CZ301306B6 - Zpusob cištení kyseliny hyaluronové o vysoké molekulové hmotnosti - Google Patents

Zpusob cištení kyseliny hyaluronové o vysoké molekulové hmotnosti Download PDF

Info

Publication number
CZ301306B6
CZ301306B6 CZ20012694A CZ20012694A CZ301306B6 CZ 301306 B6 CZ301306 B6 CZ 301306B6 CZ 20012694 A CZ20012694 A CZ 20012694A CZ 20012694 A CZ20012694 A CZ 20012694A CZ 301306 B6 CZ301306 B6 CZ 301306B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
hyaluronic acid
molecular weight
high molecular
aqueous solution
weight hyaluronic
Prior art date
Application number
CZ20012694A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20012694A3 (cs
Inventor
Carlino@Stefano
Magnette@François
Original Assignee
Trb Chemedica Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Trb Chemedica Sa filed Critical Trb Chemedica Sa
Publication of CZ20012694A3 publication Critical patent/CZ20012694A3/cs
Publication of CZ301306B6 publication Critical patent/CZ301306B6/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26Preparation of nitrogen-containing carbohydrates

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polyethers (AREA)

Abstract

Zpusob cištení kyseliny hyaluronové o vysoké molekulové hmotnosti pocházející z biologického zdroje, který zahrnuje stupen úpravy pH vodného roztoku obsahujícího kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti pocházející z biologického zdroje na hodnotu v rozmezí od 1,7 do 3,3 s následnou diafiltrací uvedeného vodného roztoku pri uvedené hodnote pH pres filtr o velikosti póru v rozmezí od limitu separace nominální molekulové hmotnosti 100 000 Daltonu do 0,45 .mi.m, stupen odstranení bunek z vodného roztoku obsahujícího kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti pocházející z biologického zdroje a stupen sterilizace.

