CZ29096A3 - Method of extracting periplasmatic proteins from procryotic micro-organisms - Google Patents

Method of extracting periplasmatic proteins from procryotic micro-organisms Download PDF

Info

Publication number
CZ29096A3
CZ29096A3 CZ96290A CZ29096A CZ29096A3 CZ 29096 A3 CZ29096 A3 CZ 29096A3 CZ 96290 A CZ96290 A CZ 96290A CZ 29096 A CZ29096 A CZ 29096A CZ 29096 A3 CZ29096 A3 CZ 29096A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
arginine
extraction
protein
liter
culture
Prior art date
Application number
CZ96290A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ286509B6 (en
Inventor
Richard Legoux
Paul Maldonado
Marc Salome
Original Assignee
Sanofi Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Sa filed Critical Sanofi Sa
Publication of CZ29096A3 publication Critical patent/CZ29096A3/cs
Publication of CZ286509B6 publication Critical patent/CZ286509B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5437—IL-13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Způsob extrakce periplasmatických mikroorganismů.
C£t!einu z co n<
prokaryotní^ýh
Oblast techniky
Vynález se týká extrakce rekombinovaných proteinů produkovaných prokaryotními mikroorganismy, zvláště Escherichia coli. Extrakce se provádí v přítomnosti argininu.
Dosavadní stav techniky
Na genetickém inženýrství se stále více požaduje, aby se zaměřilo na výrobu zajímavých proteinů jako je např. insulin, interleukiny, růstový hormon a pod.
Obecně je mikroorganismus transformován vektorem exprese, obsahujícím gen kódující předmětný protein a prostředky nutnými k jeho expresi, jako např. regulační znaky. Pak se mikroorganismus pěstuje na vhodné živné půdě a když se vytvoří dostatečné množství buněk organismu, zahájí se přídavkem induktoru fáze řečená exprese, v jejímž průběhu je produkován žádaný protein ve vysokém množství a hromadí se. Ka konci kultivace se suspendované buňky z živné půdy oddělí, např. odstředěním nebo mikrofiltrací. Pak se podrobí extrakci, která často začíná drcením stěn mikroorganismů.
Exprese genu kódujícího žádaný protein v prokaryotním mikroorganismu může být cytoplasmatická, periplasmatická nebo sekretorická, podle druhu prostředků exprese uplatněných s uvedeným genem /promotor, terminátor, fixační místo ribosomů, peptidové znaky apod./.
Cytoplasmatická exprese dovoluje získat významné množství proteinů. Nicméně je nutno před extrakcí žádaných proteinů, pokud obsahují jeden či více sirných můstků, přistoupit k etapě denaturace/renaturace, což představuje etapu obzvláště těžkopádnou a choulostivou v průmyslovém měřítku výroby.Etapa denaturace-renaturace se provádí klasickými způsoby, dob2 ře známými pracovníkům z oboru, přičemž se používá denaturační činidlo za přítomnosti redukovadla a pak podnímky denaturace zahrnují kontrolu zvláště co do redox charakteru roztoku; mezi používanými denaturačními činidly je nutno zvláště uvést guanidinhydrochlorid, který byl navržen v postupu získávání lidského interleukinu-2. 0 této problematice pojednává např. patentový spis EP-A2-0 145 390.
Sekretorické systémy exprese, v nichž se nachází žádaný protein v kultivačním mediu aktivně, jsou užívány jen zřídka nebo vůbec ne, jde-li o bakterie Gram-negativní pro jejich malou produktivitu. Zde je nutno poznamenat, že prostředí bakteriální kultury o velké hustotě v bioreaktoru není ideálním prostředím pro rekombinované proteiny, citlivé vzhledem k nebezpečí fázové interfaciální denaturace.
Periplasmatická exprese dovoluje získat přímo rekombinované proteiny v podstatě správně replikované a to v prostoru chráněném před okolím, a proto představuje rozumnou možnost pro získávání těchto proteinů, zejména proteinů neglykosylovaných. V tomto případě pak není nutno podrobovat proteiny etapě denaturační.
Metody drcení buněk obecně v této oblasti užívané jsou např. lyse buněk ultrazvukem nebo mechanickým tlakem /French Pressure Cell, kulový mlýn/, chemická lyse nebo lyse enzymatická, osmotický šok a zpracování pomocí činidel chaotropních nebo detergentů. Tyto metody rozdrtí většinu buněčných membrán včetně membrán plasmatických a membrán endoplasmatického retikula a vytvoří homogenní suspensi buněčných zlomků. Charakter sedliny buněčné drtě, která může být získána centrifugací /jádra, buněčný skelet, mitochondrie, lysosomy, ribosomy, makromolekuly atd./, závisí hlavně na délce a rychlosti centrifugace/10 minut na 1 000 g až 3 hodiny na 150 000 g/.
Obtíže, s nimiž se můžeme setkat v průběhu extrakční operace, se mění podle typu exprese a podle užitých extrakčních metod. Jsou to zejména:
- ztráta na výtěžku rekombinovaného proteinu
- ztráta biologické aktivity rekombinovaného proteinu
- proteolytická degradace rekombinovaného proteinu
- Toxicita extrakčních činidel a kontrola jejího odstranění
- nesnadný převod do průmyslového měřítka
- směs proteinů periplasmatických a cytoplasmatických.
Navíc, jde-li o žádané proteiny, které jsou hydrofobní nebo nesou náboj, mohou se vázat na buněčné složky, které jsou samy hydrofobní nebo nabité, což učiní extrakci extrémně nesnadnou.
Průmyslová výroba žádoucích rekombinovaných proteinů pomocí genetického inženýrství je velmi slibná, ale vyžaduje použití takových extrakčních metod, které umožní vyhnout se uvedeným nevýhodám nebo je alespoň minimalisovat.
Je ovšem důležité žádané proteiny nejen produkovat ve značných množstvích, ale ještě také je produkovat nekontaminované extrakčními činidly a uchovat jim všechnu biologickou aktivitu.
Za tímto účelem jsou navrhovány různé postupy, zejména pro případ extrakce-separace interleukinu-2.
Patentový spis EP-A2-0 145 390 popisuje způsob získání lidského neglykosilovaného interleukinu-2 /IL-2/ s vysokou specifickou aktivitou a to pomocí chromatografie na koloně pro extrakci IL-2. Tento postup dovoluje také provedení denaturace pomocí guanidinhydrochloridu.
Patentový spis EP-A2-0 147 819 navrhuje postup pro získání homogenního a čistého lidského rekombinovaného interleukinu-2. Tento postup spočívá v kultivaci mikroorganismu transformovaného za pomoci vektoru exprese, který obsahuje gen kódující interleukin-2, dále ve vyvolání lyse buněk, isolaci buněčné drtě, v extrakci IL-2 promýváním buněčné sedliny vho4 dným promývacím roztokem, pak v chromatografickém vyčistění promývacího roztoku. Použité promývací roztoky mohou obsahovat sůl, jako např. chlorid sodný nebo guanidinhydrochlorid, nebo detergent, jako např. produkt známý pod obchodním názvem
Triton X-100.
Podle upřednostňovaného postupu se doporučuje použít postupně tři promývací roztoky: promývací roztok obsahující chlorid sodný, promývací roztok obsahující detergent a promývací roztok obsahující guanidinhydrochlorid.
Patentový spis EP-A1-0 337 243 popisuje postup pro čistění lidského interleukinu-2, užívající dvou kolon pro kapalinovou chromatografii v obrácené fázi. Před etapou ohromatografického čistění se nerozpustná fáze lysátu bakteriálních buněk extrahuje roztokem obsahujícím guanidinhydrochlorid, aby byl získán bakteriální extrakt, jenž se pak zředí pomocí pufru bez guanidinhydrochloridu, pak se chromatografuje, přičemž se eluce provede s acetnitrilovým gradientem.
Podstata vynálezu
Nyní bylo překvapivě zjištěno, že extrakce žádaného proteinu produkovaného prokaryotním mikroorganismem, který byl pozměněn působením vektoru exprese obsahujícího gen kódující žádaný protein a prostředky pro jeho expresi, jako např. regulační znaky nutné pro periplasmatickou expresi, může být uskutečněna tak, že se buněčná sedlina nebo buněčná drň mikroorganismů, pocházející z kultivace uvedeného organismu, suspendují v roztoku pufru, kterýžto roztok obsahuje s výhodou arginin, který může být ve formě L nebo/a D.
