CZ293433B6 - Lyofilizované thioxantenonové protinádorové látky - Google Patents

Abstract

Jsou předkládány rekonstituované lyofilizované preparáty pro léčbu savčích nádorů. Tyto preparáty zahrnují thioxantenonové protinádorové látky v laktátovém pufru v kombinaci s manitolem nebo sacharózou jako stabilizačními látkami.ŕ

Description

Lyofilizované thioxantenonové protinádorové látky

Oblast techniky

Tento vynález se vztahuje k lyofilizovaným vodným parenterálním roztokům protinádorových látek. Konkrétněji se tento vynález vztahuje k lyofilizovaným thioxantenonovým protinádorovým látkám.

Dosavadní stav techniky

Mnoho konvenčních lékových substancí a bílkovin určených k terapeutickému nebo diagnostickému použití je ve vodném prostředí nestabilní a vyžaduje konverzi na pevné produkty. Pro farmaceutické výrobky přestavuje lyofilizace jednu z nejčastěji používaných metod zpracování k dosažení nezbytné stability.

Bioaktivní látky jsou z rozličných důvodů jen zřídka lyofilizovány v čisté formě. Obvykle jsou k nim ze specifických důvodů přidávány další chemické složky jako například pufrující látky, látky zvyšující rozpustnost či udržující osmolaritu. Navrhujeme-li lyofilizaci, řídí aktivní látka jako celek parametry lyofilizačního cyklu. Z tohoto důvodu každá změna v preparátu, a tedy ne pouze změna koncentrace aktivní látky, vyžaduje další modifikaci lyofilizace. Právě tak jako jsou z výše uvedených důvodů přidávány k aktivní látce vehikula, vyžaduje i lyofilizace přidání dalších aditiv pomáhajících vlastnímu procesu lyofilizace, nebo zajišťující mechanickou sílu v lyofilizátu během následného skladování a transportu. Tato vehikula jsou označována jako lyoprotektanty nebo stabilizéry. Použití těchto stabilizérů je ilustrováno v následujících referencích.

Mezinárodní přihláška WO 90/03 784 popisuje složení lyofílizátu, které zahrnuje polypeptid a stabilizační/solubilizační množství cyklodextrinu vybraného ze skupiny skládající se zhydroxypropyl, hydroxyetyl, glukosyl, maltosyl a maltotriosyl derivátů β- a γ-cyklodextrinů.

Americký patent US 4 983 586 představuje metodu snižující výskyt precipitace lipofilních a/nebo ve vodě labilních látek, která se objevuje v místě injekce při parenterálním podání. Tato metoda spočívá v převedení léku do vodného prostředí obsahující okolo 20 % až 50 % hydroxypropyl-βcyklodextrinu. Je předkládaná celá řada léku včetně antineoplastických léků, sedativ, uklidňujících léků, antikonvulzantů, antidepresiv, hypnotik, svalových relaxans, antisposmodik, léků protizánětlivých, antikoagulans, kardiotonik, vazodilatátorů a antiarytmik.

Americký patent US 5298 410 představuje lyofilizované formy biologicky aktivních látek, v kterých je jako stabilizační látka zastoupena derivát cyklodextrinu, jako pufru fosfát sodný, octan sodný a uhličitan sodný. Tyto lyofilizáty mohou také obsahovat sacharózu nebo threalózu.

Výchozí materiál pro lyofilizaci je obvykle nenasycený vodný roztok a finálním produktem je pevná látky. Celý proces spočívá v odstranění více než 99 % vody. Během ochlazení se vodný roztok koncentruje a voda je odstraněna ve formě ledu. Celý proces zahrnuje několik fázových přeměn, např. fází tekuté-pevné a pevné-plynné fáze, jejichž znalost je důležitá pro účinné zpracování a stabilitu produktů. Snížením teploty je roztok nejprve podchlazen (tj. ochlazen pod teplotu mrazu), než začne spontánní nukleace ledu. Nukleace ledu a růst krystalů přestavují komplex procesů, které závisí na stupni ochlazení, na roztoku, koncentraci a dalších faktorech. Tato fáze lyofilizace určuje z velké části strukturufinálního lyofílizovaného produktu. Během zamrazení zůstává zakoncentrovaný solut v reziduální kapalné fázi, přičemž stupeň koncentrace je řízen podle diagramu rovnováhy fází. Nakonec se roztok stává nasyceným, v tomto okamžiku se začíná tvořit z látky rozpuštěné v roztoku pevná fáze. Celý systém pak sestává ze směsi ledu a krystalů solutů.

-1 CZ 293433 B6

Vehikula přidaná primárně k usnadnění lyofilizace mají obvykle jednu nebo dvě funkce. Látky zvyšující hmotný objem jsou používány jednoduše ke zvýšení celkového obsahu pevné látky, aby se získal mechanicky odolnější lyofilizát. Taková vehikula musí během lyofilizace z roztoku krystalovat, nejlépe během zahrazovací fáze, protože pouze v oddělené fázi mají neutrální účinek na stabilitu produktu. Na druhé straně stabilizační látky dovolují chemickou protekci během mrazové koncentrace a pomáhají tvorbě sklovatění; dále také zajišťují fyzikální sílu v lyofilizátu. Teplota skelné přeměny je funkcí chemického složení celkového pevného materiálu.

Zatímco fyzikálně chemický princip pro správnou tvorbu lyofilizačních produktů byl dostatečně popsán v předchozích pracích (viz například Franks, F. Freeze-drying: a combination of physics, chemistry, engineering and aconomics, Jap. J. Freeze Drying, 38, 5-16, 1992), je tento fyzikálně chemický princip nedostatečný k tomu, aby umožnil zkušenému pracovníkovi vyrobit konečné produkty, které by uspokojily požadované nároky. Usilovný výzkum a/nebo překvapující objev jsou stále základem, z kterého vychází přípravy vlastních produktů, jak bude dále uvedeno v předkládaném vynálezu.

Tímto usilovným výzkumem bylo nyní objeveno, že jsou-li thioxantenonové protinádorové sloučeniny v obvyklých farmaceutických formách jakými jsou tablety a kapsle k perorálnímu podání, neuspokojují zcela požadavky kladené na účinný produkt; mohou však být převedeny na lyofilizované formy, které jsou po rekonstituci vhodné k injekčnímu podání. Tyto lyofilizované formy byly stabilní bez jakékoli degradace či alterace v průběhu prodlouženého skladování.

Podstata vynálezu

Ve shodě s předkládaným vynálezem jsou zde představovány rekonstituované lyofilizované formy určené k léčbě savčích nádorů a obsahující:

a) od zhruba 1 do 50 mg/ml, nejlépe od zhruba 10 do 20 mg/ml, thioxantenonové protinádorové látky definované viz níže;

b) od zhruba 10 do 125 mg/ml, nejlépe od zhruba 30 do 100 mg/ml, stabilizační látky vybrané ze skupiny skládající se z manitolu a sacharózy; a

c) od zhruba 0,025 do 0,25 M laktátového pufru, nejlépe sondolaktátového pufru, o pH od 3,0 do 4,5.

Preferované formy předkládaného vynálezu obsahují protinádorovou látku N-[[l-[[2-(di-metylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]methyl]-metansulfonamid a sacharózu jako stabilizující látku.

Rekonstituované lyofilizované formy předkládaného vynálezu jsou podávány savcům pro léčbu nádorů.

Detailní popis vynálezu

Lyofilizované formy předkládaného vynálezu zahrnují: thioxantenonovou protinádorovou látku a vodné vehikulum.

Protinádorové látky

Protinádorové látky předkládaného vynálezu mají vzorec I podle patentu US 5 346 917. Tento vzorec je zde uveden jako reference v celé své podobě:

-2CZ 293433 B6

R¹ a R² jsou nezávisle nižší alkyly;

Q je reziduum vybrané ze skupiny skládající se zCH₂NHR³, CH2N(R⁴)SO2R⁷, CH2NHCHO, CH=N-Ar, C(O)NR⁵R⁶, CH2N(R⁴)C(O)R⁷, CH2N(C2H5)CHO, CH2N(R⁴)P(Ó)(O-nižší alkyl)2, CH₂N=CH-N(R⁹)(R¹⁰), CH2N(R⁴)C(O)CF3 a CH₂N(R⁴)C(O)OR⁷;

R³ je vodík nebo nižší alkyl;

R⁴ je vodík, nižší alkyl, nebo Ar;

R⁵ je vodík, nižší alkyl, nebo Ar;

R⁶ je vodík nebo nižší alkyl;

R⁷ je nižší alkyl nebo Ar;

R⁸ je vodík, nižší alkyl, nižší alkoxyl nebo hydroxyl;

Ar je fenyl nebo fenyl substituovaný metylem, metoxylem, hydroxylem, halogenem nebo nitro skupinou s výhradou, že když n je 2, R¹ a R² jsou etyl, R⁸ je vodík a Q je CH₂NHSO₂Ar, Ar skupina nemůže být 4-monosubstituována metylem nebo halogenem; a

R⁹ a R¹⁰ jsou nezávisle nižší alkyly;

nebo farmaceuticky přijatelná sůl kyselé adice nebo její solvát. Sloučeniny jsou užitečné v léčbě nádorů u savců.

Preferované protinádorové látky jsou reprezentovány vzorcem II:

kde n je 2 nebo 3;

R¹ a R² jsou nezávisle nižší alkyly;

Q je reziduum vybrané ze skupiny skládající se z CH₂NHR³, CH2N(R⁴)SO2R⁷, CH2NHCHO, CH=N-Ar, C(O)NR⁵R⁶, CH2N(R⁴)C(O)R⁷, CH2N(C2Hs)CHO, CH2N(R⁴)P(O)(O-nižší alkyl)2, CH₂N=CH-N(R⁹)(R¹⁰), CH2N(R⁴)C(O)CF3 a CH₂N(R⁴)C(O)OR⁷;

R³ je vodík nebo nižší alkyl;

R⁴ je vodík, nižší alkyl, nebo Ar;

R⁵ je vodík, nižší alkyl, nebo Ar;

R⁶ je vodík nebo nižší alkyl;

R⁷ je nižší alkyl nebo Ar;

R⁸ je vodík, nižší alkyl, nižší alkoxyl nebo hydroxyl;

Ar je fenyl nebo fenyl substituovaný metylem, metoxylem, hydroxylem, halogenem nebo nitro skupinou, a

R⁹ a R¹⁰ jsou nezávisle nižší alkyly;

nebo farmaceuticky přijatelná sůl kyselé adice nebo jejich solvát.

Representativní sloučeniny jsou předvedeny v následujících příkladech:

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-4-(N-fenylformimidoyl)thioxanten-9-on (I: R’=R²=Et; Q=CH=N-C₆H₅; R⁸H; n=2)

Směs 17,7 g (50 mmol) l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-9-oxo-thioxanten-4-karboxyldehydu a 15,1 g (150 mmol) anilinu v 100 ml toluenu bylo zahříváno pod zpětným chlazením po dobu 8 hodin pomocí Dean-Starkova lapače. TLC na hliníkových deskách s mobilní fází chloroform/hexan/izopropylamin 10:10:2 indikovalo neúplnou reakci. Toluen byl oddestilován, bylo přidáno 25 ml anilinu a směs byla zahřívána pod zpětným chlazením po dobu 4 hodin. Dále bylo přidáno 50 ml xylenu a reakční směs byla opět zahřívána pod zpětným chlazením po dobu 3 hodin. Rozpouštědlo a přebytek anilinu byly odstraněny ve vakuu a reziduum bylo rekrystalováno z benzenu s výtěžkem 19,9 g surového produktu. Ten byl dále rekiystalizován z přibližně 1,5 1 hexanu s výtěžkem 15,8 g (86 %) produktu teplota tání 125 až 126 °C.

Příklad 2

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]formamid (I: R=R²=Et; Q=CH₂NHCHO; R⁸=H; n=2)

Roztok 35,4 g (0,1 mol) l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-9-oxo-thioxanten-4-karboxyaldehydu, 420 ml formamidu a 50 ml (1 mol) kyseliny mravenčí bylo zahříváno při teplotě 160 °C po dobu 1 hodiny. Reakční směs byla ochlazena, nalita do 2 1 vody a pH bylo zvýšeno pomocí 50 ml 35% roztoku hydroxidu sodného. Lepkavý precipitát byl zfíltrován a vysušen ve vakuu. Vysušený precipitát byl rozpuštěn ve vztahu 1,5 1 horkého etylacetátu, podroben reakci s aktivním uhlí a krystalizován ochlazením. Produkt byl zfíltrován, promyt etyl acetátem a vysušen, čímž bylo získáno 29,0 g (75 %) produktu, teplota tání 154 až 155 °C.

Příklad 3

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]-N-metylformamid (IV: R_R²=Et; R⁴=Me; R⁸=H; n=2)

-4CZ 293433 B6

Analogickým postupem popsaným v příkladu 2 bylo připraveno 24,6 g N-metylformamidu z 35,4 g (0,1 mol) l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-9-oxo-thioxanten-4-karboxyaldehydu, 394 g N-metylformamidu a 50 ml (1 mol) kyseliny mravenčí. Produkt byl rekrystalizován ze 150 ml acetonu, teplota tání 127 až 130 °C.

Příklad 4

Roztok 24,4 g (64 mmol) formamidu z příkladu 2 ve 240 ml 2N kyseliny chlorovodíkové byl zahříván v parní lázni po dobu 1 hodiny. Reakce byla ochlazena na teplotu místnosti, pH bylo zvýšeno 35% vodným hydroxidem sodným a výsledný žlutý precipitát byl sbírán filtrací. Produkt byl rozpuštěn v benzenu, podroben reakci s aktivním uhlím, vysušen síranem hořečnatým, filtrován a azeotropován k odstranění zbytků vody. Vysušené reziduum bylo krystalizováno z metanolu a izopropanolu přidáním éterického hydrogen chloridu. Výsledná pevná látka byla několikrát rekrystalizována z metanolu, čímž se dosáhlo výtěžku 10,6 g produktu, teplota tání 270 až 272 °C, ve formě dihydrochloridové soli.

Příklad 5 l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-4-[(metylamino)-metyl]thioxanten-9-on (I: R¹⁼R²=Et; Q=CH₂NHCH₃; R⁸=H; n=2)

Postupem naprosto analogickým tomu, který je popsán v Příkladu 4 bylo získáno 10,5 g metylaminu ve formě dihydrochlorid hemihydrátu z 14,6 g (37 mmol) N-metylformamidu z Příkladu 3 a ze 150 ml 2N chlorovodíkové kyseliny. Produkt se tavil při 241 až 243 °C.