Description

Způsob Čištění kyseliny hyaluronové o vysoké molekulové hmotnosti
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu čištění kyseliny hyaluronové o vysoké molekulové hmotnosti nebo její soli.
Dosavadní stav techniky
Kyselina hyaluronová je mukopoly sacharid biologického původu v přírodě značně rozšířený. Je například známé, že kyselina hyaluronová je obsažená v živočišných tkáních jako v pupeční io šňůře, synovíální tekutině, ve sklivci, v kohoutím hřebenu a v různých pojivových tkáních jako v kůži a v chrupavce.
Chemicky patří kyselina hyaluronová mezi glykosamínoglykany a obsahuje střídající se a opakující se jednotky D-glukuronové kyseliny a N-acetyl-D-glukosaminu tvořící lineární řetězec o molekulové hmotnosti až do 13 x IO6 Daltonů.
Výraz „kyselina hyaluronová o vysoké molekulové hmotnosti“ používaný v přihlášce tohoto vynálezu znamená kyselinu hyaluronovou o molekulové hmotnosti, jejíž hodnota není menší než asi 0,5 x IO6 Daltonů.
Je zapotřebí upozornit na skutečnost, že výraz „kyselina hyaluronová“ uváděný v popisu vynálezu i v patentových nárocích může znamenat bez rozlišování jak kyselinu hyaluronovou ve své kyselé formě, nebo může znamenat její sůl například natriumhyaluronát, kalium-hyaluronát, magnesium-hyaluronát, kalcium-hyaluronát nebo další.
Kyselina hyaluronová o vysoké molekulové hmotnosti je viskózní a je schopná si zachovávat gelovitý stav, má lubrikační účinky a zabraňuje invazí bakterií a zadržuje vodu.
Díky těmto vlastnostem kyselina hyaluronová umožňuje zachovávat tonicitu a elasticitu kůže.
V literatuře existují obsáhlé údaje o farmaceutickém použití kyseliny hyaluronové nebo její soli.
Protože kyselina hyaluronová je neimunogenní sloučenina a má viskózně-elastické a hydrofilní vlastnosti, používá se již několik let jako náhrada sklivce nebo kloubního mazu nebo jako nosné médium v oční chirurgii jak je popsané například v US-A 4 141 973, Balazs.
V kloubních mazech působí roztok kyseliny hyaluronové jako kluzný prostředek poskytující buňkám ochranné prostředí, a proto se používá pro léčbu zánětu kolenních kloubů.
V EP-A 0 781 547, Chemedica S. A, je popsaný oftalmický přípravek obsahující natriumhyaluronát pro použití v oční chirurgii.
V EP-A 0 719 559, Chemedica S. A, jsou popsané viskózní roztoky natři um-hyaluronátu vhodné jako maskovací tekutiny při terapeutické fotokeratektomii pomocí „excimer-laseru“.
4ó V EP-A 0 875 248, Chemedica S. A, je popsané použiti kyseliny hyaluronové nebo některé z jejích farmaceuticky přijatelných solí pro přípravu vodných roztoků vhodných jako tekutiny pro intraartikulámí výplachy.
V EP-A 0 698 388, Chemedica S. A, je popsaný oftalmický přípravek sloužící jako náhrada slz, který obsahuje hyaluronát jako prostředek pro zvýšení vískozity.
Díky své vysoce hydrofilní podstatě, je možné kyselinu hyaluronovou použít také v kosmetických produktech jako v pleťových vodách a krémech.
- 1 CZ 301306 B6
Pro farmaceutické použití kyseliny hyaluranové nebo její soli se vyžaduje, aby uvedené složky byly ve vysoce čisté formě.
Kyselinu hyaluronovou lze extrahovat a získat přečištěním například z pupeční šňůry, z kohou5 tich hřebínků nebo ze streptokoků skupiny A a C jak je popsané například v US-A 4 141 973, Balasz a v US-A 5 559 104, Romeo a sp.
Přípravu kyseliny hyaluronové s použitím streptokoků poprvé popsali Forres a sp., v roce 1937 (J. Biol. Chem., 118, 61 (1937) a později bylo prokázané, že kyselina hyaluronová získaná ze io zvířecích zdrojů je totožná s kyselinou hyaluronovou získanou z mikrobiologických zdrojů.
Způsoby přípravy kyseliny hyaluronové z mikrobiologických zdrojů jsou založené na vlastnosti streptokoků, že jejich buněčná stěna obsahuje jako hlavní složku kyselinu hyaluronovou.
Uvedené mikroorganismy jsou schopné transformovat glukosu obsaženou v jejich životním prostředí na D-glukuronovou kyselinu a N-acetyl-G-glukosamin a jako sekundární metabolit produkovat kyselinu hyaluronovou pro tvorbu své ochranné stěny.
Biosyntéza kyseliny hyaluronové je popsaná například v US-A 4 897 349, Swann a sp.
Pro získávání kyseliny hyaluronové nebo její soli z mikrobiologických zdrojů ve farmaceutické čistotě je známých více způsobů.
Například v US-A 4 780 414, Nimrod a sp., US-A 4 517 295, Bracke a sp., a v US-A 5 563 051, Ellwood a sp., jsou uvedené způsoby získávání kyseliny hyaluronové kontinuální fermentací bakterií rodu Streptococcus s následným přečištěním až na farmaceutickou čistotu.
Nicméně ve všech uvedených procesech způsoby čištění kyseliny hyaluronové zahrnují vysrážení kyseliny hyaluronové z mikrobiologického prostředí s použitím velkých množství organických rozpouštědel jako je ethanol, aceton, isopropanol atd.
Jsou také známé některé způsoby čištění kyseliny hyaluronové z mikrobiologických zdrojů s použitím kvartemích amoniových solí (US-A 4 517 295, Bracke a sp.) nebo s použitím aniontových nebo kationtových povrchově aktivních prostředků (US-A 5 316 926, Brown a sp.).
Nicméně výše popsané způsoby jsou vcelku složité, což vede k vysoké ceně produktů.
Jsou také známé způsoby čištění, kde roztok kyseliny hyaluronové se zpracuje diafiltrací s použi35 tím filtru s nominální hodnotou separace molekulové hmotnosti 10 000, 20 000 nebo 30 000 Daltonů, popsané například v US-A 5 563 051, Ellwood a sp,, a v US-A 4 517 295, Bracke a sp.
