KR100332554B1 - 면역조절물질로서의그린포르피린 - Google Patents

Abstract

본 발명은 그린 포르피린을 특정 항원에 대한 면역 반응의 활성 상태에서 항원 특정 면역 조절제로서 사용하고, 세포간 교신을 간섭하도록 사용하는 것이다. 이와 같은 효과는 그린 포르피린에 의해 흡수되는 방사선이 없는 조건 하에서 발생한다.

Description

면역 조절 물질로서의 그린 포르피린

그린 포르피린이라고 총체적으로 지정된, 광역학적 치료에 유용한 화합물 군으로서는, 미국 특허 제 5,283,255 호, 제 4,883,790 호, 제 4,920,143 호, 제 5,095,030 호 및 제 5,171,749 호를 포함한 일련의 특허와 본 명세서에 참고 문헌으로 첨부한 간행물들에 개시되어 있다. 이와 같은 그린 포르피린은 헤마토프로피린과 딜스-앨더(Diels-Alder) 반응시키고, 임의로 이 생성물을 환원 반응 또는 자리옮김(rearrangment) 반응을 수행하여 제조하고 있다. 상기한 바와 같은 인용 특허에서 약술한 바와 같이, 이와 같은 그린 포르피린 중에서 특히 바람직한 형태는 모노산 형태의 벤조포르피린 유도체, 또는 "BPD-MA"가 된다. 현재, 다양한 암과 그 외의 질병의 광역학적 치료(PDT)와 관련하여, 임상학적인 치료가 시도되고 있다.

이 경우에, 그린 포르피린이 무광원 하에서는 생리적 효과가 없다는 가정을기초로, 광활성 화합물로서 투여하는 광역학적 치료가 진행되었으며, 조사가 개시되면, 이 화합물의 활성화된 형태가 국부 독성 효과를 발휘되는 것이었다. 따라서, 암 치료 등의 경우에서는, 정상 조직으로부터 완전히 제거한 후에, 암 조직에 계속 잔존하는 이러한 광활성 화합물의 경향성을 이용해왔다. 또한, 이 화합물이 정상 조직으로부터 제거되기 이전에도 신생 혈관 부위에 국부적인 조사가 유효하다는 것도 알려져 있다.

이제, 이 그린 포르피린이 PDT의 광활성제로서 갖는 성질들과는 별개로, 면역 조절 활성을 띠고, 세포간 교신을 간섭한다는 것을 비로소 알게 되었다. 본 발명은 지금까지는 예상되지 못했던 그린 포르피린의 이러한 특정을 이용하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 조사 과정 없이, 특정 항원에 대해 발생되는 면역 반응에 관여하는 그린 포르피린의 특성을 이용한 것이다. 얻어지는 면역 조절은 다음에 예시한 바와 같이, 지발형(delayed-type) 과민 반응에서 얻어진 결과를 이용하는 항원-특정적인 것이다. 따라서, 환자는 일반적으로 면역절충화되는(immunocompromised) 불편함 없이, 자기항원, 알레르겐 등에 관한 바람직하지 못한 반응으로부터 보호될 수 있다. 추가로 이 그린 포르피린은 다음에 예시된 바와 같은 혈전증 등을 초래하는 세포간 교신을 간섭한다. 또한, 그린 포르피린은 서열 RGD로 특징지워지는 기지의 인테그린(integrin)과 유사한 구조 배열을 갖는 것으로 나타나 있다. 이러한 점에 의해, 바람직하지 않은 세포간 교신으로 특징지워지는 질병을 치료 또는 예방하는데, 이 그린 포르피린을 사용할 수 있다.

따라서, 한 가지 특징으로서, 본 발명은 항원 특정 면역 반응을 조절하는 방법을 제공하는 것인데, 이 방법은 항원에 대해 활성화된 면역 반응을 앓고 있는 환자에게, 그린 포르피린에 의해 흡수되는 빛이 없는 조건 하에서, 항원에 대한 상기 면역 반응을 조절할 수 있도록, 그린 포르피린 유효량을 투여하는 것으로 이루어지는데, 상기 투여는 특정 항원 그 자체에 대한 면역 반응의 활성 상태(active phase)동안에 이루어진다.

다른 특징으로서, 본 발명은 환자의 세포간 교신을 조절하는 방법을 제공하는 것인데, 이 방법은 이와 같은 조절이 필요한 환자에게, 그린 포르피린에 의해 흡수되는 빛이 없는 조건 하에서, 세포간 교신을 조절할 수 있도록, 그린 포르피린 유효량을 투여하는 것으로 이루어지는데, 상기 투여는 바람직하지 못한 세포간 교신 과정 동안에 이루어진다.

또다른 특징으로서, 본 발명은 상기 본 발명 방법에 유용한 그린 포르피린 배합물을 포함한다.