Příklad 6

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]metansulfonamid (I: R'=R²=Et; Q=CH₂NHSO₂CH₃; R⁸=H; n=2)

Roztok 10,65 g (30 mmol) volné báze aminu z Příkladu 4 ve 100 ml pyridinu byl ochlazen v ledové lázni a k roztoku byly přidány v jedné dávce 4g (35 mmol) metansulfonylchloridu. Směs byla míchána po dobu 2 hodin při teplotě místnosti a nalita do 750 ml vody obsahující 2 g hydroxidu sodného. Tmavě žlutý precipitát byl sesbírán, promyt vodou a sušen přes noc ve vakuu. Výsledná pevná látka byla získána přidáním nadbytku hydroxidu sodného k filtrátu a jeho následným zfiltrováním. Smíšené precipitáty byl po vysušení rekrystalizovány z benzenu, čímž se dosáhlo výtěžku 6,4 g metansulfonamidu, teplota tání 169 až 170 °C.

Příklad 7 l-[[2'-(Dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-karboxamid (I: R‘=R²=Et; Q=CONH₂; R⁸=H; n=2)

Suspenze 74 g (0,23 molu) l-[[2'-(dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-karboxaldehydu a 74 g (1,06 molu) hydroxylamin hydrochloridu ve 400 ml pyridinu a 400 ml etanolu bylo zahříváno pod zpětným chlazením pod obu 0,5 hodiny a dále bylo přidáno 70 ml vody, aby se získal homogenní roztok. Roztok byl zahříván další 2 hodiny a ponechán při teplotě místnosti po

-5CZ 293433 B6 dobu 14 hodin k usazení. Výsledný krystalický oxim byl zfiltrován, čímž se získal kvantitativní výtěžek, teplota tání 215 až 218 °C.

123 g oximu bylo krátce zahříváno v parní lázni 180 ml kyselého anhydridu tak, aby se vytvořil roztok. Roztok byl ochlazen, bylo k němu přidáno 100 ml 1,8 M HCI v éteru a výsledná suspenze byla naředěna 50 ml éteru. Suspenze sedimentovala po dobu 14 hodin při teplotě 0 °C a byla zfiltrována. Reziduum (123 g, teplota tání 109 až 112°C) bylo rozpuštěno v 250 ml xylenu a zahříváno při zpětném chlazení po dobu 20 minut. Směs byla ochlazena a 71,3 g nitrilu bylo zfíltrováno, teplota tání 265 °C.

gramů nitrilu bylo promícháváno ve 200 ml koncentrované kyseliny sírové, při teplotě místnosti a po dobu 3 dnů. Reakce byla neutralizována koncentrovaným hydroxidem amonným a reziduum bylo zfíltrováno. Reziduum bylo naštěpeno v teplém EtOA/EtOH, zfíltrováno a produkt byl krystalizován z ledového roztoku, teplota tání 241 až 243 °C. Tento produkt byl dále rozpuštěn v etanolu a poté byl přidán jeden ekvivalent HCI v etanolu. Bylo získáno 6 gramů amid hydrochloridu, teplota tání 271 až 272 °C.

Příklad 8

N-[[l-[2-(Dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-yl]metly]N-metylmetansulfonamid (I: R’=R²=Et; Q=CH₂N(CH₃)SO₂CH₃; R⁸=H; n=2)

Roztok 1,5 g (3,5 mmol) metansulfonamidu získaného v Příkladu 6, v THF (60 ml), bylo ochlazeno v ledové lázni na 0 °C a dále bylo přidáno 0,16 g NaH (4,0 mmol). Reakční směs byla zahřáta na teplotu místnosti, míchána po dobu 10 minut a poté bylo přidáno 0,25 ml metyl jodidu (4,0 mmol). Reakční směs byla promíchávána při teplotě místnosti po dobu 24 hodin a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Reziduum bylo purifíkováno sloupcovou chromatografií na silice eluované chloroformem (100%) a poté 1% izopropylamin/chloroformem, čímž se získalo 1,15 g (74 %) N-metylmetansulfonamidu ve formě žlutého prášku, teplota tání 175 až 177 °C. Volná báze byla podrobena reakci s metansulfonovou kyselinou v metanolu, čímž se získala metansulfonová sůl, s teplotou tání 194 až 195,5 °C (označeno dále jako Příklad 8a).

Příklad 9

N-[[l-[[2-(Dietylamino)ethyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]fenylsulfonamid (I: R=R²=Et; Q=CH₂NHSO₂CH₃Ph; R⁸=H; n=2)

Postupem podobným tomu, který je popsán v Příkladu 6, bylo z 2,54 g (7,15 mmol) volné báze aminu z Příkladu 4, z pyridinu (50 ml) a benzensulfonylchloridu (1,1 ml, 8,62 mmol) v následné reakci s metansulfonovou kyselinou v metanolu získáno 2,4 g (57 %) fenylsulfonamidu ve formě soli metansulfonové kyseliny. Produkt byl rekrystalizován z etanolu.

Příklad 10

N-[[l-[[2-(Dietylamino)ety!]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]acetamid (I: R'=R²=Et; Q=CH₂NHC(O)CH₃; R⁸=H; n=2)

Postupem podobným tomu, který je popsán v Příkladu 6, bylo z 4,15 g (11,7 mmol) volné báze aminu z Příkladu 4, z pyridinu (60 ml) a acetyl chloridu (0,82 ml, 11,53 mmol) získáno 2,3 g (52 %) acetamidu ve formě oranžové pevné látky. Produkt byl rekrystalizován z acetonu a roztaven při 182 až 183 °C.

-6CZ 293433 B6

Příklad 11

N~[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]benzamid (I: R*=R²=Et; Q=CH₂NHC(O)Ph; R⁸=H; n=2)

Postupem podobným tomu, který je popsán v Příkladu 6, by lo z 1,17 g (3,29 mmol) volné báze aminu z Příkladu 4, z pyridinu (25 ml) a benzoyl chloridu (0,42 ml, 3,62 mmol) získáno 1,02 g (68%) benzamidu ve formě žlutého prášku. Produkt byl purifikován sloupcovou chromatografií na silice eluované chloroformem (100%) až 1% izopropylamin/chloroformem, s následnou rekrystalizací z etylacetátu. Produkt byl roztaven při 161 až 163 °C.

Příklad 12

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]-dietyl fosforamid (I: R'=R²=Et; Q=CH₂NHP(O)(OEt)₂; R⁸=H; n=2)

Roztok 2,28 g (6,41 mmol) volné báze aminu z Příkladu 4, CH₂C1₂ (50 ml) a trietylaminu (2 ml) bylo podrobeno reakci sdietyl fosforchloridátem (1,0 ml, 6.9 mmol) při teplotě 0 °C. Reakční směs byla promíchávána při teplotě 0 °C po dobu 2 hodin a poté při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a reziduum bylo purifikováno sloupcovou chromatografií na silice eluované etylacetátem (100%), poté 5% metanol/etylacetátem a konečně metanol/izopropylamin/etylacetátem (5/5/90). To umožnilo získat po rekrystalizací z etylacetátu 2,28 g (72 %) dietyl fosforamidu ve formě žluté pevné látky, teplota ^fání 108 až 110 °C.

Příklad 13

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]-N-etylformamid (IV: R'=R²=Et; R⁴=Et; R⁸=H; n=2)

Roztok 2,0 g (5,6 mmol) N-etylformamidu l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]“9-oxothioxanten-4karboxaldelydu (24,0 ml) a kyseliny mravenčí (3,0 ml, 79,5 mmol) bylo zahříváno při teplotě 170 °C po dobu 4 hodin. Reakční směs byla ochlazena, nalita do vody a bázické prostředí bylo vytvořeno 10% hydroxidem sodným. Byla získána pevná látka, která byla sbírána filtrací a promyta vodou. Pevné reziduum bylo sbíráno ve směsi chloroform/voda a organická vrstva byla separována a sušena síranem sodným. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a purifikováno radiální chromatografií eluovanou směsí izopropylamin/metanol/etylacetát (0,5/1/98,5), čímž se získalo 1,32 g (57 %) N-etylformamidu ve formě oranžové pevné látky, teplota tání 75 až 77 °C.

Příklad 14 l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]^1-[(etylamino)-metyl]thioxaten-9-on (I: R*=R²=Et; Q=CH₂NHCH₂H₅; R⁸=H; n=2)

Postupem podobným tomu, který je popsán v Příkladu 4, bylo z 1,3 g (3,2 mmol) N-etylformamidu z Příkladu 13 a z 10,8 ml 2N kyseliny chlorovodíkové získáno 1,29 g (92%) etylaminu ve formě dihydrochloridu. Produkt byl rekrystalizován z etanol/tetrahydrofuranu a taven při 160 °C (dec.).

Příklad 15 l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-4-(dimetylaminometyl-aminometyl)-thioxanten-9-on trihydrochlorid (I: R*=R²=Et; Q=CH₂N=CHN(Me)₂; R⁸=H; n=2)

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]formamid (3 g) byl naředěn 50 ml 2N HC1 a roztok byl zahříván v parní lázni po dobu 90 minut. Směs byla ochlazena, pH bylo zvýšeno na hodnotu 10 pomocí 35% roztoku hydroxidu sodného a extrahována do chloroformu. Organická vrstva byla separována, filtrována přes K₂CO₃ a koncentrována ve vakuu. Výsledný surový produkt byl podroben reakci s dimetylformamid dimetylacetalem přes noc a při teplotě 60 °C. Nadbytek DMF-dimetylacetalu byl odstraněn ve vakuu a požadovaná sloučenina uvedená v titulku byla purifikována bleskovou chromatografií (silika gel; chloroform/iPrNH₂/MeOH (98:1:1). Tento produkt byl rozpuštěn v 2,5 M HCl/EtOh (100 ml), ochlazen v ledové lázni, filtrován a vysušen, čímž došlo k získání l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-4(dimethylaminomethylaminometyl)-thioxanten-9-on trihydrochloridu ve formě oranžové pevné látky, teplota tání 258 až 260 °C.

Příklad 16

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]trifluoroacetamid (I: R’=R²=Et; Q=CH₂NHC(O)CF₃; R⁸=H; n=2)

Roztok 4-(aminometyl)-l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]thioxanten-9-onu (2,91 g, 8,19 mmol) v 80 ml metylen chloridu bylo podrobeno reakci s trifluoracetylchloridem (14,75 ml, 0,61 M roztok v toluenu) při teplotě 0 °C a reakční směs byla promíchávána při teplotě 0 °C po dobu 90 minut. Směs byla zakoncentrována ve vakuu a reziduum bylo purifikováno bleskovou chromatografií (silika gel; EtOAc (100%), poté 2% izopropyl/EtOAc) a dále rekrystalizováno z etylacetátu, čímž bylo získáno 2,52 g (68%) produktu ve formě volné báze, teplota tání 189 až 190 °C (Příklad 16). Volná báze byla rozpuštěna v metanolu a podrobena reakci smetansulfonovou kyselinou (0,55 g, 5,72 mmol), čímž byla získána po rekrystalizaci z acetonu metansulfonová sůl, teplota tání 152 až 154 °C (Příklad 16a).

Příklad 17

a)

Směs kyseliny thiosolicyklové (50,14 g, 0,33 mol) a octanu měďnatého (5,0 g) v DMSO (500 ml) byla zahřívána pod zpětným chlazením a po porcích byl přidáván uhličitan draselný (54,3 g). Jehlou byl přidán 3-bromochlorobenzen (42 ml, 0,36 mol) a směs byla zahřívána pod zpětným chlazením po dobu 3 hodin. Reakční směs byla nalita do vody, podrobena reakci s aktivním uhlím a filtrována přes celit. Filtrát byl acidifikován pomocí koncentrované kyseliny chlorovodíkové a vytvořený precipitát byl sbírán filtrací, promyt vodou a sušen ve vakuu při teplotě 60 °C, čímž bylo získáno 75,01 g (85 %) 2-[(3-chlorofenyl)thio]benzoové kyseliny.

b)

K roztoku koncentrované kyseliny sírové byla přidána po porcích v období 1 hodiny a za teploty 0 °C 2-[(3-chlorofenyl)thio] benzoová kyselina (75,00 g, 0,28 mol). Směs byla promíchávána po dobu 2 hodin, nalita do koncentrovaného hydroxidu amonného (500 ml) ve vodě (2,5 1) a vytvořený precipitát byl sbírán filtrací, promyt vodou a sušen ve vakuu při teplotě 60 °C, čímž bylo získáno 65,9 g (95%) směsi 1-chloro a 3-chlorothioxanten-9-onu.

