CZ279304B6

CZ279304B6 - Zppůsob mikrobiologické přípravy aromatických hydroxyheterocyklických karboxylových kyselin

Info

Publication number: CZ279304B6
Application number: CS923581A
Authority: CZ
Inventors: Andreas Dr. Kiener; Markus Dr. Rohner; Klaus Heinzmann
Original assignee: Lonza A.G.
Priority date: 1991-12-05
Filing date: 1992-12-04
Publication date: 1995-04-12
Also published as: HU217419B; SK279050B6; ES2115635T3; CA2084456A1; HUT65672A; EP0556465A2; HU9203843D0; US5516661A; SK358192A3; JP3153365B2; DE59209218D1; EP0556465B1; KR930013123A; ATE163678T1; NO924703L; CZ358192A3; MX9206934A; JPH05328987A; NO924703D0; KR100279227B1

Abstract

Mikrobiologický způsob přípravy hydroxyheterocyklické karboxylové kyseliny obecného vzorce I. Výchozí látkou je odpovídající heterocyklická karboxylová kyselina. Postupuje se tak, že se a) aerobní biomasa zužitkující kyselinu nikotinovou pěstuje s kyselinou nikotinovou a s minerální kyselinou v molárním poměru od 1 do 8, přičemž se tento poměr udržuje po celou fázi pěstování, a pak se b) provede hydroxylace odpovídající heterocyklické karboxylové kyseliny obecného vzorce II, kde R.sub.1 .n.a X mají uvedený význam, s touto biomasou. Za těchto podmínek se mohou v růstové fázi obohatit mikroorganismy druhu Pseudomonas acidovorans DSM 7205, druhu Pseudomonas acidovorans DSM 7203, druhu Alcaligenes faecalis DSM 7204 a mikroorganismy s označením DSM 7202.ŕ

Description

Vynález se týká nového mikrobiologického způsobu přípravy hydroxyheterocyklických karboxylových kyselin obecného vzorce I

(I) kde Rf znamená atom vodíku nebo atom halogenu a X znamená atom dusíku nebo funkci CR₂, kde R₂ znamená atom vodíku nebo atom halogenu, pomocí aerobní biomasy, zužitkující kyselinu nikotinovou nebo její rozpustné soli. Výchozí látkou je odpovídající heterocyklická karboxylová kyselina nebo její rozpustné soli.

V následujícím textu se pod výrazem kyselina nikotinová rozumějí také její rozpustné soli. Obzvláště její ve vodě rozpustné soli, jako například nikotinát sodný jako alkalická sůl kyseliny nikotinové.

Dosavadní stav techniky

Uvedené hydroxyheterocyklické karboxylové kyseliny jsou důležitými meziprodukty při výrobě farmaceutických prostředků. Například kyselina 6-hydroxynikotinová je důležitý při výrobě kyseliny

664 754 a ta je opět výchozím produktem pro farmaceuticky účinné látky podle Setcliffa sv. 21, č. 2, str. 246.

meziprodukt

5,6-dichlornikotinové podle patentu CH a spol., J. of Chem. and Eng. Data, 1976,

Známé provedení mikrobiologického způsobu hydroxylace kyseliny nikotinové na kyselinu 6-hydroxynikotinovou je popsáno například v evropském patentovém spise 152 948. Postupuje se tak, že se nejprve pěstují mikroorganismy s kyselinou nikotinovou v přítomnosti extraktu kvasnic. Pak se pro vlastni biotransformaci volí koncentrace kyseliny nikotinové jako eduktu tak, aby se odbourání kyseliny nikotinové zabrzdilo na stupni kyseliny 6-hydroxynikotinové.

Nedostatek tohoto postupu spočívá v tom, že se mikroorganismy, zužitkující kyselinu nikotinovou, pěstují v přítomnosti extraktu kvasnic. Tímto extraktem je pak znečištěn bezbuněčný fermentační roztok po pěstování, popřípadě po biotransformaci. To vede ke znečištění izolované kyseliny 6-hydroxynikotinové.

Dalším nedostatkem je to, že se při tomto postupu používají jednotné biologicky čisté kultury mikroorganismů, které jsou

-1CZ 279304 B6 náchylnější k infekcím zejména při fermentacích v provozním měřítku.

Dále je znám mikrobiologický způsob přípravy kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové z kyseliny pyrazinkarboxylové podle evropské patentové přihlášky č. 92110425.3.

Při tomto postupu se pěstují jednotné biologicky čisté kultury mikroorganismů s alkalickou solí kyseliny nikotinové před vlastní hydroxylací.

