CN114250239A

CN114250239A - 甘氨酸核糖开关基因调控线路的构建方法及应用

Info

Publication number: CN114250239A
Application number: CN202111609842.3A
Authority: CN
Inventors: 王智文; 洪坤强; 张静; 晋彪; 陈涛
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2022-03-29

Abstract

本发明涉及甘氨酸核糖开关基因调控线路的构建方法及应用；通过在野生型的甘氨酸核糖开关元件序列上进行突变，从文库高通量筛选出性能提升，甘氨酸响应范围增加和振幅值增加的甘氨酸‑ON的突变体和构象改变的甘氨酸核糖开关突变体，从而可以实现基因的表达调控。本发明同时将野生型甘氨酸‑ON转变为甘氨酸‑OFF核糖开关,同时也增加了核糖开关的振幅值。本发明还提供了筛选性能提升与构象改变的甘氨酸突变体方法以及含有这些突变体的表达载体和宿主细胞。本发明的甘氨酸核糖开关基因调控线路的构建及性能提升与构象改变的突变体是目前在大肠杆菌内首次报道基于甘氨酸核糖开关线路和性能提升的有效突变体。

Description

甘氨酸核糖开关基因调控线路的构建方法及应用

技术领域

本发明属于合成生物学领域，具体地涉及基因调控线路的构建方法，甘氨酸核糖开关突变体的筛选及应用。

背景技术

代谢工程是生物合成化学品和生物材料重要的方法。但是传统代谢工程方法通常是通过简单的过表达或者敲除途径基因来实现目标产品的生产，这不可避免导致细胞生长受到影响，代谢不平衡以及资源不充分利用等问题。与此相比，天然的细胞能够有效的平衡细胞生长和胞内代谢物之间的平衡，从而实现细胞生长，产品生产以及能源有效利用之间的最佳效果。

为了解决以上问题，一些启动子、RBS和基因间区域的组合文库被广泛设计用来调控基因的表达水平。这些文库的筛选需要花费很大的人力物力，效率相对较低，而且在复杂的微生物代谢环境中，通常基因在一种环境下的最优表达条件可能很难适用于另一种代谢环境中。一些诱导型的启动子也被开发应用于途径基因的调控，但是诱导剂本身昂贵的价格会增加生产成本，而且诱导剂本身对细胞的生长代谢也有影响。

核糖开关，位于mRNA的非翻译区(untranslated regions，UTR)，可以直接感应信号分子并引起自身二级结构构象变化，从而在转录或者翻译水平实现对下游相关基因的表达调控。作为生物传感器的一种，核糖开关响应信号分子的过程不依赖蛋白质或其他任何因子的相互作用，相对简单迅捷，在细胞动态代谢调控，提升底物利用效率，提升目标酶的性能以及提升产品的产量和得率等方面具有重要的应用价值。

在2002年Breaker课题组首次报道了核糖开关可用于基因的表达调控，之后约有40种核糖开关被确认，包括辅酶、核苷酸衍生物、信号分子、金属离子、氨基酸和其他代谢物等类型的核糖开关。然而，相比于种类众多的代谢物分子，目前可用的核糖开关仍然有限，这极大地限制了其在代谢工程中的潜在应用。

氨基酸广泛参与许多细胞代谢反应，因此，氨基酸类核糖开关对于细胞动态代谢调控具有重要意义。其中赖氨酸核糖开关已经被广泛应用于代谢工程领域。例如，2013年，为了加快微生物的进化，基于赖氨酸核糖开关高通量筛选模块被用于筛选最优代谢通路的大肠杆菌，经过四轮富集筛选，通路优化菌株占总菌群的75％(Yang J,et al.(2013),NatCommun4(1413):1-7.)；2015年，赖氨酸核糖开关被应用于进化天冬氨酸激酶的高通量筛选。最好的突变体BT3显示出160％的体外活性增加，在含有BT3的菌株在分批培养中产生674mg/L的L-赖氨酸(Wang JM,Gao DF,Yu XL,Li W,&Qi QS(2015).Appl MicrobiolBiot99(20):8527-8536.)；同年，天然大肠杆菌来源的赖氨酸核糖开关(ECRS)和枯草芽孢杆菌来源的赖氨酸核糖开关(BSRS)被用于动态控制产赖氨酸菌株中柠檬酸合酶的表达和三羧酸循环活性。结果表明，突变体ECRS-gltA中的赖氨酸产量增加了63％，突变体BSRS-gltA中的赖氨酸产量增加了38％(Zhou LB&Zeng AP(2015).ACS Synth Biol 4(6):729-734.)；此外，来源于大肠杆菌的天然赖氨酸-OFF核糖开关和合成赖氨酸-ON核糖开关分别用于动态控制柠檬酸合酶和赖氨酸转运蛋白。在含有赖氨酸-ON核糖开关用于lysE控制的菌株的赖氨酸产量与对照菌株相比增加了21％，与天冬氨酸激酶失调的菌株相比，赖氨酸产量甚至增加了89％(Zhou LB&Zeng AP(2015).ACS Synth Biol 4(12):1335-1340.)。2021年，一种合成的色氨酸核糖开关也被用于通过提高色氨酸在大肠杆菌中的耐受性，从而增加工程大肠杆菌的Trp产量(Liu Y,et al.(2021).ACS Synth.Biol.10(6):1-10.)。

虽然以上研究表明天然氨基酸类核糖开关可以很容易地用于代谢途径的动态调控，甚至可以设计为“合成开关”，以增强其他微生物所需代谢途径的代谢通量。与传统的代谢工程方法相比，基于核糖开关的动态调控策略能够有效缓解由于外源蛋白引入导致的代谢负担，平衡细胞生长和胞内的代谢物水平的变化，实现目标产物的生产。但是天然的甘氨酸核糖开关对甘氨酸的感应十分灵敏，而且感应范围较窄仍然是亟需解决的问题。以甘氨酸核糖开关为例，当前许多天然来源或合成的甘氨酸核糖开关感应范围均较低(大约0-30mM)；同时当前的核糖开关数量远远小于感应小分子的数量，每一种可被应用于代谢工程或合成生物学的感应元件，都是对其扩大和发展。因此，开发或发现新的核糖元件或提升现有的核糖元件性能对于其在代谢工程领域的广泛应用具有重要意义。

本发明通过从文库高通量筛选出性能提升，甘氨酸响应范围增加和振幅值增加的甘氨酸-ON的突变体和构象改变的甘氨酸核糖开关突变体。这不仅提升了当前甘氨酸核糖开关的性能，也丰富了核糖开关的数量，从而解决了天然核糖开关感应范围较低的问题。通过添加廉价的甘氨酸即可实现菌株的动态表达，既不影响菌株的生长，也避免了使用高价诱导剂增加成本的问题。

发明内容

根据现有技术的问题，本发明提出了甘氨酸核糖开关基因调控线路的构建及性能提升与构象改变的突变体的应用。

本发明的技术方案概述如下：

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现通过在野生型的甘氨酸核糖开关元件序列上进行突变，从文库高通量筛选出性能提升，甘氨酸响应范围增加和振幅值增加的甘氨酸-ON的突变体和构象改变的甘氨酸核糖开关突变体，从而可以实现基因的表达调控。在此基础上完成了本发明。