Nicméně, vzhledem k nízké hodnotě separačního limitu molekulové hmotnosti lze výše uvedené diafiltrační způsoby použít pouze k odstranění velmi malých molekul a diafiltrovaný roztok obsahující kyselinu hyaluronovou musí být dále zpracován způsoby zahrnujícími různé způsoby srážení, což vede k tomu, že uvedené způsoby zůstávají i nadále složité.
Cílem předloženého vynálezu je poskytnout způsob získávání kyseliny hyaluronové nebo její soli o vysoké molekulové hmotnosti mající farmaceuticky přijatelnou čistotu z biologických zdrojů, zvláště z mikrobiologických zdrojů, ve vysokém výtěžku, při poměrně nízkých nákladech a výhodně bez použití organických rozpouštědel nebo bez přídavku dalších prostředků.
Podstata vynálezu
Výše uvedený cíl lze podle vynálezu docílit způsobem čištění kyseliny hyaluronové o vysoké molekulové hmotnosti z biologického zdroje charakterizovaným tím že zahrnuje následující stupně:
- 2 CZ 3U13U6 B6
a) stupeň úpravy pH vodného roztoku obsahujícího kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti pocházející z biologického zdroje na pH v rozmezí 1,7 až 3,3 s následnou diafiltrací uvedeného roztoku při stejné hodnotě pH s použitím filtru o velikosti pórů s nominálním separačním limitem molekulové hmotností od 100 000 Daltonů do 0,45 pm;
b) stupeň odstranění buněk z vodného roztoku obsahujícího kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti pocházející z biologického zdroje, kde uvedený stupeň se provede před stupněm (a) nebo po stupni (a);
c) stupeň sterilizace.
io Výše uvedeným způsobem zahrnujícím stupeň diafiltrace při pH v rozmezí od 1,7 do 3,3 a stupeň odstranění buněk lze tak výhodně přečistit kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti z biologického zdroje a zejména z mikrobiologického zdroje a získat tak kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti nebo její sůl ve farmaceuticky přijatelné čistotě a ve vysokém výtěžku.
Ve stupni (a) způsobu podle vynálezu se kyselina hyaluronová zpracuje diaftltrací s použitím filtru nominálního limitu separace molekulové hmotnosti nebo velikosti pórů umožňujícího recirkulaci kyseliny hyaluronové a průchod všech ostatních složek obsažených v roztoku nebo v půdě filtrem.
Způsob podle vynálezu lze provést s použitím jakéhokoliv biologického zdroje kyseliny hyaluronové.
Způsobem podle vynálezu lze kyselinu hyaluronovou ve farmaceuticky přijatelné čistotě výhodně připravit bez stopových průvodních množství organických rozpouštědel nebo dalších přidávaných složek, protože způsob čištění podle vynálezu nezahrnuje srážení organickými rozpouštědly nebo dalšími prostředky, nýbrž kyselina hyaluronová zůstává v celém průběhu uvedeného způsobu udržovaná v roztoku.
Další cíle, vlastnosti a výhody vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu.
Způsobem podle vynálezu je možné přečistit kyselinu hyaluronovou z jakéhokoliv biologického zdroje až na farmaceuticky přijatelnou čistotu.
Například vodný roztok kyseliny hyaluronové obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti určený k prvotnímu zpracování buď ve stupni (a) podle vynálezu nebo ve stupni (b) podle vynálezu může být vodný roztok obsahující kyselinu hyaluronovou získaný extrakcí pupeční šňůry, kohoutích hřebínků nebo jiných zdrojů.
Nicméně ve výhodném provedení podle vynálezu je vodný roztok kyseliny hyaluronové obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti určený nejprve ke zpracování buď ve stupni (a) podle vynálezu, nebo ve stupni (b) podle vynálezu vodná půda obsahující kyselinu hyaluronovou z mikrobiologického zdroje.
Mikrobiologický zdroj je výhodně mikroorganismus rodu Streptococcus produkující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti, a ještě výhodněji se mikrobiologický zdroj zvolí ze skupiny zahrnující Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus equi a Streptococcus pyogenes.
Půdy obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti lze připravit kterýmikoli v způsoby v oboru dobře známými, zahrnujícími fermentaci kultury Streptococcus ve vhodném vodném médiu a za vhodných podmínek za tvorby kyseliny hyaluronové o vysoké molekulové hmotnosti. Uvedené způsoby jsou popsané například v US-A 4 780 414, Nimrod a sp., US-A 5 563 051, Ellwood a sp., nebo v US-A 5 316 916, Brown a sp.
Způsob přípravy vodné půdy obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotností podle vynálezu lze provést například následovně:
-3CZ 301306 B6
Na konci obvykle používaného fermentačního způsobu se půda mající pH asi 7,4 obsahující kyselinu hyaluronovou převede do nádrže opatřené systémem pro automatické řízení teploty. Teplota se pak udržuje na hodnotě v rozmezí od 15 do 25 °C, výhodně na 20 °C.
Vodný roztok kyseliny hyaluronové nebo půda obsahující kyselinu hyaluronovou se pak zpracuje způsobem čištění podle vynálezu.
Odstranění veškerých proteinů a dalších rozpustných složek obsažených ve vodném roztoku se pak provede ve stupni (a) diafiltrací roztoku získaného z biologického zdroje o pH v rozmezí od io 1,7 do 3,3 s použitím filtru o velikosti pórů v rozmezí od separačního limitu nominální molekulové hmotnosti 100 000 Daltonů do 0,45 μτη.
Předpokládá se, že když se pH roztoku kyseliny hyaluronové upraví na hodnotu v rozmezí od 1,7 do 3,3, dojde ke vzniku určitého typu zesítění, kde molekuly kyseliny hyaluronové vytvoří síť, i5 která se za podmínek jiných hodnot pH rozpadne.
