CZ302612B6 - Kmen mikroorganismu Bacillus sp. B71 CCM 7718 - Google Patents

Abstract

Predložené rešení spocívá v cílené príprave a izolaci kmenem mikroorganismu Bacillus sp. B71 CCM 7718, využitelného zejména pro oxidaci vybraných sulfidu na sulfoxidy s vysokou enantioselektivitou bez následné oxidace sulfoxidu na sulfony a zpusobu prípravy biomasy mikroorganismu použitelné pro zmínené biotransformace. Mikroorganismus je využitelný k príprave enantiomerne cistého esomeprazolu.

Description

Dosavadní stav techniky

Omeprazol patří do skupiny léků tzv. inhibitory protonové pumpy a poprvé byl popsán v EP-A0 005 125. Inhibitory protonové pumpy jsou přípravky určené k léčbě acidopeptických onemocnění. Mezi tato onemocnění patří refluxní choroba jícnu, vředová choroba gastroduodenální (Helicobacter pozitivní), gastropatie z nesteroidních antiflogistik, vředy endokrinního původu, stresové vředy a hemoragická gastropatie. Inhibitory protonové pumpy jsou přípravky bezpečné, s minimem interakcí. (Jirásek, V. Acidopeptická onemocnění - hlavní indikace pro inhíbitoiy protonové pumpy. Interní Med., 2008, 6). Omeprazol je racemátem R a S- enantiomerů, přičemž aktivní formou je pouze S-enantiomer. Poprvé byl uveden ve formě racemátů na trh v USA v roce 1989 firmou AstraZeneca jako magnézium sůl pod názvem Losec a Prilosec. V současné době tato firma vyrábí lékovou formu na bázi S-enantiomeru. Příprava chirálně čistého S-enantiomeru omeprazolu asymetrickou oxidací prochirálního sulfidu (la) za použití oxidačního činidla a chirálního komplexu titanu je popsaná v WO-A-96/02535.

Chemická příprava neracemického S- omeprazolu z racemické směsi krystalizaci pomocí esteru kyseliny mandlové je popsána v WO-A-94/27988 a krystalizaci pomocí inkluzních komplexů s cyklodextriny v WO-A-02/098423.

- 1 CZ 302612 B6

Biokonverze prekurzorů prazolů na prazoly byla popsána v WO-A-96/17077.

Dále bylo identifikováno několik mikroorganismů se schopností oxidovat sulfidy 1 na sulfoxidy 2 v US 5 840 552A.

Doposud nebyla popsána schopnost oxidovat sulfidy 1 na sulfoxidy 2 kmeny mikroorganismů rodu Bacillus.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je nový kmen mikroorganismu Bacillus sp. B71 CCM 7718 schopný oxidovat sulfid la na sulfoxid 2a. Předmětem vynálezu je také postup kultivace uvedeného kmene a jeho použití pro biotransformaci prekursorů prazolů la, lb a le na prazoly 2a, 2b a 2c. Výhodné vlastnosti kmene spočívají ve stereoselektivitě enzymu účastnícího se biotransformace (100% tvorba S-enantiomeru) a nulovém rozsahu následné oxidace S-enantiomeru na sulfon.

Podrobný popis vynálezu

Kmen Bacillus sp. B71 CCM 7718 byl získán rozsáhlým screeningem více než 1000 sbírkových a z přírody izolovaných kmenů nejrůznějších rodů (kvasinky, plísně a bakterie) a následnou chemickou mutagenezí.

Nejprve bylo získáno 127 bakteriálních kmenů se schopností transformovat sulfid la na sulfoxid, avšak pouze 5 kmenů transformovalo sulfid na sulfoxid s převahou S-formy. Izolát s nejvyšší konverzí sulfidu la na sulfoxid 2a a současně neoxidující produkt 2a na sulfon, získaný ze zeminy dlouhodobě kontaminované sírou, byl označen jako izolát B07. Byla provedena chemická mutageneze tohoto izolátu a mutant vykazující 100% S-enantioselektivitu byl taxonomicky zařazen jako Bacillus sp. a označen jako kmen B71. Předmětný bakteriální kmen systematicky nepatří mezi popsané kmeny oxidující sulfid la na sulfoxid 2a.

Nový kmen, který je předmětem tohoto vynálezu, je uložen v České sbírce mikroorganismů (Czech Collection of Microorganisms) Masarykovy University v Brně, Tvrdého 1E4, pod označením CCM 7718. Vlastnosti kmene určené pří jeho klasifikaci a ukládání ve sbírce CCM, Brno, jsou uvedeny v Tab. 1.

