CZ290141B6

CZ290141B6 - Suąené hydrogelové kultivační médium pro mikroby, způsob jeho přípravy, testovací mikrobiologická souprava a pouľití

Info

Publication number: CZ290141B6
Application number: CZ19992470A
Authority: CZ
Inventors: Marita Jussila; Helena Tuompo; Leena Scheinin
Original assignee: Orion-Yhtyma Oyj
Priority date: 1997-01-15
Filing date: 1998-01-14
Publication date: 2002-06-12
Also published as: PL334519A1; JP2001507941A; WO1998031785A1; FI111011B; AU722087B2; HUP0000868A2; FI970163A0; NO993297D0; FI970163A; CZ247099A3; US6258586B1; AU5663998A; NO993297L; HUP0000868A3; EP0970188A1

Abstract

Su en kultiva n m dia pro p stov n mikrob , zalo en na kovalentn m ses ov n ter celul zy, jsou citliv j ne b n pou van m dia a lze je pou t pro kultivaci bakteri , kvasinek a hub. Mohou se uplatnit p°i kontrole mikrobi ln ho zne ist n v potravin °stv a jin²ch pr myslov²ch provozech, v l ka°stv a v oblasti hygieny.\

Description

Oblast techniky

Předmětem předkládaného vynálezu je kultivační médium pro mikroorganizmy ve formě, která je připravena k použití, obsahující živiny a hydrogel, který je založen na éterech celulózy. Kultivační médium může být sušeno na pevné podložce, uchováváno suché a navlhčeno v případě použití buď přímo testovaným vzorkem, nebo vodou. Zařízení s kultivačním médium může být ponořeno do roztoku testovaného vzorku, nebo může být přitlačeno na vlhký povrch testovaného vzorku a potom je médium inkubováno při vhodné teplotě, až mikroorganizmy vytvoří okem rozeznatelné kolonie.

Dosavadní stav techniky

Určení množství a druhů mikroorganizmů, které způsobují infekce a kontaminaci je důležité, když se má vybrat vhodný způsob léčení nebo vhodná ochranná metoda v potravinářském průmyslu či jinde v oblasti hygieny prostředí. Za tímto účelem bylo pro detekování rozličných bakterií a hub bylo vyvinuto několik kultivačních médií a zařízení s kultivačními médii.

V oblasti mikrobiologie, která provádí diagnosu nemoci, je cílem vyhledat a určit mikroorganizmy, které způsobují infekce, tj. bakterie (aerobní i anaerobní) a houby (kvasinky a plísně) tak přesně, jak je to jen možné, u různých vzorků lidského i živočišného původu (např. moč, krev, sérum, plazma, mozkomíšní mok, pleurální mok, hnis, výtok z ran, výměšky z dýchacího ústrojí, stolice či vzorky z hltanu) tak, aby bylo možno vybrat účinný způsob léčení. Často má být také určena citlivost mikrobů k různým antimikrobiálním lékům. Pro tento účel jsou používána různá kultivační média a zařízení s kultivačními médii.

Mikroorganizmy způsobují také problémy v několika různých průmyslových odvětvích. Jestliže dojde k jejich nahromadění ve výrobních procesech, mohou vyvolat zdravotní rizika a problémy s kontaminací, které se stávají obtížně zvládnutelné. Obvykle mikroby úspěšně odolávají čištění uvnitř tak zvané vrstvy biologického filmu, složeného z pevného materiálu buněk mikrobů a roztoků, pocházejících z výrobních procesů. Tato vrstva jim poskytuje ochranu proti účinku dezinfekčních a antiseptických činidel, rovněž proti účinku antibiotik a mikroby mohou uvnitř ní přežívat dokonce po dlouhou dobu.

Některé výrobní postupy vyžadují vysokou úroveň hygieny, protože i slabý nárůst mikroorganizmů může celý produkt zcela zničit. Nedostatečná hygiena působí problémy zvláště v potravinářském průmyslu, zdravotní péči, lékařském ošetření a vodních systémech. Ostatní druhy problémů, jako je vytváření slizu, způsobené bakteriemi v nádobách a průmyslových soustavách trubek, se mohou vyskytnout zvláště při zpracování dřeva, a plísně se mohou objevit kdekoli ve ventilačních rourách. Bylo zjištěno, že mikroby přispívají v průmyslu také k jiným problémům, jako je např. vznik koroze. Mikroby a jimi způsobované problémy se vyskytují také jinde, jako na dlaždičkách v koupelnách, lavicích v saunách a v bazénech. V nemocnicích mohou patogenní mikroby např. vytvářet kolonie ve ventilačním systému a tak způsobovat nemocniční infekce. Proto se ve většině zařízení, kde se sleduje úroveň hygieny, provádí průběžná hygienická kontrola spojená s určováním množství mikrobů.

Klasické metody kultivování mikroorganizmů jsou založeny na kultivačních médiích, kde gelovou složkou je agar, izolovaný z řas. Kultivační média se musejí buď pracně připravovat ze suchého prášku, nebo koupit ve formě, připravené k použití. Komerčně dostupné formy kultivačních médií, připravené k použití jsou vyráběny ve vlhké podobě. Skladovací doba vlastnoručně připravených anebo průmyslových, vlhkých kultivačních médií, obsahujících agar, je omezená,

-1CZ 290141 B6 neboť snadno vysychají a nemohou být opět navlhčeny. Aby se udržela vlhkost a sterilita tak dlouho, jak je to jen možné, musí být tento druh médií uchováván ve velmi dobře těsnicích obalech, které vyžadují mnoho prostoru.

V kultivačním médiu podle US patentu 3 046 201 obsahuje gelová složka, použitá namísto agaru, zesíťované polyakrylamidové hydrogely nebo směsi polyakrylamidu a želatiny, silikagel nebo škrob. Gel není vysušen a neabsorbuje roztok vzorku.