-8CZ 293433 B6

C)

Směs 1-chloro a 3-chlorothioxanten-9-onu (14,01 g, 56,8 mmol), pyridinu (20 ml) adietylaminopropylaminu (5,13 g, 39,4 mmol) byla zahřívána pod zpětným chlazením dokud reakce neproběhla. Zahřívání bylo zastaveno, rozpouštědlo odstraněno ve vakuu a reziduum bylo vytřepáno do chloroformu a purifikováno sloupcovou chromatografii na silice eluované chloroformem k odstranění nezreagovaného 3-chloroizomeru a dále eluované izopropylamino/chloroformem, čímž bylo získáno 5,10 g (54 %) l-[[3-(dietylamino)propyl]amino]-thioxanten-9-onu ve formě oranžové pryskyřice.

d)

Směs l-[[3-(dietylamino)propyl]amino]-thióxanten-9-onu (5,10 g, 15,0 mmol), formalinu (160 ml) a 5N kyseliny octové (0,8 ml) byla zahřívána při teplot 90 °C po dobu 16 hodin. Dodatečně bylo přidáno 0,20 ml 5N kyseliny octové, následované přidáním formalinu (50 ml) a směs byla zahřívána při teplotě 90 °C po dobu přibližně 57 hodin. Směs byla naředěna vodou, pH zvýšeno pomocí 5N NaOH a extrahována chloroformem. Organická vrstva byla vysušena pomocí síranu sodného a chromatografována na sloupci silica gelu eluovaného 2% směsí metanol/chloroform a poté izopropylamin/metanol/chloroform (2/2/96), čímž došlo k získání l-[[3-(dietylamino)propyl]amino]-4—hydroxymetyl)thioxanten-9-onu ve formě oranžovohnědé pryskyřice.

e) l-[[3-(Dietylamino)propyl]amino]-9-oxithioxanten-4-karboxaldehyd (II: R*=R²=Et; R⁸=H; n=3)

Směs l-[[3-(Dietylamino)propyl]amino]-4-(hydroxymetyl)-thioxanten-9-onu (3,82 g), toluenu (60 ml) a oxidu hořečnatého (7,5 g) bylo zahříváno pod zpětným chlazením po dobu 6,5 hodin. Směs byla chlazena na teplotu místnosti, filtrována přes celit a filtrát byl zakoncentrován ve vakuu, čímž došlo k získání 3,3 g (87 %) l-[[3-(Dietylamino)propyl]amino]-9-oxothioxanten4-karboxaldehydu ve formě hnědého oleje.

f) l-[[3-(Dietylamino)propyl]amino]-4-(metylaminomethyl)thioxanten-9-on dihydrochlorid. 3/2 hydrát (I: R'=R²=Et; Q=CH₂NHMe; R⁸=H; n=3)

Roztok l-[[3-(dietylamino)propyl]amino]-9-oxothioxanten^4-karboxaldehydu (3,3 g, 8,96 mmol) a 3 g kyseliny mravenčí v 50 ml N-metylformamidu byl zahříván pod zpětným chlazením po dobu 2 hodin. pH směsi bylo zvýšeno pomocí 5 ml 5N roztoku hydroxidu sodného a směs byla extrahována do chloroformu (3x150 ml). Organická vrstva byla vysušena sulfátem sodným, koncentrována ve vakuu a surový olej byl rozpuštěn v 3N roztoku vodné HC1 (50 ml a zahříván v parní lázni po dobu 3 hodin. Výše zmíněná směs byla ochlazena, její pH bylo zvýšeno pomocí 30 ml 35% NaOH a poté byla extrahována do chloroformu (3x150 ml). Organická vrstva byl vysušena sulfátem sodným a zakoncentrována ve vakuu, čímž byl získán hnědý olej, tento olej byl purifikován bleskovou chromatografii (silica gel; 5% trietylamin/Et₂O, poté 5% Et₃N/EtOAc a poté trietylamin/metanol/EtOAc (5:5:90)), čímž bylo získáno 1,1 g l-[[3-(dietylamino)propyl]amino]-4-(metylaminometyl)thioxanten-9-onu ve formě čisté oranžové pryskyřice. Tato pryskyřice byla přeměněna na korespondující dihydrochlorid . 3/2 hydrát ve formě žlutého prášku, teplota tání 222 až 224 °C.

-9CZ 293433 B6

Příklad 18

a)

4-(Aminometyl)-l-[[2-(dimetylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-9-on dihydrochlorid . 1/2 hydrát (I: R'=R²=Me; Q=CH₂NH₂; R⁸=H; n=2)

Směs N-[[l-[[2-(dimetylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]formamidu (6,2 g) a 2N HC1 (52 ml) byla zahřívána na teplotu 100 °C po dobu 1,5 až 2 hodin. Reakční směs byla nalita do ledové vody, její pH bylo zvýšeno pomocí 35% NaOH a směs byla extrahována chloroformem. Organická vrstva byla promyta (2x) vodou, poté solným roztokem (lx), vysušena síranem sodným a zakoncentrována ve vakuu. Reziduum bylo purifíkováno sloupcovou chromatografií na silice eluované etylacetátem, poté 0,5% trietylamin/EtOAc, poté 2% trietylamin/EtOAc, poté CHCl₃/l-2% izopropylamin a konečně CHCl₃/l-2% izopropylamin/2% MeOH, čímž bylo získáno 3,3 g (58%) produktu ve formě volné báze. Část volné báze (1,25 g) byla rozpuštěna v metanolu a podrobena reakci s koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou (3,3 ml) v MeOH (6 ml), čímž byl získán produkt ve formě dihydrochloridu . 1/2 hydrát, teplota tání 213 °C (dec.).

b)

N-[[l-[[2-(Dimetylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]metansulfonamid metansulfonát (I: R'=R²=Et; Q=CH,NHSO₂Me; R⁸=H; n=2)

4-(Aminometyl)-l-[[2-(dimetylamino)etyl]amino]-thioxanten-9-on (2g, 6 mmol) v 30 ml suchého pyridinu pod dusíkem bylo promícháváno při teplotě místnosti až do dokončení tvorby roztoku. Roztok byl ochlazen v ledové lázni a dále bylo po kapkách přidáno 0,52 ml (6,7 mmol) metansulfonyl chloridu v ledovém pyridinu a směs byla míchána po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Reakční směs byla nalita do 500 ml vody obsahující 0,51 g hydroxidu sodného, extrahována do chloroformu, organická vrstva byla promyta vodou (2x) a solným roztokem a vysušena bezvodým síranem sodným. Dále byla směs zfiltrována a zakoncentrována ve vakuu. Reziduum (2,5 g) bylo promícháváno v éteru, filtrováno a vysušeno, čímž se získaly 2 g N-[[l-[[2-(dimetylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metly]metansulfonamidu, teplota tání 126 až 127 °C. Volná báze byla rozpuštěna v metanolu a podrobena reakci smetansulfonovou kyselinou (0,48 g), což vedlo k získání 2,0 g (67 %) produktu ve formě metansulfonátové soli, teplota tání 168 °C (dec.).

c)

Směs l-[[2-(dimetylamino)etyl]amino]-4-(hydroxymetyl)-thioxanten-9-onu (9,2 g, 0,028 mol) v toluenu (322 ml) bylo zahříváno na teplotu okolo 60 °C, poté byl přidán oxid manganičitý (MnO₂, 16 g) a směs byla zahřívána při teplotě 60 °C po dobu 1 hodiny. Dále byla směs zfiltrována a filtrát zakoncentrován ve vakuu, což umožnilo získat 7,9 g (87 %) l-[[2-(dimetylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-karboxaldehydu (Vzorec II: R*=R²=Me; R⁸=H; n=2).

d)

N-[[l-[[2-(Dimetylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]formamid (I: R'=R²=Me; Q=CH₂NHCHO; R⁸=H; n=2)

Směs l-[[2—(dimetylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-karboxaldehydu (4,75 g, formamidu (66,5 ml) a kyseliny mravenčí (7,6 ml) byla zahřívána při teplotě 170 °C po dobu 4 hodin. Směs byla nalita do ledové vody (250 ml), její pH bylo zvýšeno pomocí 35% NaOH a směs byla

-10CZ 293433 B6 extrahována chloroformem. Organická vrstva byla promyta vodou (2x), poté solným roztokem (lx) a rozpouštědlo byla vysušeno pomocí síranu sodného a zakoncentrováno ve vakuu, což umožnilo získat 6,3 g N-[[l-[[2-(dimetylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]formamidu.

e)

4-(Aminometyl)-l-[[2-(dimetylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-9-on dihydrochlorid . 1/2 hydrát (I: R¹⁼R²=Me; Q=CH₂NH₂; R^S=H; n=2)

Směs N-[[l-[[2-(dimetylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]formamid (6,2 g) a 2N HCI (52 ml) bylo zahříváno na teplotu 100 °C po dobu 1,5 až 2 hodin. Reakční směs byla nalita do ledové vody, její pH bylo zvýšeno pomocí 35% NaOH a směs byla extrahována chloroformem. Organická vrstva byla promyta vodou (2x). poté solným roztokem (lx) a vysušena pomocí síranu sodného a zakoncentrována ve vakuu. Reziduum bylo purifikováno sloupcovou chromatografií na silice eluované etylacetátem, poté 0,5% trietylamin/EtOAc, poté 2% trietylamin/EtOAc, poté CHCI₃/l-2% izopropylaminem a finálně CHCl₃/l-2% izopropylamin/2% MeOH, což umožnilo získat 3,3 g (58%) produktu ve formě volné báze. Část volné báze (1,25 g) byla rozpuštěna v metanolu a podrobena reakci s koncentrovanou HCI (3,3 ml) v metanolu (6 ml), což umožnilo získat 1,2 g produktu ve formě dihydrochloridu . 1/2 hydrát, teplota tání 213 °C (dec.).

N-[[l-[[2-(Dimetylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]metansulfonamid rnetansulfonát (I: R'=R²=Me; Q=CH₂NHSO₂Me; R⁸=H; n=2)

4-(Aminometyl)-l-[[2-(Dimetylamino)etyl]amino]thioxanten-9-on (2g, 6 mmol) v 30 ml suchého pyridinu pod dusíkem bylo promícháváno při teplotě místnosti až do dokončení tvorby roztoku. Roztok byl ochlazen v ledové lázni a dále bylo po kapkách přidáno 0,52 ml (6,7 mmol) metansulfonyl chloridu v ledovém pyridinu a směs byla míchána po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Reakční směs byla nalita do 500 ml vody obsahující 0,51 g hydroxidu sodného, extrahována do chloroformu, organická vrstva byla promyta vodou (2x) a solným roztokem a vysušena bezvodým síranem sodným. Dále byla směs zfiltrována a zakoncentrována ve vakuu. Reziduum (2,5 g) bylo promícháváno v éteru, filtrováno a vysušeno, čímž byly získány 2 g N—[[l— [[2-(dimetylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten^4-yl]mety ljmetansulfonamidu, teplota tání 126 - 127 °C. Volná báze byla rozpuštěna v metanolu a podrobena reakci s metansulfonovou kyselinou (0,48 g), což vedlo k získání 2,0 g (67 %) produktu ve formě metansulfonátové soli, teplota tání 168 °C (dec.).

Příklad 19

a)

Postupem obdobným tomu, který je popsán v Příkladu 17(c) bylo ze směsi 1-chloro a 3-chlorothioxanten-9-onu (15,15 g, 61,4 mmol), pyridinu (20 ml) a dimethylaminopropylaminu (6,01 g, 58,7 mmol) připraveno 6,83 g l-[[3-(dimetylamino)propyl]amino]thioxanten-9-onu.

b)

Postupem obdobným tomu, který je popsán v Příkladu 17(d) bylo z l-[[3-(dimetylamino)propyl]amino]thioxanten-9-onu (6,8 g, 21,8 mmol), formalinu (175 ml) a ledové kyseliny octové

-11 CZ 293433 B6 (0,75 ml) získáno 6,74 g (90 %) l-[[3-(dimetylamin)propyl]amino]-4-hydroxymetyl)th ioxanten-9-onu.

c)

Postupem obdobným tomu, který je popsán v Příkladu 17(e) bylo z l-[[3-(dimetylamino)propyl]amino]-4-(hydroxymetyl)thioxanten-9-onu (6,7 g), v toluenu (80 ml) a MnO₂ (12,15 g) získáno 4,2 g l-[[3-(dimetylamino)propyl]amino]-9-oxothioxanten-4-karboxaldehydu (Vzorec II: R'=R²=Me; R⁸=H; n = 3). Produkt byl purifikován sloupcovou chromatografií na silice eluované CHC1₃, (1,00 % až 1% směsí izopropylamin/CHCl₃.

d)

Směs N-metylformamidu (50 ml), kyseliny mravenčí (5,2 g) a l-[[3-(dimetylamino)propyl]amino]-9-oxothioxanten-4-karboxaldehydu (4,14 g, 12,16 mmol) bylo zahříváno pod zpětným chlazením po dobu 3 hodin. Směs byla naředěna vodou (250 ml), pH zvýšeno pomocí 35% NaOH a směs byla extrahována CHC1₃ (3 x 150 ml). Organická vrstva byla vysušena síranem sodným, chromatografována na silice eluované CHC1₃ (100%), poté 2% izopropylamin/CHCl₃, což vedlo k získání 3,93 g (84%) N-[[l-[[3-(dimetylamino)propyl]amino]-9-oxothioxanten-4yl]metyl]-N-metylformamidu (Vzorec IV: R*=R²=Me; R⁴=Me; n=3).

e) l-[[3-(Dimetylamino)ethyl]amino]-4-[(metylaminometyl]thioxanten-9-on dihydrochlorid monohydrát (R'=R²=Me; Q=CH₂NHMe; R⁸=H; n=3)

Roztok výše zmíněného N-metylformamidu (3,83 g; 10 mmol) v 40 ml 3N HC1 byl zahříván v parní lázni po dobu 4 hodin; neutralizován pomocí 35% roztoku NaOH a ochlazován na ledu po dobu 1 hodiny. Tekutá vrstva byla stočena a surový produkt byl rozpuštěn v chloroformu azfiltrován na silice gelu (chloroform; 1% izopropylamin/chloroform), čímž se získalo 2,38 g požadovaného aminu ve formě oranžové pryskyřice. Produkt byl zkonvertován na příslušnou hydrochloridovou sůl rozpouštěním v metanolu a reakcí s koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou, což umožnilo získat 0,98 g dihydrochlorid monohydrát, teplota tání 228 až 229 °C.

Příklad 20

a)

Směs 1—[[2—(dimethylamino)etyl]amino]-9-oxothíoxanten-4-karboxaldehydu (4,75 g,

0,15 mol), N-metylformamidu (48 ml) a kyseliny mravenčí (3,9 ml) byla zahřívána při teplotě 170 °C po dobu 4,5 hodin a poté byla ponechána se ustálit při teplotě místnosti na dobu přibližně 64 hodin. Reakční směs byla nalita do vody (250 ml), pH bylo zvýšeno pomocí 35% NaOH a směs byla extrahována CHCI₃ (3x). Organická vrstva byla separována, promyta vodou (2x) a poté solným roztokem (lx) a vysušena síranem sodným. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu, čímž se získalo 5,75 g N-[[l-[[2-(dimetylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]-N-metyl formamidu (Vzorec IV: R¹⁼R²=Me; R⁴=Me; R⁸=H; n=3)

b) l-[[2-(Dimetylamino)etyl]amino]-4-[(metylamino)-metyl]thioxanten-9-on dihydrochlorid. 5/4 hydrát (I: R'=R²=Me; Q=CH₂NHMe; R⁸=H; n=2)

Postupem obdobným tomu, který je popsán v Příkladu 19E bylo z 5,7 g (15,4 mmol) korespondujícího N-metylformamidu z Příkladu 20(a) a z 50 ml 2N HC1 získáno purifikací volné báze

-12CZ 293433 B6 bleskovou chromatografií (silica gel; chloroform; poté 0,5% izopropylamin/chloroform; poté 1% izopropylamin/chloroform) 1,8 g l-[[2-(dimetylamino)etyl]amino]-4-[(metylamino)-metyl]thioxanten-9-onu. Volná báze byla zkoncentrována na příslušnou dihydrochlorid 5/4 hydrátovou sůl reakcí s koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou v metanolu, což umožnilo získat 1,8 g (30 %) produktu, teplota tání 177 °C (dec.).

