PL200677B1

PL200677B1 - Sposób oczyszczania wysokocząsteczkowego kwasu hialuronowego

Info

Publication number: PL200677B1
Application number: PL350135A
Authority: PL
Inventors: Stefano Carlino; Francois Magnette
Original assignee: Trb Chemedica S A
Priority date: 1999-01-28
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2009-01-30
Also published as: US6489467B1; EP1144668A1; BR0007782B1; SK286327B6; CA2360343C; DE60003282T2; AU3070400A; WO2000044925A1; BR0007782A; ATE242816T1; CA2360343A1; DE60003282D1; EP1144668B1; CH692919A5; ES2200812T3; SK10632001A3; CZ20012694A3; PL350135A1; CZ301306B6

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania wysokocz asteczkowego kwasu hialurono- wego, ewentualnie w postaci soli, o ciezarze cz asteczkowym nie mniejszym ni z 0,5 x 10 6 , z wytworze- niem wysokocz asteczkowego kwasu hialuronowego lub jego soli o czysto sci farmaceutycznej, który obejmuje: a) etap ustalenia warto sci pH wodnego roztworu, zawieraj acego wysokocz asteczkowy kwas hialuronowy ze zród la biologicznego o ciezarze cz asteczkowym nie mniejszym ni z 0,5 x 10 6 w zakre- sie od 1,7 do 3,3, a nast epnie diafiltracj e roztworu przy tym samym pH przy u zyciu filtra o wielko sci porów w zakresie od nominalnego ci ezaru cz asteczkowego wynosz acego 100000 do wielko sci 0,45 µm; b) etap usuwania komórek z roztworu wodnego zawieraj acego wysokocz asteczkowy kwas hialuronowy ze zród la biologicznego, przy czym etap ten przeprowadza si e przed etapem a) lub po etapie a); oraz c) etap sterylizacji. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania wysokocząsteczkowego kwasu hialuronowego, o ciężarze cząsteczkowym nie mniejszym niż 0,5 x 10⁶ lub jego soli.

Kwas hialuronowy jest śluzowatym polisacharydem pochodzenia biologicznego, szeroko rozpowszechnionym w naturze. Na przykład wiadomo, że kwas hialuronowy występuje w różnych tkankach zwierzęcych, takich jak pępowina, płyn maziowy, ciało szkliste, grzebień koguci i różne tkanki łączne, takie jak skóra i chrząstka.

Pod względem chemicznym kwas hialuronowy należy do grupy glikoaminoglikanów i składa się z naprzemiennie powtarzających się jednostek kwasu D-glukuronowego i N-acetylo-D-glukozoaminy, tworzących liniowy łańcuch o ciężarze cząsteczkowym do 13 x 10⁶.

Dla celów niniejszego wynalazku uznaje się, że wysokocząsteczkowym kwasem hialuronowym jest kwas hialuronowy o ciężarze cząsteczkowym nie mniejszym od około 0,5 x 10⁶.

Należy zwrócić uwagę, że termin „kwas hialuronowy” w niniejszym opisie i zastrzeżeniach może oznaczać zarówno kwas hialuronowy w jego formie kwasowej, jak i w formie soli, takiej jak np. hialuronian sodu, hialuronian potasu, hialuronian magnezu, hialuronian wapnia i inne.

Wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy jest lepki i może pozostawać w stanie galaretowatym, działając jako środek smarujący, zapobiegając inwazji bakterii i zatrzymując wodę.

Ze względu na te właściwości kwas hialuronowy jest w stanie utrzymać jędrność i elastyczność skóry. Farmaceutyczne zastosowania kwasu hialuronowego i jego soli są szeroko opisywane w literaturze.

Ponieważ kwas hialuronowy nie jest substancją immunogenną i ma właściwości lepkosprężyste i hydrofilowe jest uż ywany od kilku lat jako substancja zastę pują ca ciecz szklistą i pł yn maziowy lub jako środek pomocniczy w chirurgii oka, jak opisano w US-A-4 141 973 Balazsa.

W pł ynie maziowym lepki roztwór kwasu hialuronowego sł u ż y jako ś rodek smarują cy w celu zapewnienia środowiska ochronnego komórkom i z tego też powodu jest stosowany w leczeniu zapaleń stawów kolanowych.

W EP-A-0 781 547 firmy Chemedica S.A. opisano preparat okulistyczny do chirurgii oka oparty na hialuronianie sodu.

W EP-A-0 719 559 firmy Chemedica S.A. opisano lepki roztwór hialuronianu sodu do stosowania jako płyn maskujący w fotokeratektomii przy użyciu lasera ekscymerowego.