V metodě podle US patentu 3 360 440 je suchý gel připraven smíšením živin s éterem celulózy a lyofilizací této směsi. Před lyofilizací mohou být ke směsi přidány mikroorganizmy a tak je získána konzervovaná kultura, připravená k použití. Suchý gel je před použitím pro určování mikrobů resuspendován se sterilní vodou, nebo pokud byly mikroby přidány před lyofilizací, tak před jejich růstem. V průběhu pokusů s mikroby jsou mikroby vzorku absorbovány uvnitř gelu a rostou tedy, pokud se týká jejich morfologie, odlišně ve srovnání s růstem na běžných médiích, kde k růstu dochází na povrchu gelu. To zřetelně komplikuje odečítání výsledků a tak snižuje spolehlivost výsledků. Navíc je lyofilizace složitý proces a vyžaduje poměrně nákladné vybavení.

V testovací soupravě připravené podle výše uvedeného US patentu 3 360 440 byly voda a sušený gel obsaženy v různých částech zásobníku. Po resuspendování může být gel přenesen na požadovaný podklad zatlačením na stěnu zásobníku. Testovací souprava je složitá a není připravena k rychlému použití.

V GB 1 295 337 je popsán dehydratovaný hydrogel, který je vázán na kultivační nádobu pomocí radiace, a který obsahuje např. zesíťovaný polyethylenoxid, polyvinylpyrolidon a polyvinylalkohol. Živiny jsou do gelu přidány bezprostředně po jeho přípravě nebo těsně před použitím.

Vedle těchto popsaných postupů jsou známy metody, kde jsou živiny a gel absorbovány na absorpční membránu, kterou může být např. filtrační papír nebo jiná rovnocenná, absorpční podpůrná vrstva. Gel může být také nanesen na povrchu membrány, nebo je gel nahrazen membránou, která je nepropustná pro bakterie. U těchto metod absorpční membrány udržuje uvnitř sebe vlhkost potřebnou pro růst. Postupy podobné těmto jsou popsány v patentových publikacích US 3 881 993, EP 0 374 905, US 3 814 670 a EP 0 006 192, které jsou podrobněji rozvedeny dále.

U metody podle US patentu 3 881 993 byly živiny, reagencie a gelová složka byly absorbovány absorpční vrstvou, která je zároveň podpůrnou strukturou a médium bylo vysušeno za přetlaku nebo podtlaku. Jako gelová složka byla použita inertní klovatina, lineární polysacharidy nebo alginát sodný. U metody podle EP 0 374 905 jsou gelové složky absorbovány na filtrační papír. Jako gelová složka byl použit alginát sodný. Testovací médium podle této metody se používá ve vlhkém stavu. Metoda podle US patentu 3 814 670 je podobná výše uvedeným s tím rozdílem, že vrstva gelu je nanesena na povrch absorpční membrány. Jako gelové složky se může použít agar, želatina, celulózové klovatiny, karageny, algináty, albuminy, polysacharidy nebo polypeptidy. Kultivační médium bylo vysušeno. Metoda podle EP 0 006 192 popisuje suché kultivační médium, kde podložka napuštěná kultivačním médiem je pokryta plastickou membránou, která je homopolymer vinylacetátu nebo esterů akiylové kyseliny, kopolymer vinylpropionátu a vinylacetátu, vinylpropionátu a vinylchloridu, vinylacetátu a esterů maleinové kyseliny, akrylnitrilu, esterů akrylové kyseliny a vinylpropionátu nebo butadienu a styrenu. Jako iniciační činidlo jsou použity polyethylenglykoly, polyethylenoxidy, polyvinylpyrolidon, polyvinylalkoholy, částečně saponifikované polyvinylestery, směsné polymery vinylpyrolidonu a vinylesterů nebo deriváty celulózy, jako je hydroxyalkylcelulóza.

V US patentu 5 494 823 je směs, obsahující živiny a gelovou složku, pokryta absorpční vláknitou vrstvou, v níž se roztok vzorku rozptýlí vlivem kapilární vzlínavosti. poté, co směs obsahující gelovou složku absorbuje vlhkost a vytvoří gel, vlákna absorpční vláknité vrstvy jsou v něm ponořeny a spojeny tak se směsí.

-2CZ 290141 B6

Metoda podle JP 94 172 178 popisuje nosič pro buněčnou kulturu, který se skládá ze dvou hydrogelů, přičemž druhý gel obsahuje např. mikroskopická zrnka, vlákna či houbu atd. a funguje jako podložní struktura.

Nevýhoda výše uvedených metod je v tom, že gelová složka kultivačního média potřebuje aby zůstalo tuhé, podkladové podpůrné vrstvy, což činí přípravu média obtížnou. Takové metody, v nichž je gelová složka také absorbována absorpční vrstvou, mají další nevýhodu v tom, že povrch, na němž mikrobi rostou je hrubý, a mikroby pak jeví pozorovateli zcela odlišně od těch, které rostou na povrchu agaru v případě klasických detekčních postupů.

Jsou také známa kultivační média, kde jsou jako gelové složky použity prášky rozpustné v studené vodě. Ty jsou, jako v US patentu 5 089 413, US patentu 4 565 783 a rovněž jako v publikaci WO 93/12218 přichyceny k hydrofobnímu podkladu pomocí adhesivní vrstvy. Kultivační média často dále obsahují membránu propustnou pro vzduch. Hydrofobní podklad může být přímo pokryt gelem, kdy gel je zesíťován iontovými vazbami po přidání solí do gelu. Takováto kultivační média byla použita v metodách popsaných v US patentech 5 089 412 a 4 565 783 pouze jako média pro rozočkování mikrobů. Nicméně nevýhodou je, že když je zesíťování provedeno pomocí solí, růst mikrobů je často inhibován.