Příklad 21

a)

Roztok [[3-(dimetylamino)propyl]amino]-9-oxothioxanten-4-karboxaldehydu (3,6 g; 10,57 mmol) v 50 ml formamidu obsahujícího 3,6 g kyseliny mravenčí byl zahříván pod zpětným chlazením po dobu 1,5 hodiny a poté ponechán stát přes noc při teplotě místnosti. Reakční směs byla naředěna vodou (400 ml), pH bylo zvýšeno pomocí 3 ml roztoku 5N NaOH a směs byla rychle promíchávána po dobu 30 minut. Pevný precipitát byl zfiltrován, promyt vodou a vysušen, dávajíce výtěžek 3,1 g (79%) N-[[l-[[3-(dimetylamino)propyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]-N-metylformamidu (Vzorec I: R¹⁼R²=Me; Q=CH₂NHCHO; R⁸=H; n=2) ve formě žlutého prášku.

b)

Roztok formamidu z příkladu 21 (a) (2,98; 8,07 mmol) ve 40 ml 3N HC1 byl zahříván v parní lázni po dobu 4 hodin, ponechán vychladnout na teplotu místnosti, ochlazen na ledu a neutralizován na pH 8 pomocí 5N roztoku NaOH. Výsledná heterogenní směs byla extrahována do chloroformu (5 x 100 ml) a organická vrstva byla vysušena síranem sodným azfiltrována přes silica gel (nejprve 5% trietylamin/éter, poté 1 až 5% izopropylamin/chloroform), což vedlo k získání 2,3 g (83 %) 4-(aminometvl)-l-[[3-(dimetylamino)propyl]amino]thioxanten-9-onu (Vzorec I: R’=R²=Me; Q=CH₂N H₂; R^§=H; n=3).

c)

N-[[l-[[3-(Dimetylamino)propyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]metansulfonamid metansulfonát. 1/2 hydrát (I: R'=R²=Me; Q=CH₂NHSO₂Me; R⁸=H; n=3).

K ledovému roztoku aminu z Příkladu 21(b) (2,2 g; 6,44 mmol) v pyridinu byl přidán metansulfonyl chlorid (0,51 ml; 6,59 mmol) a výsledná směs byla promíchávána přes noc při teplotě místnosti. Směs byla naředěna chloroformem a filtrována přes silica gel eluovaný 5% trietylamin/EtOAc, což vedlo k získání 1,32 g N-[[l-[[3-(Dimetylamino)propyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]metansulfonamidu ve formě žlutého prášku. Volná báze byla rozpuštěna v metanolu (10 ml) a podrobena reakci s metansulfonovou kyselinou (0,31 g, 1 ekv.) v metanolu, což vedlo k získání 1,38 g soli metansulfonátu. 1/2 hydrát ve formě oranžové pevné látky, teplota tání více než 107 °C.

Příklad 22

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]-N-metyl-etansulfonamid metansulfonát (I: R'=R²=Et; Q=CH₂N(CH₃)SO₂Et; R⁸=H; n=2)

Roztok 2,03 g (5,49 mmol) l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-4-[(metylamino)metyl]thioxanten9-onu (připraveného podle metody popsané v Příkladu 5) a trietylaminu v 45 ml metylenu chloridu bylo ochlazeno na 0 °C a podrobeno reakci s etansulfonyl chloridem (0,74 g,

-13 CZ 293433 B6

5,76 mmol). Po 15 minutách při teplotě 0 °C byla reakční směs míchána při pokojové teplotě po dobu 72 hodin. Směs byla zakoncentrována ve vakuu, reziduum rozpuštěno v chloroformu a purifikováno na silica gelu (chloroform, poté 1% trietylamin/chloroform), což vedlo k získání 2,43 g (96%) N-[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]-N-metylensulfonamid metansulfonátu. Sulfonamid byl rekrystalizován z etylacetátu a podroben reakci s metansulfonovou kyselinou v izopropanolu, což vedlo k získání produktu ve formě metansulfonátové soli, teplota tání 159 až 161 °C.

Příklad 23

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl] (p-methoxy)benzensulfonamid metansulfonát (I: R'=R²=Et; Q=CH₂NHSO₂C₆H4-p-OMe; R⁸=H; n=2)

Roztok 1,40 g (3,94 mol) 4-(aminometyl)-l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]thioxanten-9-onu (připraveny metodou popsanou v Příkladu 4) v 30 ml chloroformu obsahujícího 1,5 ml trietylaminu bylo ochlazeno na 0 °C a podrobeno reakci s p-metoxybenzensulfonyl chloridem (0,83 g, 4,02 mmol). Po 10 minutách při teplotě 0°C byla reakční směs promíchávána při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Chloroform byl odstraněn ve vakuu, reziduum bylo rozpuštěno ve 100 ml metylen chloridu obsahujícího 1 ml trietylaminu a podrobeno reakci s dalším p-metoxybenzensulfonyl chloridem (0,85 g) za promíchávání při teplotě místnosti. Směs byla zakoncentrována ve vakuu, reziduum bylo purifikováno na silica gelu (1% trietylamin/chloroform), což vedlo k získání 1,57 g N-[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]-pmetoxy-benzensulfonamidu. Sulfonamid byl podroben reakci s metansulfonovou kyselinou (0,3 g) ve směsi izopropanol/izopropylacetát/metanol, což vedlo k získání 1,07 g metansulfonátové soli, teplota tání 133 až 137 °C.

Příklad 24

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]etansulfonamid metansulfonát (I: R¹⁼R²=Et; Q=CH₂NHSO₂Et; R⁸=H; n=2)

Roztok 2,5 g 4-(aminometyl)-l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]thioxanten-9-onu (připraveného podle metody popsané v Příkladu 4) ve 30 ml pyridinu bylo ochlazeno v ledové lázni po dobu 15 minut a poté bylo rychle po kapkách přidáno 0,95 g etansulfonyl chloridu v 5 ml pyridinu a reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Směs byla nalita do 75 ml vody obsahující 0,75 g NaOH, extrahována do chloroformu, organická vrstva byla promyta vodou (2x), poté solným roztokem a vysušena síranem sodným. Směs byla zakoncentrována ve vakuu a reziduum bylo mícháno v éteru a vysušeno (40 °C/0,l mm), což vedlo k získání 1,7 g N-[[l-[[2-dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yI]metly]etansulfonamidu, teplota tání 105 °C. Sulfonamid byl rozpuštěn v metanolu a podroben reakci s metansulfonovou kyselinou v metanolu, což vedlo k získání 1,61 g (42 %) metansulfonátové soli, teplota tání 135 °C (dec.).

Příklad 25

N-[[l-[[2-(Dieylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]-N-etyl-metansulfonamid (I: R'=R²=Et; Q=CH₂N(Et)SO₂Me; R⁸=H; n=2)

Roztok 2,10 g (5,48 mmol) l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]thioxanten-9-onu (připraveného podle metody popsané v Příkladu 14) v 30 ml metylen chloridu bylo ochlazeno na teplotu 0 °C

-14CZ 293433 B6 a dále podrobeno reakci s 2 ml trietylaminu a metansulfonyl chloridem (0,7 ml) a reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 6 hodin. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu, reziduum rozpuštěno v chloroformu a roztok byl purifikován na silica gelu (eluce chloroformem a následně 2% trietylamin/chloroformem). Izolovaná žlutá pevná látka byla rekrystalizována z etylacetátu a vysušena, což vedlo k získání 1,11 g (44 %) N-[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]9-oxothioxanten-4-yl]metyl]-N-etylmetansulfonamidu ve formě žlutého prášku, teplota tání 172 až 176 °C.

Příklad 26

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]-3,4-dichlorbenzensulfonamid metansulfonát .1/2 hydrát (I: R¹⁼R²=Et; Q=CH₂NHS0₂C₆H₃-3,4-dichloro; R⁸=H: n=2)

K roztoku 3,4-dichlorbenzensulfonyl chloridu (1,84 g, 7,5 mmol) v 35 ml pyridinu bylo přidáno 2,5 g (7 mmol) 4-(aminometyl)-l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-thioxanten-9-onu (připraveného podle metody popsané v Příkladu 4) pod dusíkem a reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 15 minut a poté byla nechána stát na zhruba 72 hodin. Reakční směs byla nalita do 75 ml vody obsahující 0,75 g NaOH a extrahována do chloroformu. Organická vrstva byla promyta vodou (2x) a solným roztokem a vysušena síranem sodným. Chloroform byl odstraněn ve vakuu a reziduum bylo rekrystalizováno zetanolu, což vedlo k získání 1,24 g N-[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]-3,4-dich!orbenzensulfonamidu, teplota tání 95 °C (dec.). Volná báze byla rozpuštěna v metanolu a podrobena reakci s metansulfonovou kyselinou v metanolu za vzniku metansulfonátu . 1/2 hydrátu, teplota táni 55 °C (dec.).

Příklad 27

N-[[l-[2-(Dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yi]-metyl]-2-fluorbenzensulfonamid (I: R*=R²=Et; Q=CH₂NHSO₂C₆H₄-2-F; R⁸=H; n=2)

Roztok 1,36 g (3,83 mmol) 4-(aminometyl)-l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-thioxanten-9-onu (připraveného podle metody popsané v Příkladu 4) v 25 ml metylen chloridu obsahující 1 ml trietylaminu byl ochlazen na teplotu 0 °C a dále podroben reakci s 2-fluorobenzensulfonyl chloridem (0,84 g; 4,32 mmol) a reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu několika hodin. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu, reziduum rozpouštěno v chloroformu a purifikováno bleskovou chromatografíí (silica gel: chloroform a následně 1% trietylamin/chloroform). Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a produkt byl rekrystalizován z etylacetátu, což vedlo k získání 1,08 g (55 %) N-[[l-[[2-(diatylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]-N-2-fluorobenzensulfonamidu ve formě oranžového prášku, teplota tání 125 až 127 °C.

Příklad 28

N-[[l-[[2-(Diatylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]-N-propyl-metansulfonamid (I: R‘=R²=Et; Q=CH₂N(C₃H₇)SO₂Me; R⁸=H; n=2)

Olej z 0,2 g 60% disperze hydridu sodného v minerálním oleji byl odstraněn rozetřením s pentanem (4x). Suchý DMF (40 ml) byl přidán pod dusíkem k hydridu sodnému za stálého míchání a 2 g N-[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]mety!]metansulfonamidu (Příklad 6) bylo poté přidáno k reakční směsi za stálého míchání pod dusíkem a směs byla zahřívána na 50 °C po dobu 2 hodin. Tato směs byla ochlazena v ledové lázni po dobu 15 minut,

- 15CZ 293433 B6 dále bylo přidáno 0,87 g propyl jodidu v malém objemu DMF a směs byla míchána při teplotě místnosti přes noc. Směs byla míchána s 35 ml vody, zfiltrována a reziduum bylo promyto vodou a vysušeno (50°C/0,l mm/P₂O₅), což vedlo k získání 2,17 g N-[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten—4-yl]metyl]-N-propylmetansulfonamidu, teplota tání 142 až 143 °C.

Příklad 29

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]-N-metyl-benzensulfonamid metansulfonát (I: R'=R²=Et; Q=CH₂N(Me)SO₂C₆H₅; R⁸=H; n=2)

Roztok 5,32 g (14,4 mmol) l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-4-[(metylamino]metyl]thioxanten9-onu (připraveného podle metody popsané v Příkladu 5) ve 100 ml metylen chloridu byl ochlazen na teplotu 0 °C a dále podroben reakci s tretylaminem (5 ml) a benzensulfonyl chloridem (2 ml; 15,67 mmol) a reakční směs byla míchána po dobu 2 hodin. Směs byla zakoncentrována ve vakuu, reziduum bylo purifikováno na silica gelu (eluovaném chloroformem; a následně 1/2% až 1% izopropylamin/chloroformem), což vedlo k získání 6,24 g žluté pryskyřice. Produkt byl rozpuštěn v etyl acetátů a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu, což vedlo k získání 6,06 g (83%) N-[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]-Nmetylbenzensulfonamidu. Sulfonamid (2,5 g) byl suspendován do izopropanolu a podroben reakci s metansulfonovou kyselinou (0,51 g), což vedlo k získání 2,63 g metansulfonátové soli, teplota tání 171 až 174 °C.

Příklad 30

a)

Ke směsi m-anýzové kyseliny (250 g, 1,67 molu v kyselině octové (1 1) byl přidán bróm (85 ml) a poté voda (1 1). Směs byla zahřívána pod zpětným chlazením, ochlazena v ledové lázni a precipitovaný produkt byl sbírán filtrací a promyt vodou, což vedlo k získání 305,7 g (79 %) 2-bromo-5-metoxybenzoové kyseliny, teplota tání 154 až 156 °C.

b)

Ke směsi 3-chlorothiofenolu (20 g, 138 mol), octanu měďnatého (1,8 g) a DMF (200 ml) byl přidán K₂CO₃ (23 g). Směs byla zahřívána na teplotu 150 °C po dobu 15 až 20 minut, a poté byla po částech přidána 2-bromo-5-metoxybenzoová kyselina (38,5 g, 0,155 mol). Směs byla přes noc zahřívána, nalita do vody (600 ml), zfiltrována a filtrát podroben reakci s aktivním uhlím, zfiltrován a naředěn HC1. Výsledný precipitát byl sbírán filtrací, promyt vodou a vysušen při 50 °C ve vakuu nad P₂O₅, což vedlo k získání 27,6 g 2-[[(3-chlorofenyl)thio]-5-metoxybenzoové kyseliny.

c)

K ochlazené kyselině sírové (89 ml) pod dusíkem byla po částech během 1,5 až 2 hodin přidána 2-[(3-chlorofenyl)thio-5-metoxybenzoové kyselina (27 g, 0,092 mol). Směs byla přes noc míchána při teplotě místnosti, nalita do vody (900 ml) obsahující koncentrovaný NH₄OH (218 ml) a led. Precipitovaná pevná látka byla sbírána filtrací a sušena při 50°C ve vakuu nad P₂O₅, což vedlo k získání 21 g (42 %) směsi 1-chloro a 3-chloro-7-metoxy-thioxanten-9-onu.

d)

Směs 1-chloro a 3-chloro-7-metoxy-thioxanten-9-onu (20,7 g), pyridinu (69 ml) a dietylaminoetylaminu (16,1 g, 0,138 mol) byla zahřívána při 115 °C pod N₂ po dobu 20 hodin. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a reziduum bylo purifikováno sloupcovou

-16CZ 293433 B6 chromatografií na silice eluované chloroformem (100%) a poté 1% izopropylamin/chloroformem, což vedlo k získání 11,22 g l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-metoxythioxanten-9-onu.

e)