V rozmezí hodnot pH od 1,7 do 3,3 tato síť neprochází filtrem o velikosti pórů v rozmezí velikosti od separačního limitu nominální molekulové hmotnosti 100 000 Daltonů od 0,45 pm, zatímco ostatní složky procházejí filtrem, což umožňuje separaci kyseliny hyaluronové od veške20 rých rozpuštěných složek obsažených v roztoku.
Ve stupni (a) se pH vodného roztoku výhodně upraví na hodnotu v rozmezí od 2,0 do 2,7 a pak se provede diafiltrace při uvedené hodnotě pH.
Ještě výhodněji se ve stupni (a) pH vodného roztoku upraví na hodnotu v rozmezí od 2,3 do 2,7 a pak se provede diafiltrace při uvedené hodnotě pH,
Ve stupni (a) se pH výhodně upraví pomocí vodného roztoku HC1.
V prvním výhodném provedení podle vynálezu, se stupeň (b) zahrnující odstranění buněk provede až po stupni (a) zahrnujícím diafiltrací, kde pH vodného roztoku nebo půdy obsahující kyse30 linu hyaluronovou z biologického zdroje se nejprve upraví na hodnotu v rozmezí od 1,7 do 3,3, výhodně na hodnotu v rozmezí od 2,5 do 2,6, výhodně vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové.
Při uvedených hodnotách pH, se vodný roztok nebo půda obsahující kyselinu hyaluronovou převede na viskozně-elastický vodný roztok nebo půdu obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti v zesítěném stavu.
Takto připravený vodný roztok nebo půda obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti se pak podrobí diafiltrací, výhodně diafiltraci s příčným rozvodem toku, za udržování hodnoty pH na konstantní hodnotě během celého diafiltračního stupně.
Zvláště výhodné je, když filtr použitý ve stupni (a) rafinačního způsobu podle prvního výhodného provedení vynálezu má velikost pórů 0,2 pm.
V uvedeném stupni (a) zahrnujícím diafiltraci, se viskozně-elastický vodný roztok nebo půda obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti čerpá do filtrační komory s příčným rozvodem toku opatřené vhodným počtem filtračních vložek o velikosti pórů v rozmezí od separačního limitu nominální molekulové hmotnosti 100 000 Daltonů do 0,45 pm, výhodně velikosti pórů 0,2 pm za přívodu apyrogenní destilované vody do zásobníku obsahujícího viskozně-elastický roztok obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti stejnou rychlostí jakou se odvádí filtrát aby byl zachován konstantní objem.
-4CZ 301306 B6
Ve stupni (a) rafinačního procesu podle prvního výhodného provedení vynálezu se viskozněelastický roztok nebo půda obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti výhodně diafiltruje tak dlouho, dokud odstraňovaný filtrát nemá absorbanci (optickou hustotu, OD) při vlnové délce 280 nm rovnou nebo nižší než 0,02. V tomto případě by absorbance filtrátu při uvedené vlnové délce měla být sledovaná během celého diafiltračního procesu.
Podle uvedeného prvního výhodného provedení vynálezu, po stupni (a) zahrnujícím diafiltraci následuje stupeň (b), zahrnující odstranění buněk, výhodně stupeň (b) který zahrnuje odstfeďování k odstranění veškerých buněk nebo proteinů obsažených v diafiltrováném roztoku nebo půdě.
V případě mikrobiologického zdroje může stupeň odstřeďování zahrnovat například úpravu pH diafiltrované půdy na pH na rozmezí od 3,5 do 5,0, výhodně na 4,0 a potom odstředění diafiltrované vodné půdy za získání supematantu obsahujícího kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti.
Výhodně se hodnota pH diafiltrované půdy upraví pomocí vodného roztoku NaOH. Nicméně je možné použít i jiné alkalické roztoky.
Podle uvedeného prvního výhodného provedení, po stupni (b) zahrnujícím odstranění buněk se provede sterilizační stupeň (c).
Podle druhého výhodného provedení způsobu podle vynálezu se stupeň (b) zahrnující odstranění buněk provede před stupněm diafiltrace (a).
V uvedeném druhém výhodném provedení se stupeň (b) odstranění buněk výhodně provede v diafiltračním stupni s příčným rozvodem toku.
V uvedeném diafiltračním stupni odstraňování buněk (b) se pH vodného roztoku kyseliny hyaluronové nebo půdy získané z biologického zdroje nejprve upraví na 3,5 výhodně vodným rozto25 kem HC1, a potom se získaný vodný roztok nebo půda diafiltruje při uvedeném pH s použitím filtru o velikosti 0,2 pm.
V uvedeném diafiltračním stupni (b) odstraňování buněk se vodný roztok nebo půda obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti čerpá do filtrační komory s příčným roz30 vodem toku opatřené vhodným počtem filtračních vložek o velikosti pórů 0,2 pm za přívodu sterilní apyrogenní destilované vody do zásobníku obsahujícího vodný roztok obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti stejnou rychlostí jakou se odvádí filtrát aby byl zachován konstantní objem.
Při uvedené hodnotě pH umožňuje filtr o velikosti pórů 0,2 pm recirkulaci buněk a průchod kyseliny hyaluronové filtrem.
Ve stupni (b) rafinačního způsobu podle druhého výhodného provedení se vodný roztok obsahující kyselinu hyaluronovou výhodně o vysoké molekulové hmotnosti diafiltruje až do dosažení přídavku 10 ekvivalentních objemů apyrogenní destilované vody.
Ve stupni (a) uvedeného druhého výhodného provedení se pH vodného roztoku kyseliny hyaluronové v podstatě prosté buněk získané ve stupni (b) nejprve upraví na 1,7 až 3,3, výhodně na 2,4, výhodně pomocí vodného roztoku HC1.
Při uvedené hodnotě pH se vodný roztok kyseliny hyaluronové převede na velmi viskozněelastický roztok obsahující kyselinu hyaluronovou v zesítěném uspořádání.