Nedostatkem tohoto postupu je rovněž ta skutečnost, že se při tomto postupu používají jednotné kultury mikroorganismů, které jsou náchylnější k infekcím obzvláště při fermentacích v provozním měřítku.

Podstata vynálezu

Úkolem předloženého vynálezu je odstranit uvedené nevýhody a dát k dispozici jednoduchý a ekologický mikrobiologický způsob přípravy hydroxyheterocyklických karboxylových kyselin vzorce I.

Tento úkol se řeší pomocí nového způsobu podle patentového nároku 1.

Podle vynálezu se postupuje tak, že se a) aerobní biomasa, zužitkující kyselinu nikotinovou, pěstuje s kyselinou nikotinovou a minerální kyselinou v molárním poměru kyseliny nikotinové k minerální kyselině od 1 do 8, přičemž se po celou fázi pěstování udržuje tento poměr, a pak se b) pomocí této biomasy provede hydroxylace odpovídající heterocyklické karboxylové kyseliny obecného vzorce II

R.

N' .COOH (II) kde Rj a X mají uvedený význam, nebo její rozpustné soli, za vzniku požadovaného hydroxylovaného konečného produktu.

Pod výrazem pěstovat aerobní biomasu, zužitkující kyselinu nikotinovou nebo její soli se rozumí toto: Jestliže se pěstuje biomasa například z kalu čisticích zařízení jako inokulum s popsaným molárním poměrem kyselina nikotinová-minerální kyselina za aerobních podmínek, získá se aerobní biomasa, zužitkující kyselinu nikotinovou. Získá se tedy biomasa, která roste s kyselinou nikotinovou jako jediným zdrojem uhlíku, dusíku a energie v přítomnosti kyslíku.

Jako inokulum lze také použít vzorky půd z různých zemí, jako například půda z městského parku v Santander (Španělsko), nebo půda z vinice ve Visperterminerí u Vispu (Švýcarsko).

-2CZ 279304 B6

Na rozdíl od již popsaných postupů se při způsobu podle vynálezu nepoužívají jednotné biologicky čisté kultury mikroorganismů, nýbrž se používá biomasa, složená ze směsných kultur.

Molární poměr kyseliny nikotinové k minerální kyselině, tzn. přidání směsi, složené z kyseliny nikotinové a minerální kyseliny k buněčné suspenzi se uskuteční tak, že se po celou fázi pěstování udržuje molární poměr kyseliny nikotinové k minerální kyselině od 1 do 8.

Jako minerální kyseliny se mohou použít například kyselina sírová, kyselina chlorovodíková, kyselina dusičná nebo kyselina fosforečná, výhodně se používá kyselina sírová.

Účelně se přidává směs během pěstování biomasy (stupeň a) tak, že se udržuje molární poměr kyseliny nikotinové ke kyselině sírové od 3 do 5. To znamená, že se pro pěstování účelně použije na jeden mol kyseliny sírové 3 až 5 molů kyseliny nikotinové. Výhodně se pro pěstování použijí 4 až 5 molů kyseliny nikotinové na jeden mol kyseliny sírové.

Obvykle se provádí pěstování aerobní biomasy, zužitkující kyselinu nikotinovou, v médiu, obsahujícím minerální soli, výhodně v médiu, obsahujícím minerální soli, jehož složení je uvedeno v tabulce 1.

Biomasa se účelně pěstuje při hodnotě pH od 5 do 9, výhodně od 6 do 8.

Teplota během pěstování biomasy je účelně mezi 15 a 50 °C, výhodně mezi 25 a 40 'C.

Obvykle se biomasa pěstuje po dobu od 0,5 do 3 dnů.

Účelně se za těchto podmínek ve fázi pěstování obohacují mikroorganismy druhu Pseudomonas acidovorans DSM 7205, nebo druhu Pseudomonas acidovorans DSM 7203, nebo druhu Alcaligenes faecalis DSM 7204, nebo mikroorganismy s označením DSM 7202, nebo jejich směsi.

Mikroorganismy DSM 7205, DSM 7203, DSM 7204 a DSM 7202 byly 13. srpna 1992 uloženy u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur GmbH, Mascheroderweg lb, D-3300 Braunschweig, ve shodě s Budapešťskou úmluvou.

Tyto mikroorganismy nejsou ještě známé z literatury a jsou proto také součástí vynálezu. Mikroorganismus s označením DSM 7202 nebyl ještě taxonomicky identifikován a nebyl zařazen k rodu.

Taxonomický popis mikroorganismů Pseudomonas acidovorans DSM 7205, DSM 7203 a Alcaligenes faecalis DSM 7204 je uveden v následujícím textu.