术语定义

本文中的术语“甘氨酸核糖开关”是指非编码氨基酸的调控元件可用于构建基因线路调控的甘氨酸核糖开关，关于本发明的目的，它来源于枯草芽孢杆菌，其核酸序列如SEQ ID NO:4所示。此外，具有与SEQ ID NO:4的功能等同的任何突变体序列，虽然他们来源相同，但是这些核酸序列已经经过双重筛选表现出性能提升和/或构象改变的突变体甘氨酸核糖开关性能提升的突变体。其中，表现为甘氨酸响应范围和振幅值增加的突变体有BSglyON3、BSglyON4、BSglyON9、BSglyON10、BSglyON13、BSglyON14，其特征是，核酸序列为SEQ ID NO.4(该序列不编码氨基酸)的第19位的腺嘌呤A突变为鸟嘌呤G、第47位的腺嘌呤A突变为胞嘧啶C、第73位的尿嘧啶U突变为腺嘌呤A、第106位的胞嘧啶C突变为尿嘧啶U，和/或第4位的腺嘌呤A突变为胞嘧啶C、和/或第5位的腺嘌呤A突变为鸟嘌呤G、和/或第8位的腺嘌呤A突变为尿嘧啶U、和/或第179位的尿嘧啶U突变为腺嘌呤A。

甘氨酸核糖开关构象改变的突变体BSglyOFF5、BSglyOFF6、BSglyOFF8、BSglyOFF11、BSglyOFF12、BSglyOFF35，表现为野生型的甘氨酸-ON构象突变为甘氨酸-OFF构象，并且振幅值增加，其特征是，核酸序列为SEQ ID NO.4(该序列不编码氨基酸)的第42位的鸟嘌呤G突变为胞嘧啶C、第62位的腺嘌呤A突变为尿嘧啶U、第79位的尿嘧啶U突变为胞嘧啶C、第92位的腺嘌呤A突变为鸟嘌呤G、第120位的尿嘧啶U突变为腺嘌呤A、和/或第56位的腺嘌呤A突变为鸟嘌呤G、和/或第64位的腺嘌呤A突变为尿嘧啶U、和/或第108位的腺嘌呤A突变为鸟嘌呤G、和/或第128位的胞嘧啶C突变为尿嘧啶U、和/或第143位的胞嘧啶C突变为腺嘌呤A、和/或第177位的尿嘧啶U突变为胞嘧啶C、和/或第177位的尿嘧啶U突变为腺嘌呤A。

以上突变体的详细特征如下表1：(突变位点信息栏中，数字代表突变位点，横杠前的字母表示突变前的核苷酸，横杠后的字母表示突变后的核苷酸)

本文所用的术语“甘氨酸-OFF核糖开关”或“glycine-OFF核糖开关”或“glycine-OFF核糖开关基因线路”指的是甘氨酸核糖开关序列具有在未结合甘氨酸时表现出激活下游基因的表达，当结合甘氨酸时表现出抑制下游基因表达功能的元件或基因线路。“甘氨酸-ON核糖开关”或“glycine-ON核糖开关”或“glycine-ON核糖开关基因线路”指的是甘氨酸核糖开关序列具有当未结合甘氨酸时表现出抑制下游基因的表达，当结合甘氨酸时表现出激活下游基因表达功能的元件或基因线路。

本文所用的术语“感应范围”指的是甘氨酸核糖开关在激活状态到抑制状态对应的甘氨酸浓度或者在抑制状态到激活状态的浓度。

本文所用的术语“振幅值”指的是甘氨酸核糖开关在激活状态到抑制状态对应的输出值的差。

本文所用的术语“构象改变”指的是甘氨酸核糖开关的二级结构通过突变等方式在同样甘氨酸浓度从“ON”改变为“OFF”或从“OFF”改变为“ON”的转变。

本发明的甘氨酸核糖开关调控基因线路质粒的构建方法，包括如下步骤：

1)：以SEQ ID No.1所示BSGlyRS-F和以SEQ ID No.2所示BSGlyRS-R为引物，以SEQID No.3所示pUC-BSGlyRS为模板，通过PCR的方法，得到以SEQ ID No.4所示BSGlyRS片段；

2)：以SEQ ID No.5所示tetA-F和以SEQ ID No.6所示tetA-R为引物，以SEQ IDNo.7所示pUC-TETA为模板，通过PCR的方法，得到以SEQ ID No.8所示tetA片段；

3)：以SEQ ID No.9所示GFP-F和以SEQ ID No.10所示GFP-R为引物，以SEQ IDNo.11所示pUC-GFP为模板，通过PCR的方法，得到以SEQ ID No.12所示GFP片段；

4)：以SEQ ID No.13所示pUC18-F和以SEQ ID No.14所示pUC18-R为引物，以SEQID No.15所示pUC18为模板，通过PCR扩增，得到pUC18质粒骨架；通过CEPC组装技术，将与上述步骤获得的BSGlyRS、tetA、和GFP片段连接到pUC18质粒骨架上面，得到质粒命名为pUC18-BSTG，以SEQ ID No.16所示；

5)：以SEQ ID No.17所示BSGT-mutF和以SEQ ID No.18所示BSGT-mutF为引物，以SEQ ID No.16所示pUC18-BSTG为模板，通过PCR扩增，得到BSGlyRS片段文库；

6)：以SEQ ID No.19所示18-mutF和以SEQ ID No.20所示18-mutF为引物，以SEQID No.16所示pUC18-BSTG为模板，，得到文库质粒载体片段pUC18-STG；获得两者片段可构建为甘氨酸核糖开关质粒文库pUC18-BSTGlib，以SEQ ID No.21所示

7)：将甘氨酸核糖开关质粒文库pUC18-BSTGlib转化到大肠杆菌MG1655中，涂布于M9固体培养基上，所有菌落收集于无菌水中；一半体积的菌液接种于补有80-100μg/mL(在此范围内均适用)氨苄青霉素的新鲜M9培养基中，和质量比10-12％(在此范围内均适用)的镍离子以除去甘氨酸-OFF核糖开关，然后在补有质量比0.4-0.8％(在此范围内均适用)的甘氨酸的新鲜M9培养基中选择甘氨酸-ON核糖开关，在补有80-100μg/mL(在此范围内均适用)氨苄青霉素，质量比0.4-0.8％甘氨酸和10-20μg/mL(在此范围内均适用)四环素的新鲜M9培养基中培养进一步富集甘氨酸-ON核糖开关。通过流式荧光细胞分选仪器(FACS)对具有最高绿色荧光的克隆进行分选。

8)：另一半体积的菌液接种于在80-100μg/mL(在此范围内均适用)氨苄青霉素，质量比10-12％(在此范围内均适用)的镍离子和质量比0.4-0.8％(在此范围内均适用)的甘氨酸新鲜M9培养基中以除去甘氨酸-ON核糖开关，然后在补有80-100μg/mL(在此范围内均适用)氨苄青霉素但没有甘氨酸但没有甘氨酸新鲜M9培养基中培养，然后转接至在补有80-100μg/mL(在此范围内均适用)氨苄青霉素和10-20μg/mL(在此范围内均适用)四环素的M9培养基中，以富集甘氨酸-OFF核糖开光。同样，通过荧光细胞流式分选仪器(FACS)对具有最高绿色荧光的克隆进行分选。