Předmětem tohoto vynálezu je způsob extrakce periplasmatických proteinů z prokaryotních mikroorganismů, který spočívá v tom, že se
1/ buněčná sedlina, pocházející z kultury mikroorganismu trans formovaného působením vektoru exprese, který obsahuje gen kódující dotyčný protein a všechny regulační znaky nutné k jeho periplasraatické expresi, suspenduje v roztoku pufru, obsahujícího arginin a že se po době kontaktu za odpovídajících podmínek pH, teploty, bakteriální koncentrace atd
2/ rekuperuje žádaný protein z takto získané suspense.
Předmětem vynálezu je zároveň použití argininu jako extrakčního činidla pro periplasmatické rekombinované proteiny.
Podle jedné z variant nového postupu spočívá extrakce příslušného periplasmatického proteinu v tom, že se sedlina buněčné drtě, získaná po lysi buněk pocházejících z kultivace, suspenduje v roztoku pufru, obsahujícím arginin.
Extrakce periplasmatických proteinů je zvláště účinná, když je extrakční pufr tvořen vodným roztokem, obsahujícím arginin o koncentraci rovné přinejmenším 0,4 Ϊ-1 argininu v mezích rozpustnosti argininu ve vodě při teplotě místnosti /blíž ká 0,8 M v čisté vodě a dále za přítomnosti solí/, a když je jeho pH mírně alkalické, s výhodou rovné 8.
Arginin je přírodní ck -aminokyselina, jež byla navržena jako pomocný prostředek při denaturaci/renaturaci/substituci dvou řetězců Abbokinasy/urinární aktivátor plasminogenu/, v nichž je původní peptid nahražen v průběhu této operace peptidem syntetickým. Zde je možno odkázat na článek G.A Homandberga,T.Wai-e v Biochimica and Biophysica Acta, 1990, 1038, 209-215.
V postupu dle vynálezu a v jeho výhodných provedeních se nepřistupuje k denaturaci-renaturaci proteinu, ale arginin působí výlučně na úrovni extrakce proteinu z buněčné sedliny nebo z buněčné drtě mikroorganismu.
Arginin vykazuje značné účinky při extrakci proteinu jak na úroveň výtěžků, tak na biologickou aktivitu proteinu. Bylo totiž nalezeno, že napoř. dospělá forma IL-13 se rekuperuje s použitím postupu dle vynálezu s výsledky vyššími než 95 % přičemž zůstane zachována její biologická aktivita. Je nutno uvést, že pokusy s extrakcí osmotickým šokem u téhož systému exprese nevedou ke srovnatelným výsledkům.
Srovnávací pokusy ukázaly, že guanidinhydrochlorid použitý za týchž podmínek dovoluje získat protein IL-13 s výtěžkem vyšším než 95 %. Na druhé straně je však biologická aktivita proteinu takto získaného změněna více než metodou argininovou.
Aniž by šlo o pokus vázat se na nějakou teorii, lze před pokládat, že arginin působí jako činidlo slabě chaotropické a biologické, na rozdíl od činidel silně chaotropických a denaturačních, jakým je při potřebných vysokých koncentracích rovných či vyšších než 5 M, nutných pro zajištění extrakce, např. guanidinhydrochlorid.
Postup dle vynálezu, případně v některém z možných výhodných provedení, může být aplikován po jakémkoliv procesu kultivace mikroorganismu, transformovaného vektorem exprese, obsahujícím gen kódující žádaný protein a činitele pro periplasmatickou expresi dotyčného proteinu, jako např. potřebné znaky regulační.
Odborníkům je zřejmé, že tato metoda je použitelná pro bakterie blízké E.coli, t.j. pro bakterie Gram-negativní, případně anerobní ze skupiny Enterobacterií. V této skupině Enterobacterií se nalézají zejména druhy: Escherichia, Salmonella a Erwinia, ale také Shigella, Klebsiella, Serratia, Próteus a Enterobacter.
Vzhledem k chaotropnímu charakteru argininu se rovněž ukazuje, že arginin lze případně s výhodou nahradit jinými chaotropními činidly. Jelikož je nemožné podat příklady týkající se všech ro-dů bakterií vzhledem k diversitě dotyčných živých systémů, odborníci si poradí s aplikací i adaptací argininové extrakční metody pro své zvláštní případy.
V rámci oboru jsou takové procesy kultivace dobře známy. Postupy popisující kultivaci bakterií Gram-negativních ve fer mentoru jsou popsány např. v patentových spisech EP 360 641 a EP 356 335 a vztahují se k získání a využívání kmenů Esche richia coli zvaných SEBR 1250 a TP 2339.
Jakmile je dosažen žádoucí počet buněk, kultura se podrobí centrifugaci /zpravidla/ nebo mikrofiltraci a na sedlinu biomasy takto získané se působí roztokem pufru obsahujícím arginin - postupem podle vynálezu.
Podle obecného předpisu se pracuje při teplotě mezi pokojovou teplotou 25°C a teplotou 2°, s výhodou při 4°C.
Doba kontaktu buněčné sedliny s roztokem pufru obsahujícím arginin musí být dostačující k tomu, aby mohl nastat přestup příslušného proteinu do pufrového roztoku. Pokud se pracuje při teplotě 4°C je obvykle délka kontaktu s výhodou blízká 1 hodině.
Extrakce, t.j. přechod periplasmatického proteinu do prostředí, probíhá v průběhu kontaktu biomasy s extrakčním prostředkem - argininovým pufrem. Doba kontaktu, která zaručí úplnou nebo už nepo-kračující extrakci, leží mezi 30 minu tami a 16 hodinami. Pokusy ukazují, že uspokojivých výtěžků může být dosaženo v průběhu několika hodin při teplotě 4°C. Bylo rovněž zaznamenáno, že lehké promíchávání biomasy v extrakčním pufru vedené tak, aby se zabránilo sedimentaci mikroorganismů, poskytuje vyšší výtěžky, t.j. vyšší míru extrak ce jako funkce času.
Postup extrakce podle vynálezu je stejně vhodný pro extrakce hydrofobních proteinů, jako jsou např. interleukiny, zejména IL-13, popsaný v patentovém spise EP-A1-0 506 574, jako pro extrakci proteinů hydrofílních, jako ne např. růstový hormon /hGH/. Postup podle vynálezu zjednodušuje získávání hGH, které normálně vyžaduje pro extrakci uplatnění osmotického šoku.
Aby bylo možno uskutečnit extrakci proteinu přímo ze su spense buněčné sedliny, použije se s výhodou roztok pufru ob sáhujícího arginin v koncentraci mezi 0,4M a 0,8M.
Pokud se chce uskutečnit extrakce žádoucího periplasmatického proteinu ze sedliny buněčné drtě podle jednoho z výhodných provedení postupu dle tohoto vynálezu, postupuje se stejným způsobem jako u základního provedení až do etapy získání buněčné sedliny po centrifugaci nebo mikrofiltraci, pak se ale uskuteční drcení buněk metodami známými odborníkům. Metody drcení buněk jsou popsány např. v těchto publikacích: C.T.Choma a H.Yamazaki, Can.J.Microbiol.,1981,27,547-550, L. 0.Ingram, Journal of Bacteriology, 1981, 146,1,331-336, N.G.Nossal a L.A.Heppel, Journal of Biological Chemistry,1966, 241,13,3065-3072, R.Bennet, D.R..Taylor a A.Hunt, Biochem. Biophys.Acta 18(3),512-521,a v kolektivní práci Fermentation and enzyme technology, kap. 12,239-309, vyd. J.Willey and Sons (1979).
Sedlina buněčné drtě získaná obvyklým způsobem se centrifugu je a znovu suspenduje, pak se na ni působí roztokem pufru s obsahem argininu. Doba styku suspense buněčné drtě s roztokem pufru obsahujícím arginin musí být dostatečně dlouhá, aby umožnila přestup příslušného proteinu do roztoku pufru. obvykle se při teplotě 4°C doba styku , zaručující prakticky úplnou extrakci, rovná 48 hodinám. Bylo pozorováno, že obdobně i zde mírné promíchávání biomasy v extrakčním pufru, které zabrání sedimentaci buněčné drtě, dává vyšší extrakční hodnoty v závislosti na čase.
