DD140476A1 - Verfahren zur erhoehung der stabilitaet tieftemperaturkonservierter lebender zellen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Stabilität von Zellen gegenüber Gefrier/Tauschädigungen bei der Tieftemperaturkonservierung. Sie ist überall dort einsetzbar, wo lebende Zellen, insbesondere für den Zweck der Rückübertragung auf gleichartige Organismen, über lange Zeit aufgehoben und vorrätig gehalten werden sollen. Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Membranstabilität der Zellen und damit ihre Überlebensrate außerhalb des Organismus im Vergleich zu bisherigen Möglichkeiten deutlich zu steigern. Es liegt die Aufgabe zugrunde, hierfür ein geeignetes Verfahren unter Verwendung eines die Stabilität erhöhenden Wirkstoffes bzw. einer Wirkstoffkombination zu entwickeln. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man der Konservierungslösung Seleno-Aminosäuren, z.B. Seleno-Methionin, oder eine Kombination von Natriumselenit und Tokopherol (Vitamin E) in einer Konzentration von 1,0 bis 10,0 Myg/100 ml zusetzt, danach die zu konservierenden Zellen darin suspendiert und bis zu maximal 3 h bis 37 Grad C inkubiert, nachfolgende in einem kryoprotektiven Medium unter Wahrung einer geeigneten Kühlrate einfriert und in flüssigem Stickstoff lagert. Mit diesem Verfahren wird im Vergleich zu bisher anwendbaren Konservierungstechniken eine hohe Membranstabilität der Zellen erreicht.

Description

Berlin, den'2,10*78

Oeinae, Prof»Dr.medehabil· Peter Hackens ellner, Prof #Dr#sc„mecL_e Hans-Alois Ma1rth.es, Dr»med· Gert

Jentzsch, Dr«med»vet»habil« Klaus-Dieter Krause, Dr_emed_e Winfried ^x Jalmbke, ProfV Dr'· so· nat_e Hans-Dieter

Verfahren zur Erhöhung der Stabilität tieftemperatur»

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Konservierung von Zellen bei tiefen Tempez-aturen (iTieftemperaturlcons ervierung) im Sinne einer Erhöhung der Membraiistabilitä'fc der vital eingefrorenen Zellen mit dem Sffekt der Erhaltung der funktion©Ilen όώ/1 s tr ulrbur ell en Integrität* Die Erfindung ist nutzbringend überall dort einsetsbar, wo lebensfähige Zellen über lange Zeit aufbewahrt und vorrätig gehalten v/erden sollen, insbesondere in 2eil-» und Blutbanken.

Bekannt ist die Tieftemperaturkonservierung von isolierten Zellen für nahezu unbegrenzte Zeit«. Hierzu v/erden die Zellen in einem kryoprotektiven Medium'(physiologisches Medium unter Zusatz; eines Gefrierschutz-stoffes., wie 2_äB« Dimethylsulfoxid oder Glyzerin) suspendiert, definiert mit einer bestimmten Kühlrate abgekühlt, gefroren und bei tiefen Üemperaturen (unter -80 ⁰C bis -100 ⁰C₅ am besten in flüssigen Stickstoff) gelagerte Auf diese Weise können z_eBc rote Blutzellen durch Anwendung der ^t?lov;~glycerol-rapid-freezing-tech~ nique" (KRUliBIi et al„,1964) oder der "High-glycerolslcw-freeaing-tecliriiQue" (ECiGGIIiS, 1964) auf bewahrt

v/erden© Eine Tief temperaturkonservie rang ohne Zusatz von Eryoprotektiva in das Suspensionsmedium besitzt nur einen bedingten Erfolg, da nur ein geringer Pro-» der Zellen die Prozedur überlebt*

Die tJberlebensfähigkeit tieftemperaturkonservierter Zellen ist wesentlich abhängig von der Zellart, dem gewählten kryoprotektiven Zusatz sowie der Art des Gefrier/l'au/Regimes* Durch den Vorgang der Tieftemperaturkonservierung, speziell des Gefrier/Tau-Prozeßses, unterliegen die Zellen Veränderungen, die zu einer Beeinträchtigung der Stabilität der Membranen und damit d.eir Uberle'bensfähigkeit der Zellen führen können (PBRSIDSKJ, 1971I MSRyMAlT, 1974). So findet SeBe im Laufe einer nachfolgenden hypοthermon oder normotheriaeii Lagerung gefrier konserviert er 'Erythro- zjten eine fortschreitende Häsiolyse sov.⁷ie ein vermehrter Ausstroia von Kaliumionen aus den Erythrozyten statt (ROWS, 1973? AEBEBXOM, 1974; YALBRI₈ 1975)ο