Směs l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-metoxythioxanten-9-onu (ll,2g, 0,031 mol), 37% formaldehydu (277 ml) a 5N kyseliny octové byla zahřívána při 100 °C po dobu 3 hodin. Reakční směs byla ochlazena a zfiltrována. Filtrát byl nalit do ledové vody (600 ml) a jeho pH bylo zvýšeno pomocí 35% NaOH. Směs byla extrahována do chloroformu (3x), promyta solným roztokem a vysušena síranem sodným. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a reziduum bylo purifikováno sloupcovou chromatografií na silice eluované 25% chloroform/hexanem, poté 50% chloroform/hexanem, poté 75% chloroform/hexanem, 0,5% izopropylamin/chloroformem, což vedlo k získání 8,8 g (73 %) l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-4-(hydroxymetyl)-7-metoxythioxanten-9-onu.

f)

Roztok l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-4-(hydroxymetyl)-7-metoxythioxanten-9-onu (8,8 g, 0,023 mol) v toluenu (267 ml) bylo zahříváno na 60 °C pod dusíkem a poté byl přidán MnO₂ (13,2 g). Směs byla přes noc zahřívána, zfiltrována a filtrát byl zakocentrován ve vakuu, což vedlo k získání 7,05 g (81%) l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-metoxy-9-oxothioxanten-4karboxaldehydu (Vzorec II: R'=R²=Et; R⁸=7-OCH₃; n=2)

g)

Roztok l-[[2-(dietylamino)etyl]arnino]-7-metoxy-9-oxothioxanten-4-karboxaldehydu (3 g, 7,8 mmol) a 1,5 ml kyseliny mravenčí v 25,5 ml N-metylformamidu bylo zahříváno na teplotu 170 °C po dobu 8 hodin při stálého míchání pod dusíkem. Reakční směs byla nalita do 160 ml ledu/vody, její pH bylo zvýšeno pomocí 35% roztoku NaOH a extrahována do chloroformu (3x). Organická vrstva byla promyta vodou (2x) a solným roztokem, vysušena síranem sodným a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu, což vedlo k získání 3 g (89,9 %) požadovaného N-[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-metoxy-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]-N-metylformamidu (Vzorec IV: R'=R²=Et; R⁴=Me; R⁸=7-OCH₃; n=2).

h) l-[[2-(Diatylamino)etyl]amino]-4-[(metylamino)metyl]-7-metoxy-thioxanten-9-on (I: R¹⁼R²=Et; Q=CH₂NHMe; R⁸=7-OMe; n=2)

N-metylformamid z Příkladu 30(g) (3,0 g) v 2N vodném roztoku HCI (24 ml) byl zahříván pří teplotě 100 °C po dobu 2 hodin pod dusíkem za stálého míchání. Výše zmíněná směs byla ochlazena, nalita do 125 ml ledu/vody, její pH bylo zvýšeno 35% roztokem NaOH, směs byla extrahována do chloroformu a promyta vodou (2x) a poté solným roztokem. Organická vrstva byla vysušena síranem sodným a zakoncentrována ve vakuu, což vedlo k získání 3,1 g surového produktu. Produkt byl rozmělněn v éteru a filtrát byl několikrát purifikován bleskovou chromatografií na sloupci silica gelu eluovaného 50% hexan/chloroformem, poté chloroformem a dále 0,25 až 0,5% izopropylamin/chloroformem (sloupec 1); chloroformem, poté 1% izopropylamin/1% MeOH/CHCl₃ (sloupec 2); a chloroformem, poté 0,5% izopropylamin/CHCl₃ (sloupec 3), což vedlo k získání 0,746 g l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-4-[(metylamino)metyl]-7metoxy-thioxanten-9-onu.

Příklad 31

a)

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-7-metoxy-9-oxothioxanten^l-yl]metyl]-N-formamid

-17CZ 293433 B6 (I: R'=R²=Et; Q=CH₂NHCHO; R⁸=7-OMe; n=2)

Směs l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-metoxy-9-oxothioxanten-4-karboxaldehydu (3,6 g, 0,0094 mol), formamidu (48 ml) a kyseliny mravenčí (6 ml) byla zahřívána na 170 °C pod dusíkem po dobu 8 hodin. Směs byla nalita do ledové vody, její pH bylo zvýšeno 35% NaOH a extrahována chloroformem. Organická vrstva byla separována, promyta vodou (2x), poté solným roztokem, vysušena síranem sodným a zakoncentrována ve vakuu, což vedlo k získání 3,88 g N[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-metoxy-9-oxothioxanten^4-yl]metyl]-N-formamidu.

b)

4-(Aminometyl)-l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-metoxythioxanten-9-on (I: R*=R²=Et; Q=CH2NH2; R⁸=7-OCH3; n=2)

Směs formamidu z příkladu 31(a) (3,88 g) a 2N NC1 (32 ml) bylo zahříváno pod dusíkem za stálého míchání při teplotě 100 °C po dobu 2 hodin. Tato směs byla ochlazena, nalita do vody, její pH bylo zvýšeno 10% roztokem NaOH. Směs byla extrahována do chloroformu, promyta vodou a poté solným roztokem. Organická vrstva byla vysušena síranem sodným a zakoncentrována ve vakuu, což vedlo k získání 3,6 g surového produktu. Produkt byl rozpuštěn v chloroformu a purifikován bleskovou chromatografií (silica gel; eluce hexan/chloroformem (50:50) a poté 1% izopropylaminem v hexan/chloroformu (50:50), což vedlo k získání 1,75 g požadovaného produktu.

c)

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-7-metoxy-9-oxothioxanten-4yl]metyl]-metansulfonamid (I: R’=R²=Et; Q=CH2NHSO2Me; R⁸=7-OCH3; n=2)

K roztoku 1,75 g (0,0045 mol) aminu z Příkladu 31(b) v 22,5 ml pyridinu v ledové lázni pod dusíkem za stálého míchání bylo po kapkách přidáno 0,39 ml (0,005 mol) metansulfonylchloridu v malém objemu pyridinu a výsledná reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Směs byla nalita do 375 ml vody obsahující 0,38 g NaOH, extrahována do chloroformu a organická vrstva byla promyta vodou a poté solným roztokem. Chloroformová vrstva byla vysušena síranem sodným, rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a reziduum bylo ve vakuu vysušeno, což vedlo k získání 1,61 g (77 %) N-[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-metoxy-9oxothioxanten-4-yl]metyl]-metansulfonamidu, teplota tání 144 °C (dec.).

Příklad 32

a)

Ke směsi 3-chlorothiofenolu (20 g, 0,138 mol), octanu měďnatého (1,75 g) a DMF (199 ml) pod dusíkem byl po částech přidán K₂CO₃ (23 g). Směs byla zahřívána na teplotu 150 °C a poté byla přidána 2,5-dibromobenzoová kyselina (43,5 g). Směs byla přes noc zahřívána, nalita do vody (600 ml), zfiltrována a filtrát byl podroben reakci s aktivním uhlím a znovu zfiltrován. Filtrát byl acidifikován koncentrovanou HC1, extrahován chloroformem, organická vrstva byla promyta solným roztokem a vysušena síranem sodným. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu, což vedlo k získání 28,9 g 2-[(3-chlorofenyl)thio]-5-bromobenzoové kyseliny.

b)

Směs 2-[(3-chlorofenyl)thio]-5-bromobenzoové kyseliny (28,4 g) a koncentrované kyseliny sírové (80 ml) byla míchána při teplotě 0 °C a poté přes noc při teplotě místnosti. Směs byla nalita do ledové vody (850 ml) obsahující koncentrovaný hydroxid amonný (199 ml) a

-18CZ 293433 B6 vyprecipitovaný produkt byl sbírán filtrací a vysušen při teplotě 50 °C ve vakuu, což vedlo k získání 15,0 g směsi 1-chloro a 3-chloro-7-bromo-thioxanten-9-onu.

c)

Směs 1-chloro a 3-chlor-7-bromothioxanten-9-onu (13.6 g), pyridinu (108 ml) a N,N,-dietyletylen diaminu (16,3 ml) byla zahřívána při 115 °C pod N₂ po dobu 20 hodin. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a reziduum bylo purifikováno sloupcovou chromatografií na silice eluované chloroformem (100%) a poté 1% izopropylamin/chloroformem, což vedlo k získání 9,3 g l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-bromothioxanten-9-onu.

d)

Směs l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-bromothioxanten-9-onu (9,3 g, 22,9 mol), 203 ml 37% roztoku formaldehydu a 3,4 ml 5N kyseliny octové byla přes noc zahřívána při teplotě 100 °C. Směs byla ochlazena na pokojovou teplotu a vytvořena pevná látka byla odstraněna filtrací. Filtrát byl naředěn vodou, jeho pH bylo zvýšeno 35% roztokem NaOH a extrahován do chloroformu. Organická vrstva byla promyta solným roztokem a vysušena síranem sodným. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu, což vedlo k získání 10 g oleje. Tento olej vmetylen chloridu byl zfíltrován, rozpouštědlo zakoncentrováno ve vakuu a surový hydroxymetylový analog byl purifikován bleskovou chromatografií (silica gel; eluce 25% chloroform/hexanem, poté chloroform/hexanem (1:1), poté 25% chloroform/hexanem, poté chloroformem (100%) a poté 0,5-1% izopropylamin/hexanem, poté chloroformem (100%) a poté 0,5-1% izopropylamin/chloroformem), což vedlo k získání 3,2 g l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-4-(hydroxymetyl)-7-bromothioxanten-9-onu.

e) l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-bromo-9-oxothioxanten-4-karboxaldehyd (II: R’=R²=Et; R⁸=7-Br; n=2)

Směs 3,2 g, (7,34 mmol) alkoholu z Příkladu 32(d) a 4,3 g MnO₂ v 85 ml toluenu bylo zahříváno při 60 °C pod dusíkem po dobu 1 hodiny. Směs byla zfiltrována, promyta chloroformem a společný filtrát byl zakoncentrován ve vakuu, což vedlo k získání 3 g žluté pevné látky. Tato pevná látka byla rozmělněna v éteru, zfiltrována a vysušena, což vedlo k získání 2,7 g (94,3 %) l—[[2— (dietylamino)etyl]amino]-7-bromo-9-oxoethioxanten-4-karboxaldehydu, teplota tání 145 až 146 °C.

f)

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-7-bromo-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]formamid (I: R¹⁼R²=Et; Q=CH₂NHCHO; R⁸=7-Br; n-2

Roztok 2,7 g (6,2 mmol) l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-bromo-9-oxothioxanten-4-karboxaldehydu, 31,7 ml formamidu a 3,6 ml kyseliny mravenčí bylo zahříváno na teplotu 170 °C po dobu 8 hodin při stálého míchání pod dusíkem a reakční směs byla nalita do 150 ml ledu/vody. Její pH bylo zvýšeno 35% roztokem NaOH a pevný produkt byl zfíltrován a promyt vodou. Pevný produkt byl rozpuštěn v chloroformu, promyt solným roztokem, vysušen síranem sodným a rozpouštědlo bylo zakoncentrováno ve vakuu, což vedlo k získání 2,85 g požadovaného formamidu, ve formě žlutooranžové pevné látky, teplota tání 132 °C (dec).

g) l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-4-(aminometyl)-7-bromothioxanten-9-on (I: R’=R²=Et; Q=CH₂NH₂; R⁸=7-Br; n=2)

-19CZ 293433 B6

Směs 2,85 g (6,6 mmol) výše zmíněného formamidu (Příklad 32(f)) v 26 ml 2N roztoku HC1 (24 ml) byl zahříván na teplotu 100 °C po dobu 2 hodin pod dusíkem a směs byla ponechána přes noc stát při teplotě místnosti. Reakční směs nalita do 200 ml ledu/vody, její pH bylo zvýšeno 35% roztokem NaOH a směs byla extrahována do chloroformu. Organická vrstva byla promyta vodou a solným roztokem, vysušena síranem sodným a zakoncentrována ve vakuu, což vedlo k získání 2,67 g tmavého oleje. Tmavý olej byl purifikován bleskovou chromatografií (silika gel; 1250 ml hexan/chloroform (1:1) a poté 1% izopropylamin v hexan/chloroformu (1:1)), což vedlo k získání 1,87 g(70 %) l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-4-(aminometyl)-7-bromothioxanten-9onu, teplota tání 79 až 82 °C.

Příklad 33

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-7-bromo-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]metansulfonamid (I: R‘=R²=Et; Q=CH₂NHSO₂Me; R⁸=7-Br; n=2) l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-4-(aminometyl)-7-bromothioxanten-9-on (1 g, 2,3 mmol) v 11,5 ml suchého pyridinu pod dusíkem byl míchán v ledové lázni po dobu 15 minut, poté bylo po kapkách přidáno 0,2 ml (2,6 mmol) metansulfonyl chloridu ve studeném pyridinu a směs byla míchána při teplotě místnosti. Reakční směs nalita do 200 ml vody, bylo přidáno 0,19 g hydroxidu sodného v ledu/vodě a provedena extrakce do chloroformu. Organická vrstva byla promyta vodou (2x) a solným roztokem, vysušena bezvodým síranem sodným. Směs byla zfíltrována, zakoncentrována ve vakuu a reziduum bylo mícháno v éteru, zfiltrováno a vysušeno, což vedlo k získání 1,02 g N-[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-bromo-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]metansulfonamidu, teplota tání 134 až 139 °C.

Příklad 34

Metyl N-[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]karbamát (I: R¹⁼R²=Et; Q=CH₂NHCOOMe; R⁸=H; n=2)

K roztoku 2,94 g (8,27 mmol) 4-(aminometyl)-l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]thioxanten-9onu v 50 ml metylen chloridu obsahujícího 5 ml trietylaminu ochlazeného na 0 °C bylo přidáno 0,7 ml (9,06 mmol) metylchlorformátu a směs byla míchána po dobu 2,5 hodiny. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu, reziduum bylo extrahováno do chloroformu a purifíkováno bleskovou chromatografií (silika gel; chloroform, poté 1% izopropylamin/chloroform), což vedlo k získání 2,36 g (69 %) metyl N-[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-9-oxothioxanten—4-yl]metlyJkarbamátu ve formě žluté pevné látky, teplota tání 129 až 131 °C.