W EP-A-0 875 248 firmy Chemedica S.A. ujawniono uż ycie kwasu hialuronowego lub jednej z jego soli dopuszczanych do uż ytku farmaceutycznego przy wytwarzaniu roztworu wodnego uż ytecznego jako płyn do płukania stawów.

W EP-A-0 698 388 firmy Chemedica S.A. opisano preparat okulistyczny do użycia jako sztuczne łzy zawierający hialuronian jako środek zagęszczający.

Dzięki swemu wysoce hydrofilowemu charakterowi, kwas hialuronowy może być również użyty w produktach kosmetycznych, takich jak pł yny kosmetyczne i kremy.

Zastosowania farmaceutyczne kwasu hialuronowego i jego soli wymagają produktu o dużej czystości.

Kwas hialuronowy można wyekstrahować i oczyścić na przykład z pępowin, grzebieni kogucich i z paciorkowców z grup A i C, jak to opisano na przykład w US-A-4 141 973 Balazsa i US-A-5 559 104 Romeo i in.

Wytwarzanie kwasu hialuronowego przez paciorkowce zostało po raz pierwszy opisane przez Forresta i in. w roku 1937 (J. Biol. Chem. 118, 61 (1937)), a później wykazano, że kwas hialuronowy ze źródła zwierzęcego jest identyczny z kwasem hialuronowym ze źródła mikrobiologicznego.

Proces wytwarzania kwasu hialuronowgo ze źródła mikrobiologicznego opiera się na fakcie, że kwas hialuronowy jest głównym składnikiem ich otoczki.

Mikroorganizmy te są w stanie przetworzyć glukozę obecną w ich otoczeniu na kwas D-glukuronowy i N-acetylo-D-glukozo-aminę i wytworzyć kwas hialuronowy jako drugorzędowy metabolit, z którego budują swe otoczki ochronne.

Biosynteza kwasu hialuronowego przez paciorkowce została opisana na przykład w US-A-4 897 349 Swanna i in.

Znanych jest kilka procesów otrzymywania ze źródeł mikrobiologicznych kwasu hialuronowego lub jego soli sodowej o czystości farmaceutycznej.

PL 200 677 B1

Na przykład w US-A-4 780 414 Nimroda i in., US-A-4 517295 Bracke'a i in. i US-A-5 563 051 Ellwooda i in. ujawniono sposoby otrzymywania kwasu hialuronowego przez ciągłą fermentację paciorkowców, a następnie oczyszczenie otrzymanego w ten sposób kwasu hialuronowego do czystości wymaganej w zastosowaniach farmaceutycznych.

Jednak we wszystkich tych procesach oczyszczenie kwasu hialuronowego wymaga strącania kwasu hialuronowego ze źródła mikrobiologicznego dużymi ilościami rozpuszczalników organicznych, takich jak etanol, aceton, izopropanol itp.

Znanych jest kilka procesów oczyszczania, w których strącanie kwasu hialuronowego ze źródła mikrobiologicznego prowadzi się za pomocą czwartorzędowych soli amoniowych (US-A-4 517 295 Bracke'a i in.) lub za pomocą anionowych lub kationowych środków powierzchniowo czynnych (US-A-5 316 926 Browna i in.).

Jednak opisane sposoby są dość skomplikowane, w wyniku czego koszty produkcji są wysokie.

Znanych jest kilka procesów oczyszczania, w których roztwór kwasu hialuronowego jest diafiltrowany przy użyciu filtra przepuszczającego cząsteczki o nominalnym ciężarze cząsteczkowym do 10000, 20000 lub 30000, jak opisano w US-A-5 563 051 Ellwooda i in. i US-A-4 517 295 Bracke'a i in.

Jednak ze względu na przepuszczalność jedynie cząsteczek o małym ciężarze cząsteczkowym, te procedury diafiltracyjne można stosować do usunięcia tylko małych rozpuszczalnych cząsteczek, a diafiltrowany roztwór kwasu hialuronowego musi być poddany dalszej obróbce z użyciem różnych układów strącających, co powoduje, że cały proces oczyszczania staje się skomplikowany.

Celem niniejszego wynalazku jest otrzymanie wysokocząsteczkowego kwasu hialuronowego lub jego soli o czystości farmaceutycznej z dowolnego źródła biologicznego, w szczególności ze źródeł mikrobiologicznych, z wysoką wydajnością, przy stosunkowo niskim koszcie i korzystnie bez użycia rozpuszczalników organicznych lub dodawania innych substancji.

Cel ten osiągnięto w opisanym poniżej procesie oczyszczania wysokocząsteczkowego kwasu hialuronowego ze źródeł biologicznych, a w szczególności ze źródła mikrobiologicznego.