V metodách podle patentů US 5 089 413 a US 4 565 783, jsou jako adhezivní činidla použity kopolymery izooktylakrylátu a akrylamidu nebo kyseliny akrylové, nebo kopolymery 2-methylbutylakrylátu a kyseliny akrylové nebo silikonová guma. Jako gelový prášek jsou používány alginin, karboxymethylcelulóza, hydroxyethylcelulóza, klovatina z guaru, klovatina z nepravého akátu, xanthanová klovatina nebo jejich směsi. V metodě popsané ve WO 93/12218 je jako adhezivní vrstva použit kopolymer izooktylakrylátu a akrylamidu nebo N-vinylpyrolidonu. Na tuto adhezní vrstvu je přichycen prášek, rozpustný ve studené vodě, který je směsí superabsorbentu a gelových složek. Jako gelová složka může být použit alginin, klovatina z guaru, hydroxymethylcelulóza, klovatina z nepravého akátu, karboxymethylcelulóza, xanthanová klovatina nebo jejich směs. Jako superabsorbent se používá glycerolem modifikovaný polysacharid, štěpený polymer škrobu a akrylát sodný, akrylamid nebo směs výše jmenovaných látek. S výjimkou média používaného pro rozočkování mikrobů, v těchto metodách rostou mikrobi uvnitř gelu. Nevýhodou je tudíž, že se morfologie kolonií nepodobá morfologii kolonií, rostoucích na povrchu agarových ploten.

Podstata vynálezu

Cílem tohoto vynálezu je překonat výše uvedené problémy a vytvořit nové zařízení s kultivačním médiem pro pěstování a určování mikroorganismů.

Hydrogelové kultivační médium, které je předmětem tohoto vynálezu, je zvláště vhodné pro použití k určování mikroorganismů ve vzorcích lidského a zvířecího původu, při ověřování lékařských diagnóz a při výběru metody léčení.

Dalším účelem tohoto vynálezu je vytvořit roztok pro určování mikroorganizmů a jimi vytvářených biofilmů např. v potrubích potravinářského nebo dřevozpracujícího průmyslu a na povrchu ocelových součástek ventilačních systémů.

Zařízení s kultivačním médiem, které je předmětem tohoto vynálezu, je zvláště vhodné pro použití v situacích, kde příprava kultivačního média není možná a kde je zapotřebí nepřetržité sledování hygienických podmínek, jako je v potravinářském průmyslu a potvrzení o vyhubení patogenních bakterií v nemocnicích, např. na různých povrchách, v roztocích a ve ventilačních systémech.

Účelem bylo vyvinout zařízení s kultivačním médiem, které umožní dosáhnout vyšší citlivosti k různým mikrobům, které však bude možno používat, při varírování se složkami kultivačního média a jejich vzájemnými poměry, pro různé rozsahy citlivosti. Aby byla zaručena dlouhá skladovací doba, je nutno toto kultivační médium připravit v suché podobě. Kultivační médium musí být snadno použitelné.

Účelem bylo též, aby živiny a jiné reagencie byly přidány do gelu a gel může být přichycen na podložku, která je nepropustná pro vodu, a to přímo, bez absorpčních podpůrných vrstev nebo adhezních vrstev.

Dalším požadavkem je také, aby gel fungoval jako filtr a mikroby se tak přichytily na jeho povrchu, zatímco roztok ze vzorkuje absorbován dovnitř gelu. Vlivem absorbovaného roztoku se rozpustí živiny a difundují, aby mohly být využity mikroby, pokud se týká morfologie, mikroby pak rostou stejně jako na klasickém agaru.

Účelem bylo vyvinout absorpční gel s viskozitou 1000 až 1 000 000 mPas (2% vodný roztok, 20 °C, 100 kPa), který po přidání živin a ostatních nezbytných složek může být nanesen na vhodnou podložku, nepropustnou pro vodu, vysušen v normální atmosféře na obsah vlhkosti 0,01 až 20 hmotnostních procent a rovněž, jestli je to nezbytné, je možno jej sterilizovat např. radiací nebo plynem.

Nyní bylo zjištěno, že výše uvedené požadavky je možno splnit, jestliže jsou jako gelové složky použity zesíťované hydrogely, založené na éterech celulózy. Jedná se o hydrofilní polymeiy, zesíťované kovalentními vazbami, které ve vodě bobtnají, ale udržují si svůj tvar, protože mají svoji permanentní trojrozměrnou strukturu a tedy nepotřebují zvláštní podpůrné nebo adhezní vrstvy, jako to potřebují roztoky, používané při dosavadní úrovni techniky. Tedy hydrogelové kultivační médium, připravené podle tohoto vynálezu, může být vysušeno na podložce, která odpuzuje vodu, a to bez pomoci adhezních činidel.

Množství chemických zesíťujících vazeb v gelu, připraveném z éteru celulózy, může být použito pro regulaci filtračních schopností tohoto gelu. Čím je v gelu více zesíťujících vazeb, tím je menší velikost jeho pórů. Mikroby jsou přichyceny na povrchu gelu, zatímco roztok ze vzorkuje gelem absorbován a vzorek se tím koncentruje. Absorpční kapacita gelu a současně citlivost kultivačního média může být regulována výběrem vhodných směsí hydrofilních a hydrofobních éterů celulózy jako výchozího materiálu (estery celulózy obsahující např. skupinu octanu sodného nebo hydroxyalkylovou skupinu jsou hydrofilní a étery celulózy obsahující např. alkylovou nebo benzylovou skupinu jsou hydrofobní). Podle stupně zesíťování a hydrofilních či hydrofobních vlastností éterů celulózy, mohou gely absorbovat vzorek, který je větší, co se týká jeho objemu tekutiny a obsahu bakterií.

Kultivační médium, které má základní složení podle tohoto vynálezu, může být použito pro různé rozsahy citlivosti. Tak může být např. použito k určení vzorku 1 až 10³ CFU/ml nebo 10³ až přes 10⁷ CFU/ml. Zařízení s kultivačním médiem, které je předmětem tohoto vynálezu, je tedy velmi vhodné pro použití jak při hygienické kontrole v průmyslu, tak i v lékařské diagnostice.

Když je ponořeno do roztoku, suché kultivační médium, které je předmětem tohoto vynálezu, absorbuje během několika minut konstantní množství tekutiny (10 až 1000 μΐ v závislosti na požadované citlivosti), které obsahuje odpovídající množství mikrobů, ve srovnání s testovaným vzorkem. Kultivační médium, které je tak zvlhčeno vzorkem je hladké a stejnoměrné jako normální agarové médium a po normální době inkubace vytvářejí mikroby na povrchu gelu kolonie.