Takto získaný vodný roztok obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti se pak diafiltruje, výhodně v procesu s příčným uspořádáním toků, přičemž hodnota pH se udržuje na konstantní výše uvedené hodnotě během celého průběhu diafiltrace.
-5CZ 301306 B6
Ve stupni (a) uvedeného rafinačního způsobu podle vynálezu podle druhého výhodného provedení, se použije filtr se separačním limitem nominální molekulové hmotnosti 300 000 Daltonů.
s V uvedeném diafiltračním stupni (a) se viskozně-elastický vodný roztok obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti čerpá do filtrační komory opatřené vhodným počtem filtračních vložek o velikosti pórů v rozmezí od separačního limitu nominální molekulové hmotnosti 100 000 Daltonů do 0,45 pm, výhodně s nominálním separačním limitem molekulové hmotnosti 300 000 Daltonů, za zahuštění a přívodu apyrogenní sterilní destilované vody do záio sobníku obsahujícího viskozně-elastický roztok obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké moekulové hmotnosti stejnou rychlostí jakou se odvádí filtrát aby byl zachován konstantní objem.
Ve stupni (a) rafinačního způsobu podle druhého výhodného provedení vynálezu se viskozněelastický vodný roztok obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti výhod15 ně diafiltruje až do dosažení přídavku 15 ekvivalentních objemů apyrogenní sterilní destilované vody. Filtrát se pak odstraní.
Při použití druhého výhodného provedení vynálezu je výhodné, že je vynecháno odstřeďování.
Podle uvedeného druhého provedení za stupněm (a) zahrnujícím diafiltraci následuje stupeň (c) zahrnující sterilizaci.
Sterilizační stupeň ve způsobu podle vynálezu se výhodně provede sterilizační filtrací.
Podle vynálezu je možné sterilizaci filtrací provést standardním způsobem sterilizace filtrací.
Podle uvedeného prvního provedení se stupeň sterilizace filtrací provede úpravou pH supernatantu získaného ve stupni (b) odstředěním na hodnotu 7,0 a následnou filtrací supematantu přes filtr o velikosti pórů 0,2 pm.
Podle uvedeného druhého provedení se stupeň sterilizace filtrací provede úpravou pH diafiltrovaného roztoku obsahujícího kyselinu hyaluronovou získaného ve stupni (a) na hodnotu 7,0 a následnou filtrací supematantu přes filtr o velikosti pórů 0,2 pm.
V uvedených dvou výhodných provedeních se pH výhodně upraví pomocí vodného roztoku
NaOH. Nicméně je možné použít i jiné vodné alkalické roztoky.
Potom je možné sterilní roztok zahustit s použitím filtru se separačním limitem nominální molekulové hmotnosti 5 000 až 10 000 Daltonů.
Po zahuštění je možné sterilizovaný roztok vysušit vymrazením za získání kyseliny hyaluronové nebo její soli ve formě suchého prášku.
Kyselina hyaluronová nebo její sůl připravená způsobem čištění podle vynálezu má farmaceuticky přijatelnou čistotu a její výtěžek v uvedeném procesu je asi 70 až 90 % hmotnostních vzhledem k obsahu kyseliny hyaluronové v roztoku suroviny.
Kyselina hyaluronová nebo její sůl, připravená způsobem čištění podle vynálezu je pozoruhodná nepřítomností pyrogenních složek a tím že nevykazuje zánětlivé účinky.
Kyselina hyaluronová nebo její sůl, připravená způsobem čištění podle vynálezu obsahuje od 90 do 95 % hmotnostních kyseliny hyaluronové obsahující D-glukuronovou kyselinu a N-acetylD-glukosamin v poměru í :1, od asi 3 do 5 % hmotnostních vody, méně než 0,2 % hmotnostních proteinů, méně než 0,3 % hmotnostních nukleových kyselin a méně než 0,3 % hmotnostních neutrálního cukru.
Způsob podle vynálezu je velmi jednoduchý a je velmi výhodný z ekonomického a z ekologického hlediska, protože nezahrnuje použití jiných prostředků než HC1 nebo NaOH.
-6CZ 301306 B6
Při použití způsobu čištění podle vynálezu získaná kyselina hyaluronová nebo její sůl neobsahuje žádné stopy organických rozpouštědel.
Následující příklady provedení způsobu přípravy kyseliny hyaluronové o vysoké molekulové hmotnosti nebo její soli o farmaceuticky přijatelné čistotě podle vynálezu jsou uvedené pouze pro znázornění vynálezu a žádným způsobem neomezují rozsah vynálezu.
Příklady provedeni vynálezu
Příprava vodné půdy obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti z mikrobiologického zdroje
Buňky Streptococcus equi se kultivují při teplotě 37 °C ve vhodném médiu následujícího složení:
is glukosa 60 g
Soytone 15 g extrakt z kvasnic 5 g díhydrogenfosforečnan draselný 2,5 g síran horečnatý heptahydrát 1,2 g přečištěná apyrogenní voda 1000 ml
Deset litrů média se vysterilizuje a ínokuluje se 1 až 2 % kultury Streptococcus equi o optické hustotě (OD) asi 7 stanovené při vlnové délce 650 nm.
Během fermentace se pH půdy automaticky udržuje na hodnotě 7,4 přídavky NaOH 5 mol/1). Provádí se vzduchování v dávce 1 objemu vzduchu na jeden objem média za minutu, a během celého průběhu fermentace se půda promíchává rychlostí 250 ot./min.
Za 20 hodin se půda sklidí a převede se do vhodné nádrže mající objemovou kapacitu 50 litrů.
Způsob čištění podle prvního výhodného provedení vynálezu.
Hodnota pH půdy připravené výše popsaným způsobem se za kontinuálního míchání upraví na 2,5 pomocí HC1 (6 mol/1) a získá se tak velmi viskózní půda která má vzhled husté kapkovité tekutiny.
Tato vodná půda se pak čerpá do filtrační komory s příčným rozvodem toku opatřené třemi filtračními vložkami 0,2 pm umístěnými na sobě. Použijí se filtrační vložky SARTOCON cassette, Mod. No. 302 186 07 06 W-SG vyráběné firmou SARTORIUS s velikostí pórů 0,2 pm.