Insgesamt läßt sich feststellen, daß die bekannten Methoden zur Tieftemperaturkonservierung lebender Zellen nicht allen Anforderungen genügen_e Das betrifft insbesondere die mangelnde Stabilität von Erythrozyten während der hypothermen Lagerung nach vorangegangener Tieftemperaturkonservierung, was sich für Blutbanken als nachteilig erweist«

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Membranstabilität der Zellen vor und v/äiirend der T ie f tempera tür konservierung zu erhöhen und diesen Effekt -praktisch, nutsbar su machen«,

Es liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu ent« wickeln, mit dem die Stabilität der Zellen durch geeig nete Zusätze zum Suspensionsmedium erhöht werden kann.

Erfinöungsgemäß· wird der Konservierungslösung Tor dem Zusatz der zu konservierenden Zellen eine geeignete Selenver"bindung, vorzugsweise eine Seleno-Aminosäure oder eine Kombination von Hatriumselenit (Na2SeO3) und weitere Zusatzstoffe, vorzugsweise Vitaminen, in einer Konzentration von 1,0 - 10,0 ug/1OOO ml zugefügt* Hierzu wird im ersten ]?alle die Seleno-Aminosäure, z_eB» Seleno-Methionin, in einer Konzentration von 2,0 ~ 2,5 .ug/1000 ml, im zweiten 3?alle Hatriumselenit in einer Konzentration von 1,8 - 2,2 ug/1000 ml und das. Vitamin, z«B_e Kokopherol (Vitamin B), in einer Konzentration von 11 - 13 ug/1000 ml zugesetzt* Nach vollständiger !lösung dieser Wirkstoffe werden die Zellen, die in gebräuchlicher Weise gewonnen, gewaschen und abzentrifugiert werden, der Konservierungslösung zugegeben und mit dieser bis zu maximal 3 Stunden bei 37 °C inkubiert« Uach Zugabe des kryoprotektiven Mediums, das ebenfalls diese Wirkstoffe oder-Wirkstoffkombinationen enthält, und einer entsprechenden Inkubationszeit zur Gefrierschutzverteilung erfolgt unter Wahrung einer geeigneten Abkühlrate die Überführung in flüssigen Stickstoff (-196 ⁰C) zur lagerung über verschieden lange Zeiträume« Eei Bedarf erfolgt das Auftauen der dem flüssigen Stickstoff entnommenen Zellen durch .Einstellen der Konservierungsbehälter in ein Viasserbad mit einer Temperatur von 37 ⁰O_e

Bei einer Überprüfung der strukturellen und funktionellen Integrität der Zellen läßt sich eindeutig nachweisen, daß das erfindungsgemäß durchgeführte Verfahren den Anteil überlebender Zellen im Vergleich zu gleichartigen Zellsuspensionen, die auf gleiche Weise, jedoch ohne Zusatz der Wirkstoffe zur iionservierungslösung, eingefroren wurden, deutlich erhöht bzw© den An-

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teil geschädigter Zeilen deutlich herabsetzt. Diese Steigerung des Überlebens von Zellen in einem Medium verspricht" überall dort bedeutende ökonomische Auswirkungen, wo lebende Zellen zum' Zweck ihrer Wiederverwendung, insbesondere für die Rüclcübertragung auf gleichartige Organismen^ im lebensfähigen Zustand zur Verfügung stehen müssen, wie insbesondere in Zeil- und -Blutbanken«

Die Erfindung wird nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel erläutert? ·