[도면의 간단한 설명]

도 1은 본 발명의 방법에 유용한 그린 포르피린의 대표적인 구조식을 나타낸 것이다.

도 2는 RGDA로 표시되는 구조 배열 군의 포개진 배열 구조를 나타낸 것이다.

도 3은 RGDB로 표시되는 구조 배열 군의 포개진 배열 구조를 나타낸 것이다.

도 4는 RGDC로 표시되는 구조 배열 군의 포개진 배열 구조를 나타낸 것이다.

도 5는 RGDA의 대표적인 구조 배열을 갖는 BPD-MA의 3차원 구조를 포개진 배열 구조로 나타낸 것이다.

도 6은 RGDB의 대표적인 구조 배열을 갖는 BPD-MA의 3차원 구조를 포개진 배열 구조로 나타낸 것이다.

도 7은 RGDC의 대표적인 구조 배열을 갖는 BPD-MA의 3차원 구조를 포개진 배열 구조로 나타낸 것이다.

도 8은 면도하지 않은, 천연의 발브(Balb)/c 마우스로 DTH 반응에 대한, 4 가지의 BPD 유사체의 영향을 비교하여 나타낸 것이다.

본 발명은 무광원 조건 하에서 그린 포르피린(green porphyrins)를 투여함으로써 면역 반응을 조절하는 분야에 관한 것이다. 항원 특정 면역 반응은, 특정 항원에 감응하는 경로중에 그린 포르피린이 투여될 경우에 조절된다. 부가적으로, 무광원 조건 하에서의 그린 포르피린은 세포간 전달을 간섭함으로써, 예컨대, 재협착증의 치료 또는 예방이 가능하다.

발명의 실시 유형

특정 항원에 대한 면역 반응이 바람직하지 못한 경우로는 다수의 예를 들 수 있다. 이러한 증상 중에서 특히 두드러지는 것은 알레르기성 반응, 자기면역 반응, 및 장기 이식, 피부 이식 등의 면역 거부 반응이다. 본 발명의 그린 포르피린은 면역 반응을 유도하는 활성 상태에 투여할 경우에 유효하므로, 항원에 노출시킨 이후의 기간 동안 또는 활성 형태에서 면역 반응이 연속적이라면, 이러한 연속 상태 동안에 투여할 경우, 유효하다.

이 그린 포르피린은 그 자체로 흡수되는 방사선이 없는 조건 하에서, 그 효과를 발휘한다. 이러한 표현은 표적 부위에 일부러 빛을 조사하지 않은채 이용한다는 것을 의미한다. 상기 배경 기술 부분에서 전술한 바와 같이, 그린 포르피린류는 광역학적 치료법에서 광범위하게 사용되왔다. 이러한 치료법에서, 상당량의 그린포르피린을 함유하는 변형 조직이나 세포단은 계획적으로, 이 그린 포르피린 화합물에 의해 흡수되는 파장을 포함하는 빛으로 조사된다. 그린 포르피린류에 의한 이러한 파장의 흡수는, 주위 물질들을 손상시키는 것과 같은 방식으로 분자 들뜸을 야기시킨다. 들뜬 화합물들의 붕괴 과정 중에서 단일항 산소가 생성되어 독성이 나타나게 된다고 추정되며, 광활성화제 자체는 비독성이라고 여겨진다.

본 발명에 의한 방법들에 있어서는, 들뜸을 야기시키는 빛의 조사가 치료법에 포함되지 않는다. 하지만, 치료를 받는 환자를 모든 빛으로부터 차단시킬 필요는 없다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "그린 포르피린에 의해 흡수되는 조사가 없는 조건 하에서"라고 함은, 전반적인 암흑이라기 보다는 전형적인 대기 조건을 지칭하는 것이다. 즉, 이미 공지된 그린 포르피린의 광역학적 효과는 본 발명의 방법들에서는 이용되지 않는다는 것을 의미하는 것이다.

그린 포르피린

그린 포르피린의 특성은, 앞서 배경 기술 부분에서 상기한 바와 같은 특허들에 개시되어 있다. 약술하자면, 이들은 치환된 아세틸렌과 딜스-앨더 반응을 하고, 임의로 환원 반응 및/또는 자리옮김 반응을 수행하여 얻을 수 있는 포르피린 IX의 유도체들이다. 이와 같이 얻어진 화합물의 전형적인 구조들을 도 1에 나타내었다. 도 1에 도시한 구조식 중에서 바람직한 예로는, 고리 화합물 시스템이 도 1-3 또는 도 1-4에 도시된 구조를 갖는 것, 및/또는 각각의 R¹과 R²가 카르보알콕시기(C_2∼6),알킬기(C:_∼6), 아릴술포닐기(C_6∼10), 시아노기 및 -CHNR⁵CO (식 중, R⁵는 아릴기(C_6∼10) 또는 알킬기(C_1∼6)임)로 이루어진 군 중에서 선택된 것이며, 각각의 R³는 카르복실기, 카르복실알킬기(C_2∼6) 또는 그의 염, 아미드, 에스테르 또는 아실히드라존이거나, 알킬기(C_1∼6)이고, R⁴는 -CH=CH₂또는 -CH(OR^4')CH₃(식 중, R^4'는 H, 또는 임의로 친수성 치환기로 치환된 알킬기(C_1∼6)임)인 화합물들이다. 물론, 혼합물을 사용할 수도 있다.