Na počátku zavádění vodné půdy do filtračního systému se ventil pro odvod filtrátu uzavře aby vodná půda mohla několik minut recirkulovat a docílilo se stability systému a systém se zbavil bublin obsažených v systému s recirkulující tekutinou.
Pak se ventil pro odvod filtrátu otevře a do nádrže obsahující vodnou půdu se začne zavádět stejnou rychlostí jakou se odvádí filtrát sterilní apyrogenní destilovaná voda aby se zachoval konstantní objem vodné půdy. Vstupní tlak se udržuje na hodnotě v rozmezí 0,1 až 0,3 MPa (1 až
3 bar) výhodně 0,2 MPa (2 bar).
Diafiltrace se ukončí, když absorbance filtrátu při vlnové délce 280 nm dosáhne hodnoty 0,012 (OD). Filtrát se odstraňuje.
Hodnota pH diafiltrované půdy se pak upraví na 4 pomocí roztoku NaOH (5 mol/1) a pak se půda odstřeďuje při 9000 ot./min a 15 °C v odstředivce s chlazením.
-7CZ 301306 B6
Pak hodnota pH supematantu upraví na 7,0 roztokem NaOH (5 mol/1) a roztok se zfiltruje přes filtr o velikosti pórů 0,2 pm ke sterilizaci roztoku standardním způsobem.
Sterilní roztok se pak lyofilizuje standardním lyofilizaěním způsobem a získá se tak hyaluronát sodný ve formě suchého prášku.
Výtěžek kyseliny hyaluronové podle tohoto příkladu je asi 85 až 87 % vzhledem k obsahu kyseliny hyaluronové v roztoku obsahujícím vstupní surovinu a připravený produkt má následující parametry:
obsah natři um-hyaluronátu 96,5 %
- vnitřní viskozita (25 °C) = 2100 ml/g
(odpovídající molekulová hmotnosti 1,7 x 106 Daltonů)
obsah vody 3,1 %
obsah proteinu 0,08 %
obsah kyseliny nukleové 0,01 %
obsah neutrálního cukru 0,01 %
Natrium-hyaluronát o vysoké molekulové hmotnosti připravený výše uvedeným způsobem je vhodný pro přípravu farmaceutických kompozic.
Způsob čištění podle druhého výhodného provedení vynálezu
Hodnota pH vodné půdy objemu 5 litrů obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti připravené výše popsaným způsobem z mikrobiologického zdroje se za kontinuálního míchání upraví na 3,5 pomocí HCI (6 mol/1) a na této hodnotě pH se udržuje v celém průběhu diafiltračního stupně s příčným rozvodem toku k odstranění buněk,
Tato vodná půda (5 litrů) se pak čerpá do filtrační komory s příčným rozvodem toku opatřené třemi filtračními vložkami 0,2 μπι umístěnými na sobě. Použijí se filtrační vložky SARTOCON cassette, Mod. No. 302 186 07 06 W-SG vyráběné firmou SARTORIUS o velikostí pórů 0,2 pm.
Na počátku zavádění vodné půdy do filtračního systému se ventil pro odvod filtrátu uzavře aby vodná půda mohla několik minut recirkulovat a docílilo se stability systému a systém se zbavil bublin obsažených v systému s recirkulující tekutinou.
Pak se ventil pro odvod filtrátu otevře a do nádrže obsahující vodnou půdu se zavádí stejnou rychlostí jakou se odvádí filtrát, sterilní apyrogenní destilovaná voda o celkovém objemu odpovídajícím 10 ekvivalentním objemům, aby se zachoval konstantní objem vodné půdy. Vstupní tlak se udržuje na hodnotě v rozmezí 0,1 MPa až 0,3 MPa (1 až 3 bar) výhodně 0,2 MPa (2 bar).
Retenční tekutina se odstraní a filtrát (50 litrů) obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti prostý buněk se zpracuje dále uvedeným způsobem.
Hodnota pH získaného diafiltrovaného roztoku (50 litrů) obsahující kyselinu hyaluronovou se pak upraví na 2,4 za tvorby velmi viskózní ho roztoku a hodnota pH se udržuje na výše uvedené hodnotě po celou dobu diafiltračního procesu s příčným rozvodem toku.
Tato vodná půda (50 litrů) se pak čerpá do filtrační komory s příčným rozvodem toku opatřené třemi filtračními vložkami 300 000 Daltonů umístěných na sobě. Použijí se filtrační vložky SARTOCON cassette, Mod. No. 302 146 790 07 7E-SG vyráběné firmou SARTORIUS s velikostí pórů odpovídající 300 000 Daltonům.
Na počátku zavádění vodné půdy do filtračního systému se ventil pro odvod filtrátu uzavře aby vodná půda mohla několik minut recirkulovat a docílilo se stability systému a systém se zbavil bublin obsažených v systému s recirkulující tekutinou.
-8CZ 301306 B6
Pak se ventil pro odvod filtrátu otevře a vodná půda se zahustí na objem 7,5 litru. Filtrát (42,5 litru) se odstraní.
Pak se do nádrže obsahující vodnou půdu zavádí stejnou rychlostí jakou se odvádí filtrát, sterilní apyrogenní destilovaná voda o celkovém objemu rovném patnácti ekvivalentním objemům, aby se zachoval konstantní objem vodné půdy. Vstupní tlak se udržuje na hodnotě v rozmezí od 0,1 MPa do 0,3 MPa (1 až 3 bar) výhodně 0,2 MPa (2 bar). Filtrát (116 litrů) se odstraní.
Pak se napájení vodou ukončí a vodná půda se zahustí.
io Hodnota pH zahuštěného diafiltrovaného roztoku (4 litry) se pak upraví na 7,0 pomocí NaOH (5 mol/1) a roztok se zfiltruje přes statický filtr o velikosti pórů 0,2 pm ke sterilizaci roztoku standardním způsobem sterilizace filtrací.
Sterilní roztok se pak suší lyofílizací standardním lyofilizačním způsobem a ve formě suchého prášku se tak získá hyaluronát sodný.
Výtěžek v provedení podle uvedeného příkladu je asi 83 až 85 % vztažených na obsah kyseliny hyaluronové v roztoku suroviny a produkt má následující parametry:
obsah natrium-hyaluronátu 97,0 %
- vnitřní viskozita (25 °C) = 2100 ml/g (odpovídající molekulové hmotnosti 1,7 x 106 Daltonů)
- obsah vody 2,9 %
- obsah proteinu 0,08 % obsah kyseliny nukleové 0,01 %
- obsah neutrálního cukru 0,01 %
Natrium-hyaluronát o vysoké molekulové hmotnosti připravený výše uvedeným způsobem je vhodný pro přípravu farmaceutických kompozic.