Tato varianta extrakčního postupu podle vynálezu vyhovuje zejména k extrakcím žádoucích periplasmatickýcn proteinů, které jsou silně asociovány na buněčných membránách, jako např. interleukiny.
Odborníkům je dobře známo, že extrakční pufr obsahující arginin podle vynálezu může rovněž obsahovat vhodný detergent který má zlepšit výtěžek nebo/a rychlost extrakce příslušného proteinu. Mezi detergenty vhodnými k použití si odborník dovede zvolit takové, jež umožní zachovat výhody použití ar9 gininu jako extrakčního činidla, zejména to, že zůstává zachována biologická účinnost dotyčného proteinu. Jako vhodné mírné detergenty je možno uvést např. alkylglykosidy jako alkylmaltosidy, nonyl-c< nebo /3 -D-glukopyranosidy, oktyl-o< nebo fo -D-glukopyranosidy nebo alkyl-karbamoyl-methyl- οζ nefl-D-glukopyranosidy, jako např. produkt značky Hecameg, jehož velmi slabá toxicita nutí mít na mysli, že může být nalezen ve stopách ve finálním produktu.
Aby byla uskutečněna extrakce žádoucího proteinu ze suspense sedliny buněčné drtě, použije se přednostně roztok pufru obsahujícího arginin v koncentraci vymezené hodnotami 0,4M a 2,5M přičemž koncentrace v hodnotě 2,5M může být získána zejména za přítomnosti solí.
Dále bylo zjištěno, že arginin vykazuje značný blahodárný účinek na výtěžky vylučovaného rekombinovaného periplasmatického proteinu, je-li přidán v neobvyklých a velmi vysokých koncentracích, mnohem vyšších, než jsou ty, s nimiž se můžeme setkat v prostředích kultury, vyráběné z hydrolysátů obchodních proteinů a které dovolují pokrýt potřebu argininu z použitého kmene.
Kromě toho bylo nalezeno, že blahodárný účinek argininu je zvlášt výrazný, pokud koncentrace argininu přidaného do kultivačního prostředí se pohybují na úrovni mezi 2 g/litr a 10 g/litr.
Odborník bude umět optimisovat tuto koncentraci případ od případu.
Tento postup je zvláště vhodný pro výrobu proteinů s aktivitou cytokinového typu, zejména IL-13, jak je popsáno v patentovém spise EP-A1-0 506 574.
Příklady provedení vynálezu
Vynález je nyní blíže osvětlen pomocí příkladů, které rozsah vynálezu nikterak neomezují.
Příklad 1
Extrakce periplasmatického IL-13 z E.Coli z buněčné sedliny za přítomnosti argininu.
1. Kultivace v baňce:
V tomto příkladu byl použit kmen E.Coli RB 791 (Roger Brent, PNAS 78 (1981),str.4204-4208) transformovaný plasmidem p922 získaným podle analogických postupů, jako jsou postupy popsané v patentových spisech EP 360 641 a 356 335, jehož sekvence ADN je sekvencí SEQ ID No.l.
Rožličné sekvence, které definují plasmid p922 jsou uvedeny níže.
Sekvence promotoru
Hexanukleotidy TTGCTT a TATAAT jsou vytištěny tučně
Xhol
1 TCGAGTGGGT TTGAGGCGAT
51 ATCTCGACTG CACGGTGCAC
101 AGCTGTGGTA TGGCTGTGCA
151 TCAAGGCGCA CTCCCGTTCT
201 GGTTCTGGCA AATATTCTGA
251 CTTATATTAC ATCGATAGCG
CACACTTCTG
CAATGCTTCT
GGTCGTAAAT
GGATAATGTT
AATGAGCTGT
TTAACGCAGA
GGCGTCAGGC
CACTGCATAA
TTTTGCGCCG
ACCTAAACGC
AGCCATCGGA
TTCGTGTCGC
ACATCATAAC
TTCGAGCTGA CTGACTGTTG
TATAATGTGT GG
Sekvence oblasti 5'nepředávaná mRNA . - Fixační místo ribosomu je tištěno tučně. Sekvence CAT umístě ná na konci 3'této sekvence je částí hexanukleotidu rozpoznávaného restrikčním enzymem Ndel
RBS
283 AATTGTGAGC GGATAACAAT TTCACACAGT TTTTCGCGAA GAAGGAGATA 333 TACAT
Sekvence kódující prekursor IL-13 Se^kvence psaná kursivou odpovídá sekvenci IL-13 maturovaného. Sekvence, která není tištěna tučně, je sekvencí vazebnou spojující konec sekvence kódující IL-13 s hexanukleotidem, poznávaným restrikčním enzymem BAmHI
338 ATGAAAAAGA TCCTGGCGTT AGCTGCGCTG ACTACCGTTG TATTCTCTGC 388 GTCCGCCTTC GCTGGCCCTG TGCCTCCCAG TACTGCCCTC AGGGAGCTCA 438 TTGAGGAGCT GGTCAACATC ACCCAGAACC AGAAGGCTCC GCTCTGCAAT 488 GGCAGCATGG TATGGAGCAT CAACCTGACA GCTGGCATGT ACTGTGCAGC 538 CCTGGAATCC CTGATCAACG TGTCAGGCTG CAGTGCCATC GAGAAGACCC 588 AGAGGATGCT GAGCGGATTC TGCCCGCACA AGGTCTCAGC TGGGCAGTTT 638 TCCAGCTTGC ATGTCCGAGA CACCAAAATC GAGGTGGCCC AGTTTGTAAA 688 GGACCTGCTC TTACATTTAA AGAAACTTTT TCGCGAGGGA CGGTTCAACT 738 GAAACTTCGA AAGCATCATT ATTTG
Sekvence terminační
763 GGATCCGGCT GCTAACAAAG CCCGAAAGGA AGCTGAGTTG GCTGCTGCCA Terminátor genu 10 fágu T7
813 CCGCTGAGCA ATAACTAGCA TAACCCCTTG GGGCCTCTAA ACGGGTCTTG
HindlII
863 AGGGGTTTTT TGCTGAAAGG AGGAACTATA TCCGGATGTA CCAAGCTTGG 913 CCGGATCAAA GTTTTGTCGT CTTTCCAGAC GTTAGTAAAT GAATTTTCTG 963 TATGAGGTTT TGCTAAACAA CTTTCAACAG TTTCAGCGGA GTGAGAATAG
Terminátor fágu fd
1013 AAAGGAACAA CTAAAGGAAT TGCGAATAAT AATTTTTTCA CGTTGAAAAT
1063 CTCCAAAAAA AAAGGCTCCA AAAGGAGCCT TTAATTGTAT CGGTTTATCA
1113 1163 1213 GCTTGCTTTC GAGGTGAATT TCTTAAACAG CTTGATACCG ATAGTTTGCGC
CGACAATGAC AACAACCATC GCCCACGCAT AACCGATATA TTCGGTCGCT
GAGGCTTGCA GGGAGTCAAA GGCCGCTTTT GCGGGATCGA T
Gsn kódující represor operonu laktosy
5 SacII
1254 CCGCGGAAGC ATAAAGTGTA AAGCCTGGGG TGCCTAATGA GTGAGCTAAC
1304 TCACATTAAT TGCGTTGCGC TCACTGCCCG CTTTCCAGTC GGGAAACCTG
1354 TCGTGCCAGC TGCATTAATG AATCGGCCAA CGCGCGGGGA GAGGCGGTTT
1404 GCGTATTGGG CGCCAGGGTG GTTTTTCTTT TCACCAGTGA GACGGGCAAC
10 1454 AGCTGATTGC CCTTCACCGC CTGGCCCTGA GAGAGTTGCA GCAAGCGGTC
1504 CACGCTGGTT TGCCCCAGCA GGCGAAAATC CTGTTTGCTG GTGGTTAACG
1554 GCGGGATATA ACATGAGCTG TCTTCGGTAT CGTCGTATCC CACTACCGAG
1604 ATATCCGCAC CAACGCGCAG CCCGGACTCG GTAATGGCGC GCATTGCGCC
1654 CAGCGCCATC TGATCGTTGG CAACCAGCAT CGCAGTGGGA ACGATGCCCT
15 1704 CATTCAGCAT TTGCATGGTT TGTTGAAAAC CGGACATGGC ACTCCAGTCG
1754 CCTTCCCGTT CCGCTATCGG CTGAATTTGA TTGCGAGTGA GATATTTATG
1βθ4 CCAGCCAGCC AGACGCAGAC GCGCCGAGAC AGAACTTAAT GGGCCCGCTA
1854 ACAGCGCGAT TTGCTGGTGA CCCAATGCGA CCAGATGCTC CACGCCCAGT
1904 CGCGTACCGT CTTCATGGGA GAAAATAATA CTGTTGATGG GTGTCTGGTC
20 1954 AGAGACATCA AGAAATAACG CCGGAACATT AGTGCAGGCA GCTTCCACAG
2004 CAATGGCATC CTGGTCATCC AGCGGATAGT TAATGATCAG CCCACTGACG
2054 CGTTGCGCGA GAAGATTGTG CACCGCCGCT TTACAGGCTT CGACGCCGCT
2104 TCGTTCTACC ATCGACACCA CCACGCTGGC ACCCAGTTGA TCGGCGCGAG
2154 ATTTAATCGC CGCGACAATT TGCGACGGCG CGTGCAGGGC CAGACTGGAG
25 2204 GTGGCAACGC CAATCAGCAA CGACTGTTTG CCCGCCAGTT GTTGTGCCAC
2254 GCGGTTGGGA ATGTAATTCA GCTCCGCCAT CGCCGCTTCC ACTTTTTCCC
2304 GCGTTTTCGC AGAAACGTGG CTGGCCTGGT TCACCACGCG GGAAACGGTC
2354 TGATAAGAGA CACCGGCATA CTCTGCGACA TCGTATAACG TTACTGGTTT
2404 CACATTCACC ACCCTGAATT GACTCTCTTC CGGGCGCTAT CATGCCATAC
