CZ291179B6

CZ291179B6 - Léčivo pro modulaci antigen-specifické imunitní reakce

Info

Publication number: CZ291179B6
Application number: CZ19972213A
Authority: CZ
Inventors: Agnes How-Ching Chan; David William Carey Hunt; Julia Levy; Modestus Onuora Kay Obochi; Anna Richter; Guillermo O. Simkin
Original assignee: Qlt Inc.
Priority date: 1995-01-17
Filing date: 1996-01-11
Publication date: 2003-01-15
Also published as: JPH10512268A; PL321362A1; NO973293L; AU706796B2; NO973293D0; FI972952A0; US6008241A; KR100332554B1; NZ298356A; CZ221397A3; TW384222B; MX9705376A; JP3574456B2; FI972952A; EP0794775A1; AU4381996A; US5789433A; HUP9801528A3; KR19980701484A; WO1996022090A1

Abstract

Pou it zelen ho profyrinu k v²rob l iva pro modulaci antigen-specifick imunitn reakce u subjektu za nep° tomnosti z °en absorbovan ho zelen²m porfyrinem, p°i em modulace prob h b hem imunitn reakce na antigen. e se rovn pou it zelen ho porfyrinu k v²rob l iva pro modulaci nevhodn intercelul rn komunikace za nep° tomnosti z °en absorbovan ho zelen²m porfyrinem, a uveden modulace prob h b hem uveden nevhodn intercelul rn komunikace.\

Description

Léčivo pro modulaci antigen - specifické imunitní reakce

Oblast techniky

Vynález se týká modulace imunitní reakce podáváním zelených porfyrinů za nepřítomnosti světla. Antigenspecifické imunitní reakce jsou modulovány, když se zelené porfyriny podávají během průběhu odezvy na specifický antigen. Vedle toho zelené porfyriny interferují za nepřítomnosti světla s intercelulámí komunikací a tak umožňují prevenci nebo léčbu např. restenózy.

Dosavadní stav techniky

Skupina sloučenin užitečných ve fotodynamické terapii, souhrnně označovaných jako zelené porfyriny, je popsána v sérii patentů zahrnujících US 5 283 255; 4 883 790; 4 920 143; 5 095 030 a 5 171 749, a na tyto vynálezu se zde odkazuje. Tyto zelené porfyriny se připravují dielsovouAlderovou reakcí s hemotoporfyrinem a případným přesmykem nebo redukcí vzniklého produktu. Jak je uvedeno ve svrchu uvedených patentech, je zvláště výhodnou formou derivátů benzoporfyrinu ve formě monokyseliny, čili BPD-MA. Tento derivát se v současnosti klinicky zkouší v souvislosti s fotodynamickou léčbou různých nádorů a dalšími případy.

Fotodynamická terapie spočívá na předpokladu, že podávané fotoaktivní látky, v tomto případě zelené porfyriny, nemají za nepřítomnosti světla fyziologický efekt. Avšak po ozáření vyvolají exditované formy těchto sloučenin místní toxické efekty. Proto se např. při léčbě tumorů s výhodou využívá tendence těchto fotoaktivních sloučenin být zadržovány ve tkáni tumorů po vymizení z tkáně normální. Bylo i zjištěno, že lokální ozáření neovaskulámích oblastí je účinné i předtím, než sloučeniny vymizely z normálních tkání.

Nyní se zjistilo, že zelené porfyriny mají imunomodulační aktivitu a zasahují do mezibuněčné komunikace nezávisle na jejich schopnosti chovat se jako fotoaktivní činidla při PDT. Této dosud neočekávané vlastnosti zelených porfyrinů tento vynález využívá.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použití zeleného porfyrinů k výrobě léčiva pro modulaci antigen-specifické imunitní reakce u subjektu, za nepřítomnosti záření absorbovaného zeleným porfyrinem, přičemž modulace probíhá během imunitní reakce na antigen.

Rovněž je podstatou vynálezu použití zeleného porfyrinů k výrobě léčiva pro modulaci stavu charakterizovaného nevhodnou intercelulámí komunikací, za nepřítomnosti záření absorbovaného zeleným porfyrinem, a uvedená modulace probíhá během uvedené nevhodné intercelulámí komunikace.

Vynález výhodně využívá schopnosti zelených porfyrinů participovat na imunitní odezvě vyvolané jednotlivým antigenem. Výsledná imunomodulace je antigen-specifická, jak je zde níže ukázáno na základě výsledků získaných při zpožďované hypersenzitivní reakci. Subjekt může být tudíž chráněn proti nežádoucím odezvám souvisejícím s antigeny, alergeny atp., bez nevýhody všeobecného oslabení imunitního systému. Jak je zde níže objasněno, zelené porfyriny vedle toho zasahují do intercelulámí komunikace, k jaké dochází při trombóze. Je rovněž ukázáno, že zelené porfyriny vykazují konformační podobnost se známými integriny charakterizovanými sekvencí RGD. To dovoluje užití zelených porfyrinů k prevenci nebo ošetření stavů charakterizovaných nežádoucí intercelulámí komunikací.

Z jednoho hlediska je tedy vynález zaměřen na způsob modulace antigen-specifické imunitní odezvy u subjektu, který imunitní reakci podstupuje. Způsob modulace spočívá na podávání zeleného porfyrinu v množství efektivním pro modulaci imunitní reakce, za nepřítomnosti světla absorbovaného zeleným porfyrinem, přičemž podávání se děje během aktivní fáze imunitní reakce na antigen jako takový.

Z druhého hlediska se vynález zaměřuje na způsob modulace intercelulámí komunikace u subjektu, u kterého je taková modulace potřebná, a zahrnuje podávání zeleného porfyrinu v účinném množství pro modulaci mezibuněčné komunikace a to za nepřítomnosti světla absorbovaného zeleným porfyrinem, přičemž podávání se uskutečňuje během nežádoucí intercelulámí komunikace.

Z dalších hledisek zahrnuje vynález formulace zelených porfyrinů využitelné ve způsobu podle vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje reprezentativní struktury vzorců I, II, III, IV, V, VI sloučenin zelených porfyrinů, které se dají využít z tohoto vynálezu.

Obrázek 2 ukazuje superpozici konformace souboru konformací reprezentovaných RGDA.

Obrázek 3 ukazuje superpozici konformace souboru konformací reprezentovaných RGDB.

Obrázek 4 ukazuje superpozici konformace souboru konformací reprezentovaných RGDC.

Obrázek 5 znázorňuje superpozici trojrozměrné struktury BPD-MA s reprezentativní konformací

RGDA.

Obrázek 6 znázorňuje superpozici trojrozměrné struktury BPD-MA s reprezentativní konformací

RGDB.

Obrázek 7 znázorňuje superpozici trojrozměrné struktury BPD-MA s reprezentativní konformací

RGDC.

Obrázek 8 ukazuje srovnání vlivu čtyř BPD analogů na DTH odezvu u dosud nepoužitých, neoholených Balb/c myší.

Případy, kdy je imunitní odezva na určitý antigen nežádoucí, jsou četné. Mezi nimi mají přední místo alergické reakce, autoimunní odezvy a imunitní odmítání transplantátů orgánů, kožní plastiky a podobné. Zelené porfyriny podle vynálezu jsou účinné, jsou-li podávány v aktivní fázi imunitní odezvy, a tudíž jsou účinné, jestliže jsou podány v časové periodě následující po expozici vůči antigenu anebo je-li aktivní forma imunitní odezvy během této souvislé fáze nepřetržitá.

Zelené porfyriny působí účinně, pokud neobsahují radiaci. Tím se míní, že se terč záměrně neozařuje. Nicméně minimální světelné pozadí přítomno být může. Jak se popisuje svrchu v části „Dosavadní stav techniky“, užívají se zelené porfyriny široce při postupech ve fotodynamické terapii.

Při těchto postupech se skupina buněk nebo tkáň, upravená tak, aby obsahovala podstatné množství zeleného porfyrinu, cíleně ozařuje světlem o vlnových délkách, které sloučeniny zelených porfyrinů obsahují. Absorpce těchto vlnových délek zelenými porfyriny vyvolá takovou excitaci jejich molekul, že seje obklopující materiál zničí. Má se za to, že se při rozpadu excito

-2CZ 291179 B6 váných sloučenin vytváří singletový kyslík, který je za toxicitu zodpovědný. O samotném fotoaktivním činidle se předpokládá, že není toxické.

Ve způsobech podle předkládaného vynálezu není do postupu zahrnuto ozařování světlem pro vyvolání excitace. Zamezovat dopadu světla na subjekt, který je ošetřován, není však nutné. V tomto textu užívaný obrat „za nepřítomnosti záření absorbovaného zelenými porfyriny“ odkazuje spíše na typické okolní podmínky než na úplnou tmu. To jednoduše znamená, že ve způsobech podle vynálezu se nevyužívají známé fotodynamické efekty zelených porfyrinů.

Zelené porfyriny

Podstata zelených porfyrinů je popsána v patentech zde svrchu citovaných v odstavci „Dosavadní stav techniky“. Ve stručnosti jsou to deriváty protoporfyrinu IX, které se dají získat DielsovouAlderovou reakcí se substituovaným acetylenem, případně následovanou přesmykem a/nebo redukcí. Typické vzorce takto získaných sloučenin jsou uvedeny na obrázku 1, zelený porfyrin je sloučeninou vzorce I, II, III, IV, V, VI nebo jejich směsí, kde každý ze symbolů R¹ aR² je nezávisle volen ze skupiny, zahrnující alkoxykabonyl -CONR⁵CO, kde R⁵ je aryl (6-10C) nebo alkyl (1-6C); každý ze symbolů R³ je nezávisle karboxyl, karboxyalkyl (2-6C), nebo jeho sůl, amid, ester; nebo acylhydrazon, anebo alkyl(l-6C); R⁴ je CH=CH2 nebo -CH(OR⁴)CH3, kde R⁴je H nebo alkyl(l—6C).

Preferovaná provedení sloučenin znázorněných na obrázku 1 jsou ta, v nichž cyklický systém odpovídá vzorcům III resp. IV na obrázcích 1-3 nebo 1-4, a/nebo v nichž význam symbolů R¹a R² je nezávisle volen ze skupiny sestávající z alkoxykarbonylu (2-6C), alkylu (1—6C), arylsulfonylu (6-10C) či kyanoskupiny a -CNR⁵CO, kde R⁵ je aryl (6-10C) nebo alkyl (1—6C); R³ je nezávisle karboxyl, karboxyalkyl (2—6C) nebo jeho sůl, amid, ester; nebo acylhydrazon, nebo alkyl (1-6C); R⁴ je CH=CH, nebo -CH(OR⁴')CH₃, kde R⁴‘ je H nebo alkyl (1-6C). Mohou být ovšem užity i směsi.

Preferovány jsou zejména ty sloučeniny III a IV podle obrázků 1-3 a 1-4, ve kterých R¹ a R² jsou nezávisle alkoxykarbonyl(2-6C), jeden ze symbolů R³ představuje karboxyalkyl (2-6C) a druhý symbol R³ je ester karboxyalkylového (2-6C) substituentu a R⁴ je CH=CH₂ nebo -CH(OH)CH₃.

Zvlášť preferovaná je sloučenina III podle obrázku 1-3, kde R¹ a R² je methoxykarbonyl, jeden ze symbolů R³ je -CH₂CH2COOCH₃ a druhý symbol R³ je -CH2CH2COOH a R⁴ je CH=CH2Tato posledně jmenovaná sloučenina se označuje BPD-MA, což je akrynom pro monokyselinu benzohydroporfyrinového derivátu, u něhož proběhla Dielsova-Alderova adice na kruhu A.

Charakter ošetřovaných stavů

Podávají-li se zelené porfyriny subjektu z řádu obratlovců během průběhu aktivované imunitní odezvy na určitý antigen, modulují odezvu na specifický antigen, aniž by docházelo k úplné imunosupresi. Časování aplikace je snadnější, nebyl-li subjekt s podávaným imunogenem/antigenem ve styku.

Nežádoucí imunitní reakce na záměrně podávané antigeny byly pozorovány např. při transplantaci alogenních štěpů, jako kožních transplantátů, transplantátů orgánů, individuálních buněčných transplantátů jaké se užívají při náhradě inzulínu při diabetes a jiných chirurgických operacích a procedurách, při nichž se do subjektu záměrně zavádějí cizí buňky nebo tkáně. Další případy, při nichž může dojít k nežádoucí imunitní reakci vůči podávané látce, představují ty, kdy jsou na subjekt aplikovány proteiny xenogenního druhu. Typickým příkladem je aplikace monoklonálních látek při léčení tumorů.

-3CZ 291179 B6

V humánní terapii se v řadě případů používají monoklonální protilátky získané z myší, i když byly činěny pokusy s protilátkami původu lidského. Nežádoucí imunitní reakce na takové protilátky může být modulovány způsoby podle vynálezu.

V těchto případech se aktivuje primární imunitní reakce a podání zelených porfyrinů současně anebo bezprostředně po podání antigenu způsobu žádaný efekt.

Jiný případ, kdy dochází k imunitní reakci na cizí antigen, představují alergické reakce. Protože tyto odezvy jsou obecně sekundárními imunitními reakcemi, je podávání zelených porfyrinů podle vynálezu současně s touto sekundární expozicí nebo v časovém úseku krátce po ní rovněž účinné.

V obou předcházejících případech se zelený porfyrin aplikuje ve stejnou dobu jako podávaný antigen nebo alergen, anebo v časovém úseku potřebném pro aktivní reakci na antigen. Tato časová perioda je obvykle mezi 24 až 48 hodinami po podání antigenu.

Subjekty, pro které jsou postupy podle vynálezu vhodné, jsou obecně obratlovci, především savci. Organismy obratlovců zpravidla využívají podobné systémy intercelulámí komunikace a analogickými cestami projevují imunitní reakce. Zvlášť preferovanými subjekty jsou zdomácnělá zvířata a ptactvo, právě tak, jako subjekty lidské. Vhodný postup, dávkování a formulace bude ovšem závist na povaze subjektu.

Aplikace antigenu

Aplikace antigenu současně nebo krátce před podáním zeleného porfyrinů se bude měnit v závislosti na povaze antigenu. Pro záměrně podávané antigeny jako jsou léky, monoklonální protilátky nebo jiné cizí proteiny užívané v terapii nebo z diagnostických důvodů, bude dávkování a způsob aplikace řízen účelem, pro který je vůbec antigen ordinován, je běžné, že antigen bývá již dosažitelný ve vhodně formulované farmaceutické kompozici a dávkování a předpokládané postupy aplikace jsou již známy.

Pokud se týká alogenních štěpů, má se obecně za to, že buňky, které tvoří tkáň nebo orgány jedinců stejného druhu jako je zamýšlený příjemce a zahrnují cévní orgány jako srdce, ledviny, játra, plíce atd. a dále endokrinní žlázy, například pituitrinální, thyreoidální, adrenální, parathyroidální a pankreas, i kožní štěpy, přestože jsou imunogenní, nemusí obsahovat antigen s větší histokompatibilitou spouštějící odmítání transplantátu. Spíše se má za to, že tyto antigeny jsou přinášeny dárcovskými buňkami jako leukocyty, které v transplantovaných buňkách jsou jako nečistoty.

Aplikace zeleného porfyrinů může být tedy provedena současně nebo krátce po samotném transplantátu přinášejícím MHC-obsahující buňky anebo lze subjekt předem chránit podáváním relevantních histokompatibilních antigenů separátně, buď jako proteiny „per se“, nebo obsažených na povrchu buněk, které je nesou. Zelený porfyrin se potom dávkuje v čase blízkém před podáváním buněk nebo histokompatibilních antigenů. Např. hlavní determinanta lidské histokompatibility je označována HLA-DR ve skupině HC1II třídy antigenů. Ty se dále subklasifíkují a jestliže byl určen donor, subtyp DR antigenu může být podáván spolu s bezprostředním podáním zeleného porfyrinů před transplantátem samotným.

Je-li antigen alergenem, může být alergen podáván přímo injekcí nebo orálně spolu se zeleným porfyrinem nebo bezprostředně před podáním zeleného porfyrinů. Alternativně lze při podání napodobit přirozenou expozici např. tak, že se subjekt umístí do blízkosti rostlin, které obsahují pyl, o němž je známo, že u subjektu vyvolává alergickou reakci. Je-li subjekt umístěn do tohoto prostředí, aplikuje se zelený porfyrin současně nebo velmi brzy nato.

-4CZ 291179 B6

Jestliže je antigen autoantigenem, jak se má za to, v řadě případů, mezi něž patří revmatoidní artritida, roztroušená skleróza, lupus erythrematodes, určité druhy diabetů nebo zánětlivé reakce způsobované obecně autoantigenem, nelze podávání antigenu odděleně kontrolovat. Účinnost způsobu podle vynálezu závisí na pokračující aktivní imunitní odezvě na autoantigen, která u subjektu vzniká. V takovém případě se subjektu postiženému autoimunní chorobou podává zelený porfyrin během epizody, ve které je imunitní odezva nejzřetelnější.

Další případ, o kterém se myslí, že souvisí s autoimunní odezvou, je psoriáza. Pro léčbu tohoto stavuje metoda podle vynálezu vhodná zejména při lokální aplikaci.

Intercelulární komunikace

Vedle své schopnosti modulovat imunitní reakci mohou zelené porfyriny podle vynálezu interferovat v mezibuněčné komunikaci pravděpodobně pomocí své tvarové podobnosti s integriny. Jak je níže ukázáno, trojrozměrná struktura zelených porfyrinů podle vynálezu napodobuje prostorovou strukturu favorizovaných konformací, reprezentativních pro molekuly obsahující adhezní sekvenci anginin-glycinkyselina asparagová (RGD). Dále bylo prokázáno, že zelené porfyriny jsou schopny rušit trombózu, známou schopnost sloučenin založených na RGD. Způsob podle vynálezu je tudíž vhodný také pro léčení stavů, kdy mezibuněčná komunikace má negativní vliv na subjekt.

Jedním z takových případů je vznik restenóz po chirurgii nebo jiných traumatických narušeních cévních tkání. Pro tento účel může být způsob podle vynálezu nasazen bezprostředně na chirurgické zákroky představující riziko tvorby krevních sraženin v reakci na tento stres. Typické nasazení má být soustavné a tak načasované, aby vyvolalo narušení mezibuněčné komunikace zodpovědné za trombózu.

Formulace a aplikace

Zelené porfyriny podle vynálezu mohou být formulovány a aplikovány způsobem vhodných obvykle pro léčiva s malými molekulami jaký je znám a popsán v Remingtonů Pharmaceutical Sciences, Marek Publishing Company, Easton, PA, poslední vydání. Kompozice bude obsahovat takové množství zeleného porfyrinu, které je účinné pro uskutečnění imunomodulace nebo pro zastavení intercelulární komunikace. Výše dávky bude kolísat v závislosti na způsobu administrace, na formulaci, na případech, které mají být léčeny a na povaze objektu. Zpravidla však pro systémovou aplikaci je množství zeleného porfyrinu v řádu od 10 pg/kg do 100 mg/kg, preferováno je 100 pg/kg až 10 mg/kg a nejčastěji kolem 1 mg/kg. Při místní aplikaci vhodné koncentrace kolísají od asi 5 % do asi 95 % ve směsi a přednostně se doporučuje 10 % až 50 % ve směsi.

Způsoby systémové aplikace mohou být injekce intravenózní, intramuskulámí, intraperitonální apod.; dále i aplikace orální, transmukosální nebo transdermální za použití vhodných excipientů apod. Lokalizovanou aplikaci je možné uskutečnit také transdermálně nebo transmukosálně pomocí čípků nebo náplastí na kůži, anebo mohou být zelené porfyriny aplikovány místně ve formě gelů nebo mastí.

Používá-li se systémová aplikace preferují se zejména liposomální směsi. Liposomy mohou být připraveny standardními metodami. Běžně se připravují z fosfolipidů s negativním nábojem, jako jsou fosfatidylglycerol, fosfatidylserin nebo fosfatidylinositol, právě tak jako z lipidů samotných a různých stabilizačních činidel. Liposomy mohou být multilaminámí nebo monolaminámí a o různé velikosti. Koncentrace zelených porfyrinů v liposomální směsi je obvykle v řádu 1 až 20%.

-5CZ 291179 B6

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou uváděny k ilustraci a nikoliv k omezení vynálezu.

Příklad 1

Účinek na EAE indukovanou MBP

Jako model lidské roztroušené sklerózy byla použita experimentální alergická encefalomyelitida (EAE) u PL myší. Tohoto stavu může být dosaženo injekcí splenocytů zdárcovských myší, senzibilizovaných mylinovým bazickým proteinem. (MBP).

Splenocyty byly získány následně: PL myším bylo podáno 0,1 ml směsi získané emulzifíkací MBP (4 mg/ml solného roztoku s fosfátovým pufrem) ve stejné objemu kompletního Freundova adjuvans (4 mg Mycobacterium tuberculosid H37RA a neúplném Freundově adjuvans). Myším bylo injikováno subkutánně u kořene ocasu. Deset dní po imunizaci byly odstraněny sleziny a rozmělněny na suspenzi jednotlivých buněk. Buňky byly odstředěním peletizovány a erytrocyty byly odstraněny pomocí roztoku 0,14M NH4CI. Buňky (4 x 10⁶/ml) byly kultivovány v prostředí RPMI 1640 obsahujícím 5 % plodového telecího séra, 5xl0‘⁵M 2-merkaptoethanol, lmM pyrohroznan sodný, 20mM HEPES, 2mM 1-glutamin, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a 100pg/ml MBP v 75cm³ baňkách. Po třech dnech při 37 °C, byly kultury propláchnuty 5 % CO₂ s lidským rekombinančním interleukinem-2 (RIL-2, 50 LJ/ml) a vráceny do inkubátoru na dalších 48 hodin. Potom byly buňky sebrány, promyty séra prostých médiem a 5 x 10⁷ buněk bylo intravenózně injikováno (iv) do dosud nepoužitých syngenních zvířat. EAE se u takto ošetřených myší běžně rozvíjela 18 až 25 dní po buněčném přenosu.

Čtyřem kontrolním myším bylo intravenózně injikováno 5 x 10⁷ buněk připravených a kultivovaných, jak je popsáno v předešlém odstavci. U tří z těchto čtyř myší se po 19 až 30 dnech vyvinula charakteristická paralytická choroba spojená s EAE. Tento stav nastupuje, když MBP-reaktivní T lymfocyty vnikají do centrálního nervového systému. Avšak experimentální skupině čtyř myší, kterým byly obdobně injikovány MBP-senzibilizované a kultivované buňky, bylo po 24 hodinách intravenózně aplikováno 1,0 mg/kg BPD-MA. U žádné z těchto myší se stav EAE nerozvinul. Myši, ošetřené toutéž dávkou BPD 24 hodin před podáním injekce MBP-senzibilizovaných a kultivovaných buněk, však vykázaly tentýž průběh EAE jako myši kontrolní.

Poněvadž injekce BPD byla účinná, jen pokud byla aplikována během cca 24 hodin po podání kultivovaných buněk, je zřejmé, že BPD působí přímo na transferované aktivované T buňky spíše než na endogenní buňky zvířecího příjemce.

Splenocyty, připravené jak popsáno v prvním odstavci tohoto příkladu, po kultivaci se 100 pg/ml MBP generují bujivou odezvu expanzí T buněk, specifickou a aktivovanou MBP. Toto bujení představuje 100% nárůst ve srovnání s buňkami s indexem 0 %, kultivovanými za nepřítomnosti MBP. Jsou-li buňky kultivovány v přítomnosti BPD při koncentracích 1 ng/ml až 1 pg/ml, je proliferace inhibována. Při ng/ml BDP je proliferace jen 20 % a index klesá na nulu při 10 ng/ml. Při více než 100 ng/ml je bujivá odezva menší, než je možno zaznamenat, jsou-li buňky kultivovány za nepřítomnosti MBP.

Je známo, že BPD při použitých koncentracích nemá za nepřítomnosti světla přirozenou toxicitu. Tyto výsledky tedy naznačují, že BPD vyvolávají u MBP-specifických T-buněk anergii.

-6CZ 291179 B6

Příklad 2

Účinek BPD na DTH

Byl uskutečněn dobře dokumentovaný model zpožďované hyporsenzitivity. V den 0 byl do tříselné oblasti kmene bezsrstých myší vetřen dinitrofluorbenzen (DNFB). Pátý den byl DNFB natřen na ucho a způsobil během následujících 24 hodin výraznou zánětlivou odezvu řízenou antigenspecifickými T buňkami, včetně otékání ucha.

Myším, kterým byl veden DNFB ve dni 0, byla intravenózně injikována liposomální BPD-MA v dávce 1 mg/kg ve dnech -2, -1, 0, +1, +2, +3 a +4. V pátý den byl myším pro vyvolání odezvy natřen DNFB na ucho a otékání ucha bylo měřeno po 24 hodinách. U nenatřených myší byl zaznamenán minimální otok ucha. Myši senzitivizované DNFB, jimž byl podáván solný roztok místo DPD, vykázaly silnou odezvu otokem ucha, následující po vyvolání pomocí DNFB. Otok byl zaznamenán procentuálně čili tloušťka ucha no vyvolání minus tloušťka před vyvoláním x 100 tloušťka ucha před vyvoláním

Otékání bylo obyčejně v rozmezí 60 až 90 % nad úrovněmi kontrol. Jestliže byl BPD podán ve dni -2, -1, 0, +1 nebo +3, bylo otékání nižší než 50 % toho, které bylo zaznamenáno u kontrolních zvířat. Inhibice DTH odezvy byla přibližně 25 %, byl-li BPD podán ve 4. dnu.

Při dalším pokusu byly myši, které byly nejdříve senzitivizovány DNFB, ošetřeny odlišným kožním senzibilizátorem, oxazolonem. U myší byl následně vyvolávána odezva DNFB a oxazolonem. Myši ošetřené BPD vykázaly snížení odezvy na DNFB. Avšak u myší, ošetřených BPD, snížení otoku ucha jako reakce na oxazolon zaznamenáno nebylo. Pomocí BPD byly tedy ovlivněny pouze antigenspecifícké T buňky (reaktivní vůči DNFB). Myším zůstala jejich schopnost reagovat na druhý antigen, oxazolon, navzdory ošetření pomocí BPD ve spojení se senzitivizací DNFB.

Příklad 3

Účinek BPD na vazbu fíbrinogenu

Krevní destičky byly aktivovány trombinem podle modifikované metody Shattila a spol., Blood (1987) 70:307. Krátce po 15minutové preinkubaci při 220 °C po 100 pg/ml liposomálního BPD nebo kontroly, byla plná krev s citrátem po 30 minut při 220 °C podrobena účinku I-trombinu (konečná koncentrace lOU/ml) za přítomnosti Gly-Pro-Arg-Pro, inhibitoru polymerizace fibrinu (konečná koncentrace 1,25 mM). Aktivace destiček byla měřena pomocí „flow“ cytometrické analýzy s použitím polyklonálních antifíbrinogenních protilátek označených fluoresceinem. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1 v procentovém obsahu destiček pozitivních na antifibrinogen (určeno jako průměr tří pokusů plus nebo minut jedna standardní odchylka).

Tabulka 1

Procenta destiček pozitivních na antifíbrinogen (Průměr ze tří pokusů plus(minus 1 standardní odchylka)

	BPD-liposomy	Liposomy	Neošetřeno
Žádný agonista	2,9	2,1	2,2
	(0,8)	(2,5)	(2,2)
Trombin	28,9	86,7	86
	(2,0)	(13)	(2,2)

Jak je z tabulky 1 zřejmé, při ošetření trombinem stoupá za nepřítomnosti BPD procentový obsah destiček pozitivních na antifíbrinogen z asi 2 % na asi 86 až 87 %. Jestliže však je přítomno 100 pg/ml liposomálního BPD, zmenšuje se úroveň aktivace o zhruba dvě třetiny.

Příklad 4

Účinek BPD na odmítání kožních štěpů

Studie odmítání alogenních kožních štěpů včetně kožních štěpů mezi MHC-inkompatibilními myšmi byla provedena podle metody Billinghama a d., The Technique of Free Skin Grafting in Mammals, J. Exp. Biol., 28:385-402 (1951). Kontrolní myši (n=16) odmítají štěpy po 11,1 ± 1,9 dnech po aplikaci alogenního štěpu.

V experimentální skupině (n=6) obdrženy myši jednu intravenózní injekci 0,25 mg/kg BPD-MA liposomálního preparátu 3 až 4 hodiny po aplikaci alogenního štěpu a vykázaly prodloužené přijetí štěpu na 20,7 ± 0,9 dní do jeho odmítnutí.

Jiná skupina myší, která obdržela dodatečnou injekci 0,25 mg/kg BPD v osmý den, vykázala 23,3 ± 1,9 dní jako střední dobu odmítnutí.

Jeví se tedy, že BPD bez ozařování potlačuje odmítání alogenních štěpů.

Příklad 5

Účinek BPD na adhezní molekuly při revmatické artritidě

Adhezní molekula buněčného povrchu ICAM-1 se nejvíce tvoří v aktivovaných buňkách. Proto se výskyt této molekuly považuje za indikátor buněčné aktivace.

Kloubní mazy pacientů s revmatickou artritidou byly kultivovány v tkáňovém médiu 18 hodin s různými koncentracemi BPD, podrobeny působení anti-ICAM-1 a podrobeny „flow“ cytometrické analýze. Výsledky této studie jsou uvedeny v tabulce 2.

-8CZ 291179 B6

Tabulka 2

(BPD) ng/ml	Nebráněná buněčná populace	Lymfocyty	Monocyty	Polymorfonukleámí buňky
	MED	+VE	MED	+VE	MED	+VE	MED	+VE
0	24,4	(85,7 %)	14,2	(23,7 %)	478	(85,9 %)	20,4	(99,3 %)
15	26,7	(87,7 %)	13,6	(30,7 %)	509	(95,9 %)	22,0	(99,3 %)
25	26,7	(87,0 %)	14,6	(29,1 %)	496	(93,8 %)	21,9	(99,5 %)
50	23,9	(84,5 %)	12,9	(23,2 %)	443	(94,2 %)	20,0	(99,2 %)
100	14,9	(66,9 %)	13,7	(22,7 %)	309	(46,6 %)	12,5	(69,0 %)

+VE: procentový obsah buněk pozitivní na ICAM-1;

MED: střední hodnota intenzity fluorecence buněk vytvářejících ICAM-1.

Jak je v tabulce 2 ukázáno, procentový obsah nebráněných buněk pozitivních na ICAM-1 klesá z 85,7 % při nepřítomnosti BPD na 66,9 % za přítomnosti 100 ng/ml BPD. Procentový obsah lymfocytů ukazuje, že tato molekula byla BPD poměrně nedotřena. Však 100 ng/ml BPD u monocytů a polymorfonukleámích buněk významně snižuje tvorbu ICAM1.

Aniž by si přihlašovatelé přáli být svazováni s nějako teorií, jsou přesvědčeni, že antigenspecifická imunitní modulace vyvolaná BPD v temnotě, je následkem jejich interakce s integriny nebo adhezními molekulami vytvářenými na aktivovaných krvetvorných buňkách tak, že narušuje buněčnou komunikaci.

Příklad 6

Vztah BPD-ΜΑ ke konformaci sloučenin vázajících integrin

Dva známí antagonisté integrinu, RGDS a acetylovaný/amidovaný CNPRGDYC, (v němž je tyrosin přítomen jako methylether), byly porovnávány z hlediska trojrozměrné struktury s BPDMA. Toto srovnání bylo provedeno na Albertza Peptide Institute.

Predikce prostorové struktury pro RGDS ukázaly 1 584 možných konformaci, jež mohou být podle svého energetického obsahu roztříděny do sedmi souborů. Predikce u acetylovaného/amidovaného CNPRGDYC daly 1 347 konformaci, seskupených podle energií do pěti souborů.

Řada predikcí v hlavních souborech u obou peptidů je podobná třem skupinám konformaci označovaných RGDA, RGDB a RGDC, které byly zjištěny experimentálně. Tyto tři skupiny konformaci slouží jako reprezentativní konformace pro oba peptidy.

Konformace, které tyto souboru obsahují, jsou znázorněny vpřekryvech na obrázcích 2 až 4. Obrázek 2 ukazuje RGDA, obrázek 3 RGDB a obrázek 4 RGDC. Všechny konformace mají vzdálenost skupiny karboxylové kyseliny (Asp) k funkční skupině dusíkové (Arg) 12-13/. Obrázek 5 až 7 znázorňuje překryv reprezentativních konformaci každé z těchto tří skupin BPDMA. Obrázek 5 představuje BPD v superpozici nad RGDA, obrázek 6 znázorňuje BPD-MA v superpozici nad RGDB a obrázek 7 ukazuje BPD-MA v superpozici nad RGDC.

Ve všech těchto superpozicích jsou překrývané struktury ploché a funkční skupiny asparagové kyseliny a argininu se překrývají s odpovídající karboxylovou i dusíkovou funkční skupinou PDMA.

-9CZ 291179 B6

Z výsledků plyne, že BPD jeví některá uspořádání funkčních skupin, která mohou napodobovat konformace sloučenin vázajících integrin.

Příklad 7

Experimentální testování BPD analogů na DTH odezvu

Srovnání vlivu BPD-ΜΑ, BPD-MB, BPD-DA a BPD-DB na DTH odezvu vůči lokálně aplikovanému heptenu DNFB za absence přímého světla bylo provedeno podle metody uvedené svrchu v příkladě 2. Sloučeniny byly vyhodnocovány u dosud nepoužitých neoholených myší Balb/c. Každá z pokusných skupin měla 4 až 5 zvířat. Analogy BPD byly rozpuštěny v DMSO a podány 24 hodin po aplikaci DNFB. Pátý den experimentu byla myším na uchu vyvolána odezva, která byla měřena den poté. Konečná koncentrace DMSO byla 2 %. Kontrolní myši obdržely přiměřeně stejné rozpouštědlo.

Výsledky uvádějí tabulky 3 a 4 a sumarizuje obrázek 8. Mono-analogy BPD silně inhibují odezvu na DTH. Di-analogy BPD odezvu na DTH neinhibují.

Tabulka 3

Účinek různých BPD derivátů na CHS odezvu

BPD derivát	Otok ucha (mm x 10'²)	SD	Přírůstek hmotnosti (g)
MA 0,1	4,02	1,59	0,2
MA 1,0	1,8	1,28	0,4
MB 0,1	2,32	0,69	0,3
MB 0,5	2,4	0,49	0,1
DA 0,1	6,46	3,6	0,8
DA 1,0	4,16	1,44	-o,i
DB 0,1	10,33	2,8	-0,4
DB 1,0	5,48	2,79	-0,7
(+) Kontrola	6,53	1,87	-0,7
Iritant	1,78	0,59	0,5
Irit.-MB 1,0	1,5	0,23	0,3
Irit.-DA 1,0	1,78	0,29	0,6
Irit.-DB 1,0	0,85	0,47	0,4

SD - standardní odchylka;

CHS - kontaktní hypersenzitivita.

-10CZ 291179 B6

Tabulka 4

Sloučenina	Dávka (mg/kg)	Relativní inhibice DTH odezvy
BPD-MA	1,0	++++
BPD-MA	0,1	+++
BPD-MB	0,5	+++
BPD-MB	0,5	+++
BPD-DA	1,0	—
BPD-DA	0,1	—
BPD-DB	1,0
BPD-DB	0,1	-

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Použití zeleného porfyrinu k výrobě léčiva pro modulaci antigen-specifické imunitní reakce u subjektu, za nepřítomnosti záření absorbovaného zeleným porfyrinem, přičemž modulace probíhá během imunitní reakce na antigen.

2. Použití podle nároku 1, kde uvedený antigen je alergen.

3. Použití podle nároku 1, kde uvedené léčivo je formulováno jako liposomální kompozice vhodná pro systémové podávání.

4. Použití podle nároku 1 nebo 3, kde uvedeným antigenem je autoantigen nebo alergen.

5. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde uvedené léčivo je vhodné pro podání příjemci cizí tkáně.

6. Použití podle nároku 1, kde antigen souvisí s psoriázou a léčivo je určeno pro lokální aplikaci.

7. Použití podle nároku 1, kde zelený poríyrin je sloučeninou vzorce I, II, III, IV, V, VI nebo jejich směsí,

-11 CZ 291179 B6 (I) απ)

- 12CZ 291179 B6 kde každý ze symbolů R¹ a R² je nezávisle volen ze skupiny, zahrnující alkoxykarbonyl (2-6C), alkyl (1-6C), arylsulfonyl (6-1OC), kyano a -CONR⁵CO, kde R⁵ je aryl (6-1OC) nebo alkyl (1-6C);

5 každý ze symbolů R³ je nezávisle karboxyl; karboxyalkyl (2-6C); nebo sůl, amid, ester karboxyalkylu (2-6C) nebo acylhydrazon; nebo alkyl (1-6C);

R⁴ je CH=CH2 nebo -CH(OR⁴’) CH3, kde R⁴ je H nebo alkyl (1-6C).

ío

8. Použití podle nároku 7, kde zelený porfyrin je sloučeninou vzorce III nebo IV nebo je jejich kde každý ze symbolů R¹ a R² je nezávisle alkoxykarbonyl (2-6C),

15 jeden ze symbolů R³ je karboxyalkyl (2-6C) a druhý je esterem karboxyalkylu (2-6C) a

R⁴ je CH=CH₂ nebo -CH(OH)CH₃, nebo kde zelený porfyrin je sloučeninou vzorce III, kde R¹ a R² jsou methoxykarbonyl, jeden ze symbolů R³ je -CH2CH2COOCH3 a druhý je -CH2CH2COOH a R⁴ je CH=CH2.

25

9. Použití zeleného porfyrinu k výrobě léčiva pro modulaci nevhodné intercelulámí komunikace, za nepřítomnosti záření absorbované zeleným porfyrinem, a uvedená modulace probíhá během uvedené nevhodné intercelulámí komunikace.

10. Použití podle nároku 9, kde následkem uvedené nevhodné intercelulámí komunikace je 30 restemóza nebo trombóza.

11. Použití podle nároku 9 nebo 10, kde léčivo je formulováno jako liposomální kompozice vhodná pro systémové podávání.

35

12. Použití podle nároků 9, 10, nebo 11, kde použitý zelený porfyrin je uvedený v nároku

7 nebo 8.

13. Použití podle nároku 9, kde nevhodná intercelulámí komunikace zahrnuje molekuly obsahující adhezní sekvenci arginin-glycin-kyselina asparagová RGD.