도 1-3 및 1-4에 도시한 바와 같은 화합물 중에서도, 각각의 R¹과 R²가 카르보알콕시기(C_2∼6)이며, R³하나는 카르복실알킬기(C_2∼6)이고, 나머지 R³는 카르복실알킬(C_2∼6) 치환기의 에스테르이고, R⁴는 -CH=CH₂또는 -CH(OH)CH₃인 화합물이 특히 바람직하다.

가장 바람직한 화합물은 도 3에 도시된 바와 같은 화합물로서, 각각의 R¹과 R²가 메톡시카르보닐기이며, R³하나는 -CH₂CH₂COOCH₃이고, 나머지 R³는 -CH₂CH₂COOH이며, R⁴는 -CH=CH₂인 화합물이다. 이러한 후자의 화합물은, 벤조하이드로포르피린 유도체 모노액시드(benzohydroporphyrin derivative monoacid)의 약자인, BPD-MA에관한 것이며, 이 화합물은 A 고리 쪽에서 딜스-앨더 반응이 일어난다.

치료되는 증상의 특성

특정 항원에 대한 활성화된 면역 반응의 과정 동안에, 척추동물문에 속하는 피대상자에게 투여되는 그린 포르피린은, 어떠한 총체적인 면역 억제 반응 없이, 특정 항원에 대한 반응을 조절한다. 투여 시기로는, 피대상자가 투여되는 항원/면역원에 대한 경험이 없는 것이 유리하다. 예컨대, 피부 이식 또는 기관 이식과 같은 타가이식을 이용한 이식 치료법, 당뇨병 환자에 대한 인슐린 대체에 사용되는 것과 같은 개별 세포 이식, 및 외부 세포 또는 조직을 피대상자에게 의도적으로 도입시키는 주사가 있는 절차 또는 외과 절차 그 외의 어떠한 것에서, 의도적으로 투여된 항원에 대한 바람직하지 못한 면역 반응이 나타난다. 의도적으로 투여된 화합물에 바람직하지 못한 면역 반응이 발생하는 그 외의 예로서는, 피대상자의 단백질에 대해서 이종 개체인 단백질이 사용되는 것을 들 수 있다. 전형적인 예로는, 종양 치료에서 모노클로날(monoclonal) 항체를 투여하는 것을 들 수 있다. 많은 경우에 있어서, 항체를 인체 적합화하는 시도가 있었음에도 불구하고, 마우스로부터 유도된 모노클로날 항체가 인간의 치료에 사용되었다. 이와 같은 항체에 대한 바람직하지 못한 면역 반응이 본 발명의 방법들에 의해 조절될 수 있다. 이러한 예로서, 일차면역 반응이 달성되고, 항체 투여와 동시에, 또는 그 이후에 즉시 그린 포르피린을 투여함으로써 바람직한 효과가 달성된다.

면역 반응이 외부 항체에 대해 발생하는 또다른 예로서는, 알레르기성 반응을 들수 있다. 이와 같은 반응들은 일반적으로 이차 면역 반응들인데, 이와 같은이차 노출과 동시에, 또는 그 직후에 본 발명에 의한 그린 포르피린의 투여가, 역시 유효하다.

상기 두 경우 모두에 있어서, 항원 또는 알레르겐의 투여와 동시에, 또는 항원에 대한 활성 반응이 필요한 기간 내로 그린 포르피린이 투여될 것이다. 일반적으로, 상기 필요한 기간이라 함은 항원 투여 24∼48 시간 이내를 지칭하는 것이다.

본 발명의 방법이 적합한 대상은 일반적으로 척추 동물, 바람직하게는 포유 동물이다. 척추 동물 기관은 일반적으로 유사한 세포간 교신 체계를 이용하고, 유사한 방식으로 면역 반응이 수집된다. 특히, 바람직한 대상으로서는, 가축과 조류 대상물, 및 인간 환자가 포함된다. 물론, 적절한 치료법, 투여법 및 배합물은 피대상자의 특성에 따라 달라진다.