30 2454 CGCGAAAGGT TTTGCGCCAT TCGATCTACG CCGGACGCAT CGTGGCCGCA
2504 AA
Sekvence pBR 327
Pflml
35 2506 CCAACCCTTG GCAGAACATA TCCATCGCGT CCGCCATCTC CAGCAGCCGC
2556 ACGCGGCGtA TCTCGGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC
2606 CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC
2656 CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT
2706 GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC
2756 TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCAAT GCTCACGCTG TAGGTATCTC
2806 AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC
2856 CGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA
2906 ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG
2956 ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG
3006 GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGGACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC
3056 TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA
3106 CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC
3156 GCGCAGAAAA AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT
3206 CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA
3256 TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTT
3306 TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT
3356 GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC
3406 ATAGTTGCCT GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT
3456 ACCATCTGGC CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG
3506 CTCCAGATTT ATCAGCAATA AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA
3556 AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCG
3606 GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG
3656 CCATTGCTGC AGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA
3706 TTCAGCTCCG GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT
3756 GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA
3806 AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAATTCT
3856 CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT TCTGTGACTG GTGAGTACTC
3906 AACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC
3956 CGGCGTCAAC ACGGGATAAT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG
4006 CTCATCATTG GAAAACGTTC TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC
4056 GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT
4106 CAGCATCTTT TACTTTCACC AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG
4156 CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT
4206 CATACTCTTC CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC
4256 TCATGAGCGG ATACATATTT GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG
4306 GTTCCGCGCA CATTTCCCCG AAAAGTGCCA CCTGACGTCT AAGAAACCAT
4356 TATTATCATG ACATTAACCT ATAAAAATAG GCGTATCACG AGGCCCTTTC
4406 GTCCC
Plasmin pER 327 je popsán v Gene, 9,287-305 (1980)
Tento kmen E.Coli RB 791/p922 byl dán do předkultivace a to přes noc při teplotě 30°C při míchání 200 otáček/minutu a na půdě L/Luria broth - popsáno v Molecular Cloning, A Laboratory Manual Sambrook, Fritsch, Manitas, Cold Spring Barbor, Laboratory Press, 2.vydání (1989)/ s 100 mg/litr ampicilinu. Z této předkultivace byla naočkována nová buňka s kultivační půdou L tak, aby počáteční optická hustota /označování optické hustoty: optická hustota D.O.při 600 nm. D.0.= 1 odpovídá 400 - 450 mg biomasy na litr/ D.O. byla 0,6. Po hodinové prodlevě byla kultivace indukována 1 mM IPG /isopropyl-fl-D-l-thiogalaktopyranosid/ a pokračovala ještě 3 hodiny. Vzorky bakteriální suspense byly centrifugovány a bakteriální sedliny takto získané byly suspendovány dále v extrakčním pufru tak, aby konečná optická hustota D.O./viz výše/ činila 10, což odpovídá 4,5 g biomasy v litru v okamžiku extrakce.
Byly použity následující pufry:
A : Arginin 0,8 M pK 8,0, nastavený pomocí HCl ve vodě Milli-Q /Millipore/
B : Guanidinhydrochlorid 5 M ve vodě Milli-Q bez úpravy pH.
Aby bylo možno měřit účinnost extrakce, byly odebírány vzorky po 1 ml suspense kultury do dosažení D.O. 0,2 odpovídající sedliny bakterií získané odstředěním při 5000 g po dobu 10 minut byly uloženy na polyakrylamidový gel do 16,5 % po denaturaci v SDS. Také bakteriální suspense byly odstředěny a jejich supernatanty byly odsoleny ultrafiltrací /filtrační zařízení Ultra-free-MC s prahem řezu 5000 Da Millipore/ před umístěním na gel. Vlastní gel byl pak vyvolán metodou Western blot za použití protilátek anti-IL-13-CH0 a vyhodnocen kvantitativně na Phosphorimager /Molecular Dynamics/. Protilátka anti-IL-13 CHO /Chinese Hamster Ovary/ použitá v tomto příkladu byla získána imunisací králíků.
V tomto příkladě bylo zjištěno, že extrakce za přítomnosti guanidinhydrochloridu a případně argininu je u maturované formy prakticky kompletní, přičemž jsou výtěžky extrakce v těchto dvou případech vyšší než 99 %. Bylo rovněž zaznamenáno, že nejsou rozdíly v obsahu prekursoru IL-13 mezi extraktem získaným za přítomnosti argininu a extraktem získaným za přítomnosti guanidinhydrochloridu.
2. Kultivace ve fermentoru
Kmen E.coli RB 791/p922 byl vnesen do živné půdy L s ampicillinem 100 mg/litr a inkubován při 30°C za míchání, aby se získala předkultura. Objem 100 ml této předkultury posloužil k naočkování do fermentoru o obsahu 2,5 litru značky MBR. Kultivace se uskutečnila v objemu 1,2 litru v prostředí, jehož složení je uvedeno níže a za podmínek rovněž definovaných níže.
Živné prostředí pro fermentor - kmen E.coli RB 791/p922
Údaje platí pro 1 konečný litr, objem inokula je třeba odečíst.
1. Rozpustí se v 700 ml vody Milli-Q:
Složka
EDTA
FeSO.,7H_0 4 2
MgSO4,7H2O K2S°4
CaCl2,2H2O Na Cl
KC1
HY-SOY
L-methionin Tryptofan stopové prvky výtažek z kvasnic hmotnost/litr
9 45 mg 1,5 g 0,75 g 32 mg 1,45 g 5 g 75 g 1,4 g g
ml g
Doplní se na 800 ml vodou Milli-Q a autoklávuje se 30 minut při teplotě 120°C.
2. Filtruje se na 0,2 ^m ve 100 ml vody Milli-Q:
Glycerin 15 g
X2HPO4 7,1 g
Koncentrace glycerinu během kultivace má být udržována na hodnotách mezi 10 a 15 g/l.
3. V okamžiku indukce se přidá:
IPTG 1 9
kyselina 0,65 g
6-aminokapronová
HY-SOY 40 g
L-cystein 0,3 g
Objem tohoto přídavku není zahrnut do následných výpočtů
Roztoky mikroelementů
Užívá se v množství 1 ml/litr.
