DD140476A1 - METHOD FOR INCREASING THE STABILITY OF TEMPERATURE OF CONSERVATED LIVING CELLS - Google Patents
METHOD FOR INCREASING THE STABILITY OF TEMPERATURE OF CONSERVATED LIVING CELLS Download PDFInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Stabilität von Zellen gegenüber Gefrier/Tauschädigungen bei der Tieftemperaturkonservierung. Sie ist überall dort einsetzbar, wo lebende Zellen, insbesondere für den Zweck der Rückübertragung auf gleichartige Organismen, über lange Zeit aufgehoben und vorrätig gehalten werden sollen. Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Membranstabilität der Zellen und damit ihre Überlebensrate außerhalb des Organismus im Vergleich zu bisherigen Möglichkeiten deutlich zu steigern. Es liegt die Aufgabe zugrunde, hierfür ein geeignetes Verfahren unter Verwendung eines die Stabilität erhöhenden Wirkstoffes bzw. einer Wirkstoffkombination zu entwickeln. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man der Konservierungslösung Seleno-Aminosäuren, z.B. Seleno-Methionin, oder eine Kombination von Natriumselenit und Tokopherol (Vitamin E) in einer Konzentration von 1,0 bis 10,0 Myg/100 ml zusetzt, danach die zu konservierenden Zellen darin suspendiert und bis zu maximal 3 h bis 37 Grad C inkubiert, nachfolgende in einem kryoprotektiven Medium unter Wahrung einer geeigneten Kühlrate einfriert und in flüssigem Stickstoff lagert. Mit diesem Verfahren wird im Vergleich zu bisher anwendbaren Konservierungstechniken eine hohe Membranstabilität der Zellen erreicht.The invention relates to a method for increasing the stability of cells to freeze / thaw damage in cryopreservation. It can be used anywhere where living cells, especially for the purpose of retransmission to similar organisms, should be kept for a long time and kept in stock. The aim of the invention is to significantly increase the membrane stability of the cells and thus their survival outside the organism in comparison to previous possibilities. It is the object of this to develop a suitable method using a stability-increasing active ingredient or a combination of active ingredients. The method according to the invention is characterized in that the preservation solution contains seleno-amino acids, e.g. Seleno-methionine, or a combination of sodium selenite and tocopherol (vitamin E) in a concentration of 1.0 to 10.0 Myg / 100 ml, then the cells to be preserved are suspended therein and incubated for a maximum of 3 h to 37 degrees C. , subsequently freezing in a cryoprotective medium while maintaining a suitable cooling rate and storing in liquid nitrogen. With this method, a high membrane stability of the cells is achieved compared to previously applicable preservation techniques.
Description
Berlin, den'2,10*78Berlin, den'2,10 * 78
Oeinae, Prof»Dr.medehabil· Peter Hackens ellner, Prof #Dr#sc„mecLe Hans-Alois Ma1rth.es, Dr»med· GertOeinae, Prof »Dr.medehabil · Peter Hackens ellner, Prof # Dr # sc" mecL e Hans-Alois Ma1rth.es, Dr »med Gert
Jentzsch, Dr«med»vet»habil« Klaus-Dieter Krause, Dremede Winfried x Jalmbke, ProfV Dr'· so· nate Hans-DieterJentzsch, Dr "med" vet "habil" Klaus-Dieter Krause, Dr med e e x Winfried Jalmbke, ProfV Dr '· as · nat e Hans-Dieter
Verfahren zur Erhöhung der Stabilität tieftemperatur»Method of increasing the stability of low temperature »
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Konservierung von Zellen bei tiefen Tempez-aturen (iTieftemperaturlcons ervierung) im Sinne einer Erhöhung der Membraiistabilitä'fc der vital eingefrorenen Zellen mit dem Sffekt der Erhaltung der funktion©Ilen όώ/1 s tr ulrbur ell en Integrität* Die Erfindung ist nutzbringend überall dort einsetsbar, wo lebensfähige Zellen über lange Zeit aufbewahrt und vorrätig gehalten v/erden sollen, insbesondere in 2eil-» und Blutbanken.The invention relates to a method for improving the preservation of cells at low Tempez-aturen (iTieftemperaturlcons ervierung) in the sense of an increase in the vital Membraiistabilitä'fc frozen cells with the Sffekt of conservation of function © Ilen όώ / 1 s s ell integrity tr ulrbur The invention can usefully be used everywhere where viable cells are to be stored and stored for a long time, especially in bilateral and blood banks.