Mutant B71 byl kultivován v třepaných baňkách na mediu LB o pH 7 až 7,2 a složení (v g.F^l): trypton 10, kvasničný extrakt, 5, NaCl 10 doplněném sulfidem la v koncentracích 0,1 až 0,5 g/1, při teplotě 25 až 35 °C, pH během kultivace drženo v rozmezí 6 až 10. Byly vybrány optimální kultivační podmínky, za kterých byl kmen kultivován v míchaném bioreaktoru. Kultivace v bioreaktoru probíhaly za následujících podmínek: přítoková kultivace s automatickou regulací pH a koncentrace rozpuštěného kyslíku (udržováno přidáváním 3M vodného roztoku KOH a regulací vzdušnění), kde přidávaný roztok obsahoval živiny nebo kombinace živin a sulfidu la.

Během kultivace byl sledován stupeň konverze a enantiomemí nadbytek (ee) S-enantiomeru analýzou odebraných vzorků kultury: vzorky byly smíchány s etylacetátem (EA) a látky la a 2a byly extrahovány třepáním 15 min při teplotě 28 °C. Pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) byla stanovena konverze látky 1 a na 2a a enantíoselektivita biotransformace.

Dalším testováním bylo zjištěno přijatelné rozmezí podmínek vhodných jak pro jednorázovou, tak pro přítokovanou kultivaci kmene podle vynálezu: teplota 15 až 35 °C, pH v rozsahu 3 až 10 (nastavováno 0,2M citrátovým pufrem v rozmezí pH 3 až 6; 0,2M fosfátovým pufrem pro pH 7 až 8; 0,2M tris pufrem pro pH 9 až 10), při frekvenci míchání zahájené na 300 ot/min a upravo váné během kultivace na 200 až 840 ot/min, pro zajištění 2 až 60% maximálního nasycení média kyslíkem, po dobu 12 až 48 hodin.

? Tab. 1 - Charakteristika kmene Bacillus sp. B 71 CCM 7718

A. Morfologie (mikroskopie)
Tvar buněk	tyčinky, nepravidelný tvar, po dvou
Spory	spóry oválné, zduřující buňku, umístěné centrálně
Gram-barvení	pozitivní
B. Morfologie kolonií na TSA agaru	Kulaté, hladké, lesklé se zahuštěným středem,
C. Růstové podmínky
Teplota	Roste dobře při 28 - 35 °C, roste i při 37 °C
PH	6,0-10,0
Vztah ke kyslíku	aerobní
Růst v přítomnosti 10,0% NaCl	negativní
D. Fyziologická charakteristika
Hydrolýza škrobu	negativní
Hydrolýza kaseinu	negativní
Hydrolýza eskulinu	negativní
Hydrolýza tyrozinu	negativní
Hydrolýza o-nitro feny l-β-D-galaktozidu	negativní
Hydrolýza lecithinu	negativní
Hydrolýza želatiny	pozitivní
Hydrolýza Tweenu 80	pozitivní
Hydrolýza DNA	pozitivní
Redukce nitrátů	negativní
Kyselina z glukózy	negativní
Kyselina z xylózy	negativní
Kyselina z manitolu	negativní
Kyselina z celociózy	negativní
Kyselina z laktózy	negativní
Kyselina z fiuktózy	negativní
Kyselina z inozitolu	negativní
Růst na Simons citrátu	negativní
Ureáza	negativní
Kataláza	pozitivní
Oxidáza	pozitivní
Arginin dihydroláza	negativní
Hemolýza	negativní
(jtilizace etanolu, metanolu	negativní
Utilizace aminokyselin	pozitivní

Ze schopnosti kmene CCM 7718, který je předmětem vynálezu, oxidovat sulfid la na sulfoxid 2a io se stoprocentní (S)-enantioseIekti vitou při úplné absenci následné oxidace sulfoxtdu na sulfon vyplývá reálný předpoklad využití předmětného kmene pro výrobu omeprazolu ve farmaceutickém průmyslu.

Aniž by se jimi jeho rozsah omezoval, je vynález v následujících příkladech detailně ilustrován 15 popisem způsobu získání kmene B. sp B71 CCM 7718 a způsobu jeho kultivace, zaměřené na biotransformační aktivitu vybraných sulfidů na sulfoxidy.

-3 CZ 302612 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obr. í Časový průběh koncentrace biomasy (X - ) a biotransformační aktivity (konverze-*) v jednorázové kultuře kmene B71 CCM7718 v třepané baňce při kultivační teplotě 30 °C v LB mediu dle příkladu 2.