Příklad 35 l-[[2-(Dietylamino)etyl]aminol-4-[(metylamino)metyl]-7-hydroxy-thioxanten-9-on (I: R¹⁼R²=Et; Q=CH₂NHMe; R-7-OH; n=2)

Roztok 1,6 g (4 mmol)-l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-4-[(metylamino)metyl]-7-metoxythioxanten-9-onu (připraveného podle postupu popsaného v Příkladu 30(h)) v 10 ml 48% roztoku HBr byl zahříván na 100 % po dobu 5 hodin. Po ochlazení byla reakční směs neutralizována nasyceným bikarbonátem sodným a extrahována do chloroformu (3x100 ml). Tmavá pryskyřice, nerozpustná ve vodě ani chloroformu, byla rozpuštěna v metanolu a smíchána s roztokem chloroformu. Rozpouštědlo bylo zakoncentrováno ve vakuu, což vedlo k získání 1,67 g tmavě oranžové pevné látky. Tato oranžová pevná látka byla purifikována bleskovou chromatografií (silica gel; izopropylamin/metanol/chloroform (1:1:98), s následnou chromato

-20CZ 293433 B6 grafií na druhém sloupci silica gelu eluovaného směsí izopropylamin/MeOH/chloroform (2:2:96), což vedlo k získání 0,56 g (36 %) l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-4-[(metylamino)metyl]-7hydroxy-thioxanten-9-onu, teplota tání 167 až 169 °C.

Příklad 36

Metyl N-[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-metoxy-9-oxothioxanten-4-yl]-metyl]karbamát (I: R'=R²=Et; Q=CH₂NHCOOMe; R⁸=7-OMe; n=2)

K roztoku 1,55 g 4-(aminometyl)-l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-metoxy-thioxanten-9-onu v 40 ml chloroformu obsahujícího 2 ml trietylaminu ochlazeného na teplotu 0 °C bylo přidáno 0,45 ml metyl chloroformu a směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu několika hodin. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu, reziduum bylo purifikováno bleskovou chromatografií (silica gel; eluovaný chloroformem, poté 1% trietylaminem v chloroform/hexanu (1:1)), což vedlo k získání 1,2 g metyl N-[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-metoxy-9-oxothioxanten-4yl]-metyl]karbamátu, který byl rekrystalizován z etylacetátu s výtěžkem 0,79 g jasně žluté pevné látky, teplota tání 131 až 132 °C.

Příklad 37

N-[[l-[[2-(Dietylamino)etyl]amino]-7-hydroxy-9-oxothioxanten—l-yl]-metyl]metansulfonamid . 3/4 hydrát (I: R’=R²=Et; Q=CH₂NHSO₂CH₃; R⁸=7-OH; n=2)

K roztoku N-[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-metoxy-9-oxothioxanten-4-yl]metyl]metansulfonamidu (0,5 g) v CH₂C1₂ (45 ml) při -78 °C byl přidán 1N BBr₃ v CH₂C1₂ (1,75 ml). Směs byla zahřívána na pokojovou teplotu, míchána přes noc a poté nalita do ledové vody (250 ml) obsahující 35% NaOH (8 ml). Směs byl acidifíkována naředěnou HC1, poté bazifikována pevným uhličitanem sodným a poté extrahována etylacetátem. Organická vrstva byla separována, promyta solným roztokem, vysušena síranem sodným a zakoncentrována ve vakuu. Reziduum bylo purifikováno sloupcovou chromatografií na silica gelu eluovaném 5% MeOH/EtOAc, což vedlo k získání 0,28 g (58 %) N-[[l-[[2-(dietylamino)etyl]amino]-7-hydroxy-9-oxothioxanten-4-yl]metyljmetansulfonamid . 3/4 hydrátu, teplota tání 78 °C (dec.).

Reprezentativní příklady vynálezu byly testovány na protinádorovou aktivitu u myší podle následujícího postupu:

Zvířata byla shromážděna, subkutánně byla implantována 30 a 60 miligramové fragmenty nádoru pomocí trokaru číslo 12, a zvířata byla znovu shromážděna před neselektivním rozdělením na různé léčené a kontrolní skupiny. U léčby časného stadia bylo s chemoterapií započato během 1 až 5 dnů po implantaci nádoru, kdy počet nádorových buněk byl relativně malý (10⁷ až 10⁸ buněk). U léčby pokročilého stadia byla chemoterapie oddálena až do doby, kdy se nádor stal relativně velkým (200 až 300 mg). 300 mg těžký nádor obsahuje přibližně 3 x 10⁸ buněk. Nádory v experimentu s pokročilým stadiem byly 2,5 krát větší u 90 % zvířat. Nádory byly měřeny jednou týdně kaliperem (nebo 2 krát týdně u rychleji rostoucích nádorů). Myši byly usmrceny v okamžiku, kdy nádor dosáhl velikosti 1500 mg (tj. před tím než mohly způsobit zvířatům dyskomfort). Hmotnosti nádorů byly odhadovány z dvourozměrných měření.

Léčebné a kontrolní skupiny byly měřeny, když nádory kontrolní skupiny dosáhly velikosti přibližně 700 až 1200 mg (medián skupiny). Byl určen medián hmotnosti nádoru každé skupiny (včetně nulových hodnot). Hodnota T/C (hmotnost léčebných nádoru ke hmotnosti kontrolních nádorů) vyjádřena v procentech je indikátorem protinádorové účinnosti: hodnota T/C stejná nebo

-21 CZ 293433 B6 menší než 42 % je považována Odborem hodnocení léčby (Drug Evaluation Branch) Oddělení pro léčbu nádorů (Division of Cancer Treatment) za hodnotu vyjadřující signifikantní protinádorovou aktivitu. Hodnota T/C menší než 10% je považována za hodnotu vyjadřující vysoce signifikantní protinádorovou aktivitu. Nádor ztráty tělesné hmotnosti (průměr skupiny) větší než 5 20 %. nebo více než 20 % polékových úmrtí jsou považovány za projev vysoce toxické dávky.

Výsledky pro pankreatické duktální adenokarcinomy #03 jsou shrnuty v Tabulce 1, výsledky pro adenokarcinom tlustého střeva #38 v Tabulce 2.

Tabulka 1

Příklad #	T/C (%)	úbytek váhy (g)*	poléková úmrtí	Celková dávka (mg/kg), i.v. nebo p.o.
1	0	1,6	0	1739
2	0	2	0	576
2	7	1,6	0	144
4	0	0,4	0	570
5	0	1,6	0	222
6	0	1,6	0	124
7	0	3,2	1/5	400
8	0	0,8	0	304
9	8	1,6	0	1395
10	0	2,4	0	540
11	0	0,8	0	855
12	36	3,2	0	1298
13	0	2,4	0	431
14	0	1,2	0	448
15	0	2,0	0	390
16(a)	21	+0,8	0	1171
17(f)	17	2,0	0	1060
18(e)	82	1,0	0	128
18(f)	0	5,2	2/5	256
19(e)	4	3,4	0	610
20(b)	10	0,4	0	383
21(c)	0	4,5	0	208
22	0	3,2	0	465
23	20	2,4	0	1212
24	0	2,3	0	203
25	0	4,6	0	288
26	13	2,2	0	654
27	5	+0,8	0	2594
28	0	2,8	0	552
29	6	2,4	0	2403
31(c)	0	5,6	0	248
30(h)	0	1,4	0	880
33	28	2,0	0	1281
34	0	3,6	0	248
36	0	0,4	0	155
37	7	0	0	32

* Průměrná tělesná hmotnost byla 25 g

-22CZ 293433 B6

Tabulka 2

Příklad #	T/C (%)	úbytek váhy (g)*	poléková úmrtí	Celková dávka (mg/kg), i.v. nebo p.o.
2	0	2,8	0	600
5	11	2,9	0	960
6	0	5	3/7	132
6	4	1,7	1/7	82
7	16	0,6	0	840
10	0	4	0	340(b)
	24	2,3	0	200(b)
	22	0,6	0	160(b)
	2	4	2/5	740(a)
	7	1,2	0	460(a)
	23	2	0	865(b)
11	0	2	0	1709(a)
	0	0,8	0	885(a)
	39	0,8	0	518(g)
16(a)	20	1,2	0	1000
	27	1,5	0	670
18(e)	51	2,2	4/5	180
	3	1	0	120
25	0	4,8	4/5	852(c)
	0	0,6	0	529(c)
	0	0,8	0	327(c)

* Průměrná tělesná hmotnost byla 20,5 až 25,5 g (a) = p.o. podání (b) = i.p. podání (c) -- i.v. podání ve dnech 3-6 a p.o. podání ve dnech 7-10

Sloučenina z Příkladu 5 byla testována podáním intravenózní infuzí proti velkému počtu dalších nádorů, jak je ukázáno v Tabulce 3. Bylo prokázáno, že tato sloučenina byla aktivní proti adenokarcinomu tlustého střeva #38 v dávce 300 mg/kg p.o.

Sloučenina z Příkladu 6 byla testována podáním intravenózní injekcí ve formě bolu proti velkému počtu dalších nádorů, jak je ukázáno v Tabulce 4.

Sloučenina z Příkladu 8(a) byla testována proti velkému počtu dalších nádorů, jak je ukázáno v Tabulce 5.

Sloučenina z Příkladu 36 byla testována proti velkému počtu dalších nádorů, jak je ukázáno v Tabulce 6.

Reprezentativní sloučeniny vynálezu byly testovány proti adenokarcinomu prsu 16/C/RP, jak je ukázáno v Tabulce 7.

Reprezentativní sloučeniny vynálezu byly testovány proti P388/adriamycin rezistentní leukémií, jak je ukázáno v Tabulce 8.

-23 CZ 293433 B6

Tabulka 3

Nádor	Celková dávka	Dávkování	Úbytek váhy v	Hodnota T/C v	Bez nádoru	Počet dnů
Lidský	960	16 hodinová	-0.4	16%	1/4	33
adenosquamózní	600	infuje	-0.4	16%	0/4	132
nádor plic #125		dny 7,20	-0.4	15%	0/5	33
Nádor prsu 16/C	720	4 hod	-2.0	18%	0/7	13
	454	infuze dny 1,4	-1.2	16%	0/7	13
Nádor prsu 16/C/Adr*	960	3 dny infuze dny 1,4	-2.8	23%	0/7	27
Adenokarcinom	732	3-15 bolus	-2,0	0%	1/5	100
tlustého střeva #38	477		-2,8	9%	0/5	100
Adenokarcinom	960	4 hod	-2.9	11%	2/7	20
tlustého střeva	60	infuze	-2.9	11%	1/7	100
#38		dny 6,13	-2.0	26%	0/7	20
Tlusté střevo	720	3 hod infuze	-1.1	8%	0/5	50
#51	454	dny 3,7	-2.8	12%	0/7	50
Pankreas 03	222	3 hodinová	-1,6	0%	1/4	108

infuze * adriamycin rezistentní

Tabulka 4

Nádor	Celková dávka	Dávkování	Úbytek váhy v	Hodnota T/C v	Bez nádoru	Počet dnů
Adenokarcinom	82	dny 6-9	-1.7	1	2/7	132
tlustého střeva	51	bolus	-1,2	18	1/7	132
#38
Nádor prsu 16/C	82	dny 1-4	-3,0	6	0/5	23
	51	bolus	-1,2	13	0/5	23
Tlusté střevo	96	dny 3-6,	-3,0	14	0/6	32
#51/A	66	9,11	-2,3	28	0/6	32
Pankreas 02	82	dny 1-4	-2,0	23	0/5	28
	51	bolus	-1,2	42	0/5	28
Pankreas 03	124	dny 3-4,	-1,6	0	3/5	245
	79	6-14	-i,o	0	1/5	245

bolus

-24CZ 293433 B6

Tabulka 5

Nádor	Celková dávka mg/kg	Způsob podáni léku	Dávkovači schéma	Úbytek váhy v nadiru g/myš	Hodnota T/C v %	Poléková úmrtí	Bez nádoru	(Počet dnů obzervace)
Adenokarcinom tlustého	340	i.p.	dny 3-10	-2,0	0	0	5/5	168
střeva #38	196	i.p.	dny 3-10	-0,0	0	0	1/5	168
	112	i.p.	dny 3-10	+0,4	3	0	-	168
	550	p.o.	dny 3-7	-2,8	0	0	5/5	168
Tlusté střevo	500	p.o.	dny 3-7	-4,6	0	4/5	0/5	31
#51/A	250	p.o.	dny 3-7	-1,6	16	0	0/5	31
Nádor prsu	340	i.v.->p.o.	i v. 2x/den	-7,1	32	5/6	0/6	27
16/C/Adr*			den 1-4; p.o.
			den 5
	284	i.v. ->p.o.	i.v. 2x/den den 1-4; p.o. den	-2,3	61	3/6	0/6	22
			5-6
	183	i.v. —>p.o.	i.v. 2x/den den	-4,3	39	0/4	0/4	22
		1-4; p.o

* adriamycin rezistentní

Tabulka 6

Nádor	Celková dávka mg/kg	Způsob podání léku	Dávkovači schéma	Úbytek váhy v nadiru g/myš	Hodnota T/C v %	Poléková úmrtí	Bez nádoru	(Počet dnů obzervace)
Pankreas 03	420	i.v.	dny 3-6	-5,6	0	3/5	2/5	45
	240	i.v.	dny 3-6	-0,4	0	0	5/5	45
	155	i.v.	dny 3-6	-0,4	0	0	5/5	45
Adenokarcinom	330	i.v.	dny 3-7	-3,2	0	0	5/5	33
tlustého	220	i.v.	dny 3-7	-0,8	0	0	5'5	33
střeva #38	147		dny 3-7	0	0	0	5/5	33
Nádor prsu	363	i.v.	dny 1-4	-2,4	2	2/5	2/5	21
16/C	242	i.v.	dny 1-4	1,2	8	1/5	0/5	21
	161		dny 1-4	-0,4	9	0	0/5	21
Nádor prsu	297	i.v.	dny 1-6	-2,4	39	0	0/5	26
MX-1	132	i.v.	dny 1-6	-0,8	27	0	0/5	26

(a): Některé injekce byly změněny po 2-4 dnech na p.o. podání v důsledku poškození ocasní žíly.