Bekannt ist die Tieftemperaturkonservierung von isolierten Zellen für nahezu unbegrenzte Zeit«. Hierzu v/erden die Zellen in einem kryoprotektiven Medium'(physiologisches Medium unter Zusatz; eines Gefrierschutz-stoffes., wie 2äB« Dimethylsulfoxid oder Glyzerin) suspendiert, definiert mit einer bestimmten Kühlrate abgekühlt, gefroren und bei tiefen Üemperaturen (unter -80 0C bis -100 0C5 am besten in flüssigen Stickstoff) gelagerte Auf diese Weise können zeBc rote Blutzellen durch Anwendung der t?lov;~glycerol-rapid-freezing-tech~ nique" (KRUliBIi et al„,1964) oder der "High-glycerolslcw-freeaing-tecliriiQue" (ECiGGIIiS, 1964) auf bewahrtThe cryogenic preservation of isolated cells is known for almost unlimited time «. For this purpose, v / cells earth in a cryoprotective medium '(physiological medium with the addition, an antifreeze substance such as 2 ä B "dimethyl sulfoxide or glycerol.) Suspended defined with a certain cooling rate cooled, frozen and deep Üemperaturen (below -80 0 C to -100 0 C 5 best stored in liquid nitrogen) In this way, z e Bc red blood cells by applying the t? lov- "glycerol-rapid-freezing-techique" (KRUliBIi et al., 1964) or "high-glycerol-freeaing-tecliriiQue" (ECiGGIIiS, 1964)
v/erden© Eine Tief temperaturkonservie rang ohne Zusatz von Eryoprotektiva in das Suspensionsmedium besitzt nur einen bedingten Erfolg, da nur ein geringer Pro-» der Zellen die Prozedur überlebt*v © A deep-temperature preservation without the addition of eryoprotectants to the suspension medium has only limited success, since only a small proportion of the cells survive the procedure *
Die tJberlebensfähigkeit tieftemperaturkonservierter Zellen ist wesentlich abhängig von der Zellart, dem gewählten kryoprotektiven Zusatz sowie der Art des Gefrier/l'au/Regimes* Durch den Vorgang der Tieftemperaturkonservierung, speziell des Gefrier/Tau-Prozeßses, unterliegen die Zellen Veränderungen, die zu einer Beeinträchtigung der Stabilität der Membranen und damit d.eir Uberle'bensfähigkeit der Zellen führen können (PBRSIDSKJ, 1971I MSRyMAlT, 1974). So findet SeBe im Laufe einer nachfolgenden hypοthermon oder normotheriaeii Lagerung gefrier konserviert er 'Erythro- zjten eine fortschreitende Häsiolyse sov.7ie ein vermehrter Ausstroia von Kaliumionen aus den Erythrozyten statt (ROWS, 1973? AEBEBXOM, 1974; YALBRI8 1975)οThe survival of cryopreserved cells depends largely on the cell type, the cryoprotective additive chosen, and the type of freezing / leu / regime. * The process of cryopreservation, especially of the freeze / thaw process, causes the cells to undergo alterations that are detrimental the stability of the membranes and thus the survival capacity of the cells (PBRSIDSKJ, 1971I MSRyMAT, 1974). So Sebe takes over a subsequent hypοthermon or normotheriaeii storage freeze he preserved 'erythrocyte zjten a progressive Häsiolyse sov. 7th an increased Ausstroia of potassium ions from the erythrocytes instead (ROWS, 1973 AEBEBXOM, 1974, YALBRI 8 1975) o
Insgesamt läßt sich feststellen, daß die bekannten Methoden zur Tieftemperaturkonservierung lebender Zellen nicht allen Anforderungen genügene Das betrifft insbesondere die mangelnde Stabilität von Erythrozyten während der hypothermen Lagerung nach vorangegangener Tieftemperaturkonservierung, was sich für Blutbanken als nachteilig erweist«Overall, it can be stated that the known methods of living cryopreservation cells do not meet all the requirements e This concerns in particular the lack of stability of erythrocytes during hypothermic storage after previous cryopreservation, which turns out for blood banks to be disadvantageous "
Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Membranstabilität der Zellen vor und v/äiirend der T ie f tempera tür konservierung zu erhöhen und diesen Effekt -praktisch, nutsbar su machen«,The aim of the invention is to increase the membrane stability of the cells before and / or during tempering door preservation and to make this effect practical, nutable,
Es liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu ent« wickeln, mit dem die Stabilität der Zellen durch geeig nete Zusätze zum Suspensionsmedium erhöht werden kann.It is an object of the invention to develop a process by which the stability of the cells can be increased by suitable additions to the suspending medium.