-3CZ 279304 B6

Taxonomický popis mikroorganismu Pseudomonas acidovorans DSM 7205

Vlastnosti kmene buněčná forma tyčinky šířka μη 0,8-0,9 délka μη 1,5-9,0 pohyblivost mrskání polar 1

Gram-reakce lyže 3 %ním KOH aminopeptidáza (Cerny) spory oxidáza kataláza růst anaerobní

37/41 °C+/pH 5,7

Mac-Conkey-agar+ ss-agar+ cetrimid-agar+ testosteron pigmenty nedifunduj ící difundující fluoreskující pyokyanin kyselina z (OF-test) glukosy aerobně glukosy anaerobně glukosy alkalicky plyn z glukosy kyselina z glukosy fruktosy xylosy adonitu L-arabinosy celobiosy dulcitu glycerinu

-4CZ 279304 B6 m-inositu laktosy maltosy rafinosy

L- rhamnosy salicinu

D-sorbitu sacharosy trehalosy ethanolu + dulcitu

ONPG/PNPG

ADH

VP indol no₂ z no₃ + fenylalanindesamináza w levan ze sacharosy lecitináza ureáza hydrolýza škrobuželatiny kaseinuw

DNA

Tweenu 80+ eskulinuPHB odbourání tyrosinu+ využití substrátu acetát+ adipát+ kaprát+ citrát+ glykolát+ levulinát+ malát+ malonát+ fenylacetát+

L-arabinosafruktosa+ glukosa manosa maltosa

D-xylosamannitol+

-5CZ 279304 B6 glukonát +

2-ketoglukonát +

N-acetylglukosamin

L-serin quinát + D,L-tryptofan + L-tartrát + acetamid + α-aminobutyrát + ethanol w

Taxonomický popis mikroorganismu Pséudomonas acidovorans DSM 7203

Vlastnosti kmene buněčná forma	tyčinky
šířka μιη	0,8-1,0
délka μιη	2,6-6,0
pohyblivost mrskání	+ polar 1
Gram-reakce lyže 3 %ním KOH aminopeptidáza (Cerny)	+ +
spory	-
oxidáza	+
kataláza	+
růst anaerobní 37/41 °C pH 5,7 Mac-Conkey-agar SS-agar cetrimid-agar testosteron	+/- + + +

pigmenty nedifunduj ící difundující fluoreskující pyokyanin kyselina z glukosy glukosy glukosy (OF-test) aerobně anaerobně alkalicky plyn z glukosy kyselina z glukosy fruktosy

-6CZ 279304 B6

xylosy	-
adonitu	-
L-arabinosy	-
pelobiosy	-
dulcitu	-
glycerinu	+
m-inositu	+
laktosy
maltosy	-
rafinosy	-
L-rhamnosy	-
salicinu	-
D-sorbitu	-
sacharosy	-
trehalosy	-
ethanolu	_·?
dulcitu	-
ONPG/PNPG	-
ADH	. -
VP	-
indol	-
no₂ z no₃	+
fenylalanindesamináza	w
levan ze sacharosy	-
lecitináza	-
ureáza	-
hydrolýza
škrobu
želatiny	-
kaseinu	+
DNA	-
Tweenu 80	+
eskulinu	-
PHB	-
odbourání tyrosinu	+
využití substrátu
acetát	+
adipát	+
kaprát	+
citrát	+
glykolát	+
levulinát	+
malát	+
malonát	+
fenylacetát	+
L-arabinosa	-

-7CZ 279304 B6 fruktosa+ glukosa manosa maltosa

D-xylosamannitol+ glukonát+

2-ketoglukonát+

N-acetylglukosamin

L-serin quinát+

D,L-tryptofan+

L-tartrát+ acetamid+ α-aminobutyrát .w ethanol+

Taxonometrický popis mikroorganismu Alcaliqenes faecalis DSM

7204

Vlastnosti kmene buněčná forma šířka μιη délka μιη pohyblivost mrskání

Gram-reakce lyže 3 %ním KOH aminopeptidáza (Cerny) oxidáza kataláza růst anaerobní 37/41 °C pH 5,7 Mac-Conkey-agar SS-agar centrimid-agar pigmenty nedifundující difunduj ící fluoreskující pyokyanin kyselina z (OF-test) glukosy aerobně glukosy anaerobně glukosy alkalicky plyn z glukosy tyčinky