Na 1 litr se doplní vodou Milli-Q, k rozpouštění se bere BCOml
H,B0, 3 j hmotnost/litr 3 mg
NaMoO.,2H_0 4 2 4,8 mg
MnSO4,H2O 59 mg
CoCl2,6H2O 23,8 mg
CuSO4,5H2O 8,7 mg
ZnSO4,7H2O 13 mg
A1C13,6H2O 60 mg
KCr(SC4)2,12H2O 6 mg
KJ /zvlášt/ 60 mg
NiSO4,6H2O 2,6 mg
Přidá se 100 ml konc. HC1 a doplní se na 1000 ml vodou Milli-Q.
V jednom případě byla při D.O. 58 zahájena exprese IL-13 přídavkem IPTG v mnoství 1 g/litr. Probíhala 5 hodin.
Parametry kultivace ve fermentoru byly následující:
pH = 7,4
T = 30°C p02= 40 mm Hg, regulováno mícháním, s průtokem vzduchu v rozmezí 1-3 litry/minutu.
Použité metody extrakce a měření biologické aktivity byly stejné jako v části 1 uvedené výše.
Bylo zjištěno, že extrakce bakteriální sedliny získané ve fermentoru a ne už v baňce, provedená za přítomnosti guanidinhydrochloridu i za přítomnosti argininu, je co do maturované formy IL-13 téměř úplná a že v obou případech jsou výtěžky extrakce vyšší než 97 %.
Příklad 2
Biologická aktivita IL-13 takto extrahovaného
Extrakty, získané za přítomnosti guanidinhydrochloridu nebo argininu v příkladu 1 byly odsoleny ultrafiltrací, jak bylo popsáno výše. Byly po zředění vneseny do sestavy za přítomnosti podklonu buněčné populace B9 závislého na IL-13. Aktivita IL-13 u zředěných vzorků vede k růstu buněk B9 a byla určena koncentrace za poločas zdvojení. Buněčný růst byl zastaven po 3 dnech kontaktu přídavkem MTT /3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-difenyltetrazolium)bromid/ a změřen na spektrofotometru pomocí absorpce vyvolaného modrého zabarvení při 565 nm. Biologická aktivita IL-13 byla vyjádřena v ng/ml v porovnání se standardem IL-13, který byl kalibrován na mezinárodní standard pocházející z kultury IL-13 CHO, získané imunisací králíků podle N.Vita, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1983,225,2,436-445.
Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce:
Tabulka
Pokus s buněč. linií B9 IL-13,ng/ml Biol.aktivita ng/ml biol.aktivita specifická
kontrola 500 500 100
arginin 3 200 1 376 43
guanidin 4 300 1 098 25
Shora uvedené výsledky ukazují, že specifická biologická aktivita argininového extraktu je už před jakoukoliv jinou následnou čisticí operací vyšší než aktivita extraktu guanidinhydrochloridového.
Příklad 3
Extrakce periplasmatického hGH bakterie E.coli z buněčné sedliny za přítomnosti argininu.
Kmen SEBR 1250 /EP 360 641 a EP 356 335/ byl předpěstovánpřes noc při teplotě 37°C za míchání 200 ot./minutu v kultivačním médiu L /Luria broth/ se l00mg/l ampicilinu. Touto předpěstovanou kulturou byla naočkována jiná baňka s živným roztokem L tak, aby počáteční D.O. byla rovna 0,2. Po hodinové prodlevě byla kultivace indukována pomocí 1 mí-i IPTG a pokračovala ještě 3 hodiny. Vzorky bakteriální suspense byly odstředěny a sedliny bakterií takto získané byly suspendovány v extrakčním pufru tak, aby konečná D.C. byla rovna 10, což odpovídá 4,5 g biomasy/litr ve chvíli extrakce.
Extrakční podmínky byly následující:
Chaotropní činidlo pH T doba
Arginin 0,8M 8,0 22°C 20 hodin
Arginin 0,8M 8,0 4°C 20 hodin
Pro změření účinnosti extrakce byly odebrány vzorky odpovídající 1 ml kultivační suspense o D.0.0,2 a příslušné ba— kteriální sedliny po odstředění při 5 000 g po dobu 10 minut. Byly naneseny na polyakrylamidový gel 16,5% po denaturaci v SDS. Bakteriální suspense byly rovněž centrifugovány a jejich supernatant byl nanesen na gel. Samotný gel byl vyvolán pomocí Western Blot za užití protilátky anti-hGH a kvantifikován na Phospnorimager /Molecular Dynamics/. Protilátky antihGH, které byly použity, byly získány imunisací králíků.
Rozbor pásem získaných pomocí Phosphorlmager dovoluje závěr, že extrakce lidského periplasmatického hGH produkovaného Escherichia coli za přítomnosti argininu, je účinná. V tomto příkladu byl dosažen výtěžek extrakce přinejmenším 60 % a to za přítomnosti argininu v množství 0,8 M při pH 8,0 a teplotě 22°C při čekací době 20 hodin. Vyšší výtěžek extrakce okolo 80 % může být dosažen za přítomnosti argininu v množství 0,8 M, pH 8,0, teplotě 4°C a době 20 hodin.
Jelikož hGH je protein hydrofilní, je možno vyslovit závěr, že přírodní rekombinantní proteiny, které jsou velmi různorodé a jsou kumulovány v periplasmatu E.coli, mohou být jednoduše extrahovány za přítomnosti argininu.
Příklad 4
Extrakce periplasmatického IL-13 z E.coli z buněčné drtě za přítomnosti argininu.
1. Kultivace ve fermentoru
V tomto příkladu byl použit kmen E.coli TP2339/EP 360 641 a EP 356 335/, transformovaný plasmidem p922, získaným podle postupů, analogických těm, jež jsou uvedeny v příkladu 1.
Kmen E.coli TP2339/p922 byl vnesen do živného prostředí L s ampicillinem lOOmg/litr a ponechán při 30°C za míchání, aby se vytvořila předkultura. Z této předkultury bylo odebráno 100 ml a použito k naočkování fermentoru o celkovém objemu 2,5 litru s živným prostředím i podmínkami definovanými níže.
Fermentační prostředí-kmen E.coli TP2339/p922
Pro předběžný finální objem 1,2 litru bylo živné prostředí vytvořeno přídavkem jednoho litru fáze autoklávované a 0,1 litru fáze filtrované, jejíž složení je popsáno níže, a 0,1 litru předkultury, definované výše.
1/autoklávovaná fáze
Rozpustit v 900 ml vody Milli-Q
hmotnost/litr
tricin 360 mg
FeS04,7H20 280 mg
CaCl2,2H2O 6,7 mg
MgCl2,6H2O 1/27 g
K_SO. 2 4 8,71 g
NaCl 500 mg
KC1 5 g
Hy-Case (SF) 25 g
výtažek z kvasnic 18 g
stopové prvky 1 ml
L-arginin 1/5 g
Roztokem KOH se upraví pH na hodnotu 7,4 a pak se doplní na objem 1000 ml vodou Milli-Q. Autoklávuje se 30 minut při 120°C
2/fáze filtrovaná
Sterilní filtrace na membráně 0,2 ^tm:
glukosa 20 g
glycerin 50 g
k2hpo4 5 g
V průběhu kultivace má být koncentrace glukosy udržována na hodnotě mezi 5 a 15 g/litr.
Když bylo dosaženo hodnoty D.0.= 40,/cca 16 g suché látky/litr/, byla zahájena exprese přídavkem IPTG /lg/1/ a prováděna 5 hodin.Parametry kultivace byly následující:
pH = 7,4
T = 37°C p02= 50 mbarů byl regulován mícháním proudem vzduchu v rozmezí množství 1 až 3 litry/minutu.
2. Získání a mletí bakteriálních těl
Jeden litr kultivační suspense byl centrifugován 20 minut na cca 6 400 g. Sedlina byla vnesena za míchání vrtulovým míchadlem do stejného objemu pufru Tris lOmM s EDTA 1 mM, pepstatinu lmg/litr a při pH 8.
Drcení bylo uskutečněno v lisu Manton-Gaulin při tlaku 700 barů dvěma pasážemi. Dr£ jako taková může být v případě podle tohoto příkladu uchovávána při -80°C.
3. Extrakce
Po rozmražení bylo odebráno 5 ml drtě o optické densitě D.O. = 75 /30 g suché látky /litr/ a centrifugováno 50 minut na 23 300 g.