9)：将步骤七和八中的菌株分别在新鲜M9固体培养基上培养12-24h，随机挑选单菌落至96深孔板中进行初步筛选。每个单菌落分别接种于添加0.4-0.8％甘氨酸和不添加甘氨酸的深孔板中，37℃培养12-24h，然后分别检测在两种条件下的荧光强度和细胞生长量(OD₆₀₀)。经96深孔板筛选后，得到如表1所示的突变体，其中有构象转变的甘氨酸-OFF核糖开关突变体和感应范围增加的甘氨酸-ON核糖开关突变体,突变体的特征如表1。

经96深孔板筛选后，得到甘氨酸-ON和-OFF核糖开关振幅比值最大的菌株MG1655-BS-ON14和MG1655-BS-OFF6。

本发明甘氨酸核糖开关突变体摇瓶表征：

挑选甘氨酸-ON和-OFF核糖开关振幅比值最大的菌株MG1655-BS-ON14和MG1655-BS-OFF6(菌株命名规则为：底盘菌株名称+甘氨酸核糖开关来源物种的简称+突变体对应的功能和序号)，分别接种于M9液体培养基中，添加不同浓度甘氨酸进行表征。并检测不同甘氨酸浓度下，菌株的荧光强度和响应的生物量，计算细胞的相对荧光强度。

测定发酵过程中绿色荧光蛋白相对强度，结果显示随着甘氨酸添加量的增加，在以上6个甘氨酸-ON突变体中，14-ON的绿色荧光蛋白相对强度随着甘氨酸浓度的增加而不断增加，当甘氨酸浓度为107mM时，其绿色荧光蛋白相对强度为615.23，相比于野生型甘氨酸核糖开关提高约50％；14-ON的甘氨酸响应范围由野生型的0-80mM提高到0-107mM。而构象改变的甘氨酸核糖开关突变体6-OFF与野生型相反，当不添加甘氨酸时，绿色荧光蛋白相对强度为631.34，而当添加107mM甘氨酸时，其绿色荧光蛋白相对强度为50，大约有10倍的抑制作用。由此可知：成功通过从文库高通量筛选出性能提升，甘氨酸响应范围增加和振幅值增加的甘氨酸-ON的突变体14-ON和构象改变的甘氨酸核糖开关突变体6-OFF。以上的突变体不仅提升了当前甘氨酸核糖开关的性能，也丰富了核糖开关的数量。

本发明涉及甘氨酸核糖开关基因调控线路的构建及性能提升与构象改变的突变体的应用。本发明的甘氨酸核糖开关基因线路可感应甘氨酸分子实现基因表达调控；本发明的甘氨酸-ON核糖开关突变体不仅显著提高了甘氨酸的响应范围，也提高了振幅值；同时将野生型甘氨酸-ON转变为甘氨酸-OFF核糖开关,同时也增加了核糖开关的振幅值。本发明还提供了筛选性能提升与构象改变的甘氨酸突变体方法以及含有这些突变体的表达载体和宿主细胞。本发明的甘氨酸核糖开关基因调控线路的构建及性能提升与构象改变的突变体是目前在大肠杆菌内首次报道基于甘氨酸核糖开关线路和性能提升的有效突变体。通过添加廉价的甘氨酸从而实现菌株的动态表达，既不影响菌株的生长，也避免了使用高价诱导剂增加成本的问题。

附图说明

图1为SEQ ID No.11所示pUC18-BSTG质粒的示意图。

图2为野生型菌株MG1655-BSTG和MG1655-BS-GLYOFF66在添加甘氨酸浓度分别为0,7,14,27,80mM时绿色荧光蛋白相对强度变化示意图。

具体实施方式

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。除非另有说明，所有技术和科学术语都具有本领域所知的常见含义。所有专利、专利申请、公开出版物、序列、以及其他公开材料均援引加入本文，除非另有说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。

本发明所用到的原始菌株大肠杆菌平台菌株，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)MG1655,为通用菌株。

原始质粒pUC18来源为Addgene(https://www.addgene.org/)。

pUC-BSGly，pUC-GFP，pUC-TETA均为生物公司化学合成。

所用限制性内切酶、DNA聚合酶等分子生物学试剂购买自thermo公司(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)。

所用PCR仪，酶标仪，分光光度计和电转仪购自Bio-Rad(http://www.bio-rad.com/)。

所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司(http://www.sangon.com/)购买。

LB固体培养基(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂2％)余量是水。

LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L)余量是水。

M9培养基：以每1L计含有：葡萄糖20g，磷酸氢二钠6.8g，磷酸二氢钾3g，氯化钠0.5g，氯化铵1.0g，硫酸镁0.24g，氯化钙0.11g，微量元素10mg，柠檬酸铁胺20mg，硫酸亚铁2.8mg，甘氨酸0.5-6g，余量为水。

实施例1

甘氨酸核糖开关基因调控线路的构建方法与突变体的筛选，其特征是包括如下步骤：

4)：以SEQ ID No.13所示pUC18-F和以SEQ ID No.14所示pUC18-R为引物，以SEQID No.15所示pUC18为模板，通过PCR扩增，得到pUC18质粒骨架；通过CEPC组装技术，将与上述步骤获得的BSGlyRS、tetA、和GFP片段连接到pUC18质粒骨架上面，得到质粒命名为pUC18-BSTG，以SEQ ID No.16所示(如图1所示)；

6)：以SEQ ID No.19所示18-mutF和以SEQ ID No.20所示18-mutF为引物，以SEQID No.16所示pUC18-BSTG为模板，通过PCR扩增，得到文库质粒载体片段pUC18-STG；BSGlyRS片段文库和pUC18-STG文库质粒载体片段分别使用dpnI快切酶在37℃孵育20分钟，然后立即切胶回收，获得两者纯化片段通过CEPC组装技术构建为甘氨酸核糖开关质粒文库pUC18-BSTGlib，以SEQ ID No.21所示。

7)：性能提升的甘氨酸核糖开关突变体的筛选为：甘氨酸核糖开关质粒文库pUC18-BSTGlib转化到大肠杆菌MG1655中，然后涂布于M9固体培养基上；用2-4mL灭菌的纯净水冲洗固体培养基上的菌落，收获在M9培养基上的所有转化体，一半体积菌液接种于补有100μg/mL氨苄青霉素的新鲜M9培养基中，补加90μM镍离子，在37℃，220rpm培养10-16h，以除去带有甘氨酸-OFF核糖开关的菌株；然后在补有80mM甘氨酸的新鲜M9培养基中选择甘氨酸-ON核糖开关，在补有100μg/mL氨苄青霉素，80mM甘氨酸和15μg/mL四环素的新鲜M9培养基中培养进一步富集甘氨酸-ON核糖开关。只有tetA和GFP表达显示较高水平的的克隆会在选择步骤中存活，然后通过流式荧光细胞分选仪器(FACS)对具有最高绿色荧光的克隆进行分选。

8)：构象改变的甘氨酸核糖开关突变体的筛选为：收获在M9培养基上的所有菌落，另一半体积菌液接种于在100μg/mL氨苄青霉素，90μM镍离子和80mM甘氨酸新鲜M9培养基中以除去甘氨酸-ON核糖开关，然后在补有100μg/mL氨苄青霉素但没有甘氨酸但没有甘氨酸新鲜M9培养基中培养，然后转接至在补有100μg/mL氨苄青霉素和15μg/mL四环素的M9培养基中，以富集甘氨酸-OFF核糖开光。同样，只有tetA和GFP表达显示较高水平的的克隆会在选择步骤中存活，然后通过荧光细胞流式分选仪器(FACS)对具有最高绿色荧光的克隆进行分选。