Tuhost povrchu vytvořeného gelu a viskózní vlastnosti gelu lze regulovat tím, že jsou jako výchozí materiál používány étery celulózy s různými molekulovými hmotnostmi a viskozitami.

-4CZ 290141 B6

Mezi výhody éterů celulózy patří také to, že gely z nich připravené jsou jasné a průhledné, jedná se o levné suroviny, dostupné ve velkém množství, a jako přírodní polymery nepoškozují při rozkladu přírodní prostředí.

Deriváty celulózy, kde jsou vodíkové atomy v OH skupinách nahrazeny alkylem jako je methylová, ethylová nebo propylová skupina, hydroxyalkylem, jako je hydroxyethylová nebo hydroxypropylová skupina, benzylovou nebo hydroxybenzylovou skupinou nebo alkalickými solemi karboxymethylu, jako je octan sodný nebo jejich směsi, lze použít jako étery celulózy. Každá jednotka glukózy v celulóze může obsahovat 0 až 3 skupiny OH substituované výše uvedenými skupinami. Viskozita éterů celulózy může být 100 až 100 000 mPas, výhodněji 1000 až 10 000 mPas (2% vodný roztok, teplota 20 °C, tlak 100 kPa) a molekulární hmotnost 500 až 1 000 000, výhodněji 1000 až 500 000. Když jsou étery celulózy, které mají výše uvedené viskozity, použity jako výchozí materiál, viskozita výsledného produktu je v rámci požadovaného rozsahu viskozity, tj. 1000 až 1 000 000 mPas.

Étery celulózy jsou lineární polymery, které se mohou použít k tvorbě hydrogelů tím, že jsou různými způsoby zesíťovány. Étery celulózy mohou být zesíťovány postupy známými pro celulózu. Tak může být trojrozměrně síťovaný polymer získán např.

a) tím, že se OH skupiny éterů celulózy ponechají reagovat s formaldehydem, glyoxalem, močovinou nebo monomethylolovými či dimethylolovými deriváty melaminu, formaldehydovým derivátem močoviny a melaminovými prepolymery formaldehydu, dimethyloletylenovým derivátem močoviny, epichlorhydrinem, diepoxidy, diizothiokyanáty (George Odian Principles of Polymerization 1981, 671, John Wiley & Sons, lne.) nebo divinylsulfonátem (David C. Harsh a Stevin H. Gehrke; Joumal of Controlled Release, 17 (1991) 175-186 a U. Anbergen a W. Oppermann; Polymer, Sv. 31,1990,1854-1858),

b) ozářením (např. elektrony, neutrony, gama a UV zářením) (George Odian Principles of Polymerization 1981, 671—672, John Wiley & Sons, lne.) nebo

c) polymerizací éterů celulózy s monomery vinylu, za využití mechanizmu volných radikálů. Volné radikály jsou vytvářeny buď radiací (např. gama či UV záření), nebo chemickou aktivací (redox systém, peroxidy nebo diazoniové soli) (A. Hebeish, J. T. Guthrie, The Chemistry and Technology of Cellulosic Copolymers, 1981, 32-241, Springer-Verlag). Například se může použít akrolein, akrylamid, 2-akrylamid-2methylpropansulfonová kyselina, soli 2-akrylamid-2metylpropansulfonové kyseliny, kyselina akrylová, soli kyseliny akrylové, akrylnitryl, methakrylamid, methakrylamidopropyl trimethylamoniumchlorid, kyselina methakrylová, soli kyseliny methakrylové, kyselina 2-methakroyloxyethan sulfonová, soli kyseliny 2-methakroyloxyethan sulfonové, 2-methakryIoxyethyl trimethylamoniumchlorid, 3-methakryloxy-2hydroxypropyl trimethylamoniumchlorid, methakroloylchlorid, Ν,Ν'-methylenbisakiylamid nebo jejich směsi.

Étery celulózy tak mohou být zesíťovány např. s divinylsulfonem v alkalickém roztoku. Divinylsulfon vytváří příčné vazby adiční reakcí s OH skupinami umístěnými buď na kostře polymeru, nebo v substituovaných skupinách. Použité množství divinylsulfonu je možno vybrat podle hustoty požadovaného zesíťování podle reaktivity a koncentrace síťovaných polymerů a je pro methylcelulózu, hydroxypropylcelulózu a karboxymethylcelulózu v rozmezí 0,005 až 1,5 g divinylsulfonu na jeden gram suchého polymeru, výhodněji v rozmezí 0,05 až 0,5 g divinylsulfonu na jeden gram suchého polymeru v 2% roztoku étery celulózy. Teoretická hustota zesíťování, pokud je provedeno divinylsulfonem nebo nějakou jinou sloučeninou, uvedenou výše v alternativě a), je v rozmezí 8,5 x 10”⁵ až 2,5 x 10~² molů na gram suchého éteru celulózy, výhodněji v rozmezí 8,5 x 10^* až 8,5 x 10³ molů na gram suchého éteru celulózy.

V kultivačním médiu, připraveném podle tohoto vynálezu, je velikost pórů u hydrogelů, založeného na zesíťování éterů celulózy v rozmezí 0,1 až 1 000 nm, výhodněji v rozmezí 1,0 až 500 nm.

-5CZ 290141 B6

Absorpční vlastnosti hydrogelů lze vylepšit přidáním detergentů. Mohou se použít aniontové detergenty (např. laurylsíran sodný) nebo neionogenní detergenty (např. Tween 20, Triton X-100). Absorpční vlastnosti hydrogelů lze také regulovat pomocí jiných, gelových sloučenin, které absorbují vodu, jako jsou výše uvedené étery celulózy, kopolymery výše uvedených polymerů, použitých v polymeraci, agar, albuminy, algináty, želatina, klovatina z guaru, karageny, xanthanová klovatina, polypeptidy a jiné modifikované póly sacharidy.