Obr. 2 Časový průběh koncentrace biomasy (X - ) a biotransformační aktivity (konverze - ♦) v přítokované kultuře (fed batch) kmene B71 CCM7718 v míchaném bioreaktoru při kultivační teplotě 30 °C v LB mediu dle příkladu 4.

Obr. 3 Časový průběh nárůstu biomasy (X - ) a množství vzniklého produktu (produkt - ♦) v přítokované kultuře (double fed-batch) kmene B71 CCM7718 vmíchaném bioreaktoru při kultivační teplotě 30 °C v LB mediu dle příkladu 5.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace kmene Bacillus sp. B07 ajeho chemická mutagenéza

Kmen Bacillus sp. B07 byl získán ze zeminy dlouhodobě kontaminované sírou. Vzhledem k nízkému mikrobiálnímu osídlení zeminy, byla autochtonní mikroflora pomnožena kultivací. 10 g zeminy bylo resuspendováno ve 100 ml LB media a třepáno 72 h při 28 °C na rotační třepačce (200 ot.min '). Takto pomnožená autochtonní mikroflora byla příslušně naředěna ve fyziologickém roztoku a vyseta na LB agar (trypton 10, kvasničný extrakt 5, NaCl 10 a agar 24 g.l '). Jednotlivé morfologicky odlišné kolonie izolátů, narostlé za 3 dny při 28 °C, byly preočkovány na čerstvý LB agar a po nárůstu při 28 °C byla u nich stanovena schopnost oxidovat sulfid na sulfoxid následujícím způsobem: 2 ml LB media v 12 jamkových kultivačních destičkách (mtwp) byly inokulovány příslušným izolátem a po 24 h kultivace (28 °C a 200 ot.min ‘) byl přidán substrát la v koncentraci OJ g.l ‘ a tím zahájen proces biotransformace. Po 24 h biotransformace (28 °C a 200 ot.min”¹) bylo k 1 ml vzorku přidáno 0,5 ml EA a kultivační kapalina byla extrahována po dobu 15 min. Po odstředění (15 min, 10 000 ot.min ') byla organická fáze použita pro kvalitativní stanovení sulfidu, sulfoxidu a sulfonu pomocí tenkovrstvé chromatografie TLC):

TLC s indikátorem 245nm Whatman eluční směs: chloroform : methanol : amoniak (90:9:1 V/V) rf la = 8,3 rf lb = 6,3

Stejným způsobem byly testovány izoláty získané z jiných přírodních lokalit i sbírkové kmeny. U mikroorganismů, kdy byla na TLC detekována přítomnost sulfoxidu, byla konverze dále kvantifikována na HPLC a stanovena ee sulfoxidu za následující podmínek:

Kolona: Chiralpack AD 250x4,6 mm

Eluční směs: hexan: etanol (1:1 V/V) + 0,05% Et₃N

Průtok: l,0mL/min

Nanášený objem 0,02mL

Detekce při vlnové délce 302nm

Retenční časy:

Látka la 5,1 min, Látka 2a enantiomer (S) 8,3 min, enantiomer (R) 12,4 min

Látka lb 5,14 min, Látka 2b enantiomer A 7,21 mm, enantiomer B 7,89 mm

-4CZ 302612 B6

Z testovaných izolátů byly vybrány kmeny s nejvyšší konverzí sulfidu la na sulfoxid 2a, s nejvyšším ee S-formy 2a a absencí tvorby sulfonu. Ze 127 bakteriálních izolátů, které vykazovaly vysokou biotransformaci sulfidu la na sulfoxid 2a, pouze 5 mělo převahu (S) enantiomeru.

Těchto 5 vybraných kmenů bylo dále kultivováno v 50 ml LB media v 500 ml kultivačních baňkách následujícím způsobem: medium bylo inokulováno danými kmeny narostlými na LB agaru a baňky byly inkubovány na rotačním třepacím stroji (200 ot.min 28 až 30 °C) po dobu 24 h (první vegetativní generace). 2 ml narostlé kultury byly použity pro inokulaci třech paralelních io baněk s 50 ml půdy stejného složení (druhá vegetativní generace), které byly kultivovány za stejných podmínek. Ve 24. h kultivace byl do kultivační kapaliny přidán sulfid la v koncentraci

0,1 g.l Po 24 h biotransformace (28 °C a 200 ot.min ') byl vzorek kultury extrahován EA (15 min) a po odstředění (15 min, 10 000 ot.min ') byla organická táze použita pro kvantitativní stanovení biokonverze pomocí HPLC (viz výše). Ze série 5 kmenů byl vybrán přírodní izolát ze i? vzorku zeminy kontaminované sírou, který vykazoval konverzi 36 %, ee 78 % (S) a neoxidoval sulfoxid na sulfon. Kmen byl označen jako B07.