항원의 투여

그린 포르피린의 투여와 동시에, 또는 그 직전에서의 항원 투여는 알레르긴(allergin)의 특성에 따라 달라질 것이다. 치료용 또는 진단용으로 사용되는 의약, 모노클로날 항체 또는 그 외의 외부 단백질과 같은, 의도적으로 투여된 항원의 경우, 투여 형태와 투여 수준은 일반적으로 항원을 투여하는 목적에 따라 조정될 것이다. 이 항원은 전형적으로 적절하게 배합된 의약 조성물로 이미 이용 가능하게 되어 있으며, 투여 예상 경로와 투여 수준도 이미 공지된 바이다.

타가 이식에 있어서, 면역원이 되는, 심장, 신장, 간, 폐 등과 같은 맥관화된 기관과, 뇌하수체, 갑상선, 부신, 상피소체 및 췌장과 같은 내분비선, 및 피부 이식 조직을 포함하는, 실시하고자 하는 피대상자와 동일한 종의 성원으로부터의장기 또는 조직으로 규정지어지는 세포들이 이식 거부 반응을 야기시키는 주요 조직적합성 항원을 함유하지 않을지도 모른다는 것이, 일반적인 추정 사실로 알려져 있다. 오히려, 이와 같은 항원은 불순물로서 이식 세포내에 포함되어 있는 백혈구와 같은 전달 세포(passenger cells)에 의해 옮겨진다고 여겨진다.

따라서, 그린 포르피린의 투여는 MHC-담지 세포들을 전달하는 이식 그 자체와 동일하게 실시하던지, 그 직후에 실시할 수 있거나, 단백질 자체로서든지, 이들이 담지된 세포의 표면에 포함되서는지로, 해당 조직적합성 항원을 따로 투여함으로써, 이 피대상자를 미리 예방시킬 수도 있다. 그 후에, 세포 또는 조직 적합성 항원의 선투여 직후에 그린 포르피린을 투여한다. 예를 들면, MHC 클래스 II 항원으로 이루어진 군 중에서의 HLA-DR이 인체 조직적합성의 주요 결정자이다. 이들은 하위 분류되고, 공급자가 유형화되어 있다면, DR 항원의 아유형을 이식 자체 직전에 그린 포르피린의 투여와 함께 투여할 수 있다.

만약, 이 항원이 알레르겐이라면, 이 알레르겐은 그린 포르피린과 함께, 또는 이 그린 포르피린의 투여 직전에 경구 투여 또는 주사에 의해 직접 투여될 수 있다. 또는, 피대상자에게 알레르기성 반응을 유도한다고 알려져 있는 꽃가루를 함유하는 식물 등을 환자 근방에 배치시킴으로써, 이 투여법이 천연 노출을 흉내낼 수도 있다. 환자가 이와 같은 환경에 배치되는 경우, 그린 포르피린은 동시에 또는 그 직후에 바로 투여된다.

만약, 이 항원이 류머티즘성 관절염, 다중 경화증, 홍반성 낭창, 모든 유형의 당뇨병, 또는 일반적으로 자기 항원에 의해 야기되는 감염성 감응을 포함하는다수의 질병을 초래한다고 생각되어지는 바와 같은 자기 항원이라면, 이 항원의 투여는 따로 조정할 수 없다. 본 발명에 의한 방법의 효용성은 자기 항원에 대한 연속 활성면역 반응에 따라 달라진다. 이와 같은 경우에서, 자기 항원 질병으로 고통받는 피대상자에게 그린 포르피린을 투여하는데, 바람직하게는 이 면역 반응이 가장 명백해진 기간 동안에 투여한다.

자기 면역 반응과 관련된다고 여겨지는 추가 질병으로서는 건선이 있다. 이와 같은 증상을 치료하는 데에는 본 발명의 방법이 적절하며, 특히 국부 투여를 이용한다.

세포간 교신

면역 반응을 조절할 수 있는 특징에 부가하여, 본 발명의 그린 포르피린은 세포간 교신을 간섭할 수 있는데, 추정적인 인테그린에 대한 형태상의 유사성을 이용하는 것이다. 다음에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의한 그린 포르피린의 3 차원 구조는 부착 서열 RGD를 포함하는 대표적인 분자의 바람직한 위치 배열의 3 차원 구조를 모사한 것이다. 또한, 이 그린 포르피린이 RGD-기초 화합물들의 기지 능력인, 혈전증을 중지시키는 것이 가능하다는 것이 밝혀졌다. 그러므로, 본 발명의 방법들은 세포간 교신이 환자에게 좋지 않은 영향을 미치는 증상들을 치료하는 데도 적합하다.

이와 같은 일례로서는, 맥관 구조의 외과적 조치 또는 그 외의 외상성 손상 이후의 재협착증 형성을 들 수 있다. 이와 같은 목적으로는, 이와 같은 스트레스에 대한 반응으로 혈병 형성의 위험을 나타내는 외과 수술 절차 가까이에서, 본 발명의 방범을 실시할 수 있다. 투여는 전형적으로 전시투여가 될 것이며, 혈전증을 초래하는 데 필요한 세포 교신을 간섭할 수 있도록 시기가 조절될 것이다.