9)：将步骤7)和8)中的菌株分别在新鲜M9固体培养基上培养12-24h，随机挑选单菌落至96深孔板中进行初步筛选。每个单菌落分别接种于添加80mM甘氨酸和不添加甘氨酸的深孔板中，37℃培养12-24h，然后分别检测在两种条件下的荧光强度和细胞生长量(OD₆₀₀)。经96深孔板筛选后，挑选甘氨酸-ON和-OFF核糖开关振幅比值最大的菌株。其中，来源甘氨酸-ON核糖开关的菌群，定义添加80mM甘氨酸时的相对荧光强度为ON值，不添加甘氨酸时的相对荧光强度为OFF值；来源甘氨酸-OFF核糖开关的菌群定义值与之相反。

公式中不同符号的含义：

GFP:绿色荧光蛋白的表达强度；

OD₆₀₀：细胞生物量；

ON₈₀：来源甘氨酸-ON核糖开关的菌群在添加80mM甘氨酸时，细胞的相对荧光强度；

OFF₀：来源甘氨酸-ON核糖开关的菌群在不添加甘氨酸时，细胞的相对荧光强度；

ON₀：来源甘氨酸-OFF核糖开关的菌群在不添加甘氨酸时，细胞的相对荧光强度；

OFF₈₀：来源甘氨酸-OFF核糖开关的菌群在添加80mM甘氨酸时，细胞的相对荧光强度；

ON(ON₈₀/OFF₀):甘氨酸-ON核糖开关的振幅比值；

OFF(ON₀/OFF₈₀):甘氨酸-OFF核糖开关的振幅比值；

实验结果：经96深孔板筛选得到的突变体BSglyON3、BSglyON4、BSglyON9、BSglyON10、BSglyON13、BSglyON14表现为甘氨酸响应范围和振幅值增加；突变体BSglyOFF5、BSglyOFF6、BSglyOFF8、BSglyOFF11、BSglyOFF12、BSglyOFF35表现为野生型甘氨酸-ON构象突变为甘氨酸-OFF构象，并且振幅值增加。以上突变体的详细突变位点如下表1：(突变位点信息栏中，数字代表突变位点，横杠前的字母表示突变前的核苷酸，横杠后的字母表示突变后的核苷酸)

上述六个甘氨酸-ON突变体和六个甘氨酸-OFF突变体中，突变体BSglyON14和BSglyOFF6的开关振幅比值最大，对应的菌株为MG1655-BS-ON14和MG1655-BS-OFF6。

实施例2

甘氨酸核糖开关基因线路的发酵表征方法，如下述步骤：

(1)活化菌株：将带有野生型甘氨酸元件的菌株MG1655-BSTG和带有BSglyON14的菌株MG1655-BS-ON14，带有BSglyOFF6的菌株MG1655-BS-OFF6在含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基中划线，37℃培养10-20h，使菌株复壮；

(2)种子液的培养：调一环步骤(1)的活化菌接种到LB液体培养基中，37℃，220rpm培养10-20h，然后将所得菌液按初始OD₆₀₀＝0.02的接种量接种到M9培养基，37℃，220rpm培养10-20h，得到种子液；

(3)发酵表征：将步骤(2)所获得的种子液按初始OD₆₀₀＝0.02接种到装有50mL的三角瓶中，加入氨苄青霉素，使浓度为80-100μg/L，分别添加不同浓度的甘氨酸，浓度分别设定为0,7,13,27,80，107mM在37℃，转速220rpm的条件下培养12-24h；发酵结束后分别检测对应菌株的OD₆₀₀和绿色荧光强度，并计算相对荧光强度。

实验结果：通过本实验的双筛选系统，成功筛选到性能提升和构象转变的甘氨酸核糖开关突变体BSglyON14和BSglyOFF6。带有BSglyON14的菌株MG1655-BS-ON14绿色荧光蛋白相对强度随着甘氨酸浓度的增加而不断增加，当甘氨酸浓度为107mM时，其绿色荧光蛋白相对强度为615.23，相比于野生型甘氨酸核糖开关提高约50％；MG1655-BS-ON14的甘氨酸响应范围由野生型的0-80mM提高到0-107mM。而构象改变的甘氨酸核糖开关突变体BSglyOFF6与野生型相反，当不添加甘氨酸时，绿色荧光蛋白相对强度为631.34，而当添加107mM甘氨酸时，其绿色荧光蛋白相对强度为50，大约有10倍的抑制作用。由此可知：成功通过从文库高通量筛选出性能提升，甘氨酸响应范围增加和振幅值增加的甘氨酸-ON的突变体BSglyON14和构象改变的甘氨酸核糖开关突变体BSglyOFF6，如图2所示。以上的突变体不仅提升了当前甘氨酸核糖开关的性能，也丰富了核糖开关的数量。这些性能优越的突变体构建的基因线路以甘氨酸为诱导剂的调控表达方法避免了过表达基因带来的菌株生长或辅因子不平衡以及使用高价诱导剂增加成本问题。此外，本领域的技术人员可以使用本发明中性能提升的甘氨酸核糖开关突变体BSglyON14及其他类似功能的突变体，用于以廉价的甘氨酸为诱导剂的微生物细胞工厂构建或代谢表达调控的案例中；本领域的技术人员可以使用本发明中构象转变的甘氨酸核糖开关突变体BSglyOFF6及其他类似功能的突变体，用于微生物细胞构建，例如丝氨酸合成细胞工厂的构建，5-氨基乙酰丙酸细胞工厂的构建，酶的定向进化等方面。

本发明公开和提出的技术方案，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。本发明未尽事宜属于公知技术。

序列表

<110> 天津大学

<120> 甘氨酸核糖开关基因调控线路的构建方法及应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1179

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcttctc acaaactgct ggttaccccg ccgaaagctc tgctgaaacc gctgtctatc 60

ccgaaccagc tgctgctggg tccgggtccg tctaacctgc cgccgcgtat catggctgct 120

ggtggtctgc aaatgatcgg ttctatgtct aaagacatgt accagatcat ggacgaaatc 180

aaagaaggta tccagtacgt tttccagacc cgtaacccgc tgaccctggt tatctctggt 240

tctggtcact gcgctctgga agctgctctg gttaacgttc tggaaccggg tgactctttc 300

ctggttggtg ctaacggtat ctggggtcag cgtgctgttg acatcggtga acgtatcggt 360

gctcgtgttc acccgatgac caaagacccg ggtggtcact acaccctgca agaagttgaa 420

gaaggtctgg ctcagcacaa accggttctg ctgttcctga cccacggtga atcttctacc 480

ggtgttctgc aaccactgga cggcttcggt gaactgtgcc accgttacaa atgcctgctg 540

ctggttgact ctgttgcttc tctgggtggt accccgctgt acatggaccg tcagggtatc 600

gacatcctgt actctggttc tcagaaagct ctgaacgctc cgccgggtac ctctctgatc 660

tctttctctg acaaagctaa aaaaaaaatg tactctcgta aaaccaaacc gttctctttc 720

tacctggaca tcaaatggct ggctaacttc tggggttgcg acgaccagcc gcgtatgtac 780

caccacacca tcccggttat ctctctgtac tctctgcgtg aatctctggc tctgatcgct 840

gaacagggtc tggaaaactc ttggcgtcag caccgtgaag ctgctgctta cctgcacggt 900

cgtctgcaag ctctgggtct gcaactgttc gttaaagacc cggctctgcg tctgccgacc 960

gttaccaccg ttgctgttcc ggctggttat gactggcgtg acatcgtgag ctacgttatc 1020

gaccacttcg acatcgaaat catgggtggt ctgggtccgt ctaccggtaa agttctgcgt 1080

atcggtctgc tgggttgcaa cgctacccgt gaaaacgttg accgtgttac cgaagctctg 1140

cgtgctgctc tgcaacactg cccgaaaaaa aaactgtaa 1179

<210> 2

<211> 392

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ser His Lys Leu Leu Val Thr Pro Pro Lys Ala Leu Leu Lys