Zgodnie z wynalazkiem, sposób oczyszczania wysokocząsteczkowego kwasu hialuronowego, ewentualnie w postaci soli, o ciężarze cząsteczkowym nie mniejszym niż 0,5 x 10⁶, z wytworzeniem wysokocząsteczkowego kwasu hialuronowego lub jego soli o czystości farmaceutycznej obejmuje następujące etapy:

a) etap ustalenia wartości pH wodnego roztworu zawierającego wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy ze źródła biologicznego o ciężarze cząsteczkowym nie mniejszym niż 0,5 x 10⁶ w zakresie od 1,7 do 3,3, a następnie diafiltrację roztworu przy tym samym pH przy użyciu filtra o wielkości porów w zakresie od nominalnego ciężaru cząsteczkowego wynoszącego 100000 do wielkości 0,45 μm;

b) etap usuwania komórek z roztworu wodnego zawierającego wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy ze źródła biologicznego, przy czym etap ten przeprowadza się przed etapem a) lub po etapie a);

c) etap sterylizacji.

Zgodnie z etapem a) sposobu według niniejszego wynalazku, kwas hialuronowy diafiltruje się przy użyciu filtra, który przepuszcza cząsteczki o nominalnym ciężarze cząsteczkowym lub rozmiarze porów takim, by zatrzymany został kwas hialuronowy, a przepuszczone wszystkie substancje zawarte w roztworze lub bulionie.

Sposób według niniejszego wynalazku można przeprowadzić używając dowolnego biologicznego źródła kwasu hialuronowego.

Korzystnie, poddaje się obróbce roztwór wodny będący bulionem zawierającym wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy ze źródła mikrobiologicznego. Korzystnie, źródłem mikrobiologicznym jest gatunek paciorkowca wytwarzający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy, w szczególności Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus egui i Streptococcus pyogenes.

Korzystnie sposobem według niniejszego wynalazku można otrzymać kwas hialuronowy o czystości farmaceutycznej, bez ilości śladowych rozpuszczalników organicznych lub innych dodanych substancji, ponieważ w sposobie oczyszczania według niniejszego wynalazku kwas hialuronowy nie jest strącany rozpuszczalnikami organicznymi lub innymi substancjami, ale pozostaje w roztworze wodnym w czasie całego procesu.

Inne cele, cechy i zalety niniejszego wynalazku są przedstawione w poniższym szczegółowym opisie.

Jak wskazano powyżej, sposobem według niniejszego wynalazku można oczyścić do czystości farmaceutycznej kwas hialuronowy z dowolnego źródła biologicznego.

PL 200 677 B1

Na przykład roztwór wodny kwasu hialuronowego zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy, który traktuje się zgodnie z wynalazkiem przeprowadzając najpierw etap a) lub etap b), może być roztworem wodnym zawierającym wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy otrzymany w wyniku ekstrakcji z pępowiny, grzebienia koguta lub z innego źródła.

Jednak w korzystnym wykonaniu wynalazku roztworem wodnym kwasu hialuronowego, który traktuje się zgodnie z etapem a) lub zgodnie z etapem b), jest bulion wodny zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy ze źródła mikrobiologicznego.

Źródłem mikrobiologicznym korzystnie jest gatunek paciorkowca wytwarzający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy, a bardziej korzystnie źródło mikrobiologiczne wybiera się spośród Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus egui i Streptococcus pyogenes.

Bulion zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy można wytwarzać w dowolny dobrze znany sposób, w tym przez fermentację kultury paciorkowca wytwarzającego wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy w odpowiednim ośrodku wodnym i w odpowiednich warunkach. Procesy takie opisano na przykład w US-A-4 780 414 Nimroda i in., US-A-5 563 051 Ellwooda i in. lub US-A-5 316 916 Browna i in.

Sposób wytwarzania wodnego bulionu zawierającego wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy według niniejszego wynalazku może być, na przykład, następujący.

Pod koniec zwykłego procesu fermentacyjnego bulion zawierający kwas hialuronowy o pH około 7,4 zbiera się i przenosi do zbiornika wyposażonego w automatyczne sterowanie temperaturą. Temperaturę utrzymuje się w zakresie od 15°C do 25°C, korzystnie 20°C.

Otrzymany w ten sposób roztwór lub bulion kwasu hialuronowego poddaje się obróbce zgodnie ze sposobem oczyszczania według niniejszego wynalazku.

Diafiltracja zgodnie z etapem a) niniejszego wynalazku kwasu hialuronowego ze źródła biologicznego przy pH w zakresie od 1,7 do 3,3, przy użyciu filtra o rozmiarze porów w zakresie od nominalnego ciężaru cząsteczkowego wynoszącego 100000 do wielkości 0,45 μm, prowadzi do usunięcia wszystkich białek i innych rozpuszczalnych substancji obecnych w roztworze wodnym.