Erfinöungsgemäß· wird der Konservierungslösung Tor dem Zusatz der zu konservierenden Zellen eine geeignete Selenver"bindung, vorzugsweise eine Seleno-Aminosäure oder eine Kombination von Hatriumselenit (Na2SeO3) und weitere Zusatzstoffe, vorzugsweise Vitaminen, in einer Konzentration von 1,0 - 10,0 ug/1OOO ml zugefügt* Hierzu wird im ersten ]?alle die Seleno-Aminosäure, zeB» Seleno-Methionin, in einer Konzentration von 2,0 ~ 2,5 .ug/1000 ml, im zweiten 3?alle Hatriumselenit in einer Konzentration von 1,8 - 2,2 ug/1000 ml und das. Vitamin, z«Be Kokopherol (Vitamin B), in einer Konzentration von 11 - 13 ug/1000 ml zugesetzt* Nach vollständiger !lösung dieser Wirkstoffe werden die Zellen, die in gebräuchlicher Weise gewonnen, gewaschen und abzentrifugiert werden, der Konservierungslösung zugegeben und mit dieser bis zu maximal 3 Stunden bei 37 °C inkubiert« Uach Zugabe des kryoprotektiven Mediums, das ebenfalls diese Wirkstoffe oder-Wirkstoffkombinationen enthält, und einer entsprechenden Inkubationszeit zur Gefrierschutzverteilung erfolgt unter Wahrung einer geeigneten Abkühlrate die Überführung in flüssigen Stickstoff (-196 0C) zur lagerung über verschieden lange Zeiträume« Eei Bedarf erfolgt das Auftauen der dem flüssigen Stickstoff entnommenen Zellen durch .Einstellen der Konservierungsbehälter in ein Viasserbad mit einer Temperatur von 37 0Oe Erfinöungsgemäß · preservation solution is the addition of the binding target cells to be preserved a suitable Selenver ", preferably a seleno-amino acid or a combination of Hatriumselenit (Na2SeO3) and other additives, preferably vitamins, in a concentration from 1.0 to 10.0 ug For this, the seleno-amino acid, z e B "seleno-methionine, in a concentration of 2.0 ~ 2.5 μg / 1000 ml, and in the first 3 ° of all the hesiumselenite in one concentration of 1.8 to 2.2 g / 1000 ml and the vitamin, z "B e Kokopherol (vitamin B), at a concentration of 11 -.! added to 13 ug / 1000 ml * After complete dissolution of these agents, the cells are , which are obtained in a conventional manner, washed and centrifuged, added to the preservative solution and incubated with this up to a maximum of 3 hours at 37 ° C after addition of the cryoprotective medium, which also contains these drugs or drug combinations, and a corresponding incubation for antifreeze distribution takes place while maintaining a suitable cooling rate, the conversion into liquid nitrogen (-196 0 C) for storage over different periods of time «Eei need thawing of the liquid nitrogen removed cells by .Einstellen the preservation container in a Viasserbad with a Temperature of 37 0 O e
Bei einer Überprüfung der strukturellen und funktionellen Integrität der Zellen läßt sich eindeutig nachweisen, daß das erfindungsgemäß durchgeführte Verfahren den Anteil überlebender Zellen im Vergleich zu gleichartigen Zellsuspensionen, die auf gleiche Weise, jedoch ohne Zusatz der Wirkstoffe zur iionservierungslösung, eingefroren wurden, deutlich erhöht bzw© den An-In a review of the structural and functional integrity of the cells can be clearly demonstrated that the method according to the invention significantly increased the proportion of surviving cells compared to similar cell suspensions, which were frozen in the same way, but without addition of the active ingredients to iionservierungslösung, or © the