1 5 10 15

Pro Leu Ser Ile Pro Asn Gln Leu Leu Leu Gly Pro Gly Pro Ser Asn

20 25 30

Leu Pro Pro Arg Ile Met Ala Ala Gly Gly Leu Gln Met Ile Gly Ser

35 40 45

Met Ser Lys Asp Met Tyr Gln Ile Met Asp Glu Ile Lys Glu Gly Ile

50 55 60

Gln Tyr Val Phe Gln Thr Arg Asn Pro Leu Thr Leu Val Ile Ser Gly

65 70 75 80

Ser Gly His Cys Ala Leu Glu Ala Ala Leu Val Asn Val Leu Glu Pro

85 90 95

Gly Asp Ser Phe Leu Val Gly Ala Asn Gly Ile Trp Gly Gln Arg Ala

100 105 110

Val Asp Ile Gly Glu Arg Ile Gly Ala Arg Val His Pro Met Thr Lys

115 120 125

Asp Pro Gly Gly His Tyr Thr Leu Gln Glu Val Glu Glu Gly Leu Ala

130 135 140

Gln His Lys Pro Val Leu Leu Phe Leu Thr His Gly Glu Ser Ser Thr

145 150 155 160

Gly Val Leu Gln Pro Leu Asp Gly Phe Gly Glu Leu Cys His Arg Tyr

165 170 175

Lys Cys Leu Leu Leu Val Asp Ser Val Ala Ser Leu Gly Gly Thr Pro

180 185 190

Leu Tyr Met Asp Arg Gln Gly Ile Asp Ile Leu Tyr Ser Gly Ser Gln

195 200 205

Lys Ala Leu Asn Ala Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ile Ser Phe Ser Asp

210 215 220

Lys Ala Lys Lys Lys Met Tyr Ser Arg Lys Thr Lys Pro Phe Ser Phe

225 230 235 240

Tyr Leu Asp Ile Lys Trp Leu Ala Asn Phe Trp Gly Cys Asp Asp Gln

245 250 255

Pro Arg Met Tyr His His Thr Ile Pro Val Ile Ser Leu Tyr Ser Leu

260 265 270

Arg Glu Ser Leu Ala Leu Ile Ala Glu Gln Gly Leu Glu Asn Ser Trp

275 280 285

Arg Gln His Arg Glu Ala Ala Ala Tyr Leu His Gly Arg Leu Gln Ala

290 295 300

Leu Gly Leu Gln Leu Phe Val Lys Asp Pro Ala Leu Arg Leu Pro Thr

305 310 315 320

Val Thr Thr Val Ala Val Pro Ala Gly Tyr Asp Trp Arg Asp Ile Val

325 330 335

Ser Tyr Val Ile Asp His Phe Asp Ile Glu Ile Met Gly Gly Leu Gly

340 345 350

Pro Ser Thr Gly Lys Val Leu Arg Ile Gly Leu Leu Gly Cys Asn Ala

355 360 365

Thr Arg Glu Asn Val Asp Arg Val Thr Glu Ala Leu Arg Ala Ala Leu

370 375 380

Gln His Cys Pro Lys Lys Lys Leu

385 390

<210> 3

<211> 1179

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcttctc acaaactgct ggttaccccg ccgaaagctc tgctgaaacc gctgtctacc 60

ccgaaccagc tgctgctggg tccgggtccg tctaacctgc cgccgcgtat catggctgct 120

ggtggtctgc aaatgatcgg ttctatgtct aaagacatgt accagatcat ggacgaaatc 180

aaagaaggta tccagtacgt tttccagacc cgtaacccgc tgaccctggt tatctctggt 240

tctggtcact gtgctctgga agctgctctg gttaacgttc tggaaccggg tgactctttc 300

ctggttggtg ctaacggtat ctggggtcag cgtgctgttg acatcggtga acgtatcggt 360

gctcgtgttc gcccgatgac caaagacccg ggtggtcact acaccctgca agaagttgaa 420

gaaagtctgg ctcagcacaa accggttctg ctgttcctga cccacggtga atcttctacc 480

ggtgttctgc aaccactgga cggcttcggt gaactgtgcc accgttacaa atgcctgctg 540

ctggttgact ctgttgcttc tctgggtggt accccgctgt acatgtaccg tcagggtatc 600

ggcatcctgt actctggttc acagaaagct ctgaacgctc cgccgggtac ttctctgatc 660

tctttctctg acaaagctaa aaaaaaaatg tgctctcgta aaaccaaacc gttctctttc 720

tacctggaca tcaaatggct ggctaacttc tggggttgcg acgacctgcc gcgtatgtac 780

caccacacca tcccggttat ctctctgtac tctctgcgtg aatctctggc tctgatcgct 840

gaacagggtc tggaaaactc ttggcgtcag caccgtgagg ctgctgctta cctgcacggt 900

cgtctgcaag ctctgggtct gcaactgttc gttaaagacc cggctctgcg tctgccgacc 960

gttaccaccg ttgctgttcc ggctggttat gactggcgtg acatcgtgag ctacgttatc 1020

ggccacttcg acatcgaaat catgggtggt ctgggtccgt ctaccggtaa agttctgtgt 1080

atcggtctgc tgggttgcaa cgctacccgt gaaaacgttg accgtgttac cgaagctctg 1140

cgtgctgctc tgcaacactg cccgaaaaaa gaactgtaa 1179

<210> 4

<211> 392

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Ser His Lys Leu Leu Val Thr Pro Pro Lys Ala Leu Leu Lys

1 5 10 15

Pro Leu Ser Thr Pro Asn Gln Leu Leu Leu Gly Pro Gly Pro Ser Asn

20 25 30

Leu Pro Pro Arg Ile Met Ala Ala Gly Gly Leu Gln Met Ile Gly Ser

35 40 45

Met Ser Lys Asp Met Tyr Gln Ile Met Asp Glu Ile Lys Glu Gly Ile

50 55 60

Gln Tyr Val Phe Gln Thr Arg Asn Pro Leu Thr Leu Val Ile Ser Gly

65 70 75 80

Ser Gly His Cys Ala Leu Glu Ala Ala Leu Val Asn Val Leu Glu Pro

85 90 95

Gly Asp Ser Phe Leu Val Gly Ala Asn Gly Ile Trp Gly Gln Arg Ala

100 105 110

Val Asp Ile Gly Glu Arg Ile Gly Ala Arg Val Arg Pro Met Thr Lys

115 120 125

Asp Pro Gly Gly His Tyr Thr Leu Gln Glu Val Glu Glu Ser Leu Ala

130 135 140

Gln His Lys Pro Val Leu Leu Phe Leu Thr His Gly Glu Ser Ser Thr

145 150 155 160

Gly Val Leu Gln Pro Leu Asp Gly Phe Gly Glu Leu Cys His Arg Tyr

165 170 175

Lys Cys Leu Leu Leu Val Asp Ser Val Ala Ser Leu Gly Gly Thr Pro

180 185 190

Leu Tyr Met Tyr Arg Gln Gly Ile Gly Ile Leu Tyr Ser Gly Ser Gln

195 200 205

Lys Ala Leu Asn Ala Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ile Ser Phe Ser Asp