Zakłada się, że gdy pH roztworu kwasu hialuronowego ustali w zakresie od 1,7 do 3,3, zachodzi swego rodzaju odwracalne sieciowanie, w którym cząsteczki kwasu hialuronowego tworzą sieć, którą można rozbić przy innym pH.

Przy pH od 1,7 do 3,3 sieć może być zatrzymana przez filtr o wielkości porów w zakresie od nominalnego ciężaru cząsteczkowego wynoszącego 100000 do wielkości 0,45 μm, podczas gdy białka i inne materiały przechodzą przez filtr, umożliwiając w ten sposób oddzielenie kwasu hialuronowego od dowolnych substancji rozpuszczalnych zawartych w roztworze.

W etapie a) wartość pH roztworu wodnego korzystnie ustala się w zakresie od 2,0 do 2,7, a następnie roztwór diafiltruje się przy tym samym pH.

Bardziej korzystnie w etapie a) pH roztworu wodnego ustala się w zakresie od 2,3 do 2,7, a następnie roztwór diafiltruje się przy tym samym pH.

W fazie a) wartość pH korzystnie ustala się przy pomocy roztworu wodnego HCl.

W pierwszym korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku, w którym etap b) usuwania komórek prowadzi się po diafiltracyjnym etapie a), wartość pH wodnego roztworu lub bulionu kwasu hialuronowego otrzymanego ze źródła biologicznego ustala się w zakresie od 1,7 do 3,3, korzystnie 2,5-2,6, korzystnie za pomocą roztworu wodnego HCl.

Przy tej wartości pH wodny roztwór lub bulion kwasu hialuronowego zmienia się w bardzo lepkosprężysty roztwór wodny lub bulion zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy w postaci sieci.

Tak otrzymany wodny roztwór lub bulion zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy następnie diafiltruje się, korzystnie zgodnie z procesem diafiltracji z przepływem krzyżowym, utrzymując taką samą wartość pH przez cały etap diafiltracji.

W etapie a) sposobu oczyszczania według wspomnianego pierwszego korzystnego wykonania szczególnie korzystny filtr ma rozmiar porów równy 0,2 μm.

W etapie a) diafiltracji lepkosprężysty wodny roztwór lub bulion zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy pompuje się do zestawu do filtracji z przepływem krzyżowym wyposażonego w odpowiednią liczbę wkładów o rozmiarze porów w zakresie od nominalnego ciężaru cząsteczkowego wynoszącego 100000 do wielkości 0,45 μ^ι, korzystnie o rozmiarze porów 0,2 μm, a następnie do zbiornika zawierającego lepkosprężysty roztwór zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy dodaje się wodę destylowaną nie zawierającą pirogenów, z taką samą prędkością, z jaką przepływa przesącz, tak by zachować stałą objętość.

PL 200 677 B1

W etapie a) sposobu oczyszczania według pierwszego korzystnego wykonania, lepkosprężysty wodny roztwór lub bulion zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy korzystnie diafiltruje się, dopóki usuwany przesącz ma gęstość optyczną, przy długości fali 280 nm, równą lub mniejszą niż 0,02. W takim przypadku gęstość optyczna przesączu, przy tej długości fali powinna być monitorowana podczas całego procesu diafiltracji.

Zgodnie z pierwszym korzystnym wykonaniem, po etapie a) diafiltracji następuje etap b) usuwania komórek, korzystnie etap b) odwirowania w celu usunięcia wszelkich komórek lub białek ciągle obecnych w poddanym diafiltracji roztworze lub bulionie.

W przypadku źródła mikrobiologicznego etap odwirowania może obejmować na przykład ustalanie wartości pH diafiltrowanego bulionu w zakresie od 3,5 do 5,0, korzystnie do 4,0, a następnie odwirowanie diafiltrowanego wodnego bulionu, z wytworzeniem w ten sposób supernatantu zawierającego wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy.

Korzystnie pH diafiltrowanego roztworu ustala się za pomocą wodnego roztworu NaOH. Jednak można używać innych zasadowych roztworów wodnych.

Zgodnie z pierwszym korzystnym wykonaniem, po etapie b) usuwania komórek następuje etap c) sterylizacji.

Zgodnie z drugim korzystnym wykonaniem procesu według wynalazku etap b) usuwania komórek przeprowadza się przed etapem a) diafiltracji.

W drugim korzystnym wykonaniu etap b) usuwania komórek korzystnie jest etapem usuwania komórek przez diafiltrację z przepływem krzyżowym.

W tym diafiltracyjnym etapie usuwania komórek b) pH wodnego roztworu lub bulionu kwasu hialuronowego otrzymanego ze źródła biologicznego ustala się na poziomie 3,5, korzystnie za pomocą wodnego roztworu HCl, a następnie tak otrzymany wodny roztwór lub bulion diafiltruje się przy tym samym pH używając filtra o rozmiarze porów 0,2 μm.