Vollblut gesunder Spender wird im Verhältnis 4s1 mit AGD-AG-Stabilisatorlösungen I - IU (lab«, 1) versetzt, der in der ersten Versuchsgruppe Seleno-Methionin in einer Kons ent rat ion von O₅,226 ug/100 ml, in der-zweiten Versuchsgruppe Natriumselenit in einer Konzentration von Oj2 ug/100 ml und Tokopherol in einer Konzentration von 1_y2 ug/100 ml zugefügt wurde«. Die dritte Versuchsgruppe dient als Kontrolle und enthält keine Wirkstoffe in der ACD-AG- Stabilisator lösung,. Zur Inkubation werden die .Konservenflaschen mit dem Konservenblut für 3 Stunden bei 37 ⁰C aufbewahrte lach Ablauf der Inkubationszeit wird das Konservenblut zentrifugiert, der Plasmaüberstand verworfen und die verbliebenen Erythrozyten langsam im Verhältnis 1 : 1 mit den glyzerinhaltigen Konservierungslösungen I - III (Habe 2) vermischt und für 30 min zur G-efri er schutzverteilung bei 25 ⁰C gehalten» Zur Gefrierkonservierung wird das Konservenblut dann in Zentrifugengläser (0 20 mm, länge loo mm) überführt und direkt in flüssigen Stickstoff (-196 ⁰C) getaucht« Nach 24 Stunden oder später erfolgt das Auftauen durch Einstellen der Zentrifugengläser in ein 37 ⁰G-BaCl,, 3>Jach dreimaligem Waschen der Erythrozyten wird der Gehalt an freiem Hämoglobin im Überstand geprüft und die Hämolyserate

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P» in «, - Hämoglobin (mg/100 ml) im e* in 7« - überstand . ^ _% ___«,—________ _—__ χ 100 )

Hämoglobin (mg/100 ml) vor dem Gefrieren

bestimmt» Nach der Tieftemperaturkonservierung ist die Hämolyserate in Versuchsgruppe 1 (Zusatz von Seleno»Methionin) und Versuchsgruppe II (Zusatz von Natriumselenit und Tokopheröl) statistisch signifi« kant geringer als in Versuchsgruppe III (Kontrollgruppe) _β Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt«

Zusammensetzung der verwendeten ACD-AG-Stabilisatorlösungen (Angaben in g/l)

Substanz ' Stabilisatorlösung

ι; . Iiin

Glukose« H2 O	25,0	25,0	Substanz	25,0	I	II	III
Natriumzitrat'2 H2O	13,2	13,2		13,2
Z itr onens äure8H^O	4,8	4,8	4,8
Adeninsulfat	0,46	0,46	0,46
Guanosin	0,71	0,71	0,71
Natriums elenit		2,Ο·1Ο"6	-
Sokopherol	-	1,2·10-5
Seleno-Methionin	2,26·1Ο"6		-
Tabelle 2; Zusammensetzung der	verwendeten	Konservie-
_ rungslösungen (Angaben in g/l)
Kons ervi e rungslösung

Glyzerol 360,0 360,0 360,0

Sorbitol 30,0 .30,0 30,0

Natriumchlorid 60,0 60,0 60,0

Ha tr rams elenit ~ 2,O^<?1O"*^⁾

!Eokopherol - 1,2·1Ο"*5

Seleno-Methionin 2,26»'IO"⁶

Hämolyseraten tieftemperaturkonservierter Erythrozyten unter Verwendung von Wirkst offzusätzen (n = 5)

"Versuchsgruppe Hämolyse {%)

I 8,33

II 3,85 ^x)

III 3_$34 ^z)

'Statistisch signifikant im Vergleich zu Versuchsgruppe I (p < 0_?05)

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Claims (3)

Erfindiingsanspruch.

1) Verfahren zur Erhöhung der Stabilität von tief« temperaturkonservierten lebenden Zellen, insbesondere Blutzelleiiy dadurch gek.eianzeichnetj daß die Zellen unmittelbar nach ihrer Gewinnung und bis zn 3 und mehr Stunden vor dem Einfrieren in einer mit geeigneten Selenverbindungen in bestimmter Konzentration j, vorzugsweise zwischen 1,0'und 1O«O ug/1OOO ml, und gegebenenfalls weiteren Zu» sa.tzstoffen_s vorzugsweise Vitaminen_? versetzten 37 ⁰C warmen Konservierungslösung suspendiert _} danach in einem, kryoprotektiven Medium in defi~ niertsr Weise eingefroreni in f.Iücsigen Sticlcstoff überführt und darin bis sum Bedarf gelagert werden«

2) Verfahren nach Punkt i)_s dadurch gekennzeichnet,. daß der Konservierung?;lösung Selenp-Methionin, vorzugsweise in der. Konsentration von 2,0 bis 2,5 ug/1000 ml, zugegeben ""wird«

3) Verfahren nach Punkt 1)_? dadurch gekennzeichnet, daß der Konservierungslösung eine Kombination, von Uatrium-'Selenit, vorzugsweise in der Konzentration von 1_f8 bis 2,2 ug/1000 ml, und Sokopherol

(Vitamin E), vorzugsweise in der Konzentration von 11 bis 13 ug/1000 ml, zugegeben wird*

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