210 215 220

Lys Ala Lys Lys Lys Met Cys Ser Arg Lys Thr Lys Pro Phe Ser Phe

225 230 235 240

Tyr Leu Asp Ile Lys Trp Leu Ala Asn Phe Trp Gly Cys Asp Asp Leu

245 250 255

Pro Arg Met Tyr His His Thr Ile Pro Val Ile Ser Leu Tyr Ser Leu

260 265 270

Arg Glu Ser Leu Ala Leu Ile Ala Glu Gln Gly Leu Glu Asn Ser Trp

275 280 285

Arg Gln His Arg Glu Ala Ala Ala Tyr Leu His Gly Arg Leu Gln Ala

290 295 300

Leu Gly Leu Gln Leu Phe Val Lys Asp Pro Ala Leu Arg Leu Pro Thr

305 310 315 320

Val Thr Thr Val Ala Val Pro Ala Gly Tyr Asp Trp Arg Asp Ile Val

325 330 335

Ser Tyr Val Ile Gly His Phe Asp Ile Glu Ile Met Gly Gly Leu Gly

340 345 350

Pro Ser Thr Gly Lys Val Leu Cys Ile Gly Leu Leu Gly Cys Asn Ala

355 360 365

Thr Arg Glu Asn Val Asp Arg Val Thr Glu Ala Leu Arg Ala Ala Leu

370 375 380

Gln His Cys Pro Lys Lys Glu Leu

385 390

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtaacgccag ggttttccca gtcacttaca gttttttttt cgggcagtg 49

<210> 6

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtataatgct agcacgaata ctagagaaag aggagaaata ctagatggct tctcacaaac 60

tgctggtta 69

<210> 7

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctcctctttc tctagtattc gtgctagcat tatacctagg actgagctag ctgtcaaaag 60

cttggctgtt ttggcgg 77

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gactgggaaa accctggcgt tacccaacgc atgcctgcag gtcgactc 48

<210> 9

<211> 4915

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc 60

ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc 120

gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 180

tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggtca cacagaattc 240

gagctcggta cccggggatc ctctagagtc gacctgcagg catgcgttgg gtaacgccag 300

ggttttccca gtcacttaca gttctttttt cgggcagtgt tgcagagcag cacgcagagc 360

ttcggtaaca cggtcaacgt tttcacgggt agcgttgcaa cccagcagac cgatacacag 420

aactttaccg gtagacggac ccagaccacc catgatttcg atgtcgaagt ggccgataac 480

gtagctcacg atgtcacgcc agtcataacc agccggaaca gcaacggtgg taacggtcgg 540

cagacgcaga gccgggtctt taacgaacag ttgcagaccc agagcttgca gacgaccgtg 600

caggtaagca gcagcctcac ggtgctgacg ccaagagttt tccagaccct gttcagcgat 660

cagagccaga gattcacgca gagagtacag agagataacc gggatggtgt ggtggtacat 720

acgcggcagg tcgtcgcaac cccagaagtt agccagccat ttgatgtcca ggtagaaaga 780

gaacggtttg gttttacgag agcacatttt ttttttagct ttgtcagaga aagagatcag 840

agaagtaccc ggcggagcgt tcagagcttt ctgtgaacca gagtacagga tgccgatacc 900

ctgacggtac atgtacagcg gggtaccacc cagagaagca acagagtcaa ccagcagcag 960

gcatttgtaa cggtggcaca gttcaccgaa gccgtccagt ggttgcagaa caccggtaga 1020

agattcaccg tgggtcagga acagcagaac cggtttgtgc tgagccagac tttcttcaac 1080

ttcttgcagg gtgtagtgac cacccgggtc tttggtcatc gggcgaacac gagcaccgat 1140

acgttcaccg atgtcaacag cacgctgacc ccagataccg ttagcaccaa ccaggaaaga 1200

gtcacccggt tccagaacgt taaccagagc agcttccaga gcacagtgac cagaaccaga 1260

gataaccagg gtcagcgggt tacgggtctg gaaaacgtac tggatacctt ctttgatttc 1320

gtccatgatc tggtacatgt ctttagacat agaaccgatc atttgcagac caccagcagc 1380

catgatacgc ggcggcaggt tagacggacc cggacccagc agcagctggt tcggggtaga 1440

cagcggtttc agcagagctt tcggcggggt aaccagcagt ttgtgagaag ccatctagta 1500

tttctcctct ttctctagta ttcgtgctag cattatacct aggactgagc tagctgtcaa 1560

aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa 1620

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gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc 1740

catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg 1800

ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc 1860

gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc 1920

ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt 1980

tctacaaact ctttttgttt atttttctaa atacatgtga cggaagatca cttcgcagaa 2040

taaataaatc ctggtgtccc tgttgatacc gggaagccct gggccaactt ttggcgaaaa 2100

tgagacgttg atcggcacgt aagaggttcc aactttcacc ataatgaaat aagatcacta 2160

ccgggcgtat tttttgagtt atcgagattt tcaggagcta aggaagctaa aatggagaaa 2220

aaaatcactg gatataccac cgttgatata tcccaatggc atcgtaaaga acattttgag 2280

gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcagctgga tattacggcc 2340

tttttaaaga ccgtaaagaa aaataagcac aagttttatc cggcctttat tcacattctt 2400

gcccgcctga tgaatgctca tccggaattc cgtatggcaa tgaaagacgg tgagctggtg 2460

atatgggata gtgttcaccc ttgttacacc gttttccatg agcaaactga aacgttttca 2520

tcgctctgga gtgaatacca cgacgatttc cggcagtttc tacacatata ttcgcaagat 2580

gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat ttccctaaag ggtttattga gaatatgttt 2640

ttcgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc accagttttg atttaaacgt ggccaatatg 2700

gacaacttct tcgcccccgt tttcaccatg ggcaaatatt atacgcaagg cgacaaggtg 2760

ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat gccgtctgtg atggcttcca tgtcggcaga 2820

atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat gagtggcagg gcggggcgta atttttttaa 2880