We wspomnianym diafiltracyjnym etapie b) usuwania komórek, wodny roztwór lub bulion zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy pompuje się do zestawu filtracyjnego z przepływem krzyżowym wyposażonego w odpowiednią liczbę wkładów filtrujących o rozmiarze porów 0,2 μ^ι, a następnie dodaje się do zbiornika zawierającego wodny roztwór lub bulion zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy, sterylną wodę destylowaną nie zawierającą pirogenów, z taką samą prędkością, z jaką przepływa przesącz tak, by zachować stałą objętość.

Przy tej wartości pH filtr o rozmiarze porów 0,2 μ^ι umożliwia zatrzymanie komórek, a przepuszczenie kwasu hialuronowego.

W etapie b) procesu oczyszczania zgodnego z drugim korzystnym wykonaniem, wodny roztwór zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy korzystnie filtruje się aż do dodania 10 równoważnych objętości sterylnej wody destylowanej nie zawierającej pirogenów.

W etapie a) drugiego korzystnego wykonania pH wodnego roztworu kwasu hialuronowego zasadniczo wolnego od komórek, otrzymanego w etapie b) najpierw ustala się na 1,7 do 3,3, korzystnie 2,4, korzystnie za pomocą roztworu wodnego HCl.

Przy tej wartości pH wodny roztwór kwasu hialuronowego przekształca się w bardzo lepkosprężysty roztwór wodny zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy w postaci usieciowanej.

Tak otrzymany roztwór wodny zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy następnie diafiltruje się, korzystnie w procesie filtracji z przepływem krzyżowym, utrzymując taką samą wartość pH podczas całego etapu diafiltracji.

W etapie a) sposobu oczyszczania według niniejszego wynalazku zgodnie z drugim korzystnym wykonaniem, szczególnie korzystny jest filtr, który jest przepuszczalny dla cząsteczek o nominalnym ciężarze cząsteczkowym do 300000.

W tym etapie a) diafiltracji lepkosprężysty roztwór wodny zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy pompuje się do zestawu do filtracji z przepływem krzyżowym wyposażonego w odpowiednią liczbę wkładów filtrujących o wielkości porów w zakresie od nominalnego ciężaru cząsteczkowego wynoszącego 100000 do wielkości 0,45 μm, korzystnie przepuszczalnego dla cząsteczek o nominalnym ciężarze cząsteczkowym do 300000 i zatęża się, a następnie do zbiornika zawierającego lepkosprężysty roztwór zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy dodaje się sterylną wodę destylowaną nie zawierającą pirogenów, z taką samą prędkością, z jaką przepływa przesącz tak, by zachować stałą objętość.

W etapie b) sposobu oczyszczania według wynalazku zgodnie ze wspomnianym drugim korzystnym wykonaniem lepkosprężysty wodny roztwór zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy

PL 200 677 B1 korzystnie filtruje się, aż do dodania 15 równoważnych objętości sterylnej wody destylowanej nie zawierającej pirogenów. Przesącz odrzuca się.

Stosując drugie korzystne wykonanie, unika się odwirowywania.

Zgodnie z drugim korzystnym wykonaniem, po etapie a) diafiltracji następuje etap c) sterylizacji.

Etap sterylizacji według niniejszego wynalazku korzystnie jest etapem sterylizacji filtracyjnej.

Zgodnie z pierwszym korzystnym wykonaniem etap sterylizacji filtracyjnej przeprowadza się przez ustalenie wartości pH supernatantu otrzymanego w etapie b) odwirowywania, na poziomie 7,0, a nastę pnie przefiltrowanie supernatantu przez filtr o wielkoś ci porów 0,2 μ m.

Zgodnie z drugim korzystnym wykonaniem etap sterylizacji filtracyjnej przeprowadza się przez ustalenie wartości pH diafiltrowanego roztworu zawierającego kwas hialuronowy otrzymanego w etapie a), na poziomie 7,0, a następnie przefiltrowanie supernatantu przez filtr o wielkości porów 0,2 μm.

W tych dwóch korzystnych wykonaniach pH korzystnie ustala się za pomocą wodnego roztworu NaOH. Jednak można używać innych wodnych roztworów zasadowych.

Następnie sterylny roztwór można zatężyć używając filtra przepuszczalnego dla cząsteczek o nominalnym ciężarze cząsteczkowym do 5000-10000.

Po zatężeniu sterylizowany roztwór można w końcu liofilizować do otrzymania suchego proszku kwasu hialuronowago lub jego soli.