Takto získaná sedlina byla vyjmuta do jedné třetiny počátečního objemu pufrem Tris 0,1 mM, pH 7,0, pak bylo doplněno na původní objem roztokem obsahujícím arginin a to tak, aby výsledná koncentrace argininu byla 2,5 M a pH 8,0.
Pro tento příklad byl k argininu připojen pomocný detergent /Hecameg na finální koncentraci 20 g/litr.
Suspense buněčné drtě takto vzniklé byla umístěna do rotační třepačky /300 otáček/minutu/ na dva dny při 4°C.
Pak byla suspense centrifugována naposled 50 minut při 23 300 g a supernatant tvořil očekávaný extrakt.
4. Biochemické analysy a biochemická aktivita a/ Stanovení úhrnu všech proteinů bylo uskutečněno metodou Protein Assay Biorad.
b/ Metoda stanovení IL-13 rekombinovaného je stejná jako u příkladu 1.
Výtěžek IL-13 takto získaného extrakcí.
Získané výsledky jsou shrnuty do následující tabulky:
V suspensi buněčné V supernatantu drtě před extrakcí po extrakci úhrn všech proteinů 324 g/ml 108 g/ml
IL-13 rekombinovaný 575 ng/ml 390 ng/ml
V tomto příkladu bylo konstatováno, že uskutečněná extrakce buněčné drtě za přítomnosti 2,5 M argininu a pomocného detergentu umožňuje získat extrakční výtěžek okolo 70 %.
Příklad 5
Exprese IL-13 za přítomnosti argininu v kultivačním prostředí
Kmen E.coli RB 791/p922 byl kultivován v živném prostředí L obsahujícím ampicillin v množství 100 mg/litr za přítomnosti různých koncentrací argininu. Indukce byla zahájena 1 hodinu po naočkování přídavkem 1 mM IPGT a kultivace pokračovala ještě 3 hodiny.
Vzorky bakteriálních sedlin ekvivalentní 1 ml kultivační suspense o optické densitě D.0=0,2 a vzorky odpovídajících supernatantů byly naneseny na gel, vyvolány a kvantifikovány postupy popsanými výše. Výsledky představuje následující tabulka :
Vzorek D.O.konec kultivace IL-13 v ng/l,D.0. 1
srovnávací vzorek 1,17 388
Arginin 2 g/1 1,24 455
Arginin 4 g/1 1,24 600
Arginin 8 g/1 1 720
Je zřejmé, že za pokusných podmínek a při uvažovaném systému exprese:
- arginin znatelně zvyšuje expresi periplasmatického IL13 a to z 2g/litr na 4 g /litr.
- růst bakterie se zpomaluje při koncentraci 8 g/litr
- při těchto koncentracích arginin nezpůsobuje přestup IL-13 do supernatantu.
Důležitost argininu v extračním procesu podle vynálezu spočívá ve schopnosti využít proteinové extrakty jako takové nebo po minimální úpravě při testování biologické aktivity.
Toto zjednodušení extrakční metody přináší výhodu jak pro průmyslovou výrobu rekombinovaných plasmatických proteinů, tak pro třídění tím, že se stanoví biologická aktivita v laboratorním měřítku. To se týká např. mutovaných proteinů.
Na rozdíl od guanidinhydrochloridu, který je často používán jako extrakční činidlo, arginin nepůsobí agresivně na materiály používané v průmyslu, zejména na ocel. Arginin není ani znečistovadlo, takže jeho použití nevyžaduje nákladnou úpravu odpadu.
Výhodný způsob exprese periplasmatického proteinu za pří tomnosti argininu při koncentracích rovných nejméně 2g/litr a zejména při koncentracích v rozmezí 2 g/litr až 10 g/litr upoutává na sebe pozornost vzrůstem výtěžku vylučovaného rekombinovaného proteinu získaného in-vivo.
Seznam sekvencí (1) Obecná informace:
(i) Ukladatel
(A) Jméno: SANOFI
(B) Ulice: 32-34 rue Marboeuf
(C) Město: Paříž
(E) Země: Francie
(F) PSČ: 57003
(G) Telefon: 53 77 41 31
(H) Fax: 53 77 42 16
(ii) Název vynálezu: Způsob extrakce periplasmatických proteinů z prokaryotních mikroorganismů (iii) Počet sekvencí: 1 (iv) Čtecí způsob pro počítač:
(A) Typ nosiče: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Systém provozu: PC-DCS/ilS-DOS (D) Software: Patentln Release# 1.0, Verse# 1.25 (CEB) (2) Informace o sekvenci ID č: 1:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) délka: 4410 základních párů (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jednoduché (D) konfigurace: lineární (ii) Typ molekuly: ADN (geonomická) (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 1:
TCGAGTGGGT TTGAGGCGAT CACACTTCTG TTAACGCAGA ACCTAAACGC ATCTCGACTG 60
CACGGTGCAC CAATGCTTCT GGCGTCAGGC AGCCATCGGA AGCTGTGGTA TGGCTGTGCA 120
GGTCGTAAAT CACTGCATAA TTCGTGTCGC TCAAGGCGCA CTCCCGTTCT GGATAATGTT l80
TTTTGCGCCG ACATCATAAC GGTTCTGGCA AATATTCTGA AATGAGCTGT TTCGAGCTGA 240
CTGACTGTTG CTTATAYTAC ATCGATAGCG TATAATGTGT GGAATTGTGA GCGGATAACA 300
ATTTCACACA GTTTTTCGCG AAGAAGGAGA TATACATATG AAAAAGATCC TGGCGTTAGC 36Ο
TGCGCTGACT ACCGTTGTAT TCTCTGCGTC CGCCTTCGCT GGCCCTGTGC CTCCCAGTAC 420
TGCCCTCAGG GAGCTCATTG AGGAGCTGGT CAACATCACC CAGAACCAGA AGGCTCCGCT 480
(TGCAATGGC AGCATGGTAT GGAGCATCAA CCTGACAGCT GGCATGTACT GTGCAGCCCT 540
CGAATCCCTG ATCAACGTGT CAGGCTGCAG TGCCATCGAG AAGACCCAGA GGATGCTGAG 600
CGGATTCTGC CCGCACAAGG TCTCAGCTGG GCAGTTTTCC AGCTTGCATG TCCGAGACAC 660
(AAAATCGAG GTGGCCCAGT TTGTAAAGGA CCTGCTCTTA CATTTAAAGA AACTTTTTCG 720
CGAGGGACGG TTCAACTGAA ACTTCGAAAG CATCATTATT TGGGATCCGG CTGCTAACAA 780
AGCCCGAAAG GAAGCTGAGT TGGCTGCTGC CACCGCTGAG CAATAACTAG CATAACCCCT 840
TGGGGCCTCT AAACGGGTCT TGAGGGGTTT TTTGCTGAAA GGAGGAACTA TATCCGGATG 900
TACCAAGCTT GGCCGGATCA AAGTTTTGTC GTCTTTCCAG ACGTTAGTAA ATGAATTTTC 960