K možným detergentům a gelovým složkám, jsou do gelové směsi před jejím vysušením přidány výživné látky (peptony, hydrolyzáty a cukry) a pokud je to požadováno i regulátory pH; substráty, další reagencie, mající vztah k biochemickým detekčním reakcím, selektivní inhibitory, antibiotika a barvicí činidla.

Takto získaná hydrogelová kultivační média, založená na éterech celulózy, mohou být nanesena na vhodný podklad, nepropouštějící vodu a vysušena tak, aby obsahovala zbytkovou vlhkost 0,01 až 20 hmotnostních procent. Jako vhodné podklady, nepropustné pro vodu, jsou např. z polypropenu, polystyrenu nebo polyesteru, z nichž mohou být připraveny testovací proužky. Pokud je to vyžadováno, kultivační médium může být vysušeno na tkanině ze skelných vláken, pokud je tkanina dostatečně jemná a zesíťování hydrogelů dostatečné. Vysušení může být provedeno za normálního atmosférického tlaku, nebo pokud je to vyžadováno, lze jej provést za podtlaku či přetlaku. Vhodný konečný obsah vlhkosti je 0,01 až 20 hmotnostních procent, výhodněji 0,05 až 10 hmotnostních procent.

Suché kultivační médium zůstává použitelné po dlouhé časové období a jeho použití jsou různorodá. Tak např. může být zařízení s kultivačním médiem ponořeno přímo do roztoku testovaného vzorku, nebo přitisknuto na vlhký povrch testovaného vzorku, kde gel absorbuje konstantní množství vzorku. Pokud má objekt, který má být testován, suchý povrch, gel může být předem navlhčen např. vodou a poté přitisknut k testovanému povrchu, nebo může být navlhčen testovaný povrch a suchý gel k němu přitisknut. Na druhé straně je možno suchý, pevný vzorek suspendovat do tekutiny, do níž je pak zařízení s kultivačním médiem ponořeno. Suché kultivační médium je možno také navlhčit a testovaný vzorek může být na takto upravené médium nakapán.

Dalším předmětem vynálezu je mikrobiologická testovací souprava, obsahující zařízení se suchým, hydrogelovým kultivačním médiem, kde gelová složka kultivačního média obsahuje hydrogel, který je předmětem tohoto vynálezu a který je založený na zesíťovaných éterech celulózy. Testovací souprava může např. dále obsahovat zvlhčující roztok a vzorkový roztok. Obal testovacích proužků může být také používán jako prostor pro inkubaci.

Na základě toho co bylo výše uvedeno, kultivační médium, které je předmětem tohoto vynálezu, může v případě, když je jako zesíťovací činidlo použit divinylsulfon i obsahovat např. (% hmotnost/objem tekutiny)

a) 0,1 až 10 hmotnostních % sodné soli karboxymethylcelulózy

b) 0,1 až 10 hmotnostních % hydroxypropylmethylcelulózy nebo hydroxypropylcelulózy

c) 0,05 až 0,5 hmotn. % hydroxidu sodného

d) 0,005 až 1,5 g divinylsulfonu/g éteru celulózy

e) 0,01 až 1,0 hmotn. % Tweenu 20

f) 0,1 až 10 hmotnostních % kvasničného extraktu

g) 0,1 až 10 hmotnostních % Lablemco a

h) 0,001 až 0,005 hmotn. % bromthymolové modři poté je tato směs nanesena na podložku, nepropustnou pro vodu~a sušena při 20 až 60 °C, až do obsahu vlhkosti 0,01 až 20 hmotnostních %.

-6CZ 290141 B6

Pokud jsou étery celulózy zesíťovány polymerizací, může kultivační médium, které je předmětem tohoto vynálezu, obsahovat např. (vyjádřeno v procentech w/v (hmotnost na objem) na základě objemu tekutiny)

a) 0,1 až 10 hmotnostních % sodné soli karboxymetylcelulózy

b) 0,1 až 10 hmotnostních % akrylamidu

c) 0,01 až 10 hmotnostních % N,N'-bismethylenakrylamidu

d) 0,001 až 0,1 hmotn. % hydroxidu draselného

e) 0,001 až 0,01 hmotn. % pyrosiřičitanu sodného

f) 0,005 až 0,1 hmotn. % persíranu draselného

g) 0,1 až 10 hmotnostních % živného extraktu BHI poté je tato směs nanesena na podložku, nepropustnou pro vodu~a sušena při 20 až 60 °C, až do obsahu vlhkosti 0,01 až 20 hmotnostních %. Ve výše uvedeném složení fungují persíran draselný a pyrosiřičitan sodný jako redox iniciátory polymerace za zásaditých podmínek, zatímco akrylamid a Ν,Ν'-bismethylenakrylamÍd polymerují s étery celulózy.

V následujícím textu je vynález dále popsán pomocí pracovních příkladů. Jedná se pouze o příklady a cílem jejich uvedení není jakýmkoli způsobem omezit rozsah uplatnění vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Mikroby byly pěstovány pomocí dosavadní techniky v roztoku BHI a kultury byly zředěny do sérií s různými CPU/ml. Mikroby v suspenzi byly určovány pomocí nového pevného média a porovnávány s dosavadními kultivačními technikami, jako jsou živné agarové kultivační plotny a ponořovací sklíčka (Uricult™, Hygicult™).

Příklad 1

Čtyřistapadesát miligramů hydroxidu sodného je rozpuštěno v 400 ml deionizované vody. V tomto roztoku jsou rozpuštěny 2 g hydroxypropylmethylcelulózy (viskozita 4000 mPas, 2% roztok) nebo hydroxypropylcelulózy (molekulová hmotnost 370 000) a 4 g sodné soli karboxymethylcelulózy (viskozita 6000 mPas, 1% roztok). Směs je míchána 3 h při teplotě 60 °C, ochlazena na teplotu místnosti a poté je přidáno 0,4 ml divinylsulfonu, promícháno a ponechána stát 16 hodin. Po míchání po dobu 2 h při teplotě 60 °C byl gel zředěn na 1 % a pH bylo upraveno pomocí hydroxidu sodného na pH7. Do 100 ml výše uvedeného gelu bylo přidáno 0,05 g Tweenu 20, 0,6 g kvasničného extraktu, 0,3 g Lablemco a 3 mg bromthymolové modři. Získaná směs je sušena na polypropenové podložce (200 μΐ/cm²) při teplotě místnosti a takto získané kultivační médium bylo nařezáno na testovací proužky o ploše 12 cm².