Kwas hialuronowy lub jego sól, otrzymane sposobem oczyszczania według niniejszego wynalazku, mają czystość farmaceutyczną, a wydajność wynosi około 70-90% wagowych w stosunku do zawartości kwasu hialuronowego w roztworze wyjściowym.

Kwas hialuronowy lub jego sól, otrzymane sposobem oczyszczania według niniejszego wynalazku, charakteryzują się tym, że nie wywołują gorączki ani stanów zapalnych.

Kwas hialuronowy lub jego sól, otrzymane sposobem oczyszczania według niniejszego wynalazku, zawierają od 90% do 95% wagowych kwasu hialuronowego składającego się z kwasu D-glukuronowego i N-acetylo-D-glukozoaminy w stosunku 1:1, od około 3% do 5% wagowych wody, mniej niż 0,2% wagowych białek, mniej niż 0,3% wagowych kwasów nukleinowych i mniej niż 0,3% obojętnych cukrów.

Sposób według wynalazku jest bardzo prosty i bardzo korzystny z punktu widzenia opłacalności i ekologii, bowiem nie używa się innych substancji niż HCl i NaOH.

Gdy stosuje się sposób według niniejszego wynalazku, kwas hialuronowy lub jego sole nie zawierają śladów rozpuszczalników organicznych.

Poniższe przykłady sposobu otrzymywania wysokocząsteczkowego kwasu hialuronowego lub jego soli i o czystości farmaceutycznej według niniejszego wynalazku służą tylko zilustrowaniu wynalazku i nie ograniczają jego zakresu.

P r z y k ł a d y

Wytwarzanie bulionu wodnego zawierającego wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy ze źródła mikrobiologicznego

Komórki Streptococcus equi hodowano w temperaturze 37°C w odpowiednim podłożu o następującym składzie:

glukoza 60 g soytone 15 g ekstrakt z drożdży 5,0 g diwodorofosforan potasu 2,5 g heptahydrat siarczanu magnezu 1,2 g oczyszczona woda bez pirogenów 1,0 l litrów podłoża poddano sterylizacji i inokulowano 1-2% hodowli Streptococcus equi o gęstości optycznej równej około 7 mierzonej przy długości fali równej 650 nm.

Podczas fermentacji pH bulionu automatycznie utrzymywano na poziomie 7,4 przez dodanie 5N NaOH. Napowietrzanie utrzymywano na poziomie 1 objętości powietrza na objętość podłoża na minutę, a mieszanie utrzymywano na poziomie 250 obrotów na minutę podczas całego okresu fermentacji. Po 20 godzinach bulion zebrano i przeniesiono do odpowiedniego zbiornika o pojemności 50 litrów.

Proces oczyszczania według pierwszego korzystnego wykonania niniejszego wynalazku

Wartość pH bulionu przygotowanego jak powyżej ustalono na poziomie 2,5 za pomocą 6N HCl, ciągle mieszając. Otrzymano w ten sposób bardzo lepki bulion o wyglądzie gęstej masy.

PL 200 677 B1

Wodny bulion przepompowano do zestawu do filtracji z przepływem krzyżowym, wyposażonego w 3 filtry o porach wielkości 0,2 μm, ułożone jeden na drugim. Używanym filtrem jest kaseta SARTOCON, Mod. nr 302 186 07 06 W-SG firmy SARTORIUS o wielkości porów 0,2 μ^ι.

Na początku wprowadzania wodnego bulionu do filtra zawór przesączu był zamknięty w celu recyrkulacji bulionu przez kilka minut, aż system stał się stabilny i w retentacie nie było pęcherzyków.

Zawór przesączu następnie otwarto i w celu utrzymania stałej objętości wodnego bulionu do zbiornika zawierającego wodny bulion dodawano w sposób ciągły sterylną wodę destylowaną nie zawierającą pirogenów, przy tej samej prędkości przepływu co spływający przesącz. Ciśnienie na wejściu utrzymywano na poziomie 1 do 3 barów, korzystnie 2 bary.

Diafiltrację zakończono, gdy absorbancja przesączu przy długości fali równej 280 nm wynosiła 0,012 gęstości optycznej. Przesącz potraktowano jako odpad.

Wartość pH diafiltrowanego bulionu ustalono na poziomie 4 za pomocą 5N NaOH, a następnie bulion odwirowano przy 9000 obrotów na minutę w temperaturze 15°C w schładzanej wirówce.

Wartość pH supernatantu znad osadu ustalono na poziomie 7,0 przy użyciu 5N NaOH i przefiltrowano roztwór przez filtr o wielkości porów 0,2 μm tak, by wysterylizować roztwór, zgodnie ze standardową metodą sterylizacji filtracyjnej.

Sterylny roztwór liofilizowano zgodnie ze standardowym procesem liofilizacji, w celu uzyskania suchego proszku hialuronianu sodu.

