Zers.) /Fi7v° = -27,74° (c=1, DMP)

C₂₁H₂₇ClIi₂O₅S (454,98)

Ber. C 55,43 H 5,98 H 6,16 Gef. C 54,93 H 6,09 H 5,98

³⁰ 21 5859

II.χ, Boc-Thr-Ser-Cys(Mbzl)OBzl (Methode C II)

1,04 g (2,7 mMol) Boc-Thr-OPfp in 8 ml THP wurden bei 0 ⁰C mit 1,36 g (3 mMol) II.6. und 0,42 ml (3 mMol) TA'A und nach 0,5 h bei 0 ⁰C und 15 h bei ET wie üblich aufgearbeitet. Nach Kristallisation aus EE/PÄ, Me0H/H₂0 und Isopropanol/HgO/resultierte ein stark hygroskopisches, DC einheitliches Produkt.

Ausbeute: 1,3 g (78 % d. Th.) Pp: 45-50 ⁰C (stark hygroskopisch) ßCß^ = -21,32° (o«1, DMP) DC: einheitlich in BAW, BEW2, CM

II.8. H-Thr-Ser-Cys(Mbzl)-OBzl.HCl

Nach Entacylierung von 1,24 g (2 mMol) II ·2·- mit 5 ml 5,9 W HCl/Dioxan wurde das Produkt gründlich mit Äther gewaschen und aus MeOH/Äther umkristallisiert. Das DC einheitliche Produkt erwies sich als stark hygroskopisch, so daß eine nähere Charakterisierung nicht möglich war,

Ausbeute: 0,95 g (85,5 # d. Th.) DC: einheitlich in BAW, BEW2, CM

II_.£· Boo-Phe-D-Trp-Lys/"Z(pCl)J7-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(Mbzl)-OBzl (Methode B)

Zu einer Lösung von 1150 mg (1,15 mMol) Boc-Phe-D-Trp-Lys2f"2(pCl)J7-Thr-Phe-OH 1.17. 695 mg (1,25 mMol) II.8. und 169 mg (1,25 mMol) HOBt in 20 ml DMP gab man bei -5 ⁰C 0,14 ml (1,25 mMol N-Methylniorpholin und 285 mg DCCI (1,25 mMol) - in 2. ml DMP gelöst. Nach einer Reaktionszeit von 2 h bei 0 ⁰C und über Nacht bei RT wurde nach Zugabe einiger Tropfen Eisessig und mehrstündigem Aufbewahren der Heaktionslösung in der Tiefkühltruhe vom Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das DMP im HV abgezogen. Der ölige

31 215 85 9

Rückstand wurde in EE "gelöst" (leicht ölige, schlierige Lösung, aus der das Produkt nach Zugabe von HoO sofort ausfiel) und das Rohprodukt mit PÄ ausgefällt, filtriert und wie üblich auf der Fritte gewaschen. Wach Umkristallisieren aus DMF/Äther erhielt man ein DC einheitliches Produkt.

Ausbeute: 1,45 g (84 %> d. Th.) Pp: 163 - 165 ⁰C (Zers. ab 150 ⁰C) /oCJ²^ = -7,44° (c=1, IMi¹) DC: einheitlich in BAW, BEW2, CM

Aminosäuren-	Analyse:	Ber.	Phe	Lys	Thr	Ser
		Gef.	2	1	2	1
		53C1N1	2,2	1,0	2,0	0,9
	C77H,	H 6	0°17S	(1498,1	3)
Ber. C 61	,73	H 6	,26	Ii 9,35
Gef. C 61	,03	,41	IT 9,00

II .Ij). H-Phe~D-Trp-Lys/~Z(pCl)J7-Thr-Phe~Thr-Ser-· Cys(Mbzl)-OBzl»HCl

1,39 g (0,94 mMol) I]E »2· löste man unter Zusatz von 1 ml Mercaptoäthanol in 20 ml 0,12 H" HC1/HC00H und " beließ die Lösung während 30 min unter Argonatmosphäre bei ET. Die Säure wurde anschließend am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand je zweimal in wenig Methanol und Äther suspendiert und wieder eingedampft. Das nach erneuter Ätherzugabe auskristallisierte und gründlich mit Äther ge-7/aschene Produkt war in den Laufmittelsystemen BAW, BEW2 und CM DE einheitlich.

Ausbeute: 1,23 g (91 % d. Th.) Pp: 120 - 140 ⁰C (Zersetzung)

Boc-Ala-Gly-Cys^bzl^Iys^'XoClXJ'-Asn-Phe-Phe-I)-Trp-Lys-Z(pCl)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(Mbzl)-OBzl

(Methode D)

871 mg (0,836 mMol) ΙΙ·4. wurden in 10 ml IMP gelöst, auf -20 ⁰C gekühlt und anschließend mit 0,7 ml (3,5 mMol) 5 N HCl/Dioxan und 119 al (1 mMol) tert.-Butylnitrit versetzt. Hach 20 min bei -20 ⁰C neutralisierte man mit 0,49 ml (3,5 mMol) TÄA und gab nun eine Lösung von 120 mg (0,836 mMol) 11.1J). ^und 117^1 (0,836 mMol) TÄA in 5 ml DMP zum Reaktionsansatz. Nach einer Reaktionszeit von 2 h bei -15 ⁰C, 24 h bei 0 ⁰C und 5 h bei RT wurde wie üblich aufgearbeitet, aus DMP/ Äther umgefällt und mit EE, MeOH und Äther gewaschen. Man erhielt ein in den laufmittelsystemen BAY/, BEW2 und BPEW DC nahezu einheitliches Produkt.