Claims (25)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob čištění kyseliny hyaluronové o vysoké molekulové hmotnosti pocházející z biologického zdroje vedoucí k získání kyseliny hyaluronové nebo její soli o vysoké molekulové hmotnosti o čistotě přijatelné pro farmaceutické použití, vyznačující se tím,že zahrnuje:
    a) stupeň úpravy pH vodného roztoku obsahujícího kyselinu hyaluronovou o vysoké moleku40 lové hmotnosti pocházející z biologického zdroje na pH v rozmezí 1,7 až 3,3 s následnou diafiltrací uvedeného roztoku pří stejné hodnotě pH s použitím filtru o velikosti pórů s nominálním separačním limitem molekulové hmotnosti od 100 000 Daltonů do 0,45 pm;
    b) stupeň odstranění buněk z vodného roztoku obsahujícího kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti pocházející z biologického zdroje, kde uvedený stupeň se provede před
    45 stupněm (a), nebo po stupni (a);
    c) stupeň sterilizace,
  2. 2. Způsob čištění podle nároku 1, vyznačující se tím, že vodný roztok obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti pocházející z biologického zdroje, který
    50 se nejprve zpracuje buď ve stupni (a), nebo ve stupni (b), je vodná půda obsahující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti pocházející z mikrobiologického zdroje.
    -9CZ 301306 B6
  3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že uvedeným mikrobiologickým zdrojem je mikroorganismu rodu Streptococcus produkující kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti.
  4. 5 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedený mikroorganismus rodu
    Streptococcus se zvolí ze skupiny zahrnující Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus equi a Streptococcus pyogenes.
    5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž4, vyznačující se tím, že ve stupni (a) io se hodnota pH vodného roztoku obsahujícího kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti upraví na hodnotu v rozmezí od 2,0 do 2,7 a pak se roztok zpracuje diafiItrací při výše uvedené hodnotě pH.
  5. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že ve stupni (a) se hodnota pH i? vodného roztoku obsahujícího kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti upraví na hodnotu v rozmezí od 2,3 do 2,7 a pak se roztok zpracuje diafi Itrací při výše uvedené hodnotě pH.
  6. 7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že ve stupni (a)
    20 se hodnota pH vodného roztoku obsahujícího kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti upraví pomocí vodného roztoku HCl.
  7. 8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že ve stupni sterilizace (c) se sterilizace provede filtrací.
  8. 9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž8, vyznačující se tím, že po stupni sterilizace (c) následuje stupeň lyofilizace d), ve kterém se tyofilizací sterilizovaného roztoku získá kyselina hyaluronová nebo její sůl ve formě suchého prášku.
    30
  9. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že sterilizovaný roztok se před lyofilizací zahustí.
  10. 11. Způsob podle kteréhokoliv znároků 1 až 10, vyznačující se tím, že stupeň odstranění buněk (b) se provede po stupni diafi ltrace (a).
  11. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že ve stupni (a) se hodnota pH vodného roztoku obsahujícího kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti upraví na hodnotu v rozmezí od 2,5 do 2,6 a pak se roztok zpracuje diafi Itrací pri výše uvedené hodnotě pH.
  12. 13. Způsob podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím, že filtr použitý v diafiltraci ve stupni (a) má velikost pórů 0,2 pm,
  13. 14. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 11 až 13, vyznačující se tím, že roztok
    45 kyseliny hyaluronové se ve stupni (a) diafiltruje tak dlouho, dokud odstraňovaný filtrát nemá hodnotu absorbance (OD) při vlnové délce 280 nm rovnou nebo nižší 0,02.
  14. 15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 11 až 14, vyznačující se tím, že stupeň (b) odstranění buněk se provede s použitím odstřeďování.
  15. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že stupeň odstřeďování zahrnuje úpravu pH diafiltrovaného vodného roztoku získaného ve stupni (a) na hodnotu pH v rozmezí od 3,5 do 5,0 a odstředění diafiltrovaného vodného roztoku za získání supematantu obsahujícího kyselinu hyaluronovou.
    - 10CZ 301306 B6
  16. 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že hodnota pH diafiltrovaného vodného roztoku získaného ve stupni (a) se upraví na 4,0.
  17. 18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že uvedená úprava hodnoty pH se
    5 provede vodným roztokem NaOH.
  18. 19. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 15 až 18, vyznačující se tím, že sterilizační stupeň (c) je stupeň sterilizace filtrací zahrnující úpravu pH supematantu získaného ve stupni odstředění (b) na hodnotu 7 a filtraci supematantu filtrem o velikosti pórů 0,2 pm.
  19. 20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedená úprava pH se provede vodným roztokem NaOH.
  20. 21. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že stupeň (b)
    15 odstranění buněk se provede před stupněm (a).
  21. 22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že stupeň (b) odstranění buněk je diafiltrační stupeň odstranění buněk.
    20 23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že diafiltrační stupeň (b) odstranění buněk zahrnuje úpravu pH vodného roztoku obsahujícího kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti pocházející z biologického zdroje na hodnotu pH 3,5 a následnou diafiltraci roztoku při stejné hodnotě pH s použitím filtru o velikosti pórů 0,2 μιη.
  22. 25 24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že uvedená hodnota pH se upraví vodným roztokem HCl.
    25. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 2laž24, vyznačující se tím, že filtr použitý v diafiltračním stupni (a) má velikost pórů odpovídající separačnímu limitu nominální moteku30 love hmotnosti 300 000 Daltonů.
  23. 26. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 21 až 25, vyznačující se tím, že ve stupni (a) se pH vodného roztoku obsahujícího kyselinu hyaluronovou o vysoké molekulové hmotnosti upraví na 2,4 a potom se roztok diafiltruje při stejné hodnotě pH.
  24. 27. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 21až26, vyznačující se tím, že sterilizační stupeň (c) je stupeň sterilizace filtrací zahrnující úpravu hodnoty pH vodného roztoku získaného ve stupni (a) diafiltraci na hodnotu 7 a filtraci tohoto vodného roztoku filtrem o velikosti pórů 0,2 pm.
  25. 28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že uvedená úprava pH se provede vodným roztokem NaOH.
CZ20012694A 1999-01-28 2000-01-27 Zpusob cištení kyseliny hyaluronové o vysoké molekulové hmotnosti CZ301306B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH00154/99A CH692919A5 (fr) 1999-01-28 1999-01-28 Procédé de purification de l'acide hyaluronique à poids moléculaire élevé.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20012694A3 CZ20012694A3 (cs) 2002-02-13
CZ301306B6 true CZ301306B6 (cs) 2010-01-06