배합 및 투여 방법

본 발명의 그린 포르피린은 이 분야에서 소분자 의약용에 대한 일반적인 통상의 방식으로, 예컨대, 레밍턴의 의약 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences: Mack Publishing Company, Easton, PA, Latest Edition)에 개시된 바와 같이 배합하고 투여할 수 있다. 조성물에는 그린 포르피린이 면역 조절 반응 또는 세포간 교신의 간섭에 유효한 양으로 함유될 것이다. 투여 정도 수준은 투여 유형, 배합물, 치료조건 및 피대상자의 특성에 따라 달라질 것이긴 하지만, 일반적으로, 전신 계통 투여용의 그린 포르피린 양은 10 Tg/kg∼100 mg/kg, 바람직하게는 100 Tg/kg∼10 mg/kg, 및 가장 바람직하게는 1 mg/kg 정도가 된다. 국부 투여인 경우에는, 조성물의 약 5∼95% 정도, 바람직하게는 약 10∼50% 정도 범위의 조성물내 농도로 사용된다.

전신 계통 투여 경로는 정맥 주사, 근육 주사, 복강 주사 등을 포함한 주사법에 의한 경로, 구강 경로, 점막 경유 경로, 적절한 부형제를 이용한 경피성 경로 등이 될 수 있다. 또한, 국부 투여가 좌약 또는 피부 패치를 이용한 점막 경유성 또는 경피성 방법들에 의해 달성될 수도 있으며, 이 그린 포르피린을 겔 또는 연고의 형태로 국소적으로 적용시킬 수도 있다.

전신 계통 투여를 채용한 경우에는, 리포솜(liposome) 조성물이 특히 바람직하다. 리포솜은 표준 방법을 이용하여 제조할 수 있는데, 이들은 전형적으로 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 세린 또는 포스파티딜 이노시톨과 같은 음으로 대전된 인지질 및 지질 자체와 다양한 안정제로 제조된다. 이 리포솜은 다층 또는 단층이 될수도 있으며, 크기 범위도 다양하다. 리포솜 조성물의 그린 포르피린 농도는 전형적으로 1∼20%에 속한다.

다음 실시예들은 단지 일례를 나타낸 것 뿐이지 본 발명을 한정시키고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

MBP-유도 EAE에 대한 효과

PL 마우스의 경험성 알레르기 뇌척수염(Experimental allergic encephalomye litis:EAE)은 인체의 다중 경화증의 모델로서 사용되어 왔다. 이러한 증상은 미엘린 기초 단백질(MBP)을 실컷 먹인 공급자 마우스의 비세포(splenocyte)를 주사함으로써 유발시킬 수 있다. 비세포는 다음과 같이 제조하여 얻었다: 완전 프로인트 보조액(불완전 프로인트 보조액에 H37RA형 결핵균 4 mg)에 MBP(인산염 완충 식염수 4 mg/mL)동부피량을 유화시킴으로써 제조된 혼합물 0.1 mL를 PL 마우스에게 투여하였다. 그후에, 마우스의 꼬리 밑 부분에 주사하였다. 접종하고 열흘이 경과한 후에, 비장을 떼어내어 단일 세포 현탁액 테스트를 실시하였다. 세포들을 원심 분리에 의해 펠렛화하고, 0.14 M NH₄Cl에 용해시킴으로써 적혈구를 제거하였다. 75 ㎠ 플라스크에 태아 송아지 혈청 5%, HEPES 20 mM, 1-글루타민 2 mM, 페니실린 100 U/mL, 스트렙토마이신 100 Tg/mL 및 MBP 100 Tg/mL를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 세포(4×10⁶/mL)를 배양하였다. 350 ℃, 5% CO₂조건 하에서 사흘을 경과한 후에, 인체 재조합 인터로이킨-2(rIL-2, 50 U/mL)로 이 배양을 펄스화(pulsed)하고, 배양기에 다시 넣고 48 시간 동안을 추가 배양시켰다. 그 후에, 세포들을 모아서, 무혈청 배지로 씻어내고나서, 천연의 동종 동물들에게 5×10⁷세포를 정맥 주사하였다(iv). 이와같이 처리된 마우스들은 전형적으로 18∼25 일 포스트-세포 전이(post-cell transfer)로 EAE를 발병시켰다.

세포 5×10⁷를 정맥 주사한 대조군 마우스 4 마리를 마련하여 상기한 바와 같이 배양하였다. 19∼30 일 지난 후에, 이 마우스 4 마리 중에서 3 마리에게서 EAE와 관련된 특성 마비 질환이 발병하였다. MBP-반응성 T 임파구가 중추 신경계에 퍼질 경우에, 이와 같은 증상이 도출되는 것이다. 하지만, 실험군으로서, 마찬가지로 MBP-흡수하고 배양된 세포들이 주사된 4 마리의 마우스에게는 24 시간 후에 BPD-MA 1.0 mg/kg을 정맥 주사하였다. 이 마우스들에게서는 EAE 이상 증상이 발병되지 않았다. 하지만, MBP-흡수하고 배양된 세포들을 주사하기 24 시간 전에 동일한 양의 BPD를 투여한 마우스들은 대조군에서와 같은 EAE 과정을 나타내었다.