Mutageneza:

Byla připravena první a druhá vegetativní generace kmene B07 jak je uvedeno výše, s tím rozdílem, že z kultury druhé generace byl v 15. h kultivace (exponenciální fáze růstu) asepticky odebrán vzorek a oddělena biomasa centrifugací. Biomasa byla promyta a resuspendována do stejného objemu 0,1 M fosfátového pufru pH 7,0. Tato suspenze buněk byla přidána k roztoku Nmetyl-N-nítro-N-nitrosoguanidinu v 0,1 M fosfátovém pufru tak, aby výsledná směs obsaho25 vala cca 10⁷ až 10⁸ buněk a 150 pg uvedeného mutagenu na 1 ml směsi. Tato směs byla míchána 60 min při 28 °C a vyseta na LB půdu doplněnou agarem. Po inkubaci misek při 28 °C po dobu 48 h bylo získáno 600 monokoloniových izolátů, u kterých byla testována schopnost oxidace sulfidu la na sulfoxid 2a ve 12 jamkových mtwp stejným způsobem jako při screeningu. Tímto způsobem byl získán bakteriální izolát, označený B71, který vykazoval 45% konverzi sulfidu la

3u na sulfoxid 2a s ee 100% (S) a nulovou oxidaci sulfoxidu 2a na sulfon. Kmen byl taxonomicky zařazen jako Bacillus sp. B7t a deponován ve sbírce mikroorganismů pod číslem CCM7718.

Příklad 2

Jednorázová kultivace Bacillus sp. B71 CCM 7718

Jednorázová kultivace probíhaly v 500 ml kultivačních buňkách se 100 ml LB medika (při 7,0) na reciprokém třepacím stroji (200 ot.min 30 °C). pH kultivační kapaliny v průběhu kultivace nebylo upravováno. Kultivační media byla inokulována 2% kulturou 1. vegetativní generace (viz. příklad 1).

Časový průběh koncentrace biomasy (suchá hmotnost - X) a schopnost buněk oxidovat sulfid la (% konverze) jsou uvedeny v obr. 1: v časových intervalech byly odebírány 2 ml vzorky kulti45 vační kapaliny a přeneseny do 12 jamkových mtwp. Dále bylo postupováno podle příkladu 1 (druhá vegetativní generace): do vzorku kultury byl přidán sulfid la v koncentraci 0,1 g.l“¹ a po 24 h biotransformace bylo kvantitativně detekováno procento konverze látky la na 2a. Z průběhu grafu je zřejmé, že nejvyšší schopnost biokon verze (70%) vykazuje kultura v průběhu exponenciální fáze růstu, tzn. od 8. do 15. h kultivace. Poté dochází k prudkému poklesu biokonverzní aktivity kultury.

Příklad 3

Jednorázová kultivace Bacillus sp. B71 CCM 7718 v přítomnosti sulfidu la v koncentraci 0,1 g.l

-5CZ 302612 B6

Jednorázová kultivace proběhla za stejných podmínek jako v příkladu 2 s tím rozdílem, že v 0. h kultivace byl do půdy přidán sulfid la v koncentraci 0,1 g.l Maximální hodnoty biokonverzc (55%) bylo dosaženo až ve 44 h kultivace, s ee 100% (S), kdy kultura byla ve stacionární fázi růstu.

Příklad 4

Přítokovaná (fed-batch, 5% roztok kvasničného cxtraktu-YE) kultivace Bacittus sp.B71 CCM 7718 v bioreaktoru