Ausbeute: 1,9 (90 ψο d. Th.)

Pp: Zers, über großes Temperaturintervall

£ζ?1° = -16,84° (0-1, DMP)

R_F: 0,74 (BAW)

0,75 (BEW2) 0,82 (BPEW)

Aminosäuren-Analyse:

	AIa+	GIy	Lys	Asp	Phe	Thr	Ser
Ber.	1	1	2	1	3	2	1
Gef.	1,00	0,97	2,12	1,04	3,00	1,96	0,74

Claims (4)

1. -χ- 215 8 5 9

   ERPINDU Ή G S AISPRUCHE

   1. Verfahren zur Herstellung von Somatostatin und Somatostatin-Analoga der allgemeinen Formel (I)

   H-Ala-Gly-X-Lys-Asn-Phe-Phe-Y-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X-OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 H

   (D,

   worin X für Cystein oder Selenocystein steht und Y L- oder D-Tryptophan sein kann, gekennzeichnet dadurch, daß man von Hexapeptiden der allgemeinen Formel (III)

   S-AIa-GIy-X(T)-Lys(U)-Asn-Phe-W (III)

   ausgeht, worin X die obige Bedeutung besitzt und S, T, U und W wie folgt definiert sein können, S = tert.-Butyloxycarbonyl; Benzyloxycarbonyl; p-Chlor-

   benzyloxycarbonyl; p-Methoxybenzyloxycarbonyl T = Benzyl; p-Methoxybenzyl
   U = Benzyloxycarbonyl; p-Chlorbenzyloxycarbonyl;

   o-Chlorbenzyloxycarbonyl
   W = Methyl-, Äthyl- oder Benzylester,

   diese einer Hydrazinolyse oder alkalischen Hydrolyse unterwirft und nach der Azidmethode bzw. dem DCCI/ Additiv-Verfahren oder der Mischanhydridtechnik mit geschützten Octapeptiden der allgemeinen Formel (IV)

   H-Phe-Y-Lys(U)-Thr-Phe~Thr-Ser-X(T)-V (IV),

   worin X, Y, U, T wie vorstehend definiert sind und V für Benzyl- bzw. p-Fitroberizyl steht, zu geschützten Tetradecapeptiden der allgemeinen Formel (II)

   S-Ala-Gly-X(T)-Lys(U)-Asn-Phe-Phe-Y-Lys(U)-Thr-Phe-Thr-Ser-X(T)-V (II)

   -«- 215 85 9

   mit den oben genannten Bedeutungen für X, Y, S, T, U und V verknüpft, deren Schutζgruppen durch Behandlung mit Fluorwasserstoff/Anisol, Bortris(trifluoracetat)/ Thioanisol oder Natrium/flüss. Ammoniak abgespalten und anschließend aus den resultierenden reduzierten Verbindungen die cyclischen Disulfide bzw. Diselenide der allgemeinen Formel (I) durch Oxydation mit Luftsauerstoff oder mit Kaliumferricyanid hergestellt werden.
2. 2. Verfahren zur Herstellung von Somatostatin und Soraatostatin-Analoga der allgemeinen Formel (I) nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß X für Selenocystein steht und Υ die Bedeutung von D-Trp besitzt, d. h.

   H-Ala-Gly-Sec-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Sec-OH
3. 3. Verfahren zur Herstellung von Somatostatin und Somatostatin-Analoga der allgemeinen Formel (I) nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß für das Zwischenprodukt der Formel (II) nach Punkt 1 X für Selenocystein steht, Y die Bedeutung von D-Trp besitzt und S, T, U und V wie unter Punkt 1 definiert sein können, d. h.

   S-Ala-Gly-Sec(T)-Lys(U)-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys(U)-Thr-Phe-Thr-Ser-Sec(T)-V (II)

   ist.
4. 4. Verfahren zur Herstellung von Somatostatin und Somatostatin-Analoga der allgemeinen Formel (I) nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß für das Zwischenprodukt der Formel (HE) nach Punkt 1 X für Selenocystein steht und S, T, U und W wie in Punkt 1 definiert sind, d. h.

   S-Ala-Gly-Seo(T)-Lys(U)-Asn-Phe-W (III)

   ist.

   Verfahren zur Herstellung von Somatostatin und Somatostatin-Analoga der allgemeinen Formel (I) nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß für das Zwischenprodukt der Formel (IV) nach Punkt 1 J für Selenocystein steht, Y die Bedeutung von D-Trp besitzt und U, T und V wie im Punkt 1 definiert sind, d. h.

   H-Phe-D-Trp-Lys(U)-Thr-Phe-Thr-Ser-Sec(T)-V (IV) ist.