BPD-주사가 배양된 세포를 투여한 후로부터 약 24 시간 이내에 투여될 경우에만 유효했기 때문에, BPD는 받아들여지는 동물들의 내인성 세포보다는 전이된 활성화 T세포에 직접 작용한다고 보여진다.

이와 같은 실시예 1에 상기한 바와 같이 제조된 비세포는, MBP 100 Tg/mL로 배양할 경우에, MBP에 의해 활성화되고, 특성화된 T 세포의 확대에 의해 증식성 반응이 발생한다. 이와 같은 증식성 반응은 MBP 없이 배양된 세포와 비교하여, 이를 0%라 하고, 100%로 지수화된다. 이 세포들을 BPD 존재 하에서, 1 ng/mL∼1 Tg/mL의 농도로 배양시킬 경우에, 이 증식 반응은 억제된다. BPD 1 ng/mL에서의 증식은 20% 뿐이였고, 10 ng/mL에서 이 지수는 0으로 떨어졌다. 100 ng/mL를 초과하여서는, 이 증식성 반응은 MBP 없이 배양된 세포에서 보이는 것에도 못 미쳤다.

사용된 농도 범위에서 BPD는 무광원 하에서는 본연의 독성이 나타나지 않았기에, 이와 같은 결과들을 통해 BPD가 MBP-특정 T 세포의 면역성 결여를 유도시킨다는 알수 있다.

실시예 2

DTH에 대한 BPD의 효과

지발성 유형의 과감작증(DTH) 모델이 제공된 웰을 이용하였다. 0 일째에 디나이트로플루오로벤젠(DNFB)를 무모증종인 마우스의 서혜부에 칠하였다. 5 일째에, DNFB를 귀에 칠하여, 항원 특정 T 세포에 의해 결집되는 이후의 24 시간 동안에, 귀가 부풀어오르는 것을 포함한, 명백한 염증성 반응을 야기시켰다.

0 일째에 DNFB를 칠한 마우스들에게 리포솜 BPD-MA를 -2, -1, 0, +1, +3 또는 +4일에 1 mg/kg의 투여량으로 정맥 주사하였다. 5 일이 되는 날, 이 마우스들의 귀에 DNFB를 칠하고, 24 시간 후에 귀의 팽창을 측정하였다. BPD가 아닌 식염수를 투여한 DNFB-민감성 마우스들은 DNFB를 칠하고난 후에 심하게 귀가 부풀는 반응을보였다. 팽창 정도는 팽창 백분율, 또는

으로서 측정되어 기록되었다.

팽창은 대개 상기 대조 수준 60∼90% 범위 정도가 되었다. 하지만, BPD -2, -1, 0, +1 또는 +3 일에 투여한 경우에는, 귀의 팽창치 대조군 동물들에서 관찰된 것의 50% 미만이었다. BPD를 4 일에 투여한 경우에, DTH 감응의 억제 반응은 대략 25%이였다.

추가 실험으로는, 먼저 DNFB 감작된 마우스를 다양한 피부 접촉 감작제, 옥사졸론으로 처리하였다. 이어서, 이 마우스들에게 DNFB와 옥사졸론의 처리를 실시하였다. BPD 치료된 마우스들은 DNFB에 대한 반응의 억제를 나타내었다. 하지만, BPD 투여된 마우스들에서도 옥사졸론에 대한 귀의 팽창이 감소되는 것이 나타나지 않았다. 따라서, 항원 특정 T 세포들(DNFB 반응성의)만이 BPD에 의해 유효하였다. DNFB 감작과 관련된 BPD를 치료함에도 불구하고, 이 마우스들은 이차 항원, 옥사졸론에 대해 반응하는 그 능력을 보유하고 있었다.

실시예 3

피브리노겐 결합에 대한 BPD의 효과

쉐트틸(Shattil) 등의, Blood(1987) 70: 307에 개시된 방법을 변형하여, 트롬빈으로 혈소판을 활성화시켰다. 간략하게는, 대조군 또는 리포솜성 BPD 100 Tg/mL으로 220 ℃에서 15 분 동안 예비 배양한 후에, 구연산염 함유된 전체 혈액을, 피브린폴리머화 억제자 Gly-Pro-Arg-Pro(최종 농도 1.25 mM)의 존재 하에서 I-트롬빈(최종 농도 10 U/mL)으로 220 ℃에서 30 분 동안 처리하였다. 혈소판 활성화도는 유체혈구 계산 분석으로 형광-표지된 안티피브리노겐 폴리클로날 항체를 사용하여 결합된 피브리노겐을 분석 산측하였다. 이 결과들은 다음 표 1에 안티피브리노겐에 대한 양성 혈소판 백분율로서 나타내었다(실험치 3 회 ± 표준 편차 1 회의 평균으로 산측함).