Příklad 2

Dvanáct gramů sodné soli karboxymetylcelulózy (viskozita 6000 mPas, 1% roztok) je rozpuštěno v 600 ml vody, probubláno inertním plynem a zahřáto na teplotu 70 °C. Ke směsi je přidáno 0,6 g Ν,Ν'-bismethylenakrylamidu a 0,6 g akrylamidu, které byly rozpuštěny v 20 ml vody. Dále je přidán 1 ml 1 M roztoku hydroxidu draselného, 35 mg pyrosiřičitanu sodného a polymerizováno přidáním 100 mg persíranu draselného. Míchání směsi pokračovalo pod inertní plynnou atmosférou po dobu 4 hodin, poté bylo přidáno 15 g živného extraktu BHI, pH upraveno na pH 7, směs je sušena na polypropenové podložce (200 μΐ/cm²) při teplotě místnosti a takto získané kultivační médium bylo nařezáno na testovací proužky o ploše 12 cm².

-7CZ 290141 B6

Příklad 3

Absorpční kapacita testovacích proužků byla testována tak, že testovací proužky z Příkladů 1 a 2 byly ponořeny do 0,9% roztoku NaCl po dobu 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 a 2,5 minuty a poté byly zváženy. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 1.

Tabulka 1: Schopnost testovacích proužků absorbovat tekutinu

	Absorpční doba (min) / množství absor	>ované tekutiny (ml)
Gel	0,5 min.	1,0 min.	1,5 min.	2,0 min.	2,5 min.
1	0,26 ml	0,39 ml	0,41 ml	0,46 ml	0,49 ml
2	0,23 ml	0,34 ml	0,40 ml	0,45 ml	0,49 ml
3	0,38 ml	0,54 ml	0,62 ml	0,69 ml	0,75 ml

Gel 1 = Hydrogel ze sodné soli karboxymethylcelulózy a hydroxypropylmethylcelulózy (Příklad 1).

Gel 2 = Hydrogel ze sodné soli karboxymethylcelulózy a hydroxypropylcelulózy (Příklad 1).

Gel 3 = Polymer sodné soli hydroxypropylmethylcelulózy, akrylamidu - N,N'-bismethylenakrylamidu (Příklad 2).

Závěrem, kteiý vyplývá z těchto výsledků je, že gely syntetizované z více hydrofílních éterů celulózy absorbují za stejnou dobu více tekutiny.

Příklad 4

Testovací proužky připravené z karboxymethylcelulózy a hydroxypropylmethylcelulózy v Příkladu 1 byly na dobu půl minuty ponořeny do sériových ředění 10' až 108 CFU/ml Escherichia coli (ATCC 25922). Bylo absorbováno 0,25 ml vzorku. Testovací proužky byly inkubovány 20 h při teplotě 37 °C. Bylo provedeno porovnání s živnou agarovou plotnou, očkovanou 0,1 ml vzorku. Hustoty nárůstu byly spočteny jako u agarových ploten. Výsledky jsou shromážděny v Tabulce 2.

Tabulka 2: Hustoty nárůstu Escherichia coli na živných agarových plotnách a na testovacích proužcích

Ředění bakterií	Hustota nárůstu CFU/ml na agarových plotnách	Hustota nárůstu CFU/ml na testovacích proužcích
10¹	3	8
10²	18	38
10³	10³	10⁴
10⁴	10⁴	10⁵
10⁵	10⁵	10⁷
—5	10⁶	^O⁷
10⁷	<10⁷
Ϊ0⁵	<1?	^ΪΟ⁷

Z hustot nárůstu, uvedených v Tabulce 2 je zřejmé, že jsou úměrné množství vzorku.

-8CZ 290141 B6

Příklad 5

Účinnost testovacích proužků připravených ze sodné soli karboxymethylcelulózy a hydroxypropylmethylcelulózy v Příkladu 1 byla zjišťována pro různé bakterie a kvasinky. Testovací proužky byly na dobu půl minuty ponořeny do sériových ředění Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae (ATCC 33495), Próteus mirabilis (ATCC 12453), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Staphylococcus aureus (ATCC 25922) a Candida albicans (ATCC 14053) o koncentracích 10¹ až 10⁸ CFU/ml. Bylo absorbováno 0,25 ml vzorku. Testovací proužky byly inkubovány 20 h při teplotě 37 °C. Pro porovnání bylo použito médium Cled ze soupravy ponořovacích sklíček Uricult™ s 0,025 ml vzorku. Hustoty nárůstu byly odečteny pomocí porovnání s modelovou kartou soupravy Uricult. Výsledky jsou shromážděny v Tabulce 3.

Tabulka 3: Hustoty nárůstu různých mikrobů na testovacích proužcích a v mediu Cled ze soupravy Uricult™

	Zředění mikrobů CFU/ml
Mikrob Testovací proužek Uricult™-Cled	10*	10²	10³	10⁴	10⁵	10⁶	10⁷	10⁸
E. Coli Testovací proužek Uricult™-Cled	8 0	38 1	10⁴ 6	10⁵ 10⁴	10⁷ 10«	>10⁷ 10⁶	>10⁷ 10⁷	>10⁷ >10⁷
K. pneumoniae Testovací proužek Uricult™-Cled	4 1	10« 2	10⁴ 10³	10« 10⁴	>10⁷ 10⁵	>10⁷ 10⁶	>10⁷ 10⁷	>10⁷ >10⁷
P. mirabilis Testovací proužek Uricult™-Cled	14 5	39 5	10⁴ 7	10⁵ 10«	>10⁷ 104	>10⁷ 105	>10⁷ 106	>10⁷ 10⁷
P. aeruginosa Testovací proužek Uricult™-Cled	6 0	17 2	10⁴ 10	10« 10⁴	>10⁷ >10⁷	>10⁷ >10⁷	>10⁷ >10⁷	>10⁷ >10⁷
S. aureus Testovací proužek Uricult™-Cled	1 0	2 0	18 10	10⁴10«	10⁵ 10«	10« 10«	>10⁷ 10⁶	>10⁷ 10⁷
E. faecalis Testovací proužek Uricult™-Cled	1 0	10« 1	10⁴ 3	10« 10«	>10⁷ 10⁴	>10⁷ 10«	>10⁷ 10⁶	>10⁷ >10⁷
C. albicans Testovací proužek Uricult™-Cled	0 0	0 0	0 1	20 10³	10« 10⁴	>10⁷ 10⁵	>10⁷ 10«	>10⁷ 10⁶

Mikrobiální nárůst byl na testovacích proužcích až lOOkrát větší, protože jimi bylo absorbováno více vzorku než médiem Cled.

Příklad 6

Účinnost testovacích proužků připravených ze sodné soli karboxymethylcelulózy ahydroxypropylmethylcelulózy v Příkladu 1 byla zjišťována pro kvasinky a plísně. Testovací proužky byly na dobu dvou minut ponořeny do sériových ředění Candida albicans (ATCC 14053) zAspergilus niger o koncentracích 10¹ až 10⁶ CFU/ml. Bylo absorbováno 0,45 ml vzorku. Testovací proužky byly inkubovány 20 h při teplotě 37 °C (Candida albicans) nebo 72 h při teplotě 22 °C (Asper-9CZ 290141 B6 gilus niger). Pro porovnání byla použita souprava Hygicult™ Y & F s 0,050 ml vzorku. Hustoty nárůstu byly odečteny pomocí porovnání s modelovou kartou soupravy Hygicult.

Tabulka 4: Hustoty nárůstu kvasinky a plísně na testovacích proužcích a u soupravy Hygicult™ Y&F

	Zředění kvasinky/plísně CFU/ml
Mikrob Testovací proužek Hygicult™Y & F	10¹	10²	10³	10⁴	10⁵	10⁶
C. albicans Testovací proužek Hygicult™ Y & F	0 0	3	2	50 1	300 32	ΙΟ⁴“⁵ 10⁴	>10⁷ 10⁶
A. niger Testovací proužek Hygicult™ Y & F	0 0	0	1	0 1	2 6	6 36	18 10⁴'⁵

Hydrogelové kultivační médium, založené na zesíťování éterů celulózy, podporuje růst plísní a kvasinky, třebaže v tomto příkladu nejsou živiny kultivačního média optimální ani pro kvasinku ani pro plíseň, jako je tomu v soupravě Hygicult™ Y&F.

Příklad 7

Účinnost různých hydrogelových kultivačních médií, založených na zesíťování éterů celulózy, byla zjišťována ponořením proužku kultivačního média na dobu půl minuty do sériových ředění Escherichia coli (ATCC 25922), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), a Candida albicans (ATCC 14053) o koncentracích 10¹ až 10⁴ CFU/ml a poté inkubováním 20 h při teplotě 37 °C. Hustoty nárůstu byly odečteny pomocí porovnání s modelovou kartou soupravy UricultTM. Výsledky jsou shromážděny v Tabulce 5.

Tabulka 5: Hustoty nárůstu Escherichia coli, Enterococcus faecalis a Candida albicans, CFU/ml, na různých hydrogelových kultivačních médiích

	Ředění mikrobů CFU/ml
	Escherichia coli	E. faecalis	C. albicans
Gel	10¹	10²	10³	10⁴	10¹	10²	10³	10⁴	10¹	10²	10³	10⁴
1	8	38	10⁴	10³	1	10³	10⁴	10⁵	0	0	0	20
2	16	49	10⁴	10³	2	21	10⁴	10⁵	0	2	20	io^r
3	1	54	10⁴	10³	7	35	10⁴	10³	0	4	30	10⁴

Z příkladů v Tabulce 5 je zřejmé, že hydrogely připravené z různých éterů celulózy podporují mikrobiální růst.

-10CZ 290141 B6

Z výše uvedených příkladů lze učinit závěry, že

- všechny mikroby rostou na kultivačním médiu, které je předmětem tohoto vynálezu, třebaže složení kultivačního média v těchto příkladech nebylo vůbec optimalizováno pro různé, zde použité mikroby,

- kultivační médium, které je předmětem tohoto vynálezu, je obecně citlivější než živný agar nebo komerčně dostupné testovací proužky,

- růst na kultivačním médiu, které je předmětem tohoto vynálezu, je úměrný množství vzorku.

Průmyslová využitelnost

Sušená kultivační média pro pěstování mikrobů, která jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou citlivější než běžně používaná média a mohou se uplatnit při kontrole mikrobiálního znečistění v potravinářství a jiných průmyslových provozech, v lékařství a v oblasti hygieny.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Sušené hydrogelové kultivační médium pro mikroby, vyznačující se tím, že obsahuje hydrogel založený na kovalentně zesíťovaných éterech celulózy, kdy hydrogelové kultivační médium může být přichyceno na podložce nepropouštějící vodu bez potřeby absorpčních podpůrných vrstev nebo adhezních vrstev.

2. Hydrogelové kultivační médium podle nároku 1, vyznačující se tím, že gelová složka obsahuje jak hydrofílní, tak hydrofobní étery celulózy.

3. Hydrogelové kultivační médium podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že vodíkové atomy OH skupin v éterech celulózy byly nahrazeny alkylem hydroxyalkylem, benzylem, hydroxybenzylovou skupinou nebo alkalickou solí karboxymethylu, přičemž každá glukózová jednotka v celulóze může obsahovat 0 až 3 OH skupiny nahrazené výše jmenovanými skupinami.

4. Hydrogelové kultivační médium podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že molekulová hmotnost éterů celulózy je 500 až 1 000 000, výhodněji 1000 až 500 000.

5. Hydrogelové kultivační médium podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že viskozita éterů celulózy je 100 až lOOOOOmPas, výhodněji 1000 až 10 000 mPas měřeno v 2% roztoku při 20 °C.

6. Hydrogelové kultivační médium podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se t i m , že velikost pórů hydrogelu, založeného na zesíťování éterů celulózy je 0,1 až 1000 nm, výhodněji 1,0 až 500 nm.

7. Hydrogelové kultivační médium podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že kromě hydrogelu, založeného na zesíťování éterů celulózy, obsahuje živiny a případně jiné gelové složky, regulátory pH, detergenty, substráty, další reagencie, které mají vztah k biochemickým detekčním reakcím, selektivní ihhibitory, antibiotika a barvicí činidla.

-11CZ 290141 B6

8. Hydrogelové kultivační médium podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že bylo vysušeno na podkladu, který je nepropustný pro vodu, až do zbytkové vlhkosti 0,01 až 20 hmotnostních procent.

9. Hydrogelové kultivační médium podle nároku 1,vyznačující se tím, že dále obsahuje étery celulózy, agar, albuminy, algináty, želatina, klovatina z guaru, karageny, xanthanová klovatina, polypeptidy, kopolymery polymerizované z vinylových monomerů nebo jiné modifikované polysacharidy.

10. Hydrogelové kultivační médium podle nároku 9, vyznačující se tím, že dále obsahuje kopolymery polymerizované z vinylových monomerů, které jsou vybrány ze skupiny zahrnující akrolein, akrylamid, kyselina 2-aloylamido-2-methylpropan-sulfbnová, soli kyseliny 2-akrylamido-2-methyIpropan-sulfonové, kyselina akrylová, soli kyseliny akrylové, akrylonitryl, methakrylamid, methakrylamidopropyl trimethylamoniumchlorid, kyselina methakrylová, soli kyseliny methakiylové, kyselina 2-methakroyloxyethan sulfonová, soli kyseliny 2-methakroyloxyethan sulfonové, 2-methakryloxyethyl trimethylamoniumchlorid, 3-methakryloxy-2hydroxypropyl trimethylamoniumchlorid, methakroloylchlorid, N,N'-methylenbisakrylamid ajejich směsi.

11. Způsob přípravy sušeného hydrogelového kultivačního média podle nároku 1,vyznačující se tím, že se étery celulózy vzájemně zesíťují

a) tím, že se OH skupiny éterů celulózy ponechají reagovat s divinylsulfonem, formaldehydem, glyoxalem, močovinou nebo monomethylolovými a dimethylolovými deriváty melaminu, močovinoformaldehydovými a melaminformaldehydovými prepolymery, dimethylolethylenovou močovinou, epichlorhydrinem, diepoxidy, nebo diizothiokyanáty, nebo

b) radiací, nebo

c) roubovanou polymerací éterů celulózy s monomery vinylu za využití mechanizmu volných radikálů, přičemž se získaný zesítěný hydrogel doplní živinami, případně dalšími nezbytnými složkami a získané hydrogelové kultivační médium se nanese na podložku, která je nepropustná pro vodu, a vysuší se.

12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že vedle živin se ke gelu přidají gelové, vodné roztoky absorbující složky, regulátory pH, detergenty, substráty, další reagencie, které mají vztah k biochemickým detekčním reakcím, selektivní inhibitory, antibiotika a barvicí činidla, a získané hydrogelové kultivační médium se nanese na podložku, která nepropustná pro vodu, suší při teplotě 20 až 60 °C do zbytkové vlhkosti 0,01 až 20 hmotnostních procent a rozřeže na testovací proužky.

13. Způsob podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím, že když jsou étery celulózy zesíťovány podle alternativy a) nároku 11, teoretická hustota zesíťování éterů celulózy je 8,5 x 10'⁵ až 2,5 x 10'² molu na gram suchého éteru celulózy.

14. Způsob podle kteréhokoli z nároků 11 až 13, v y z n a č u j i c í se t í m , že pokud jsou étery celulózy zesíťovány pomocí divinylsulfonu, množství divinylsulfonu je 0,005 až 1,5 gramu na gram éteru celulózy.

15. Způsob podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím, že když jsou étery celulózy zesíťovány polymerací s akrylamidem a Ν,Ν'-methyIenbisakrylamidem, množství akrylamidu je 0,1 až 10 hmotnostních procent a množství Ν,Ν'-methylenbisakrylamidu je 0,01 až 10 hmotnostních procent.

-12CZ 290141 B6

16. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že se hydrogely připraví z éterů celulózy polymerizací za využití mechanizmu volných radikálů s akroleinem, akrylamidem, kyselinou 2-akrylamido-2-methylpropan-sulfonovou, solemi kyseliny 2-akrylamido-2-methylpropan sulfonové, kyselinou akrylovou, solemi kyseliny akrylové, akrylonitrylem, methakrylamidem, methakrylamidopropyltrimethylamoniumchloridem, kyselinou methakiylovou, solemi kyseliny methakrylové, kyselinou 2-methakroyloxyethansulfonovou, solemi kyseliny 2-methakroyloxyethansulfonové, 2-methakryloxyethyl trimethylamonium-chloridem, 3-methakryloxy2-hydroxypropyltrimethylamoniumchloridem, methakroloylchloridem, N,N'-methylenbisakrylamidem nebo jejich směsmi.

17. Testovací mikrobiologická souprava, vyznačující se tím, že obsahuje sušené hydrogelové kultivační médium podle nároku 1, jehož gelová složka obsahuje hydrogel, založený na kovalentně zesíťovaných éterech celulózy.

18. Testovací mikrobiologická souprava podle nároku 17, vyznačující se tím, že dále obsahuje tekutinu na zvlhčení povrchu, vzorkový roztok a balení, které lze použít jako prostor pro inkubaci.

19. Použití hydrogelového kultivačního média podle nároku 1 pro určování druhů a množství mikrobů v rámci různých rozsahů citlivosti.