TGTATGAGGT TTTGCTAAAC AACTTTCAAC AGTTTCAGCG GAGTGAGAAT AGAAAGGAAC 1020
AACTAAAGGA ATTGCGAATA ATAATTTTTT CACGTTGAAA ATCTCCAAAA AAAAAGGCTC 1080
CAAAAGGAGC CTTTAATTGT ATCGGTTTAT CAGCTTGCTT TCGAGGTGAA TTTCTTAAAC 1140
AGCTTGATAC CGATAGTTGC GCCGACAATG ACAACAACCA TCGCCCACGC ATAACCGATA 1200
TATTCGGTCG CTGAGGCTTG CAGGGAGTCA AAGGCCGCTT TTGCGGGATC GATCCGCGGA 1260
AGCATAAAGT GTAAAGCCTG GGGTGCCTAA TGAGTGAGCT AACTCACATT AATTGCGTTG I32O
CGCTCACTGC CCGCTTTCCA GTCGGGAAAC CTGTCGTGCC AGCTGCATTA ATGAATCGGC I38O
CAACGCGCGG GGAGAGGCGG TTTGCGTATT GGGCGCCAGG GTGGTTTTTC TTTTCACCAG 1440
TGAGACGGGC AACAGCTGAT TGCCCTTCAC CGCCTGGCCC TGAGAGAGTT GCAGCAAGCG 1500
GTCCACGCTG GTTTGCCCCA GCAGGCGAAA ATCCTGTTTG CTGGTGGTTA ACGGCGGGAT I56O
ATAACATGAG CTGTCTTCGG TATCGTCGTA TCCCACTACC GAGATATCCG CACCAACGCG 1620
CAGCCCGGAC TCGGTAATGG CGCGCATTGC GCCCAGCGCC ATCTGATCGT TGGCAACCAG 1680
CATCGCAGTG GGAACGATGC CCTCATTCAG CATTTGCATG GTTTGTTGAA AACCGGACAT 1740
GGCACTCCAG TCGCCTTCCC GTTCCGCTAT CGGCTGAATT TGATTGCGAG TGAGATATTT 1800
ATGCCAGCCA GCCAGACGCA GACGCGCCGA GACAGAACTT AATGGGCCCG CTAACAGCGC 1860
GATTTGCTGG TGACCCAATG CGACCAGATG CTCCACGCCC AGTCGCGTAC CGTCTTCATG 1920
GGAGAAAATA ATACTGTTGA TGGGTGTCTG GTCAGAGACA TCAAGAAATA ACGCCGGAAC I98O
ATTAGTGCAG GCAGCTTCCA CAGCAATGGC ATCCTGGTCA TCCAGCGGAT AGTTAATGAT 2040
CAGCCCACTG ACGCGTTGCG CGAGAAGATT GTGCACCGCC GCTTTACAGG CTTCGACGCC 2100
GCTTCGTTCT ACCATCGACA CCACCACGCT GGCACCCAGT TGATCGGCGC GAGATTTAAT 2160
CGCCGCGACA ATTTGCGACG GCGCGTGCAG GGCCAGACTG GAGGTGGCAA CGCCAATCAG 2220
CAACGACTGT TTGCCCGCCA GTTGTTGTGC CACGCGGTTG GGAATGTAAT TCAGCTCCGC 2280
CATCGCCGCT TCCACTTTTT CCCGCGTTTT CGCAGAAACG TGGCTGGCCT GGTTCACCAC 2340
GGGGGAAACG GTCTGATAAG AGACACCGGC ATACTCTGCG ACATCGTATA ACGTTACTGG 2400
TITCACATTC ACCACCCTGA ATTGACTCTC TTCCGGGCGC TATCATGCCA TACCGCGAAA 2460
G3TTTTGCGC CATTCGATCT ACGCCGGACG CATCGTGGCC GCAAACCAAC CCTTGGCAGA 2520
ACATATCCAT CGCGTCCGCC ATCTCCAGCA GCCGCACGCG GCGCATCTCG GGCCGCGTTG 258Ο
CrGGCGTTTT TCCATAGGCT CCGCCCCCCT GACGAGCATC ACAAAAATCG ACGCTCAAGT 2640
CAGAGGTGGC GAAACCCGAC AGGACTATAA AGATACCAGG CGTTTCCCCC TGGAAGCTCC 2700
CTCGTGCGCT CTCCTGTTCC GACCCTGCCG CTTACCGGAT ACCTGTCCGC CTTTCTCCCT 2760
T3GGGAAGCG TGGCGCTTTC TCAATGCTCA CGCTGTAGGT ATCTCAGTTC GGTGTAGGTC 2820
GTTCGCTCCA AGCTGGGCTG TGTGCACGAA CCCCCCGTTC AGCCCGACCG CTGCGCCTTA 2880
T3CGGTAACT ATCGTCTTGA GTCCAACCCG GTAAGACACG ACTTATCGCC ACTGGCAGCA 2940
G3CACTGGTA ACAGGATTAG CAGAGCGAGG TATGTAGGCG GTGCTACAGA GTTCTTGAAG 3000
T3GTGGCCTA ACTACGGCTA CACTAGAAGG ACAGTATTTG GTATCTGCGC TCTGCTGAAG 3060
C3AGTTACCT TCGGAAAAAG AGTTGGTAGC TCTTGATCCG GCAAACAAAC CACCGCTGGT 3120
AGCGGTGGTT TTTTTGTTTG CAAGCAGCAG ATTACGCGCA GAAAAAAAGG ATCTCAAGAA 318Ο
GATCCTTTGA TCTTTTCTAC GGGGTCTGAC GCTCAGTGGA ACGAAAACTC ACGTTAAGGG 3240
ATTTTGGTCA TGAGATTATC AAAAAGGATC TTCACCTAGA TCCTTTTAAA TTAAAAATGA 3300
AGTTTTAAAT CAATCTAAAG TATATATGAG TAAACTTGGT CTGACAGTTA CCAATGCTTA 3360
ATCAGTGAGG CACCTATCTC AGCGATCTGT CTATTTCGTT CATCCATAGT TGCCTGACTC 3420
CCCGTČGTGT AGATAACTAC GATACGGGAG GGCTTACCAT CTGGCCCCAG TGCTGCAATG 3480
ATACCGCGAG ACCCACGCTC ACCGGCTCCA GATTTATCAG CAATAAACCA GCCAGCCGGA 3540
AGGGCCGAGC GCAGAAGTGG TCCTGCAACT TTATCCGCCT CCATCCAGTC TATTAATTGT 3600
TGCCGGGAAG CTAGAGTAAG TAGTTCGCCA GTTAATAGTT TGCGCAACGT TGTTGCCATT 3660
GCTGCAGGCA TCGTGGTGTC ACGCTCGTCG TTTGGTATGG CTTCATTCAG CTCCGGTTCC 3720
CAACGATCAA GGCGAGTTAC ATGATCCCCC ATGTTGTGCA AAAAAGCGGT TAGCTCCTTC 3780 , GGTCCTCCGA TCGTTGTCAG AAGTAAGTTG GCCGCAGTGT TATCACTCAT GGTTATGGCA 3840
GCACTGCATA ATTCTCTTAC TGTCATGCCA TCCGTAAGAT GCTTTTCTGT GACTGGTGAG 3900
TACTCAACCA AGTCATTCTG AGAATAGTGT ATGCGGCGAC CGAGTTGCTC TTGCCCGGCG 3960
TCAACACGGG ATAATACCGC GCCACATAGC AGAACTTTAA AAGTGCTCAT CATTGGAAAA 4020
CGTTCTTCGG GGCGAAAACT CTCAAGGATC TTACCGCTGT TGAGATCCAG TTCGATGTAA 4θ8θ
CCCACTCGTG CACCCAACTG ATCTTCAGCA TCTTTTACTT TCACCAGCGT TTCTGGGTGA 4l4O
GCAAAAACAG GAAGGCAAAA TGCCGCAAAA AAGGGAATAA GGGCGACACG GAAATGTTGA 4200
ATACTCATAC TCTTCCTTTT TCAATATTAT TGAAGCATTT ATCAGGGTTA TTGTCTCATG 4260
AGCGGATACA TATTTGAATG TATTTAGAAA AATAAACAAA TAGGGGTTCC GCGCACATTT 4320
CCCCGAAAAG TGCCACCTGA CGTCTAAGAA ACCATTATTA TCATGACATT AACCTATAAA 4380
AATAGGCGTA TCACGAGGCC CTTTCGTCCC 4410 η
SHIeS VŠFTEČKI advokát
JAiOIMlSVlA 0Η3Λ0'3λίΛΙ SHd ΐ avy ο ’
6 i i ε
I j 0150a , S Z o L 0 0 z prdkae a í m/f‘3

Claims (6)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob extrakce periplasmatických proteinů ryotních mikroorganismů, vyznačující s že buněčná sedlina, pocházející z kultivace prokaryotních mikroorganismů, transformovaných pomocí vektoru exprese, který obsahuje gen kódující příslušný protein a prostředky pro jeho expresi v periplasmě, se suspenduje v roztoku pufru, obobsahujícím arginin a příslušný protein se isoluje ze supernatantu takto získané bakteriální suspense.
  2. 2., Způsob podle, nároku 1, vyznačující se tím, že se v roztoku pufru, obsahujícím arginin, suspenduje sedlina buněčné drtě z buněk pocházejících z kultivace prokaryotních mikroorganismů, transformovaných pomocí vektoru exprese, který obsahuje gen kódující příslušný protein a prostředky pro jeho expresi v periplasmě.