Tabulka 7

Příklad č.	Celková dávka mg/kg	Způsob podání léku	Dávkovači schéma	Úbytek váhy v nadiru	Hodnota T/Cv%	Poléková úmrtí	Bez nádoru	Počet dnů obzervace
30 (H)	900	i.v. infuze	infuze dny 1,4	0	29	1/6	0/5	63
	600	i.v. infuze	infuze dny 1,4	-0,7	32	0/5	0/5	63
	400	i.v. infuze	infuze dny 1,4	-1,0	46	0/5	0/5	63
31(C)	224	i.v.	2X/den, dny 3-6	-4,4	0	0	1/5	28
	156,8	i.v.	2X/den, dny 3-6	-1,6	5	0	0/5	28
	109,6		2X/den, dne 3-6	-1,6	6	0	1/5	28

-25CZ 293433 B6

Tabulka 8

Přiklad č.	#bunék P388/Adr implantov aných i.v. v	Celková dávka mg/kg	Způsob podáni léku	Dávkovači schéma	Úbytek váhy v nadiru g/myš	Poléková úmrtí	% ILS	Logio zahubeni nádorových bunčk	Nádorové buňky	Počet dnů obzervace
10	10 na 5	520	3 hodinová i.v. infuze	dny 1,4	-3,75	3/7	54	3,5	0/7	129
	10 na 5	320	3 hodinová i.v infuze	dny 1,4	-1,75	0/5	23	1,5	0/5	129
	10 na 5	200	3 hodinová i.v. infuze	dny 1,4	-1,5	0/7	8	0,5	0/7	129
13	10 na 5	450	3 hodinová	dny 1,4	-3	2/7	38	2,5	0/7	129
	10 na 5	300	3 hodinová i.v. infuze	dny 1,4	-1,75	0/7	15	1	0/7	129
	10 na 5	150	3 hodinová	dny 1,4	-1,75	0/8	8	0,5	0/8	129
30 (H)	10 na 5	450	3 hodinová i.v. infuze	den 1	-2,3	0/7	62	5,3	0/7	43
	10 na 6	280	3 hodinová i.v. infuze	den 1	-1,7	0/7	69	6	2/7	43
31 (C)	10 na 6	248	i.v. ->p.o.*	dny 1,4	-3	1/6	0	0	0/6	43
	10 na 6	112	i.v. —>p.o. *	dny 1,4	-2,7	0/6	80	0	0/6	43
34	10 na 6	320	3,5 hodinová	den 1	-3,6	5/5	toxi	LD100	0/5	23
		198	3,5 hodinová i.v.infuze	den 1	-1,2	0/5	41,7	3,3	0/5	23
		123	3,5 hodinová	den 1	-1,2	0/5	8,3	0,7	0/5	23
		76	3,5 hodinová	den 1	-0,4	0/5	0	0	0/5	23

i.v. infuze *: den 4 p.o. injekce v důsledku poškození ocasní vény.

% ILS = procentuální zvýšení délky života.

V průběhu výše popsaného testování se výzkumný tým potýkal s problémy degradace injekčních roztoků, které nebyly připraveny čerstvě před injekcí. Projekt byl poté pojat, aby zajistil přípravu injekčních roztoků, které se nedegradují stáním, takže protinádorové látky mohou pak býti 10 použity v medicíně v léčbě nádorů.

Sloučenina Příkladu 6, mající vzorec

a chemický název N-[[l-[[2-(Dimetylamino)eyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]-metyl]metan15 sulfonamid, vykazující cytotoxickou antineoplastickou aktivitu, byla použita ve studiích projektu.

Tato sloučenina bude dále pro zjednodušení označována jako WIN 33377. Sloučenina byla v klinických studiích hodnocena ve formě terminálně stabilizovaného roztoku v ampulích o koncentraci 2,5 mg/ml v citrátovém pufru (pH 5,5). Aby se dosáhlo přijatelného skladování,

-26CZ 293433 B6 byly preparáty skladovány v lednici při teplotě 2-8 °C. Skladování při vyšších teplotách vedlo k tvorbě velmi málo rozpustných dimerů, které při nižších koncentracích precipitovaly, K zajištění komerčně přijatelného produktu, který by mohl být skladován při pokojové teplotě může být nezbytné použití metody lyofilizace preparátů.

Tyto preparáty byly připraveny, jak je ukázáno v Tabulce 9:

Tabulka 9

Složení	1	2	3
WIN 33377	10,0 mg	10,0 mg	10,0 mg
Kyselina octová (0,lM)	0,5 ml
Kyselina citrónová (0,lM)		9,6 mg
Kyselina mléčná (0,lM)			0,5 ml
Hydroxid sodný (0,5M)		8,8 μΐ	12 μΐ
Voda pro injekce	1 ml	1 ml	1 ml
_	4,95	3,98	3,99

Vodné roztoky WIN 33377 byly připraveny před přidáním stabilizérů.

K roztokům byly přidány tři stabilizační látky v různých koncentracích: manitol (Fison AR stupeň M/2405), dextran (Sigma Chemical Co. Klinický stupeň D-4751) a sacharóza (Prolabo Normapur AR stupeň 27480,294).

Byl použit přístroj Perkin-Elmer DSC-II vybavený přídavným zařízením. Data byla hodnocena a analyzována na mikropočítači Dell 210 se softwarem DARES. Kalibrace teploty byla provedena podle manuálu od výrobce s indiem a vodou jako referenčními materiály. Tekuté vzorky pro analýzu byly uzavřeny do velkých nádob z nerez oceli. Ty byly dány do kalorimetru při teplotě 27 °C a podrobeny cyklu ochlazení a zahřívání mezi teplotami -53 ^CC a 27 °C. Stupeň zahřívání a ochlazování byl 5 deg/min. Lyofilizované vzorky byly také uzavřeny do velkých nádob z nerez oceli, ale pod suchou dusíkovou atmosférou, ke snížení možnosti zvlhčení lyofilizátu. Ke zvýšení amplitudy signálu byl použit stupeň zahřívání a ochlazování 10 deg/min při teplotách nad -53 °C a 27 °C. Lyofilizace byla provedena v laboratorním lyofilizátoru.

Hodnocení stability lyofilizovaných vzorků bylo prováděno za použití vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Tato analýza byla provedena pro WIN 33377 a také pro detekci celkových chromatografických nečistot.

Metoda analýzy WIN 33377

Chromatografie byla provedena za následujících podmínek při použití HPLC zařízení (Kontron):

Sloupec:	Partisil ODS - 3, 5 pm, 10 x 0,46 cm
Mobilní fáze:	A:B (77:23 v/v)
kde a Rychlost:	A = 0,5 M amonium acetátový pufr, pH 4,8 B = acetonitril 2,0 ml/min
Detekční vlnová délka: Teplota:	258 nm 40 °C
Injekční objem:	20 μΐ

-27CZ 293433 B6

Metoda na celkové chromatografícké nečistoty

Pro určení celkových chromatografických nečistot byla použita HPLC technika gradientové eluce s následujícími parametry:

Sloupec: Hypersil BDS, Cl8, 5 gm, 25 x 0,46 cm i.d.

Mobilní fáze: A: 7,71 g/1 amonium acetátů + 6,0 ml/1 ledové kyseliny octové + 10 ml/1 triethylaminu, upraveného na pH 4,8

B: acetonitril

Podmínky gradientu

Čas (min)	%A	%B
0,00	80	20
30,00	80	20
60,00	60	40
70,00	60	40
70,01	80	20
80,00	80	20
Průtok:		2,0 ml/min
Vlnová délka detektoru:		438 nm
Teplota:		40°
Injekční objem:		25 gl

Příprava preparátů

První krok v lyofilizačním procesuje plně charakterizovat fyziochemické vlastnosti roztoků ještě před provedením vlastní lyofilizace. Vzorky třech postupů, jak jsou uvedeny v Tabulce 9, byly analyzovány pomocí DSC podle postupu popsaného výše. Relevantní přechodné teploty jsou sumarizovány v tabulce 10.

Tabulka 10

Postup	Pufr	Teplota přechodu 1 (°C)	Teplota přechodu 2 (°C)
1	Acetát	-28	-17
2	Citrát	-33	-17
3	Laktát	-32

U těchto tří směsí byly nalezeny různé fyziochemické vlastnosti: směs na bázi acetátů byla krystalická; směs na bázi citrátu byla částečně krystalická zatímco zbývající část sklovatěla; a směs na bázi laktátu sklovatěla.

Z těchto tří typů vlastností představuje pro lyofilizaci částečná krystalizace největší problém. Částečná krystalizace je obvykle nepředvídatelná a v případě farmaceutik dodávaných v lahvičkách může tato částečná krystalizace způsobit mezi jednotlivými lahvičkami významné rozdíly ve struktuře zmrzlého produktu. Toto může následně způsobit rozdíly v účinnosti lyofilizace mezi jednotlivými lahvičkami. Konečným důsledkem je rozdíl v kvalitě produktu jedné série, jako například ve stabilitě, rehydrataci a trvanlivosti. Rozdíly v obsahu vlhkosti mezi jednotlivými lahvičkami jsou nejčastějším indikátorem výskytu tohoto problému.

Nekompletní krystalizaci v citrátové směsi může být zabráněno přidáním vhodných vehikul napomáhajících sklovatění do směsi. Toto vehikulum zabrání kiystalizaci jiných materiálů

-28CZ 293433 B6 a výsledkem je zesklovatění. Množství takovéhoto vehikula závisí na vlastnostech krystalizujícího materiálu a na stupni krystalizace. V naší přípravě jsme citrát odmítli především proto, že ačkoli byl lék rozpuštěn během iniciální přípravy, došlo v citrátovém pufru během několika hodin a při teplotě 4 nebo 25 °C kjeho krystalizaci. Protože lyofilizace neovlivňuje rozpustnost léku může v okamžiku rehydratace preparátu s citrátem nastat problém s rozpuštěním a navíc se může také během podávání léku objevit sporadicky krystalizace.

Celkový objem solutů všech tří směsí byl nízký, okolo 1 až 2 %. Tato koncentrace je nedostatečná k udržení adekvátní struktury lyofilizovaného vzorku; z tohoto důvodu bylo nutno změnit směs. Krystalická směs 1 vyžadovala přidání objemné látky. Na druhé straně směs 3 (amorfní) vyžadovala přidání látky napomáhající zesklovatění. Vybranými stabilizačními látkami byly manitol pro krystalickou směs a sacharóza nebo dextran pro amorfní směs. Tyto stabilizační látky byly přidány k roztokům popsaných v Tabulce 9 v koncentracích 50 mg/ml. Vzorky těchto roztoků byly analyzovány pomocí DSC.

DSC měření umožnilo získat hodnoty přechodných teplot sklovatění pro všechny tři směsi. Tyto teploty představují maximální přípustné primární vysoušeči teploty, pokud chceme minimalizovat zhroucení a zhoršení kvality produktu. Systém obsahující dextran má nejvyšší přechodnou teplotu sklovatění a umožňuje, jak se stupeň sublimace ledu zvyšuje se zvyšující se teplotou, nejkratší vysoušeči cyklus. Ovšem WIN 33377 vyžaduje opakované podání a za těchto podmínek může dextran způsobit anafylaktický šok. Z tohoto důvodu bylo toto složení preparátu pro klinické účely odmítnuto.

Pro další dvě varianty byly učiněny následující objevy.

Pro složení se sacharózou/laktátem by mělo být primární sušení provedeno při teplotě -40 °C. Tato teplota zahrnuje limit bezpečnosti 5 °C (dostatečný pro používané lyofilizační zařízení), který umožňuje kompenzaci teplotních gradientů v lyofilizátoru. Každá lahvička obsahovala 10 ml produktu s průměrnou hloubkou náplně 1,63 cm. Průměrem lahvičky 2,8 cm bylo dosaženo plochy povrchu produktu 6,15 cm². Efektivní stupeň sublimace pro tyto vzorky byl spočítán jako 0,226 g/lahvičku/h celkové hmotnosti produktu; přibližně 9,4 g tvořil led a zbytek byl tvořen pevnými látkami a nezmrzlou vodou. Při rychlosti 0,226 g/hodinu je vyžadováno přibližně 42 hodin ke kompletní sublimaci ledu při -40 °C.

Pro smíšené složení s manitolem/acetátem musí být primární vysoušení provedeno pod nejnižším teplotním přechodem detekovaným pomocí DSC pro acetátové složení, tj. -30 °C. Plnicí objemy a rozměry lahviček byly stejné, ale sublimace mohla prováděna při vyšších teplotách; vypočítaný stupeň efektivní sublimace byl pro tyto vzorky 0,670 g/lahvičku/hodinu. Stejně jako v předchozím případě bylo sublimováno 9,4 g ledu; primární vysoušeči čas byl zkrácen na 14 hodin.

Uchovávání produktů při doporučených teplotách po dobu popsanou výše zajistí, při teplotě sublimační fronty stejné s ledovým jádrem, dokončení primárního vysoušení. Teplota produktu musí být poté zvýšena postupně na teplotu skladování, aby se odstranila reziduální vlhkost produktu.

Příprava lyofílizovaných produktů

Tabulka 11 ukazuje proměnné veličiny pro lyofílizaci roztoků pufrovaných acetátem a laktátem stabilizovaných manitolem a respektive sacharózou.

-29CZ 293433 B6

Tabulka 11

Složení	Manitol	Sacharóza
Objem lahvičky (ml)	20	20
Plnící objem (ml)	10	10
Hloubka náplně (cm)	1,63	1,63
Primární vysoušeči teplota (°C)	-30	-40
Primární vysoušeči čas (hod)	14	42

Stupeň zvyšování teploty během sekundárního vysoušení deg/hod

	4	4
Konečná vysoušeči teplota (°C)	25	25
Tlak během primárního vysoušení (mbar)	0,3	0,1

Vzorky předkládaného vynálezu jsou lyofilizovány pomocí následujícího procesu.

Podle požadavku na dávku preparátu jsou zvoleny lahvičky příslušných rozměrů. Ve zvolených lahvičkách by neměl k upravení konečné dávky plnící objem překročit určitou část objemu lahvičky. Například 5 ml náplň by neměla být plněna do lahviček s objemem menším než 10 ml. Po naplnění jsou lahvičky dány do vysoušeči komory a umístěny přímo na chladicí poličky, které byly předchlazeny na teplotu 4 °C. Do určitého množství lahviček jsou umístěny termoelektrické články k monitoraci teploty preparátu během lyofilizačního procesu. Lahvičky jsou poté temperovány na teplotu poliček (4 °C) před ochlazením těchto poliček na teplotu -40 °C pro vzorky se sacharózou a na teplotu -30 °C pro vzorky s manitolem. Po dosažení těchto teplot pro jednotlivé vzorky, jsou lahvičky udržovány při této teplotě po dobu přibližně 2 hodin, aby bylo dosaženo kompletního zmrazení vzorku. (Pro vzorky s manitolem je v této fázi zahrnut chladicí krok). Po tomto časovém intervalu jsou ochlazeny kondenzovací cívky na -60 °C a je zapnuta vakuová pumpa k \y prázdnění kondenzovací komory s následným procesem primárního a sekundárního vysoušení. V primárním procesu vysoušení je hlavní ventil mezi kondenzátorem a vysoušeči komorou otevřen a vysoušeči komora je vyprázdněna tlakem okolo 100 mikronů plynného dusíku. Tato část lyofilizačního cyklu (primární vysoušení vyžaduje okolo 40 až 50 hodin. Primární vysoušeči proces je ukončen, když všechen led zmizí ze zmrzlé matrix. V sekundárním vysoušecím procesu se teplota zvyšuje z -20 °C nebo -30 °C na +25 °C k odstranění reziduální vlhkosti, která nebyla odstraněna během primárního vysoušecího procesu. Toto sekundární vysoušení je vyžadováno po dobu přibližně 15 hodin.

Po dokončení sekundárního vysoušecího procesu je hlavní ventil uzavřen a vysoušeči komora je naplněna dusíkem, aby bylo udrženo v komoře slabé vakuum. Poté je aktivováno zátkovací zařízení a do lahviček jsou zatlačeny zátky. Vysoušeči komora je poté uvedena v rovnováhu s atmosférickým tlakem a dveře komory jsou otevřeny k odstranění lahviček a aplikaci plisovacích uzávěrů. Lahvičky jsou poté uskladněny při předepsané teplotě až do rekonstituce vodou pro injekce.

Výsledky stability

Stabilita lyofílizováných produktů byla hodnocena po skladování při teplotách 30 °C, 40 °C a 50 °C po dobu 4 týdnů. U vzorků byly provedeny analýzy vzorků a studie na chromatografické nečistoty. Výsledky preparátů s manitolem neprokázaly signifikantní změnu po skladování produktu po dobu 4 týdnů při teplotách do 50 °C. Celkové chromatografické nečistoty se zvýšily z původních 0,35 na 0,54% w/w při 30 °C, 0,49% w/w při 40 °C a 0,56% w/w při 50 °C. Obsah vlhkosti produktu byl 2,4% w/w a vzhled lyofilizátu byl uspokojivý, tj., že nebylo pozorováno žádné zhroucení lyofilizátu. Avšak dvě lahvičky z pěti nebylo možno rehydrovat na jasně žlutý roztok. Lahvičky, které mohly být rekonstituovány na čisté roztoky měly nižší pH (5,0) než ty, které čisté roztoky netvořily (pH 5,6). Tento posun byl považován za důsledek odpaření kyseliny octové během lyofilizace.

-30CZ 293433 B6

Výsledky stability pro preparáty se sacharózou (s 5% reziduální vlhkostí) neprokázaly žádnou změnu v preparátu ani v obsahu celkových chromatografických nečistot po skladování produktu po dobu 4 týdnů při teplotách 30 °C a 40 °C. U lahviček skladovaných při 50 °C bylo prokázáno snížení v analýze preparátu a zvýšení v obsahu celkových chromatografických nečistot. U někte5 rých vzorků bylo pozorování zhroucení lyofilizátu po dvou týdnech skladování při všech použitých teplotách.

Výsledky stability preparátu WIN 33377 smanitolem jsou ukázány v Tabulce 12, zatímco výsledky stability preparátu WIN 33377 se sacharózou jsou ukázány v Tabulce 13.

Tabulka 12

		Původně		2 týdny		4 týdny
Teplota	lék	nečistoty	lék	nečistoty	lék	nečistoty
	%w/w	%w/w	%w/w	%w/w	%w/w	%w/w
Pokojová teplota	101,6	0,35	—			—
30 °C	-	-	100,3	0,43	98	0,54
40 °C	—	—	102,5	0,54	100,9	0,49
50 °C	—	—	101	0,65	98,1	0,56
15 Tabulka 13		Původně		2 týdny		4 týdny
Teplota	lék	nečistoty	lék	nečistoty	lék	nečistoty
	%w/w	%w/w	%w/w	%w/w	%w/w	%w/w
Pokojová teplota	98,4	0,35	—	—	—	—
30 °C	—	-	98,4	0,32	96,8	0,33
40 °C	—	—	98,2	0,31	98,1	0,34
50 °C	-	-	96,8	0,51	95,2	0,87

Podle výsledků studie bylo určeno vhodné složení lyofilizátů (laktát-sacharóza), ale toto složení 20 může být ještě optimalizováno a přidány další požadavky na konečné použití. Bylo zjištěno, že koncentrace léku v původním roztoku může být zvýšena na 20 mg/ml, čímž dojde ke zmenšení plnicího objemu na polovinu a umožní se tak snížit primární vysoušeči čas. Také bylo důležité vyrovnat izotonicitu preparátu přidáním chloridu sodného. Protože sůl ovlivní přechodovou teplotu sklovatění (Tg'), bylo toto přepracované složení analyzováno pomocí DSC (Tabulka 14). 25 Změřené přechodové teploty sklovatění jsou uvedeny v Tabulce 15.

Tabulka 14 - Test různých složení k určení relativních účinků NaCl a sacharózy na pufrovaný roztok WIN 33377

Složení	A	B	C	D
WIN33377	200,0 mg	20,0 mg	20,0 mg	20,0 mg
kyselina mléčná (0,1 M)	0,5 ml	0,5 ml	0,5 ml	0,5 ml
hydroxid sodný (0,5 M)	12 μΐ	12 μΐ	12 μΐ	12 μΙ
Sacharóza	100 mg	50 mg	40 mg	30 mg
NaCl	2,7 mg	2,7 mg	3,8 mg	5,0 mg
Voda pro injekce do	1 ml	1 ml	1 ml	1 ml
PH	3,99	3,99	3,99	3,99

-31 CZ 293433 B6

Tabulka 15 - Hodnoty přechodových teplot sklovatění pro složení uvedená v Tabulce 14.

Složení

Kontrolní složení A bez NaCI A

B

C

D

Tg' (°C)

-42,5

-45,5

Jak je ukázáno, přidání NaCI snižuje teplotu sklovatění zmrzlého koncentrátu. NaCI má přechodovou teplotou sklovatění, která je mnohem nižší než u sacharózy (-87 °C ve srovnání s -32 °C). Z tohoto důvodu tedy jak dochází ke zvyšování hmotnosti části NaCI (A až D), dochází také ke snižování přechodových teplot sklovatění až na hodnotu čistého NaCI. Přidání NaCI ke standardnímu složení s 5% sacharózou způsobuje snížení přechodové teplotě sklovatění o 2 °C. Snížení koncentrace sacharózy a kompenzační zvýšení koncentrace NaCI, které je nezbytné k udržení izotonicity, způsobuje další snížení přechodové teploty sklovatění. Přechodová teplota sklovatění vysušeného produktu může být považována za maximální teplotu, která může být produkt exponován. Překročení této teploty způsobí zhroucení lyofilizátu odpařením tekutiny produktu. V tomto stavu se poměr difúze rapidně zvyšuje, což vede k degradaci aktivního materiálu. Přechodová teplota sklovatění závisí na obsahu vlhkosti; proto jakákoli rozdíly v obsahu vlhkosti mezi jednotlivými produkty jedné série způsobí rozdíl v přechodové teplotě sklovatění. Z tohoto důvodu je dobré skladovat produkt alespoň 5 °C pod změřenou teplotou sklovatění, což umožňuje využít vyšší maximální teplotu skladování v každé sérii produktů.

Složení obsahující roztok WIN 33377 (100 mg) a sacharózu ve 20 ml lahvičkách

Složka_____________________

WIN33377

Sacharóza

Chlorid sodný

0,5 M roztok kyseliny mléčné

1,0 M hydroxid sodný

Voda pro injekce ad pH (rozmezí 3,70 až 4,30)

Množství (mg na lahvičku)

100,0

250,0

5,0 ml

1,0 ml 57,0 μΐ

5,0 ml

4,00

Stabilita preferovaného složení se sacharózou byla hodnocena během skladování při teplotě 30 °C a 40 °C po dobu až 6 měsíců. Výsledky analýzy a pH jsou uvedeny v Tabulce 16. Produkt má výchozí obsah vlhkosti 1,3 % w/w. Zhroucení produktu bylo pozorováno po 2 týdnech skladování při teplotě 40 °C. Toto bylo očekáváno, neboť tato teplota skladování byla blízká přechodové teplotě sklovatění pro tuto sérii (42 °C). Výsledky stability ukazují, že produkt je chemicky stabilní, tj., že nebyly pozorovány po 6 měsících skladování při teplotě 30 °C nebo 40 °C žádné změny v analýze preparátu nebo pH.

-32CZ 293433 B6

Tabulka 16

WIN 33377 (%w/w)

Doba	Teplota (°C)	duplikát	analýza	PH
Výchozí	místnosti	90,85	90,95	3,95
3 týdny	30 °C	89,13	89,28	3,96
	40 °C	90,14	89,79	3,94
2 měsíce	30 °C	90,81	92,36	3,95
	40 °C	88,59	89,49	3,95
4 měsíce	30 °C	93,88	91,93	3,99
	40 °C	95,52	95,2	4,00
6 měsíců	30 °C	90,08	87,68	4,02
	40 °C	88,4	86,75	4,05

Zvýšená stabilita dosažení v předkládaném vynálezu dovolila skladování produktu při teplotě místnosti a zvýšila jeho trvanlivost. Tento lyofilizovaný produkt je vhodný pro balení buď v konvenčních skleněných lahvičkách, nebo v předplněné injekci. Produkty těchto složení jsou velmi prospěšné v léčbě nádorů.

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rekostituovaný lyofilizovaný prostředek pro léčbu savčích nádorů, vyznačující se tím, že obsahuje:

   (a) od 1 do 50 mg/ml protinádorové látky mající obecný vzorec I:

   ve kterém:

   n je
2. 2 nebo 3;

   R¹ a R² znamenají navzájem na sobě nezávisle alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku; Q je zbytek vybraný ze skupiny zahrnující CH2NHR³, CH2N(R⁴)SO2R⁷, CH2NHCHO, CH=N-Ar, C(O)NR⁵R⁶, CH2N(R⁴)C(O)R⁷, CH2N(C₂H₅)CHO, CH₂N(R⁴)P(O) (O-alkyl)2 obsahující v alkylové části 1 až 4 atomy uhlíku, CH2N=CH-N(R⁹)(R¹⁰), CH2N(R⁴)C(O)CF₃ a CH₂N(R⁴)C(O)OR⁷,

   R³ je vodík nebo alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku;

   R⁴ je vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy vodíku nebo Ar;

   R⁵ je vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo Ar;

   R⁶ je vodík nebo alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku;

   -33CZ 293433 B6

   R⁷ je alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo Ar;

   R⁸ je vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo hydroxylová skupina;

   5 Ar je fenylová skupina nebo fenylová skupina substituovaná methylovou skupinou, methoxylovou skupinou, hydroxylovou skupinou, halogenem nebo nitroskupinou s tou podmínkou, že když n je 2, R¹ a R² jsou ethylová skupina, R⁸ je vodík a Q je skupina CH₂NHSO₂Ar, že skupina Ar nemůže být 4-monosubstituována methylovou skupinou nebo halogenem; a

   10 R⁹ a R¹⁰ jsou navzájem na sobě nezávisle alkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku;

   nebo její farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou nebo solvát odvozený od této sloučeniny,

   15 (b) od 10 do 125 mg/ml stabilizační látky vybrané ze skupiny zahrnují manitol a sacharózu; a (c) od 0,025 do 0,25 M laktátového pufru, přičemž uvedený prostředek má hodnotu pH v rozmezí od 3,0 do 4,5.

   20 2. Rekonstituovaný lyofilizovaný prostředek podle nároku 1, vy zn ač uj í c í se tím, že dále obsahuje od 1,0 do 10,0 mg/ml chloridu sodného.
3. 3. Rekonstituovaný lyofilizovaný prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že laktátový pufr je na bázi laktátu sodného.
4. 4. Rekonstituovaný lyofilizovaný prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje:

   (a) od 1 do 20 mg/ml protinádorové látky mající obecný vzorec (II),

   R¹ ve kterém:

   n je 2 nebo 3;

   35 R¹ a R² znamenají navzájem na sobě nezávisle alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku; Q je zbytek vybraný ze skupiny zahrnující CH2NHR³, CH2NHCHO, CH=N-Ar, C(O)NR⁵R⁶,

   CH₂N(R⁴)C(O)R⁷, CH2N(C2H5)CHO, CH2N(R⁴)P(O)(O-alkyl)2 obsahující v alkylové části 1 až 4 atomy uhlíku, CH₂N=CH-N(R⁹)(R¹⁰), CH2N(R⁴)C(O)CF3 a CH₂N(R⁴)C(O)OR⁷,

   R³ je vodík nebo alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku;

   R⁴ je vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy vodíku nebo Ar;

   R⁵ je vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo Ar;

   R⁶ je vodík nebo alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku;

   -34CZ 293433 B6

   R⁷ je alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo Ar;

   R⁸ je vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo hydroxylová skupina;

   Ar je fenylová skupina nebo fenylová skupina substituovaná methylovou skupinou, methoxylovou skupinou, hydroxylovou skupinou, halogenem nebo nitroskupinou; a

   R⁹ a R¹⁰ jsou navzájem na sobě nezávisle alkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku;

   nebo její farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou nebo solvát odvozený od této sloučeniny, (b) od 30 do 100 mg/ml stabilizační látky vybrané ze souboru zahrnující manitol a sacharózu; a (c) od 0,025 do 0,25 M laktátového pufru, přičemž uvedený prostředek má hodnotu pH v rozmezí od 3,5 do 4,5.
5. 5. Rekonstituovaný lyofilizovaný prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že dále obsahuje od 1,0 do 10,0 mg/ml chloridu sodného.
6. 6. Rekonstituovaný lyofilizovaný prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že laktátový pufr je na bázi laktátu sodného.
7. 7. Rekonstituovaný lyofilizovaný prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že obsahuje:

   (a) 1 až 50 mgN-[[l-[[2-(dimethylamino)ethyl]amino]-9-oxothioxanten-4-yl]methyl]methansulfonamidu;

   (b) 0,025 až 0,25 M pufru na bázi laktátu sodného;

   (c) od 10 do 125 mg sacharózy;

   (d) od 1,0 do 10 mg chloridu sodného;

   (e) přičemž doplněk do 1,0 mililitru činí voda.
8. 8. Rekonstituovaný lyofilizovaný prostředek podle nároku 1 pro použití jako léčivo pro léčbu citlivých nádorů u savců.
9. 9. Rekonstituovaný lyofilizovaný prostředek podle nároku 4 pro použití jako léčivo pro léčbu citlivých nádorů u savců.
10. 10. Rekonstituovaný lyofilizovaný prostředek podle nároku 7 pro použití jako léčivo pro léčbu citlivých nádorů u savců.