W tym przykładzie wydajność otrzymywania kwasu hialuronowego wynosiła około 85-87% w stosunku do zawartości kwasu hialuronowego w wyjściowym roztworze, a produkt miał następujące cechy:

- zawartość hialuronianu sodu 96,5%

- lepkość istotna (25°C) (odpowiada ciężarowi cząsteczkowemu 1,7 x 10⁶) 2100 ml/g

- zawartość wody 3,1%

- zawartość białek 0,08%

- zawartość kwasów nukleinowych 0,01%

- zawartość obojętnych cukrów 0,01%

Otrzymany w ten sposób wysokocząsteczkowy hialuronian sodu może być stosowany przy wytwarzaniu kompozycji farmaceutycznych.

Sposób oczyszczania według drugiego korzystnego wykonania niniejszego wynalazku

Ciągle mieszając, wartość pH 5 l przygotowanego jak powyżej wodnego bulionu, zawierającego wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy ze źródła mikrobiologicznego, ustalono na poziomie 3,5 przy użyciu 6N HCl i utrzymywano na tym poziomie podczas całego procesu diafiltracji z przepływem krzyżowym, mającej na celu usunięcie komórek.

Wodny bulion (5 litrów) przepompowano do zestawu do filtracji z przepływem krzyżowym, wyposażonego w 3 filtry o porach o wielkości 0,2 μm, ułożone jeden na drugim. Używanym filtrem jest kaseta SARTOCON, Mod. nr 302 186 07 04 0-SG wytworzona przez firmę SARTORIUS o wielkości porów 0,2 μτη.

Zawór przesączu następnie otwarto. W celu utrzymania stałej objętości wodnego bulionu do zbiornika zawierającego wodny bulion dodawano w sposób ciągły 10 równoważnych objętości sterylnej wody destylowanej nie zawierającej pirogenów, przy tej samej prędkości przepływu, co spływający przesącz. Ciśnienie na wejściu utrzymywano na poziomie 1 do 3 barów, korzystnie 2 bary.

Retentat odrzucono, a przesącz (50 litrów) zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy bez komórek poddawano dalszej obróbce.

Wartość pH tak otrzymanego roztworu diafiltrowanego (50 litrów) zawierającego kwas hialuronowy ustalono na poziomie 2,4, otrzymując w ten sposób bardzo lepki roztwór i utrzymywano pH na tym samym poziomie w czasie całego procesu diafiltracji z przepływem krzyżowym.

Wodny bulion (50 litrów) przepompowano do zestawu do filtracji z przepływem krzyżowym, wyposażonego w 3 filtry o porach wielkości 300000, ułożone jeden na drugim. Stosowanym filtrem jest kaseta SARTOCON, Mod. nr 302 146 790 07 7E-SG, wytworzona przez firmę SARTORIUS, o wielkości porów 300000.

PL 200 677 B1

Zawór przesączu następnie otwarto. Wodny bulion (42,5 litra) zatężono, aby zmniejszyć objętość do 7,5 litra. Przesącz odrzucono.

Następnie, w celu utrzymania stałej objętości wodnego bulionu, do zbiornika zawierającego wodny bulion dodawano w sposób ciągły 15 równoważnych objętości sterylnej wody destylowanej nie zawierającej pirogenów, przy tej samej prędkości przepływu, co spływający przesącz. Ciśnienie na wejściu utrzymywano na poziomie 1 do 3 barów, korzystnie 2 bary. Przesącz (116 litrów) odrzucono. Następnie zatrzymano dopływ wody, a wodny bulion zatężono.

Wartość pH zatężonego roztworu diafiltrowanego (4 litry) ustalono na poziomie 7,0 przy użyciu 5N NaOH i w celu sterylizacji roztworu przesączono go przez filtr statyczny o wielkości porów 0,2 μm, zgodnie ze standardową metodą sterylizacji filtracyjnej.

Sterylny roztwór liofilizowano zgodnie ze standardowym procesem liofilizacji w celu uzyskania suchego proszku hialuronianu sodu.

W tym przykładzie wydajność otrzymywania kwasu hialuronowego wynosiła około 83-85% w stosunku do zawartości kwasu hialuronowego w wyjściowym roztworze, a produkt miał następujące cechy:

- zawartość hialuronianu sodu 97,0%

- zawartość wody 2,9%

- zawartość białek 0,08%

- zawartość kwasów nukleinowych 0,01%

- zawartość obojętnych cukrów 0,01%

Claims

1. Sposób oczyszczania wysokocząsteczkowego kwasu hialuronowego, ewentualnie w postaci soli, o ciężarze cząsteczkowym nie mniejszym niż 0,5 x 10⁶, z wytworzeniem wysokocząsteczkowego kwasu hialuronowego lub jego soli o czystości farmaceutycznej, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) etap ustalenia wartości pH wodnego roztworu, zawierającego wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy ze źródła biologicznego o ciężarze cząsteczkowym nie mniejszym niż 0,5 x 10⁶, w zakresie od 1,7 do 3,3, a następnie diafiltrację roztworu przy tym samym pH przy użyciu filtra o wielkości porów w zakresie od nominalnego ciężaru cząsteczkowego wynoszącego 100000 do wielkości 0,45 μm;

c) etap sterylizacji.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór wodny zawierający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy ze źródła biologicznego, który najpierw poddaje się obróbce albo zgodnie z etapem a), albo zgodnie z etapem b) jest wodnym bulionem zawierającym wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy ze źródła mikrobiologicznego.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że źródłem mikrobiologicznym jest gatunek paciorkowca wytwarzający wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że gatunek paciorkowca wytwarzającego wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy wybiera się spośród Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus egui i Streptococcus pyogenes.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie a) wartość pH roztworu wodnego zawierającego wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy ustala się w zakresie od 2,0 do 2,7, a następnie roztwór diafiltruje się przy tym samym pH.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie a) wartość pH roztworu wodnego zawierającego wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy ustala się w zakresie od 2,3 do 2,7, a następnie roztwór diafiltruje się przy tym samym pH.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie a) wartość pH roztworu wodnego zawierającego wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy ustala się przy użyciu roztworu wodnego HCl.

PL 200 677 B1

8. Sposób wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e etap sterylizacji c) stanowi etap sterylizacji filtracyjnej.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po etapie sterylizacji c) następuje etap d) liofilizacji sterylizowanego roztworu w celu uzyskania suchego proszku kwasu hialuronowego lub jego soli.

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że roztwór sterylizowany jest zatężany przed etapem liofilizacji.

11. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, znamienny tym, że etap b) usuwania komórek przeprowadza się po diafiltracji w etapie a).

12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że w etapie a) wartość pH roztworu wodnego zawierającego wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy ustala się w zakresie od 2,5 do 2,6, a następnie roztwór diafiltruje się przy tym samym pH.

13. Sposób według zastrz. 11 albo 12, znamienny tym, że filtr używany w etapie diafiltracji a) ma rozmiar porów 0,2 μm.

14. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że w etapie a) roztwór kwasu hialuronowego diafiltruje się do momentu, gdy przesącz ma gęstość optyczną, przy długości fali 280 nm, równą lub mniejszą od 0,02.

15. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że etap b) usuwania komórek stanowi etap odwirowywania.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że etap odwirowywania obejmuje ustalenie wartości pH diafiltrowanego roztworu wodnego otrzymanego w etapie a) w zakresie od 3,5 do 5,0 i odwirowania diafiltrowanego roztworu wodnego z uzyskaniem supernatantu zawierającego kwas hialuronowy.

17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że wartość pH diafiltrowanego roztworu wodnego otrzymanego w etapie a) ustala się na poziomie 4,0.

18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że wartość pH ustala się przy użyciu wodnego roztworu NaOH.

19. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że etap sterylizacji c) jest etapem sterylizacji filtracyjnej, obejmującym ustalenie wartości pH supernatantu, uzyskanego w etapie odwirowania b), na poziomie 7 i przefiltrowanie supernatantu przez filtr o wielkości porów 0,2 μm.

20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że wartość pH ustala się przy użyciu roztworu NaOH.

21. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, znamienny tym, że etap b) usuwania komórek przeprowadza się przed etapem a).

22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że etap b) usuwania komórek jest etapem usuwania komórek przez diafiltrację.

23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że etap diafiltracyjnego usuwania komórek b) obejmuje ustalenie wartości pH roztworu wodnego zawierającego wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy ze źródła biologicznego na poziomie 3,5, a następnie diafiltrację roztworu przy tym samym pH, za pomocą filtra o wielkości porów 0,2 μm.

24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że pH ustala się przy użyciu roztworu wodnego HCl.

25. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że filtr używany w etapie diafiltracji a) ma wielkość porów równą nominalnemu ciężarowi cząsteczkowemu 300000.

26. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że w etapie a) wartość pH roztworu wodnego zawierającego wysokocząsteczkowy kwas hialuronowy ustala się na poziomie 2,4, a następnie roztwór diafiltruje się przy tym samym pH.

27. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że etap sterylizacji c) stanowi etap sterylizacji filtracyjnej, obejmujący ustalenie wartości pH wodnego roztworu uzyskanego w etapie diafiltracji a) na poziomie 7 i przefiltrowanie wodnego roztworu przez filtr o wielkości porów 0,2 μ^ι.

28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że wartość pH ustala się przy użyciu wodnego roztworu NaOH.