ggcagttatt ggtgccctta aacgcctggt gctacgcctg aataagtgat aataagcgga 2940

tgaatggcag aaattcgaaa gcaaattcga cccggtcgtc ggttcagggc agggtcgtta 3000

aatagccgct tatgtctatt gctggttcta agcctgttga tgataccgct gccttactgg 3060

gtgcattagc cagtctgaat gacctgtcac gggataatcc gaagtggtca gactggaaaa 3120

tcagagggca ggaactgctg aacagcaaaa agtcagatag caccacatag cagacccgcc 3180

ataaaacgcc ctgagaagcc cgtgacgggc ttttcttgta ttatgggtag tttccttgca 3240

tgaatccata aaaggcgcct gtagtgccat ttacccccat tcactgccag agccgtgagc 3300

gcagcgaact gaatgtcacg aaaaagacag cgactcaggt gcctgatggt cggagacaaa 3360

aggaatattc agcgatttgc ccgagcttgc gagggtgcta cttaagcctt tagggtttta 3420

aggtctgttt tgtagaggag caaacagcgt ttgcgacatc cttttgtaat actgcggaac 3480

tgactaaagt agtgagttat acacagggct gggatctatt ctttttatct ttttttattc 3540

tttctttatt ctataaatta taaccacttg aatataaaca aaaaaaacac acaaaggtct 3600

agcggaattt acagagggtc tagcagaatt tacaagtttt ccagcaaagg tctagcagaa 3660

tttacagata cccacaactc aaaggaaaag gactagtaat tatcattgac tagcccatct 3720

caattggtat agtgattaaa atcacctaga ccaattgaga tgtatgtctg aattagttgt 3780

tttcaaagca aatgaactag cgattagtcg ctatgactta acggagcatg aaaccaagct 3840

aattttatgc tgtgtggcac tactcaaccc cacgattgaa aaccctacaa ggaaagaacg 3900

gacggtatcg ttcacttata accaatacgc tcagatgatg aacatcagta gggaaaatgc 3960

ttatggtgta ttagctaaag caaccagaga gctgatgacg agaactgtgg aaatcaggaa 4020

tcctttggtt aaaggctttg agattttcca gtggacaaac tatgccaagt tctcaagcga 4080

aaaattagaa ttagttttta gtgaagagat attgccttat cttttccagt taaaaaaatt 4140

cataaaatat aatctggaac atgttaagtc ttttgaaaac aaatactcta tgaggattta 4200

tgagtggtta ttaaaagaac taacacaaaa gaaaactcac aaggcaaata tagagattag 4260

ccttgatgaa tttaagttca tgttaatgct tgaaaataac taccatgagt ttaaaaggct 4320

taaccaatgg gttttgaaac caataagtaa agatttaaac acttacagca atatgaaatt 4380

ggtggttgat aagcgaggcc gcccgactga tacgttgatt ttccaagttg aactagatag 4440

acaaatggat ctcgtaaccg aacttgagaa caaccagata aaaatgaatg gtgacaaaat 4500

accaacaacc attacatcag attcctacct acataacgga ctaagaaaaa cactacacga 4560

tgctttaact gcaaaaattc agctcaccag ttttgaggca aaatttttga gtgacatgca 4620

aagtaagtat gatctcaatg gttcgttctc atggctcacg caaaaacaac gaaccacact 4680

agagaacata ctggctaaat acggaaggat ctgaggttct tatggctctt gtatctatca 4740

gtgaagcatc aagactaaca aacaaaagta gaacaactgt tcaccgttac atatcaaagg 4800

gaaaactgtc catatgcaca gatgaaaacg gtgtaaaaaa gatagataca tcagagcttt 4860

tacgagtttt tggtgcattc aaagctgttc accatgaaca gatcgacaat gtaac 4915

<210> 10

<211> 5363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtttatctc tggcggtgtt 300

gacaagagat aacaacgttg atataattga gcccgtattg ttagcatgta cgtttaaacc 360

aggaaacagc tatgaaaacc cgtacacaac aaattgaaga attacagaaa gagtggactc 420

aaccgcgttg ggaaggcatt actcgcccat acagtgcgga agatgtggtg aaattacgcg 480

gttcagtcaa tcctgaatgc acgctggcgc aactgggcgc agcgaaaatg tggcgtctgc 540

tgcacggtga gtcgaaaaaa ggctacatca acagcctcgg cgcactgact ggcggtcagg 600

cgctgcaaca ggcgaaagcg ggtattgaag cagtctatct gtcgggatgg caggtagcgg 660

cggacgctaa cctggcggcc agcatgtatc cggatcagtc gctctatccg gcaaactcgg 720

tgccagctgt ggtggagcgg atcaacaaca ccttccgtcg tgccgatcag atccaatggt 780

ccgcgggcat tgagccgggc gatccgcgct atgtcgatta cttcctgccg atcgttgccg 840

atgcggaagc cggttttggc ggtgtcctga atgcctttga actgatgaaa gcgatgattg 900

aagccggtgc agcggcagtt cacttcgaag atcagctggc gtcagtgaag aaatgcggtc 960

acatgggcgg caaagtttta gtgccaactc aggaagctat tcagaaactg gtcgcggcgc 1020

gtctggcagc tgacgtgacg ggcgttccaa ccctgctggt tgcccgtacc gatgctgatg 1080

cggcggatct gatcacctcc gattgcgacc cgtatgacag cgaatttatt accggcgagc 1140

gtaccagtga aggcttcttc cgtactcatg cgggcattga gcaagcgatc agccgtggcc 1200

tggcgtatgc gccatatgct gacctggtct ggtgtgaaac ctccacgccg gatctggaac 1260

tggcgcgtcg ctttgcacaa gctatccacg cgaaatatcc gggcaaactg ctggcttata 1320

actgctcgcc gtcgttcaac tggcagaaaa acctcgacga caaaactatt gccagcttcc 1380

agcagcagct gtcggatatg ggctacaagt tccagttcat caccctggca ggtatccaca 1440

gcatgtggtt caacatgttt gacctggcaa acgcctatgc ccagggcgag ggtatgaagc 1500

actacgttga gaaagtgcag cagccggaat ttgccgccgc gaaagatggc tataccttcg 1560

tatctcacca gcaggaagtg ggtacaggtt acttcgataa agtgacgact attattcagg 1620

gcggcacgtc ttcagtcacc gcgctgaccg gctccactga agaatcgcag ttctaagcct 1680

cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 1740

cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag cttttatctc 1800

tggcggtgtt gacaagagat aacaacgttg atataattga gccactggct cgtaatttat 1860

tgtttaaacc aggaaacagc tatgaactac gaagcctact tccgtcgcca gctggatggt 1920

ctgcatcgcg aaggccgcta ccgtgtgttc gccgatctgg aacgtcatgc cggttccttc 1980

ccacgcgcaa cccatcaccg tccagagggt gccggcgacg tcaccgtctg gtgctccaac 2040

gattatctgg gtatgggtca gcatccagca gtgctgaccg ccatgcacga agcactggat 2100

tcttgcggcg ccggtgccgg tggcactcgt aacattgccg gcaccaacca ctaccacgtg 2160

ctgctggagc aagaactcgc agcactgcac ggcaaggaat ccgcactcct cttcacctcc 2220

ggctatgtct ccaactgggc ctctctgtcc actctggcat cccgcatgcc gggctgcgtg 2280

atcctctccg acgaactgaa tcacgcctcc atgatcgaag gcatccgtca ctcccgctct 2340

gaaacccgca tctttgccca caacgatcct cgcgatctgg aacgtaagct cgcagatctg 2400

gatcctcacg ccccaaagct ggtcgcattc gagtccgtgt actccatgga cggcgatatc 2460

gccccaatcg cagaaatctg cgacgtggcc gatgcacaca acgccatgac ctatctggat 2520

gaggtccacg gtgtcggcct ctacggtcca aacggcggtg gtatcgccga tcgcgaaggc 2580

atttcccacc gtctgaccat catcgaaggc actctggcca aggcattcgg tgtggtcggt 2640

ggctacattg ccggctcttc cgccgtgtgc gacttcgtgc gctcctttgc ctccggcttt 2700

atcttctcta cctctcctcc accagccgtg gcagccggcg cactggcctc tatccgtcat 2760

ctccgcgcat cctctgccga gcgcgaacgt catcaagatc gcgtcgcacg tctgcgcgca 2820

cgtctggatc aagccggcgt ggcacacatg ccaaacccat ctcacatcgt gccagtgatg 2880

gtcggtgacg cagccctctg caaacagatc tctgacgagc tcatctcccg ctatggcatc 2940

tacgtgcagc ctatcaacta tccaaccgtg ccacgcggca ccgagcgtct ccgtatcact 3000

ccatccccac aacacaccga cgccgatatc gaacacctcg tgcaagcact gtccgaaatc 3060

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ggtatcgttc acttataacc aatacgctca gatgatgaac atcagtaggg aaaatgctta 2460