Family

ID=4180486

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20012694A CZ301306B6 (cs) 1999-01-28 2000-01-27 Zpusob cištení kyseliny hyaluronové o vysoké molekulové hmotnosti

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6489467B1 (cs)
EP (1) EP1144668B1 (cs)
AT (1) ATE242816T1 (cs)
AU (1) AU3070400A (cs)
BR (1) BR0007782B1 (cs)
CA (1) CA2360343C (cs)
CH (1) CH692919A5 (cs)
CZ (1) CZ301306B6 (cs)
DE (1) DE60003282T2 (cs)
ES (1) ES2200812T3 (cs)
PL (1) PL200677B1 (cs)
SK (1) SK286327B6 (cs)
WO (1) WO2000044925A1 (cs)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH692919A5 (fr) * 1999-01-28 2002-12-13 Trb Chemedica S A Procédé de purification de l'acide hyaluronique à poids moléculaire élevé.
ES2192960B1 (es) * 2001-11-16 2005-03-01 Consejo Sup. Investig. Cientificas Nuevo procedimiento de obtencion de acido hialuronico.
PL217885B1 (pl) * 2002-08-07 2014-08-29 Medidom Lab Sposób wytwarzania sterylnej, gotowej do użycia, wodnej formulacji farmaceutycznej, zawierającej sól wysokocząsteczkowego kwasu hialuronowego
US7002007B2 (en) * 2004-05-28 2006-02-21 Calcigen Corporation Production of high molecular weight hyaluronates
KR100577075B1 (ko) * 2004-06-16 2006-05-08 주식회사 티앤라이프시스템 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염을 이용한 히아루론산정제방법
GB0502096D0 (en) * 2005-02-01 2005-03-09 Chiron Srl Purification of streptococcal capsular polysaccharide
CN102617754B (zh) 2006-07-06 2015-09-16 利莱恩斯生命科学有限公司 用于纯化高分子量透明质酸的有效方法
CN100478360C (zh) * 2006-10-31 2009-04-15 山东福瑞达生物化工有限公司 将浓缩用于透明质酸或其盐的生产的方法
PL2209814T3 (pl) * 2007-11-13 2017-08-31 Bio-Technology General (Israel) Ltd. Proces sterylizacji przez filtrację z rozcieńczaniem dla lepkosprężystych biopolimerów
DE102009021372A1 (de) * 2009-05-14 2010-11-18 Ursapharm Arzneimittel Gmbh Phosphatfreie pharmazeutische Zusammensetzung zur Glaukombehandlung
US8283463B2 (en) 2010-02-09 2012-10-09 Bausch & Lomb Incorporated Sterile hyaluronic acid solutions
JP5713995B2 (ja) * 2010-03-17 2015-05-07 電気化学工業株式会社 ヒアルロン酸及び/又はその塩の精製方法
CN102504047A (zh) * 2011-11-30 2012-06-20 上海景峰制药有限公司 一种玻璃酸钠发酵液的超滤方法
US9315588B2 (en) 2012-02-03 2016-04-19 University Of Rochester Compositions and methods for recombinant synthesis of high molecular weight hyaluronic acid
CN105237656A (zh) * 2015-10-30 2016-01-13 深圳市阳光之路生物材料科技有限公司 一种提纯透明质酸钠的方法
GB201703850D0 (en) * 2017-03-10 2017-04-26 Givaudan Sa Improvements in or relating to organic compounds
IT201900019724A1 (it) 2019-10-24 2021-04-24 Bmg Pharma S P A “procedimento in solvente organico per la purificazione dell’acido ialuronico sale sodico”

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4517295A (en) * 1983-02-18 1985-05-14 Diagnostic, Inc. Hyaluronic acid from bacterial culture
EP0694616A2 (en) * 1994-07-26 1996-01-31 POLI INDUSTRIA CHIMICA S.p.A. Process for the preparation of hyaluronic acid by fermentation with streptococcus
EP1144668A1 (en) * 1999-01-28 2001-10-17 Chemedica S.A. Process for purifying high molecular weight hyaluronic acid

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH072117B2 (ja) 1986-10-09 1995-01-18 三菱レイヨン株式会社 ヒアルロン酸の製造法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4517295A (en) * 1983-02-18 1985-05-14 Diagnostic, Inc. Hyaluronic acid from bacterial culture
EP0694616A2 (en) * 1994-07-26 1996-01-31 POLI INDUSTRIA CHIMICA S.p.A. Process for the preparation of hyaluronic acid by fermentation with streptococcus
EP1144668A1 (en) * 1999-01-28 2001-10-17 Chemedica S.A. Process for purifying high molecular weight hyaluronic acid

Also Published As

Publication number Publication date
ATE242816T1 (de) 2003-06-15
EP1144668B1 (en) 2003-06-11
AU3070400A (en) 2000-08-18
DE60003282D1 (de) 2003-07-17
CA2360343A1 (en) 2000-08-03
ES2200812T3 (es) 2004-03-16
PL200677B1 (pl) 2009-01-30
CA2360343C (en) 2010-02-23
PL350135A1 (en) 2002-11-04
CH692919A5 (fr) 2002-12-13
SK286327B6 (en) 2008-07-07
BR0007782B1 (pt) 2013-08-27
SK10632001A3 (sk) 2002-04-04
CZ20012694A3 (cs) 2002-02-13
DE60003282T2 (de) 2004-05-06
WO2000044925A1 (en) 2000-08-03
BR0007782A (pt) 2002-09-10
EP1144668A1 (en) 2001-10-17
US6489467B1 (en) 2002-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ301306B6 (cs) Zpusob cištení kyseliny hyaluronové o vysoké molekulové hmotnosti
FI79346C (fi) Framstaellning av hyaluronsyra medelst bakteriekultur.
EP0716688B1 (en) Culture medium and process for the preparation of high molecular weight hyaluronic acid
CA1270219A (en) Ultrapure hyaluronic acid and method of making it
EP2046969B1 (en) Process for producing high molecular weight hyaluronic acid
US9896518B2 (en) Dilute filtration sterilization process for viscoelastic biopolymers
US6946551B2 (en) Preparation of hyaluronic acid from eggshell membrane
JPS60251898A (ja) 醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法
DE3531612C2 (cs)
US6660853B2 (en) Method for purifying high molecular weight hyaluronic acid
EP1366082B1 (en) Highly sulfated derivatives of k5 polysaccharide and their preparation
MXPA01007523A (en) Process for purifying high molecular weight hyaluronic acid
JPH0455675B2 (cs)
KR101627014B1 (ko) 히알루론산의 정제 방법
JPS61239898A (ja) ヒアルロン酸の製造法
JPS62257393A (ja) ヒアルロン酸の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20200127