Přítokovaná kultivace probíhala v míchaném bioreaktoru Biostat MD: pracovní objem 3 l, vzdušnění 3 I vzduchu.min počáteční frekvence míchání 300 otáček.min ^l, při teplotě 30 °C. LB medium obsahující sulfid la v koncentraci 0,1 g.l ¹ bylo ínokulováno 5% kulturou druhé generace (viz příklad 1) s tím rozdílem, že kultivační medium pro přípravu druhé generace kultury bylo od počátku kultivace doplněno sulfidem la v koncentraci 0,1 g.l '. pH media bylo regulováno od 4.h kultivace (pH 7,8). Po počátečním poklesu koncentrace rozpuštěného kyslíku v mediu na 30% byl spuštěn přítok 5% roztoku kvasničného extraktu a byly udržovány konstantní otáčky míchadla. Režimem feedování byla udržována koncentrace rozpuštěného kyslíku (pO?) v rozmezí 25 až 35 % hodnoty maximálního nasycení media kyslíkem. V průběhu kultivace v bioreaktoru byly v pravidelných časových intervalech odebírány vzorky kultury a stanoveny následující parametry: koncentrace biomasy (suchá hmotnost buněk, edw), konverze sulfidu la na sulfoxid 2a (%) a ee sulfoxidu 2a. Obr. 2 uvádí časový průběh koncentrace biomasy a bíotransformační aktivity. Za tohoto režimu kultivace bylo po 16 hodinách dosaženo konečné koncentrace biomasy 7,8 g.l ¹ (edw), konverze 76,3% a ee (S) 100 %.

Příklad 5

Přítoková (double fed-batch, 5% roztok YE a 0,3 g.l ¹ sulfidu la) kultivace Bacittus sp.B71 CCM 7718 v bioreaktoru

Přítokovaná kultivace probíhala za stejných podmínek jako v příkladu 4 stím rozdílem, že byla přidávána směs obsahující navíc sulfid la v koncentraci 0,3 g.l '. Obr. 3 uvádí časový průběh nárůstu biomasy a tvorby produktu. Od 14.h do 22.h kultivace byl dočasně zastaven přítok přikrmovacího roztoku, čemuž odpovídá zastavení nárůstu biomasy i tvorby produktu. Po té bylo přikrmování obnoveno. Za tohoto režimu kultivace bylo po 36 hodinách dosaženo konečného množství biomasy 71 g (suché místnosti) a množství produktu 2a 0,65 g. Biotransformace substrátu 1 a souvisí s růstem mikroorganismu Bacittus sp. B71 CCM 7718 a závisí na rychlosti růstu kultury.

Příklad 6

Jednorázová kultivace Bacittus sp. B71 CCM 7718 v přítomnosti sulfidu lb

Jednorázová kultivace proběhla za stejných podmínek jako v příkladu 3 s tím rozdílem, že v 0. h kultivace byl do půdy přidán sulfid lb. Po 44 h biotransformace byla hodnota konverze na sulfid 2b 8% a ee 100% (enantiomer A).

Příklad 7

Jednorázová kultivace Bacittus sp. B71 CCM 7718 v přítomnosti sulfidu lc

-6CZ 302612 B6

Jednorázová kultivace proběhla za stejných podmínek jako v příkladu 3 s tím rozdílem, že v 0. h kultivace byl do půdy přidán sulfid 1c. Po 44 h biotransformace byla hodnota konverze na sulfid 2c 8% a ee 100% (enantiomer A).

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kmen mikroorganismu Bacillus sp. B71 CCM 7718, schopný transformovat sulfid vzorce la (la),

   15 na S-omeprazol vzorce 2a se stoprocentním enantiomerním nadbytkem bez následné oxidace sulfoxidu na sulfon.
2. 2. Způsob přípravy biomasy kmene Bacillus sp. B71 CCM 7718 podle nároku 1 vyznačující se tím, že mikroorganismus je kultivován v jednorázové kultivaci při teplotě 15 až 35 °C, pH v rozsahu 3 až 10, při frekvenci míchání zahájené na 300 ot/min a upravované během kultivace na 200 až 840 ot/min, pro zajištění 2 až 60 % maximálního nasycení média kyslíkem,

   25 po dobu 12 až 48 hodin,
3. 3. Způsob přípravy biomasy kmene Bacillus sp. B71 CCM 7718 podle nároku 1 vyznačující se tím, že mikroorganismus je kultivován v přítokované kultivaci při teplotě 15 až 35 °C, pH v rozsahu 3 až 10, při frekvenci míchání zahájené na 300 ot/min a upravované během

   30 kultivace na 200 až 840 ot/min, pro zajištění 2 až 60 % maximálního nasycení média kyslíkem, po dobu 12 až 48 hodin a přidávaný roztok obsahuje směs aminokyselin.
4. 4. Způsob přípravy kmene Bacillus sp. B71 CCM7718 podle nároku 3 vyznačující se tím, že přidávaný roztok je doplněn sulfidem la v koncentraci 0,1 až 5 mg/ml.

   -7CZ 302612 B6
5. 5. Použití kultury kmene podle nároku 1 pro biotransformace sulfidů vzorce la, lb a 1c