tggtgtatta gctaaagcaa ccagagagct gatgacgaga actgtggaaa tcaggaatcc 2520

tttggttaaa ggctttgaga ttttccagtg gacaaactat gccaagttct caagcgaaaa 2580

attagaatta gtttttagtg aagagatatt gccttatctt ttccagttaa aaaaattcat 2640

aaaatataat ctggaacatg ttaagtcttt tgaaaacaaa tactctatga ggatttatga 2700

gtggttatta aaagaactaa cacaaaagaa aactcacaag gcaaatatag agattagcct 2760

tgatgaattt aagttcatgt taatgcttga aaataactac catgagttta aaaggcttaa 2820

ccaatgggtt ttgaaaccaa taagtaaaga tttaaacact tacagcaata tgaaattggt 2880

ggttgataag cgaggccgcc cgactgatac gttgattttc caagttgaac tagatagaca 2940

aatggatctc gtaaccgaac ttgagaacaa ccagataaaa atgaatggtg acaaaatacc 3000

aacaaccatt acatcagatt cctacctaca taacggacta agaaaaacac tacacgatgc 3060

tttaactgca aaaattcagc tcaccagttt tgaggcaaaa tttttgagtg acatgcaaag 3120

taagtatgat ctcaatggtt cgttctcatg gctcacgcaa aaacaacgaa ccacactaga 3180

gaacatactg gctaaatacg gaaggatctg aggttcttat ggctcttgta tctatcagtg 3240

aagcatcaag actaacaaac aaaagtagaa caactgttca ccgttacata tcaaagggaa 3300

aactgtccat atgcacagat gaaaacggtg taaaaaagat agatacatca gagcttttac 3360

gagtttttgg tgcattcaaa gctgttcacc atgaacagat cgacaatgta acgtttgaca 3420

gcttatcatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 3480

tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 3540

gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 3600

gctgttgaca attaatcatc cggctcgtat aatgtgtggt cacacagaat tcgagctcgg 3660

tacccgggga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcgtt gggtaacgcc agggttttcc 3720

cagtc 3725

Claims

1.甘氨酸核糖开关基因调控线路的构建方法，其特征是，通过在野生型的甘氨酸核糖开关元件序列上进行突变，从文库高通量筛选出性能提升，甘氨酸响应范围增加和振幅值增加的甘氨酸-ON的突变体和构象改变的甘氨酸-OFF的突变体，从而实现基因的表达调控。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征是，源于枯草芽孢杆菌，核酸序列如SEQ IDNO:4所示；具有与SEQ ID NO:4等同的基因表达调控功能，经过筛选得到的突变体BSglyON3、BSglyON4、BSglyON9、BSglyON10、BSglyON13、BSglyON14表现为甘氨酸响应范围和振幅值增加；突变体BSglyOFF5、BSglyOFF6、BSglyOFF8、BSglyOFF11、BSglyOFF12、BSglyOFF35表现为野生型甘氨酸-ON构象突变为甘氨酸-OFF构象；以上突变体的详细突变位点如下表1：

表1中突变位点信息栏的数字代表突变位点，横杠前的字母表示突变前的核苷酸，横杠后的字母表示突变后的核苷酸。

3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征是，包括如下步骤：

1)：以SEQ ID No.1所示BSGlyRS-F和以SEQ ID No.2所示BSGlyRS-R为引物，以SEQ IDNo.3所示pUC-BSGlyRS为模板，通过PCR的方法，得到以SEQ ID No.4所示BSGlyRS片段；

2)：以SEQ ID No.5所示tetA-F和以SEQ ID No.6所示tetA-R为引物，以SEQ ID No.7所示pUC-TETA为模板，通过PCR的方法，得到以SEQ ID No.8所示tetA片段；

3)：以SEQ ID No.9所示GFP-F和以SEQ ID No.10所示GFP-R为引物，以SEQ ID No.11所示pUC-GFP为模板，通过PCR的方法，得到以SEQ ID No.12所示GFP片段；

4)：以SEQ ID No.13所示pUC18-F和以SEQ ID No.14所示pUC18-R为引物，以SEQ IDNo.15所示pUC18为模板，通过PCR扩增，得到pUC18质粒骨架；通过CEPC组装技术，将与上述步骤1)获得的BSGlyRS、骤2)获得的tetA和骤3)获得的GFP片段连接到pUC18质粒骨架上面，得到质粒命名为pUC18-BSTG，以SEQ ID No.16所示；

5)：以SEQ ID No.17所示BSGT-mutF和以SEQ ID No.18所示BSGT-mutF为引物，以SEQID No.16所示pUC18-BSTG为模板，通过PCR扩增，得到BSGlyRS片段文库；

6)：以SEQ ID No.19所示18-mutF和以SEQ ID No.20所示18-mutF为引物，以SEQ IDNo.16所示pUC18-BSTG为模板，，得到文库质粒载体片段pUC18-STG；获得两者片段构建为甘氨酸核糖开关质粒文库pUC18-BSTGlib，以SEQ ID No.21所示；

7)：将步骤6)中质粒文库转化到大肠杆菌MG1655中，得到转化子收集于2-4mL无菌水中；一半体积的转化子接种于M9培养基中，并补加质量比10-12％镍离子过夜培养；然后转接到新鲜M9培养基中，补加质量比0.4-0.8％的甘氨酸以选择甘氨酸-ON核糖开关，随后在80-100μg/mL氨苄青霉素，质量比0.4-0.8％甘氨酸和10-20μg/mL四环素的新鲜M9培养基中培养进一步富集甘氨酸-ON核糖开关；通过流式荧光细胞分选仪器对具有最高绿色荧光的克隆进行分选；

8)：另一半体积的转化子接种于新鲜M9培养基中，补加与步骤7)相同浓度的氨苄青霉素、镍离子和甘氨酸以除去甘氨酸-ON核糖开关，然后在补有80-100μg/mL氨苄青霉素但没有甘氨酸的M9培养基中过夜培养，然后转接至在补有80-100μg/mL氨苄青霉素和10-20μg/m四环素的M9培养基中，以富集甘氨酸-OFF核糖开光；同样，通过荧光细胞流式分选仪器对具有最高绿色荧光的克隆进行分选；

9)：将步骤7)和步骤8)中的菌株分别在新鲜M9固体培养基上培养12-24h，随机挑选单菌落至96深孔板中进行初步筛选；每个单菌落分别接种于添加质量比0.4-0.8％甘氨酸和不添加甘氨酸的深孔板中，37℃培养12-24h，然后分别检测在两种条件下的荧光强度和细胞生长量(OD₆₀₀)；经96深孔板筛选后，得到甘氨酸-ON和-OFF核糖开关振幅比值最大的菌株MG1655-BS-ON14和MG1655-BS-OFF6。

4.权利要求1或权利要求2得到的感应范围增加的甘氨酸-ON突变体和构象改变的甘氨酸-OFF突变体应用于大肠杆菌胞内基因表达调控。