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teil geschädigter Zeilen deutlich herabsetzt. Diese Steigerung des Überlebens von Zellen in einem Medium verspricht" überall dort bedeutende ökonomische Auswirkungen, wo lebende Zellen zum' Zweck ihrer Wiederverwendung, insbesondere für die Rüclcübertragung auf gleichartige Organismen^ im lebensfähigen Zustand zur Verfügung stehen müssen, wie insbesondere in Zeil- und -Blutbanken«markedly degrades part of damaged lines. This increase in the survival of cells in a medium promises "significant economic repercussions everywhere where living cells must be available for the purpose of reuse, particularly for re-transmission to similar organisms" in a viable state, such as, in particular, cell and blood banks "
Die Erfindung wird nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel erläutert? ·The invention is explained below using an exemplary embodiment. ·
Vollblut gesunder Spender wird im Verhältnis 4s1 mit AGD-AG-Stabilisatorlösungen I - IU (lab«, 1) versetzt, der in der ersten Versuchsgruppe Seleno-Methionin in einer Kons ent rat ion von O5,226 ug/100 ml, in der-zweiten Versuchsgruppe Natriumselenit in einer Konzentration von Oj2 ug/100 ml und Tokopherol in einer Konzentration von 1y2 ug/100 ml zugefügt wurde«. Die dritte Versuchsgruppe dient als Kontrolle und enthält keine Wirkstoffe in der ACD-AG- Stabilisator lösung,. Zur Inkubation werden die .Konservenflaschen mit dem Konservenblut für 3 Stunden bei 37 0C aufbewahrte lach Ablauf der Inkubationszeit wird das Konservenblut zentrifugiert, der Plasmaüberstand verworfen und die verbliebenen Erythrozyten langsam im Verhältnis 1 : 1 mit den glyzerinhaltigen Konservierungslösungen I - III (Habe 2) vermischt und für 30 min zur G-efri er schutzverteilung bei 25 0C gehalten» Zur Gefrierkonservierung wird das Konservenblut dann in Zentrifugengläser (0 20 mm, länge loo mm) überführt und direkt in flüssigen Stickstoff (-196 0C) getaucht« Nach 24 Stunden oder später erfolgt das Auftauen durch Einstellen der Zentrifugengläser in ein 37 0G-BaCl,, 3>Jach dreimaligem Waschen der Erythrozyten wird der Gehalt an freiem Hämoglobin im Überstand geprüft und die HämolyserateWhole blood from healthy donors is treated in the ratio 4s1 with AGD-AG stabilizer solutions I-IU (lab, 1), which in the first experimental group seleno-methionine in a consensus of O 5 , 226 μg / 100 ml, in the was added -second experimental group sodium selenite in a concentration of Oj2 ug / 100 ml and tocopherol in a concentration of 1 y 2 ug / 100 ml. " The third experimental group serves as a control and contains no active ingredients in the ACD-AG stabilizer solution. For incubation, the .Konservenflaschen be with the preserved blood for 3 hours at 37 0 C kept laugh the end of the incubation period, the preserved blood is centrifuged, the plasma supernatant is discarded and the remaining red blood cells slowly in the ratio 1: 1 with the glycerine preservation solutions I - III (I 2) mixed for 30 min to he G-efri square distribution at 25 0 C held "for cryopreservation, the preserved blood then in centrifuge tubes (0 20 mm, length loo mm) transferred and dipped" directly into liquid nitrogen (-196 0 C) After 24 Thawing is carried out hours or later by placing the centrifuge tubes in a 37 0 G-BaCl 3. After washing the erythrocytes three times, the free hemoglobin content in the supernatant is checked, and the hemolysis rate