[표 1]

안티-피브리노겐에 대한 양성 혈소판의 백분율: 3 ± (1 S.D.)의 평균

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 트롬빈으로 처리된 경우에, 안티피브리노겐에 대한 양성 혈소판의 백분율이 BPD가 없을 경우에 약 2% 정도로부터 약 86∼87% 정도까지로 상승한다. 하지만, 리포솜 BPD 100 Tg/mL가 존재할 경우에, 활성화 수준은 약 2/3 정도로 감소된다.

실시예 4

피부 타가 이식 거부 반응에 대한 BPD의 효과

MHC-부적합 마우스들 사이의 피부 이식에 수반되는 피부 타가 이식 거부 반응 분석은 메데바와 빌링햄(Medewar and Billingham)(1951)의 방법에 의해 실시하였다. 대조군 마우스들(n=16)은 타가 이식후 11.1 ± 1.9 일에 이식 거부 반응을일으켰다. 실험군(n=16)에서는, 마우스들에게 타가 이식 3∼4 시간 후에 BPD-MA 리포솜 조제 약 0.25 mg/kg을 1 회 정맥 주사하였는데, 거부 반응에 대해 20.7 ± 0.9 일의 장기 이식 기간을 나타내었다. 8 일 되는 날에 BPD 0.25 mg/kg을 추가로 투여한 마우스의 다른 군은 23.3 ± 1.9 일이라는 평균 적응 기간을 나타내었다.

따라서, 무광원 하에서의 BPD가 타가 이식의 거부 반응을 억제함을 알 수 있다.

실시예 5

류머티즘성 관절염의 접착 분자에 대한 BPD의 효과

세포 표면 접착 분자 ICAM-1은 활성화된 세포들에서 상향 조절된다. 그러므로, 이와 같은 분자의 출현은 세포 활성화의 지표라고 여겨진다.

류머티즘성 관절염을 앓는 환자의 활액 유체를 BPD의 다양한 농도로 조직 배양 배지에서 18 시간 동안 배양시키고, 안티-ICAM-1로 처리하고, 유체 혈구 계산하였다.

이와 같은 분석의 결과를 다음 표 2에 나타내었다.[표 2]

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, ICAM-1에 대해 양성인 비차단 세포(ungated cells)의 백분율이 BPD가 없을 경우의 85.7%로부터, BPD 100 ng/mL 존재 하에서는 66.8%로 감소된다. 이와 같은 분자를 활성 제거하는 백혈구의 백분율은 BPD에 의한 영향이 비교적 없었지만, 탄핵 세포와 다형핵 세포의 경우에는, BPD 100 ng/mL가 ICAM-1의 발현을 현저하게 감소시켰다.

그 어떤 이론에 근거를 두고자 하는 것은 아니지만, 본 출원인은 어두운 곳에서의 BPD에 의해 도출되는 항원 특정 면역 조절 반응이, 세포 교신을 교란시키도록 하는, 활성화된 조혈 세포로 발현되는 접착 분자들 또는 인테그린 사이에서의 상호작용에 기인한 것이라고 생각한다.

실시예 6

인테그린-결합 화합물의 구조 배열와 BPD-MA의 관계

기지의 인테그린 길항제 두 가지, RGDS와 아세틸기/아미드기 치환된 CNPRGDYC(티로신이 메틸에테르로서 존재하는)은 3 차원 구조적으로 BPD-MA의 3 차원 구조와 비교하였다. 이와 같은 대비는 알베르타 펩티드 협회(Alberta Peptide Institute)에 의해 수행되었다. RGDS의 3 차원적 구조 예상은 가능한 구조 배열 1584 가지로 나타났는데, 그 에너지에 따라 7 개 군으로 분류할 수 있다. 아세틸기, 아미드기 치환된 펩티드 CNPRGDYC의 예상 구조는 그 에너지에 따라 5 개 군으로 분류되는 구조배열 1347 가지로 나타났다.

두 가지 펩티드 모두에 대한 예상 구조의 5 가지 주요 분류군의 부분류군은 RGDA, RGDB 및 RGDC라고 지정된, 실험적으로 밝혀진 배열 구조의 3 가지 군과 유사하다. 구조 배열의 이와 같은 3 가지 군들은 이 두 가지 펩티드 모두에 대한 대표적인 구조 배열로서 사용되었다.

이와 같은 분류군 내에 포함되는 구조 배열들을 도 2∼4에 겹친 구조 도면으로 도시하였는데, 도 2는 RGDA를 나타낸 것이고, 도 3은 RGDB를 나타낸 것이며, 도 4는 RGDC를 나타낸 것이다. 모든 구조 배열들은 질소(Arg) 작용기 길이 12∼13/에 대한 카르복실산(Asp)을 갖는다. 도 5∼7은 BPD-MA를 갖는 이와 같은 3 가지 군 각각의 대표적인 배열 구조 겹친 도면으로 도시한 것이다. 도 5는 RGDA를 나타낸 것이고, 도 6은 BPD-MA를 나타낸 것이며, 도 7는 RGDC에 겹쳐진 BPD-MA를 나타낸 것이다. 이와 같은 포개 얹는 과정 모두에서는, 겹쳐진 구조가 평면이며, BPD-MA의 해당 카르복실산과 질소 작용기 위에 아스파르트산기와 아르기닌의 작용기가 겹쳐져 있다. 이 결과들을 통해, BPD가 인체그린 결합 화합물의 구조 배열을 모사하는 작용기의 일부 배열을 갖는 것으로 나타나는 것을 알 수 있다.

실시예 7

DTH 감응에 대한 BPD 유사체의 실험적 테스트

직사 광선이 없는 조건 하에서, DTH 감응에 대한 BPD-MA, BPD-MB, BPD-DA 및 BPD-DB와 국부적으로 적용되는 부착소 DNFB의 유효성 비교는 상기 실시예 2에서 약술된 방법을 사용하여 수행되었다. 이 화합물들은 면도하지 않은, 천연의 발브/c마우스를 이용하여 평가하였다. 각각의 처리군은 4∼5 마리의 동물들로 구성되었다. BPD 유사체들은 DMSO에서 재조합하여, DNFB 적용후 24 시간 후에 투여하였다. 마우스에게 실험 5 일 되는 날에 귀 시험을 실시하고, 하루가 지난 뒤에 반응을 측정하였다. 최종 DMSO 농도는 2%이였다. 대조군 마우스들에게는 적합한, 일치되는 용매를 투여하였다.

이 결과들은 다음 표 3과 4에 나타내었으며, 도 8에 간략하게 도시하였다. 모노-BPD 유사체들은 DTH 감응을 강력하게 억제시켰다. 디-BPD 유사체들은 DTH 감응을 억제시키지 못하였다.

[표 3]

CHS 감응에 대한 다양한 BPD 유도체의 효과

[표 4]

Claims (8)

1. 항원 특정 면역 반응 조절용 조성물로서, 상기 조성물은 상기 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 데 유효한 양의 그린 포르피린을 함유하고, 투여 후에 의도적인 광 조사 없이 대기 상태의 광 조건 하에서 유지되며, 상기 투여는 항원에 대한 항원-특정 면역 반응이 진행중인 동안에 수행되는 것이 특징인 항원 특정 면역 반응 조절용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 리포솜 조성물인 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 항원이 자기 항원인 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 항원이 건선과 관련된 것인 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 항원이 알레르겐인 조성물.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 그린 포르피린이 다음과 같이 이루어진 군 중에서선택된 일반식의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 혼합물인 조성물:

   

   

   식 중, 각각의 R¹과 R²가 독립적으로 카르보알콕시기(C_2∼6), 알킬기(C_1∼6), 아릴술포닐기(C_6∼10), 시아노기, 및 -CHNR⁵CO(여기서, R⁵는 아릴기(C_6∼10) 또는 알킬기(C_1∼6)임)로 이루어진 군 중에서 선택된 것이며,

   각각의 R³가 독립적으로 카르복실기, 카르복시알킬기(C_2∼6) 또는 그의 염, 아미드, 에스테르 또는 아실히드라존이거나, 또는 알킬기(C_1∼6)이고,

   R⁴는 -CH=CH₂또는 -CH(OR^4')CH₃임(여기서, R^4'는 H, 또는 임의로 친수성 치환기로 치환된 알킬기(C_1∼6)임).
7. 제 6 항에 있어서, 상기 그린 포르피린이 다음과 같은 일반식의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 혼합물인 조성물:

   

   

   식 중, 각각의 R¹과 R²가 독립적으로 카르보알콕시기(C_2∼6)이며,

   R³중 하나는 카르복시알킬기(C_2∼6)이고, 나머지 R³는 카르복시알킬(C_2∼6) 치환기의 에스테르이며,

   R⁴는 -CH=CH₂또는 -CH(OH)CH₃임.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 그린 포르피린이 다음과 같은 일반식의 구조를 갖는화합물인 조성물:

   

   식 중, 각각의 R¹과 R²가 독립적으로 메톡시카르보닐기이고,

   R³중 하나는 -CH₂CH₂COOCH₃이고, 나머지 R³는 -CH₂CH₂COOH이며,

   R⁴는 -CH=CH₂임.

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