  3. 3. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačuj ící se t í m , že se buněčná sedlina suspenduje ve vodném alkalickém roztoku o koncentraci argininu nejméně rovné 0,4 M.
  4. 4. Použití argininu jako činidla pro extrakci periplasmatických rekombinovaných proteinů.
  5. 5. Způsob kultivace prokaryotních mikroorganismů, transformovaných pomocí vektoru exprese, který obsahuje gen kódující příslušný protein, vyznačující se tím, že se kultivace provádí za přítomnosti argininu o koncentraci nejméně rovné 2 g/litr.
  6. 6. Způsob podle nároku 5,vyznačující se tím, že se kultivace provádí v přítomnosti argininu o koncentraci v rozmezí 2g/litr až 10 g/litr.
CZ1996290A 1995-01-31 1996-01-31 Extraction process of periplasmatic protein CZ286509B6 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9501083A FR2729972B1 (fr) 1995-01-31 1995-01-31 Procede d'extraction de proteines periplasmiques de microorganismes procaryotes en presence d'arginine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ29096A3 true CZ29096A3 (en) 1996-08-14
CZ286509B6 CZ286509B6 (en) 2000-04-12

Family

ID=9475667

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ1996290A CZ286509B6 (en) 1995-01-31 1996-01-31 Extraction process of periplasmatic protein

Country Status (25)

Country Link
US (2) US5700665A (cs)
EP (1) EP0725140B1 (cs)
JP (1) JP3005464B2 (cs)
KR (1) KR100401028B1 (cs)
CN (1) CN1132842C (cs)
AR (1) AR000831A1 (cs)
AT (1) ATE250132T1 (cs)
AU (1) AU700509B2 (cs)
BR (1) BR9600270A (cs)
CA (1) CA2168382C (cs)
CZ (1) CZ286509B6 (cs)
DE (1) DE69629965D1 (cs)
EA (1) EA000017B1 (cs)
FI (1) FI960427A (cs)
FR (1) FR2729972B1 (cs)
HU (1) HU222598B1 (cs)
IL (1) IL116973A0 (cs)
MX (1) MX9600380A (cs)
NO (1) NO316519B1 (cs)
NZ (1) NZ280919A (cs)
PL (1) PL183598B1 (cs)
SK (1) SK281946B6 (cs)
TW (1) TW403760B (cs)
UA (1) UA27997C2 (cs)
ZA (1) ZA96734B (cs)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1048732A1 (de) * 1999-04-26 2000-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen
KR20010056451A (ko) * 1999-12-15 2001-07-04 윤재승 아르기닌이 강화된 동물세포 배양용 배지 조성물
AU2003300295A1 (en) * 2002-12-20 2004-07-22 Cardiac Inventions Unlimited, Inc. Left ventricular pacing lead and implantation method
BRPI0621124A2 (pt) * 2005-12-22 2011-11-29 Genentech Inc métodos para recuperação de uma proteìna de ligação à heparina
WO2008008975A2 (en) 2006-07-14 2008-01-17 Genentech, Inc. Refolding of recombinant proteins
GB201107737D0 (en) 2011-05-09 2011-06-22 Univ Birmingham Extraction from cells
WO2022191223A1 (ja) * 2021-03-10 2022-09-15 株式会社カネカ 原核生物細胞から標的タンパク質を抽出する方法
JPWO2022201917A1 (cs) 2021-03-22 2022-09-29
CN113249391A (zh) * 2021-05-10 2021-08-13 江苏坤力生物制药有限责任公司 一种编码rPD蛋白的核酸、其制备方法和用途

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6244198A (ja) * 1985-08-23 1987-02-26 Toray Ind Inc 有用タンパク質の生産方法
JPS6251983A (ja) * 1985-09-02 1987-03-06 Hagiwara Yoshihide ヒト／ヒト・ハイブリド−マ培養用無血清培地
JPH0672105B2 (ja) * 1985-10-02 1994-09-14 持田製薬株式会社 血栓溶解剤及びその製法
DE3537708A1 (de) * 1985-10-23 1987-04-23 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten
JP2769541B2 (ja) * 1987-06-24 1998-06-25 ジェネンテク，インコーポレイテッド 平衡型構成誘導性転写系
FR2636644B1 (fr) * 1988-08-24 1990-12-28 Sanofi Sa Sequence d'adn participant a la regulation de l'expression d'une sequence d'adn codant pour un precurseur d'un polypeptide, vecteurs d'expression et procede de production periplasmique du polypeptide
PT100580A (pt) * 1991-06-12 1993-09-30 Regeneron Pharma Producao e recuperacao de neurotrofinas recombinantes

Also Published As

Publication number Publication date
AR000831A1 (es) 1997-08-06
NO960396L (no) 1996-08-01
IL116973A0 (en) 1996-05-14
PL312543A1 (en) 1996-08-05
EA199600001A3 (ru) 1996-10-01
KR100401028B1 (ko) 2004-03-31
NO316519B1 (no) 2004-02-02
US5856142A (en) 1999-01-05
EP0725140B1 (fr) 2003-09-17
HUP9600209A3 (en) 2000-08-28
CN1142502A (zh) 1997-02-12
AU4224496A (en) 1996-08-08
UA27997C2 (uk) 2000-10-16
FI960427A (fi) 1996-08-01
AU700509B2 (en) 1999-01-07
EA000017B1 (ru) 1997-12-30
FR2729972B1 (fr) 1997-04-18
SK10696A3 (en) 1996-09-04
JP3005464B2 (ja) 2000-01-31
ATE250132T1 (de) 2003-10-15
BR9600270A (pt) 1997-12-23
TW403760B (en) 2000-09-01
HUP9600209A2 (en) 1997-05-28
JPH08242879A (ja) 1996-09-24
EA199600001A2 (ru) 1996-07-01
KR960029343A (ko) 1996-08-17
HU222598B1 (hu) 2003-08-28
CA2168382C (en) 2003-09-30
DE69629965D1 (de) 2003-10-23
CA2168382A1 (en) 1996-08-01
MX9600380A (es) 1997-01-31
PL183598B1 (pl) 2002-06-28
FI960427A0 (fi) 1996-01-30
CN1132842C (zh) 2003-12-31
ZA96734B (en) 1996-08-16
NO960396D0 (no) 1996-01-30
FR2729972A1 (fr) 1996-08-02
SK281946B6 (sk) 2001-09-11
HU9600209D0 (en) 1996-03-28
CZ286509B6 (en) 2000-04-12
NZ280919A (en) 1997-07-27
EP0725140A1 (fr) 1996-08-07
US5700665A (en) 1997-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021200988A1 (en) Gene therapy for retinitis pigmentosa
AU2013221187B9 (en) Virus like particle composition
US6187991B1 (en) Transgenic animal models for type II diabetes mellitus
CN108949825A (zh) 一种靶向her2的car-t细胞的制备方法及应用
CN101802183A (zh) 高保真度限制性内切核酸酶
AU700509B2 (en) Method for the extraction of periplasmic proteins from prokaryotic microorganisms in the presence of arginine
KR101616572B1 (ko) 홍역-말라리아 조합 백신
CN108718529B (zh) 用于产生l-半胱氨酸的突变微生物以及使用其产生l-半胱氨酸的方法
WO1992017581A1 (en) Mammalian expression vector
CN114480385A (zh) 基于来自耐酸酵母的基因的合成启动子
CN115707779B (zh) 重组柯萨奇病毒a16病毒样颗粒及其用途
CN113186140B (zh) 用于预防和/或治疗宿醉和肝病的基因工程细菌
CN114032217A (zh) 基于dna载体和复制型痘苗病毒载体的新冠病毒复合型疫苗
CN113846071B (zh) 一种酶活提高的丙氨酸-乙醛酸转氨酶突变体及应用
CN114250239A (zh) 甘氨酸核糖开关基因调控线路的构建方法及应用
CN111492059A (zh) 在宿主细胞中进行基因组编辑的方法
KR102454110B1 (ko) ppGpp 생합성 관련 유전자 발현의 저해물질 탐색용 재조합 플라스미드 및 돌연변이 균주
CN114990163A (zh) 用于干细胞基因修饰的慢病毒载体及其构建方法和应用
KR20150045872A (ko) 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 레플리콘을 사용한 구제역 백신주

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20050131