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9 0 6 9.1 29 0 6 9.1 2
tisa ^&P ^^tisa ^ & P ^^
P» in «, - Hämoglobin (mg/100 ml) im e* in 7« - überstand . ^ % ___«,—________ _—__ χ 100 )P »in«, - Hemoglobin (mg / 100 ml) in e * in 7 "supernatant. ^ % ___ «, -________ _-__ χ 100)
Hämoglobin (mg/100 ml) vor dem GefrierenHemoglobin (mg / 100 ml) before freezing
bestimmt» Nach der Tieftemperaturkonservierung ist die Hämolyserate in Versuchsgruppe 1 (Zusatz von Seleno»Methionin) und Versuchsgruppe II (Zusatz von Natriumselenit und Tokopheröl) statistisch signifi« kant geringer als in Versuchsgruppe III (Kontrollgruppe) β Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt«determined »After cryopreservation the hemolysis rate in test group 1 (addition of seleno» methionine) and test group II (addition of sodium selenite and tocopherol oil) is statistically significantly lower than in test group III (control group) β The results are shown in table 3 «
Zusammensetzung der verwendeten ACD-AG-Stabilisatorlösungen (Angaben in g/l)Composition of the ACD-AG stabilizer solutions used (data in g / l)
Substanz ' StabilisatorlösungSubstance 'stabilizer solution
ι; . Iiinι; , IIin
Glyzerol 360,0 360,0 360,0Glycerol 360.0 360.0 360.0
Sorbitol 30,0 .30,0 30,0Sorbitol 30.0 .30.0 30.0
Natriumchlorid 60,0 60,0 60,0Sodium chloride 60.0 60.0 60.0
Ha tr rams elenit ~ 2,O<?1O"*^) Ha tr rams elenit ~ 2, O < ? 1O "* ^ )
!Eokopherol - 1,2·1Ο"*5Eocopherol - 1.2 · 1Ο "* 5
Seleno-Methionin 2,26»'IO"6 Seleno-methionine 2.26 »'IO" 6
Hämolyseraten tieftemperaturkonservierter Erythrozyten unter Verwendung von Wirkst offzusätzen (n = 5)Hemolysis rates of cryopreserved erythrocytes using active ingredients (n = 5)
"Versuchsgruppe Hämolyse {%) "Experimental Group Hemolysis {%)
I 8,33I 8:33
II 3,85 x) II 3.85 x)
III 3$34 z)III 3 $ 34 z )
'Statistisch signifikant im Vergleich zu Versuchsgruppe I (p < 0?05)'Statistically significant compared to experimental group I (p <0 ? 05)
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Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD20891278A DD140476B1 (en) | 1978-11-07 | 1978-11-07 | METHOD FOR INCREASING THE STABILITY OF TEMPERATURE OF CONSERVATED LIVING CELLS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD20891278A DD140476B1 (en) | 1978-11-07 | 1978-11-07 | METHOD FOR INCREASING THE STABILITY OF TEMPERATURE OF CONSERVATED LIVING CELLS |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD140476A1 true DD140476A1 (en) | 1980-03-05 |
| DD140476B1 DD140476B1 (en) | 1986-05-07 |
Family
ID=5515190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD20891278A DD140476B1 (en) | 1978-11-07 | 1978-11-07 | METHOD FOR INCREASING THE STABILITY OF TEMPERATURE OF CONSERVATED LIVING CELLS |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD140476B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0394788A1 (en) * | 1989-04-28 | 1990-10-31 | Miles Inc. | Large scale fermenter inoculation with frozen cells |
-
1978
- 1978-11-07 DD DD20891278A patent/DD140476B1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0394788A1 (en) * | 1989-04-28 | 1990-10-31 | Miles Inc. | Large scale fermenter inoculation with frozen cells |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DD140476B1 (en) | 1986-05-07 |
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|---|---|---|---|
| ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |