JPH10512268A - 免疫調節剤としての緑色ポルフィリン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 緑色ポルフィリンは細胞間伝達を妨げるのと同様に、特定の抗原に対する免疫応答の活性段階において抗原特異的免疫調節剤として働く。これらの効果は緑色ポルフィリンが吸収する輻射の非存在下で起きる。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫調節剤としての緑色ポルフィリン技術分野 本発明は光の非存在下で緑色ポルフィリンを投与することにより免疫応答を調 節する分野に関するものである。特異的抗原に対する応答の過程の間に緑色ポル フィリンが投与されたとき抗原特異的免疫応答は調節される。さらには、光の非 存在下において緑色ポルフィリンは細胞間伝達を阻害し、このようにして例えば レステノシスの予防又は治療を可能にする。背景技術 総体として緑色ポルフィリンと称される光ダイナミック療法に用いられる化合 物群は米国特許第5,283,255、4,883,790、4,920,143、5,095,030及び5,171,749 を含む一連の特許に記載されており、それらの記載は本明細書に援用される。こ れらの緑色ポルフィリンはヘマトポルフィリンのジールス・アルダー反応及び生 じた産物の所望による再転位又は還元を用いることにより調製される。これらの 緑色ポルフィリンの特に好ましい形態は、前記出典特許に概要が述べられている が、一酸の形態のベンゾポルフィリン誘導体又は“BPD-MA”と示されている。こ の薬は現在では様々な腫瘍及びその他の症状の光ダイナミック治療に関して臨床 試験中である。 光ダイナミック療法は、投与された光活性化化合物は、この場合は緑色ポルフ ィリンだが、光非存在下では生理的効果がないという仮定に基づいている。しか しながら、光に照射されたとき化合物の励起状態の形態は局部的毒性効果を及ぼ す。そのために例えば腫瘍の治療には正常の細胞から除去された後に腫瘍の細胞 に残るというこれらの光活性化化合物の性質が利用されている。化合物が正常の 細胞から除かれる前でも新小脈管地帯への局部的光照射が効果的であるというこ とも見いだされている。 本発明によれば、緑色ポルフィリンは光ダイナミック療法（PDT）において光 活性化作用物として振る舞う能力とは独立に免疫調節力を持つこと及び細胞間伝 達を阻害することが見いだされた。本発明は緑色ポルフィリンの従来予期されて いなかったこの特性を利用するものである。発明の開示 本発明は光照射なしに特定の抗原に関して起きる免疫応答に関与する緑色ポル フィリンの能力を利用するものである。生じる免疫調節は抗原特異的であり、そ のことは遅延型の過敏症で得られた結果を使って後に説明される。そのために患 者は自己抗原、アレルゲン及びその他に関し、一般的な免疫寛容を生じるという 不利益を受けずに、望ましくない応答に対して保護されることができる。さらに は、緑色ポルフィリンは後に説明されるように血栓症を引き起こすような細胞間 伝達を阻害する。緑色ポルフィリンはまたRGD配列によって特徴づけられる既知 のインテグリン類にコンホメーションの類似性を持つことが示されている。この ことは望ましくない細胞間伝達によって特徴づけられる症状の予防又は治療のた めに、緑色ポルフィリンを使用することを可能にする。 このように、一つの観点では、本発明は抗原特異的免疫応答を調節する方法に 向けられており、その方法は抗原に対する活性化された免疫応答を経験している 患者に、当該抗原に対する前記免疫応答を調節するのに必要な量の緑色ポルフィ リンを緑色ポルフィリンが吸収する光の非存在下において投与することからなり 、さらに前記投与は当該特異的抗原そのものに対する免疫応答が活性化されてい る段階の間に行われる。 別の観点では、本発明は患者の中で細胞間伝達を調節する方法に向けられてお り、その方法はそうした調節を必要とする患者に、細胞間伝達を調節するのに効 果的な量の緑色ポルフィリンを、緑色ポルフィリンが吸収する光の非存在下にお いて投与することからなり、前記投与は望ましくない細胞間伝達が生じている間 に行われる。 さらに別の観点では、本発明は本発明の方法に有用な緑色ポルフィリンの製剤 を含んでいる。図面の簡単な説明 図1は本発明の方法に有益な緑色ポルフィリンの代表的構造を示している。 図2はRGDAに代表される形態ファミリーの重ね合わせコンホメーショを示して いる。 図3はRGDBに代表される形態ファミリーの重ね合わせコンホメーショを示して いる。 図4はRGDCに代表される形態ファミリーの重ね合わせコンホメーショを示して いる。 図5はRGDAの代表的な形態にBPD-MAの3次元的構造が重ね合わされたものを示し ている。 図6はRGDBの代表的な形態にBPD-MAの3次元的構造が重ね合わされたものを示し ている。 図7はRGDCの代表的な形態にBPD-MAの3次元的構造が重ね合わされたものを示し ている。 図8はナイーブな、髭をはやしているBalb/cマウスのDTH応答における4個のBPD アナログの影響の比較を示している。発明の実施の態様 特定の抗原に対する免疫応答が望ましくない非常に多くの実例がある。アレル ギー反応、自己免疫反応並びに臓器移植、皮膚組織移植及びそのようなものの免 疫拒絶反応がこれらの状況の中で目立っている。本発明の緑色ポルフィリンは、 免疫応答が引き起こされる活性段階に投与されたとき効果的であり、したがって 、抗原に対する暴露に続く期間に投与されたとき、又はもし免疫応答の活性形態 が継続的であるなら、この継続段階で投与されたとき効果的である。 緑色ポルフィリンは自らが吸収する輻射の非存在下で効果を発揮する。この一 文は、目標に対して意図的な輻射はなされないことを意味する。最小量のバック グランドの光はなお存在してもよい。前記背景技術の項で述べたように、緑色ポ ルフィリンは光ダイナミック治療プロトコルで広く用いられてきた。これらのプ ロトコルでは緑色ポルフィリンを多大な量含むように修飾された細胞又は組織の 一群は、緑色ポルフィリン化合物が吸収する波長を含む光で意図的に照射される 。緑色ポルフィリンによるこれらの波長の吸収は周囲の物質が害を受ける様な方 法で分子の励起を引き起こす。毒性の原因となる励起化合物の崩壊の間に1重項 酸素が発生すると仮定される。光活性化薬剤自体は無毒性であると推定されてい る。 本発明の方法においては励起を生じさせるための照射はプロトコルには含まれ ていない。しかしながら、全ての光を治療される患者から遮断する必要はない。 このようにして、ここで用いられている“緑色ポルフィリンが吸収する輻射の非 存在下”という文言は、暗黒ではなくむしろ典型的な周囲環境を意味する。すな わち、緑色ポルフィリンの既知の光ダイナミック効果は本発明の方法では用いら れないことを単に意味する。緑色ポルフィリン 緑色ポルフィリンの性質は、前記背景技術の項で参照した特許に記載されてい る。簡単に言うと、これらはプロトポルフィリンIXの誘導体であり、置換された アセチレンとのジールス・アルダー反応を用い、所望により再転位及び／又は還 元することにより得られる。このようにして得られる化合物の典型的な式は図1 に示されている。図1で示される式の好ましい態様は、環式化合物が図1―3又は 図1―4に示される式を持つものであり、及び／又はR¹及びR²が各々に独立にカル バルコキシル（2―6C）、アルキル（1―6C）、アリールスルホニル（6―10C）、 シアノ及び-CONR⁵COからなる群から選択されており、R³は各々独立にカルボキシ ル、カルボキシアルキル（2―6C）若しくは塩、アミド、エステル若しくはアシ ルヒドラゴネ若しくはアルキル（1―6C）であり、R⁴はCH=CH₂若しくは−CH(OR^4' )CH₃であり、ここでR⁵はアリール（6―10C）又はアルキル（1―6C）を意味し、R⁴ 'は水素又は場合により親水性置換基で置換されたアルキル（1―6C）を意味す る。もちろん混合物も用いられることが出来る。 特に好ましいものは図1―3及び図1―4の化合物であり、ここでR¹及びR²が各々 に独立にカルバルコキシル（2-6C）であり、一方のR³はカルボキシアルキル（2 ―6C）であり、他方のR³はカルボキシアルキル（2―6C）置換基のエステルであ り、R⁴はCH=CH₂又は―CH(OH)CH₃である。 さらに特に好ましいものは図1―3に示される化合物であり、ここでR¹及びR²は メトキシカルボニルであり一つのR³は―CH₂CH₂COOCH₃でありもう一つのR³はCH₂C H₂COOHでありR⁴はCH=CH₂である。この化合物はベンゾヒドロポルフィリン誘導体 一酸(benzohydroporphyrin derivative monoacid)の頭文字をとってBPD―MAと呼 ばれており、そのジールス・アルダー付加は環Aで生じている。治療される状態の性質 緑色ポルフィリンは特定の抗原に対する免疫応答が活性化されている期間に脊 椎動物患者に投与されたとき、全体的免疫抑制を生じることなしに特定の抗原に 対する応答を調節する。もしその患者が投与される免疫原／抗原に対してナイー ブであるなら処理のタイミングは促進される。意図的に投与された抗原に対する 望ましくない免疫応答が見いだされるのは、例えば皮膚移植又は臓器移植のよう なアログラフトを用いた移植術、糖尿病のインシュリン補給に使われるような個 々の細胞の移植、及びその他の外科手術又は、患者に意図的に外部からの細胞若 しくは組織を注射で導入する事を含む措置においてである。望ましくない免疫応 答が意図的に投与された化合物に起きるかもしれないその他の例は、患者の蛋白 質に異種の蛋白質が使われる場合も含む。典型的な例には腫瘍治療の際のモノク ローナル抗体の投与があげられる。ヒト型の抗体をつくる試みはなされているが 、多くの場合、マウス由来のモノクローナル抗体が人間の治療に用いられている 。そのような抗体に対する望ましくない免疫応答は本発明の方法により調節する ことができる。これらの例においては一次的免疫応答が活性化され、そして抗原 の投与と同時の又は抗原の投与のすぐ後の緑色ポルフィリンの投与は望ましい結 果を与える。 免疫応答が外部からの抗原に対し起きる別の例はアレルギー反応によって説明 される。これらの応答は一般的には二次的免疫応答であるが、この二次的暴露と 同時に又はその後の短期間内に本発明の緑色ポルフィリンを投与することもまた 効果的である。 前記の両方の場合において抗原若しくはアレルゲンが投与されると同時に又は 抗原に対する活性化応答が必要とされる期間の間に緑色ポルフィリンは投与され るであろう。一般にこの期間は抗原の投与の24時間から48時間の間である。 本発明の方法が適当な患者は、一般に脊椎動物患者であり、好ましくはほ乳類 の動物である。しかしながら脊椎動物生物は一般に似た細胞間伝達系を利用しそ して類似的方法で免疫応答を構成する。特に好ましい患者は、ヒトの患者と並ん で、家畜及び鳥類の患者動物である。正確なプロトコル、投薬量及び剤型はもち ろん患者の性質によるであろう。抗原の投与 緑色ポルフィリンの投与と同時に又はそのごく前に抗原を投与することはアレ ルゲンの性質に幅広くよるであろう。薬、モノクローナル抗体又は治療若しくは 診断のために使われるその他の外来蛋白質といった意図的に投与された抗原の為 には、投薬量レベル及び投与の形態は一般に抗原が投与される目的によって調節 されるであろう。典型的には、抗原は適宜製剤化された薬剤組成物として従来よ り入手可能である、また、投薬量レベル並びに投与の予期されるルートはすでに 知られている。 同種移植に関しては一般に次のようなことが信じられている；すなわち、予定 されている受容者と同じ種の一員からの組織又は臓器を構成する細胞は、心臓、 腎臓、肝臓、肺等といった血管化臓器並びに脳下垂体、甲状腺、副腎、上皮小体 及び膵臓といった内分泌腺、及び皮膚移植片を含めて、免疫原性は有するものの 、移植拒絶を引き起こす主要組織適合性抗原は含まないであろうということであ る。むしろこれらの抗原は不純物として移植された細胞に含まれる白血球のよう なパッセンジャー細胞によって運ばれると信じられている。 このようにして、緑色ポルフィリンの投与は、MHCを有する細胞を含む移植片 自体と同時に又はそのすぐ後に実行することができる。あるいは患者を予め保護 するために、蛋白質自体として又は組織適合性抗原を有する細胞の表面に含まれ た状態で、移植片とは別に投与することもでき、その場合は、緑色ポルフィリン は細胞又は組織適合性抗原の前投与に近い時間に投与される。例えば人間におい て、組織適合性の主要な決定因子はMHCクラスII抗原群中のHLA―DRと称されてい る。この因子はサブタイプに副分類されているので、もしドナーのサブタイプが 類別されているなら、当該サブタイプのDR抗原を移植片自体より先に緑色ポルフ ィリンの投与の直ぐ前後に投与することができる。 もし抗原がアレルゲンであるならそのアレルゲンは緑色ポルフィリンと共に又 は緑色ポルフィリンの投与のすぐ前に注射によって直接に若しくは経口によって 投与することができる。代わりにその投与は自然界での暴露に似せることもでき 、例えば患者にアレルギー応答を誘発することが知られている花粉を含む植物の 側、 に患者を置くことができる。患者をこのような環境に置いたとき、緑色ポルフィ リンは同時に又はそのすぐ直後に投与される。 もし抗原が自己抗原であるなら抗原の投与を別々に制御することはできない； そのような自己抗原は、リュウマチ性関節炎、多発性硬化症、紅斑性狼蒼、ある 種の糖尿病又は一般に自己抗原により引き起こされる炎症性反応を含む多くの状 態の原因であると信じられている。この場合、本発明の方法の効果は、内部から 供給される自己抗原に対して継続的に活性な免疫応答に依存する。この場合は緑 色ポルフィリンは自己免疫病に悩んでいる患者に、望ましくは免疫応答が最も明 らかな期間に投与される。 自己免疫応答に関連すると信じられているさらに別の状態は乾癬である。本発 明の方法は、特に局所投与を使ってこの症状を治療するために適している。細胞間伝達 本発明の緑色ポルフィリンは、免疫応答を調節する能力に加えて、おそらくイ ンテグリンに形態が似ている特徴に基づいて、細胞間伝達を阻害することが可能 である。後述するように、本発明の緑色ポルフィリンの三次元構造は接着性RGD 配列を持つ分子に代表される好ましい形態の三次元構造に似ている。さらには緑 色ポルフィリンは、血栓症を阻害することができる、つまりRGDに基づく化合物 の既知の能力を持つことが証明されている。それゆえに本発明の方法は、細胞間 伝達が患者に好ましくない効果を持つ症状の治療にもまた適している。 一つのそのような例は、手術の後のレステノシス又は血管その他の外傷後のレ ステノシスの形成である。この目的のために本発明の方法は、このようなストレ スヘ応答における血栓形成の危険がある外科手術措置の短時間内に行うことがで きる。投与は、血栓症の原因である細胞間伝達を阻害する効果を得るために、典 型的には全身的に、そしてタイミングを測って行われる。製剤及び投与 本発明の緑色ポルフィリンは小分子の薬に一般に便利な方法で製剤化され及び 投与することができ、そのような方法は例えばRemingtons Pharmaceutical Scie nces，Mack Publishing Company，Easton，PAの最新版で説明されている技術で 知られている。製剤組成物は、免疫調節するのに又は細胞間伝達を阻害するのに 有効な量の緑色ポルフィリンを含有するであろう。投薬量レベルは投与、製剤化 、治療される症状及び患者の性質等の多岐の因子により変化するであろうが、し かしながら、一般的には全身的投与のための緑色ポルフィリンの量は10Tg／kgか ら100mg／kgまでの範囲であり、好ましくは100 Tg／kgから10 mg／kgまでの範囲 であり、最も好ましくは1 mg／kgの近辺である。もし投与が局所的であれば適切 な濃度は製剤中の約5パーセントから約95パーセントまでの間、好ましくは約10 パーセントから約50パーセントの間である。 全身的投与ルートは、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、その他の注射に よることができ、経口投与、適切な助剤を用いる経粘膜又は経皮投与、その他に よることもできる。局所的投与はまた座薬又は皮膚用パッチを使う皮膚面又は粘 膜面からの手段によって達成されることができ、あるいは緑色ポルフィリンをゲ ル又は軟こうの形で局在的に用いてもよい。 全身的投与がなされるときリポソーム組成物は特に好ましい。リポソームは標 準的方法によって調製されることができ典型的には負に帯電したホスホリピドか ら調製され、そのようなホスホリピドには、リピド自体及び様々な安定化薬剤と 並んでホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン又はホスファチジル イノシトール等が含まれる。リポソームは多重層状又は単層状であってもよく、 及び大きさにも幅がありうる。リポソーム組成物内の緑色ポルフィリンの濃度は 典型的には1から20パーセントまでの範囲である。 以下の例は本発明の説明のためであり、制限することは意図していない。実施例1 MBP を抑制されたEAEに対する効果 PLマウスにおける実験的アレルギー脳脊髄炎（EAE）は人間における多発性硬 化症に対するモデルとして使われている。この状態はミエリン塩基性蛋白質（MB P）をあらかじめ準備したドナーマウスから脾臓細胞を注入することにより誘導 されることができる。脾臓細胞は次のようにして得られた。PLマウスはMBP（4mg ／ml燐酸バッファーサリン）を等量の完全フロイントアジュバント（不完全フロ イントアジュバント中に結核菌H37RA 4mg）中に乳化して調製された混合物0.1ml を投与された。マウスは尻尾の基部に皮下注射された。免疫10日後に脾臓は取り 除かれ、そして単体細胞懸濁液に細かく砕かれた。細胞は遠心によってペレット にされ赤血球は0.14M塩化アンモニウム中でリシスによる細胞溶解によって取り 除かれた。細胞（4×10⁶／ml）は75平方センチメートルのフラスコ中に5パーセ ントの胎児の子牛の血清、5×10^-5M 2 −メルカプトエタノール、1mMピルビン酸 ナトリウム、20mMヘペス、2mM 1 −グルタミン、100U／mlペニシリン、100Tg／m lストレプトマイシン及び100Tg／ml MBPを含むRPMI1640培地で培養された。摂氏 37度、5パーセント炭酸ガス中で三日間培養された後、培養物は人間の組み換え 体インターロイキン―2（rIL―2、50U／ml）でパルス処理され、そしてさらに48 時間恒温器に戻された。その後細胞は集められ血清フリーの培地で洗われそして 5×10⁷個の細胞がナイーブな同系動物に静脈注射(iv)された。このように処置さ れたマウスは、典型的には細胞移入後18から25日でEAEを発症した。 四匹のコントロールマウスが先の段落で述べられたように準備され又培養され た5×10⁷個の細胞を静脈注射された。19日から30日後四匹中三匹のマウスがEAE に関連する特徴的な麻痺病を発症した。MBP反応Tリンパ球が中枢神経系を侵すと きこの症状が誘発される。しかしながら、実験集団においてはMBPプライム処理 され又培養された細胞を同じように注射された四匹のマウスは、24時間後静脈に 1.0mg／kgのBPD―MAを投与された。これらのマウスはどれもEAE症状を起こさな かった。しかしながら、MBPでプライム処理され又培養された細胞を注射する24 時間前に同じ量のBPDを投与されたマウスは、コントロールと同じようなEAEコー スを示した。 BPD注射は培養細胞の投与後約24時間以内に投与されたときにのみ効果があっ たので、BPDは受容動物の内因性の細胞よりむしろ移入され活性化されたT細胞に 直接に働くことが示される。 この例の第一段落で述べられたように調製された 脾臓細胞は、100Tg／mlのMB Pで培養されたとき、MBPに特異的で及びMBPによって活性化されるT細胞の増大に よって増殖応答を引き起こす。この増殖応答を100パーセントとして表し、これ に対してMBP非存在下で培養された細胞の増殖応答を0パーセントと表す。細胞が 1ng／mlから1Tg／mlの濃度のBPD存在下で培養されるとき増殖は妨げられる。BPD 1ng/mlでは増殖はわずか20パーセントであり10ng／mlではそれはゼロまで落ちる 。 100ng／ml以上では増殖応答はMBP非存在下で培養された細胞にみられるよりも減 る。 BPDは用いられる濃度幅では光の非存在下で固有の毒性を持たないことが知ら れており、そのためにこれらの結果はBPDがMBP特異的T細胞においてアネルギー を誘発することを示す。実施例2 DTH におけるBPDの効果 よく立証された遅効型過敏症（DTH）モデルが用いられた。0日目に無毛系統マ ウスの鼠けい部地帯にジニトロフルオロベンゼン（DNFB）が塗られた。5日目にD NFBが耳に塗られ、引き続く24時間の間に、抗原特異的T細胞の共同作用によって 、処理された耳の膨張を含む重大な炎症応答を生じさせた。 0日目にDNFBを塗られたマウスは−2日目、−1日目、0日目、+1日目、+3日目又 は+4日目に1mg／kgの投薬量でBPD―MAのリポソームを静脈注射した。5日目にマ ウスの耳をDNFBの塗布によりチャレンジし、そして耳の膨張は24時間後に測定さ れた。処理されていないマウスでは最低限の耳の増大が認められた。BPDの代わ りに塩化ナトリウム水溶液を投与されたDNFB感作マウスは、DNFBでのチャレンジ の後に強い耳膨張応答を示した。膨張は膨張パーセントつまり （チャレンジ後の耳の厚さ−チャレンジ前の耳の厚さ）／（チャレンジ前の耳の 厚さ）×100 として記録された。 増大はふつうコントロールレベルよりも60から90パーセント上の範囲であった 。しかしながら、−2日目、−1日目、0日目、1日目及び3日目にBPDが与えられた とき耳増大はコントロール動物に観測されたものよりも50パーセント少なかった 。BPDが4日目に与えられたときDTH応答の抑制は略25パーセントであった。 さらなる実験において、あらかじめDNFBで感作されたマウスは異なる皮膚接触 感作剤、つまりオキサゾローンによって処理された。次いでマウスをDNFBとオキ サゾローンでチャレンジした。BPDで治療されたマウスはDNFBに対する応答の抑 制を示した。しかしながら、オキサゾローンに対する耳膨張の減少はBPDを投与 されたマウスでは見いだされなかった。このようにして抗原特異的T細胞（DNFB に反応を示す）のみがBPDに影響された。BPDで治療された場合でも治療がDNFB感 作と同時の場合は、マウスは第二次抗原のオキサゾローンに応答する能力を保持 していた。実施例3 フィブリノーゲン結合へのBPDの効果 血小板はBlood（1987）70：307のShattilらに報告された方法の修正にしたが ってトロンビンによって活性化された。簡単に述べると、100Tg／mlのBPDリポソ ーム又はコントロールを用いて摂氏22度で15分間プレインキュベーションした後 、クエン酸加全血液は、摂氏22度で30分間、フィブリン重合抑制剤Ｇｌｙ−Ｐｒ ｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（終濃度1.25mM）の存在下で、Ｉ−トロンビン（終濃度10U ／ml）で処理された。フローサイトメトリーでフルオレセイン標識アンチフィブ リノゲンポリクローナル抗体を使ってフィブリノゲンの結合を評価することによ り血小板の活性化を測定した。その結果はアンチフィブリノゲンに対して陽性の 血小板の百分率として表1に示されている（三回の実験の平均±標準偏差で決定 された）。 表1で示されているようにトロンビンと一緒に処理されたときアンチフィブリ ノゲンに陽性な血小板の百分率はBPDが存在しないとき約2パーセントから約86、 87パーセントまであがる。しかしながら、100Tg／mlのリポソームBPDが存在する とき活性化のレベルは約三分の二減少する。実施例4 皮膚他家移植拒絶に対するBPDの効果 MHC不適合マウス間の皮膚移植を含む皮膚他家移植拒絶アッセイはMedewar及び Billingham（1951）の方法によってなされた。コントロールマウス（n＝16）は 他家移植後11.1±1.9日で移植を拒否する。 実験群において、マウス（n＝6）は他家移植後3―4時間で0.25mg／kgのBPD―M Aリポソーム調製物の一回の静脈注射を受けており、そして拒絶までの20.7±0.9 の移植の延長を示した。8日目にさらなる0.25mg／kgのBPDの注射を受けた別群の マウスは23.3±1.9日という中間の拒絶時間を示した。 このようにして、照射を受けないBPDは他家移植の拒絶を押さえている。実施例5 リュウマチ性関節炎での付着分子に対するBPDの効果 細胞表面付着分子ICAM―1は活性化された細胞で上流制御されている。そのた めにこの分子の出現は細胞活性化の指標と考えられている。 リュウマチ性関節炎患者からの滑液を種々の濃度のBPDと共に18時間組織培養 培地で保温し、アンチICAM―1で処理して、フローサイトメトリーを行った。こ の測定の結果は表2に示されている。 +VE:ICAM―1に関して陽性な細胞の百分率 MED:ICAM―1を発現する細胞のフルオレセン強度の中間値 表2に示されているように、ICAM―1に陽性なゲートされない細胞の百分率はBP D非存在下の85.7パーセントから100ng／mlＢＰＤ存在下で66.9パーセントまでに 減少している。この分子を提示しているリンパ球の百分率は比較的にBPDに影響 されなかったが、しかしながら、単核細胞及び多核型細胞にとって100ng／mlBPD はICAM―1の発現を非常に減少させた。 いかなる理論に縛られることも望まないが、暗所ででBPDによって引き起こさ れる抗原特異的免疫調節は、活性化した造血細胞が発現するインテグリン又は付 着分子との相互作用によって細胞伝達が阻害されることによると出願人は信じて いる。実施例6 BPD ―MAとインテグリン結合化合物のコンホメーションとの関係 二つの既知のインテグリンアンタゴニストであるRGDS及びアセチル化/アミド 化されたCNPRGDYC（ここではチロシンはメチルエーテルとして存在する）を、三 次元構造に関してBPD―MAの三次元構造と比較した。この比較はアルベルタ蛋白 質研究所によってなされた。 RGDSに対する三次元構造の予測は、それらのエネルギーによって七つのファミ リーに分類することができる1584個の可能なコンホメーションを示した。アセチ ル化、アミド化ペプチドCNPRGDYCに対する予測は、エネルギーによって五つのフ ァミリーに分類できる1347個のコンホメーションを示した。 両方の蛋白質の予測における主要なファミリー集団の部分集合はRGDA、RGDB及 びRGDCと称される実験的に見いだされる三つの集団のコンホメーションに似てい る。これらの三集団のコンホメーションは、両方の蛋白質の代表的コンホメーシ ョンとして用いられた。 これらのファミリーに含まれるコンホメーションは図2から図4までに重ねられ て示されており、図2はRGDAを示し、図3はRGDBを示し、図4はRGDCを示す。全て のコンホメーションは、カルボン酸（Ａｓｐ）から窒素（Ａｒｇ）までの官能基 距離12―13／を持つ。図5から図7まではBPD―MAにこれらの三集団の各々の代表 的コンホメーションを重ねたものを示している。図5はBPDをRGDAに重ねたものを 示しており、図6はBPD―MAをRGDBに重ねたものを示しており、図7はBPD―MAをRG DCに重ねたものを示している。 これらの重ね合わせの全てにおいて重なった構造は平面的であり、及びアスパ ラギン酸及びアルギニンの官能基はBPD―MAの対応するカルボン酸官能基及び窒 素官能基に重なっている。 その結果は、BPDはインテグリン結合性化合物のコンホメーションに似た幾つ かの官能基の配置を持つらしいことを示している。 実施例7 DTH応答へのBPDアナログの実験的テスト 直接光の非存在下において局所的に与えられたハプテンDNFBに対するDTH応答 に対して、BPD―MA、BPD―MB、BPD―DA及びBPD―DBが与える影響の比較を、上記 実施例2で概略が述べられた方法を用いて行った。化合物は無毛のナイーブなBal b／cマウスによって評価された。各々の処理集団は4、5匹の動物からなっていた 。BPDアナログはDMSO中で再構成されて及びDNFBの適用後24時間で投与された。 マウスは実験の5日目に耳にチャレンジ処理を受け、そして1日後に応答が測定さ れた。DMSOの最終濃度は2パーセントであった。コントロールマウスには、適宜 対応する溶媒を投与した。 結果は表3及び表4に示されており並びに図8に要約されている。単体のBPDアナ ログはDTH応答を強く抑制した。二量体のBPDアナログはDTH応答を抑制しなかっ た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハント，デーヴィッド・ウィリアム・カレ ー カナダ国ブリティッシュ・コロンビア州ブ イ４ビー・４ダブリュー３，ホワイト・ロ ック，ハブグッド・ストリート 886 (72)発明者 レヴィ，ジュリア カナダ国ブリティッシュ・コロンビア州ブ イ６ジェイ・４ズィー３，バンクーバー, ペニーファーシング・ドライブ 1890，ア パートメント ナンバー 601 (72)発明者 オボチ，モデスタス・オヌオラ・カイ カナダ国ブリティッシュ・コロンビア州ブ イ５ズィー・４ケイ７，バンクーバー，ス パイグラス・プレイス 1869，アパートメ ント ナンバー 212 (72)発明者 リクター，アンナ カナダ国ブリティッシュ・コロンビア州ブ イ６ティー・１エックス９，バンクーバ ー，トロント・ロード 5775，アパートメ ント ナンバー 903 (72)発明者 シムキン，ギリェルモ・オ カナダ国ブリティッシュ・コロンビア州ブ イ６エル・２ビー３，バンクーバー，サー ティセカンド・アベニュー・ウエスト 2726

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．抗原特異的免疫応答の調節が必要な患者に、抗原に対する該免疫応答を調 節するために有効な量の緑色ポルフィリンを、該緑色ポルフィリンに吸収される 照射の非存在下において、該抗原に対する抗原特異的免疫応答が進行している間 に投与することよりなる、抗原特異的免疫応答の調節方法。 ２．前記緑色ポルフィリンをリポソーム組成物として全身的に投与する、請求 項1の方法。 ３．前記抗原が自己免疫である請求項1の方法。 ４．前記患者が外来組織の受容者である請求項1の方法。 ５．前記抗原が乾せんに関連する抗原であり、及び前記投与が局在的投与によ るものである請求項1の方法。 ６．前記抗原がアレルゲンである請求項1の方法。 ７．前記緑色ポルフィリンが図1の構造を有するポルフィリン又はその混合物 からなり、R¹及びR²が各々独立にカルバルコキシル（2―6C）、アルキル（1―6C ）、アリールスルホニル（6―10C）、シアノ、及びR⁵がアリール（6―10C）又は アルキル（1―6C）である−CONR⁵COからなる群から選択されたものであり、R³が 各々独立にカルボキシル、カルボキシアルキル（2―6C）又は塩、アミド、エス テル若しくはアシルヒドラゾン、またはアルキル（1―6C）であり、R⁴がCH=CH₂ または−CH（OR^4'）CH₃であり、ここでR^4'が水素又は場合により親水性置換基に よって置換されたアルキル（1―6C）である、請求項1の方法。 ８．前記緑色ポルフィリンが図1−3又は図1−4で表される式の化合物若しくは それらの混合物であり、R¹及びR²が各々独立にカルバルコキシル（2―6C）であ り、一方のR³がカルボキシアルキル（2―6C）であり、他方のR³がカルボキシア ルキル（2―6C）置換基のエステルであり、R⁴がCH=CH₂又は―CH（OH）CH₃である 、請求項7の方法。 ９．前記緑色ポルフィリンが図1−3に示される式の化合物であり、ここでR¹及 びR²がメトキシカルボニルであり、一方のR³が―CH₂CH₂COOCH₃であり、他方のR³ がCH₂CH₂COOHであり、及びR⁴がCH=CH₂である、請求項8の方法。 10．不所望な細胞間伝達によって特徴づけられる状態を調節する方法であって 、該方法は緑色ポルフィリンの吸収する光の非存在下で前記細胞伝達を調節する のに効果的な量の緑色ポルフィリンを、そのような調節を必要とする患者に投与 することからなり、前記投与が前記細胞間伝達が起きる間になされる方法。 11．前記細胞間伝達がレステノシスを生じる請求項10の方法。 12．前記緑色ポルフィリンがリポソーム組成物として全身的に投与される請求 項10の方法。 13．前記緑色ポルフィリンが図1に示される式の化合物又はその混合物であり 、ここで、R¹及びR²が各々独立にカルバルコキシル（2―6C）、アルキル（1―6C ）、アリールスルホニル（6―10C）、シアノ及び-CONR⁵COからなる群から選択さ れ、R³は各々独立にカルボキシル、カルボキシアルキル（2―6C）若しくは塩、 アミド、エステル若しくはアシルヒドラゾン、またはアルキル（1―6C）であり 、R⁴はCH=CH₂若しくは―CH(OR⁴・)CH₃であり、R⁴・は水素又は場合により親水性 置換基で置換されたアルキル（1―6C）を表す請求項12の方法。 14．緑色ポルフィリンが図1―3又は図1―4で示される式の化合物若しくはその 混合物であり、ここでR¹及びR²が各々独立にカルバルコキシル（2-6C）であり、 一方のR³はカルボキシアルキル（2―6C）であり、他方のR³はカルボキシアルキ ル（2―6C）置換基のエステルであり、R⁴はCH=CH₂又は−CH(OH)CH₃である請求項 10の方法。 15．前記緑色ポルフィリンが図1―3に示される化合物であり、ここでR¹及びR² はメトキシカルボニルであり、一方のR³は―CH₂CH₂COOCH₃であり、他方のR³はCH₂ CH₂COOCHであり、R⁴はCH=CH₂である請求項14の方法。