0,6-0,8

1,0-2,0 +

peritrich +

+ +

+ +/+ +

+ +

8CZ 279304 B6 kyselina z

D-glukosy D-fruktosy +

D-xylosy

ONPG/PNPG

ADH

VP indol no₂ z no₃ denitrifikace fenylalanindesamináza levan ze sacharosy lecitináza ureáza hydrolýza škrobu želatiny kaseinu DNA Tweenu 80 eskulinu odbourání tyrosinu využiti substrátu acetát adipát kaprát citrát .glykolát levulinát D-malát malonát fenylacetát L-arabinosa D-fruktosa D-glukosa D-manosa maltosa D-xylosa mannit glukonát 2-ketoglukonát N-acetylglukosamin L-serin

-9CZ 279304 B6

V následujícím textu se pod pojmem heterocyklická karboxylová kyselina (substrát) pro hydroxylaci rozumí také její soli, jako například její ve vodě rozpustné alkalické soli.

Po pěstování se může biomasa pro vlastní biotransformaci (hydroxylaci) buď oddělit v oboru běžným způsobem, nebo se heterocyklická karboxylová kyselina (obecný vzorec II), určená k hydroxylaci, přidá přímo k napěstované biomase.

Vlastní hydroxylace heterocyklické karboxylové kyseliny (substrátu) se uskuteční v oboru běžným způsobem s nerostoucími buňkami.

Výhodně se vlastní hydroxylace heterocyklické karboxylové kyseliny uskuteční s mikroorganismy, obohacenými v růstové fázi druhu Pseudomonas acidovorans DSM 7505, druhu Pseudomonas acidovorans DSM 7203, druhu Alcaliqenes faecalis DSM 7204, nebo s mikroorganismy s označením DSM 7202, nebo s jejich směsmi.

Jako substrát se mohou použít například kyselina nikotinová, pyrazinkarboxylová, nebo jejich halogenované deriváty. Jako halogenované deriváty kyseliny nikotinové nebo kyseliny pyrazinkarboxylové se mohou použít například kyselina 5-chlornikotinová, 6-chlorpyrazinkarboxylová. Výhodně se hydroxyluje kyselina nikotinová na kyselinu 6-hydroxynikotinovou, nebo kyselina pyrazinkarboxylová na kyselinu 5-hydroxypyrazinkarboxylovou.

Substrát se může pro biotransformaci přidávat kontinuálně nebo diskontinuálně. Účelně se substrát přidává tak, aby množství substrátu ve fermentoru nepřesáhlo 20 % hmotnostních, výhodně 15 % hmotnostních.

Jako médium se mohou použít média běžná v oboru, výhodně buď médium, obsahující minerální soli, uvedené v tabulce 1, nebo A-N-médium, popsané v tabulce 2.

Obvykle se biotransformace provádí s buňkami, které mají optickou hustotu při 550 nm (OD₅₅₀) nebo při 650 nm (OD_&50) od 5 do 100.

Účelně se biotransformace provádí při hodnotě pH od 5 do 9, výhodně od 6,5 do 7,5 a při teplotě účelně od 15 do 50 °C, výhodně od 25 do 35 °C.

Po obvyklé reakční době od 5 do 24 hod. se může hydroxylovaná heterocyklická karboxylová kyselina obecného vzorce I izolovat v oboru obvyklými metodami, například okyselením bezbuněč.ného fermentačního roztoku nebo vysrážením ve formě těžko rozpustných solí. Výhodně se jako hydroxylovaná heterocyklická karboxylová kyselina izoluje kyselina 6-hydroxynikotinová, nebo 5-hydroxypyrazinkarboxylová.

-10CZ 279304 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 (a) Pěstování biomasy

Ferňientace se provádí v nesterilním médiu, obsahujícím minerální soli (tabulka 1), s 1 g kyseliny nikotinové na 1 litr, ve fermentoru o pracovním objemu 15 1 při pH 7,0, při teplotě 30 °C a při rychlosti větrání mezi 5 až 20 1/min. Pro regulaci pH se přidává k médiu jen kyselina ve formě vodní suspenze, složené z 307 g kyseliny nikotinové (2,5 mol) a 49 g (0,5 mol) H₂SO₄a 1 1 vody z nádoby s míchadlem, která je upevněna na víku fermentoru, přes pneumaticky řízený kuličkový ventil. Fermentor se naočkuje 500 ml kalu z čisticího zařízení odpadních vod, Visp, Švýcarsko (tabulka 2). Po 36 hod. se fermentor vyprázdní až na 1 1 a naplní se čerstvým médiem. Po dalších 24 hod., 48 hod. a 72 hod. se tento postup opakuje.

(b) Hydroxylace (příprava kyseliny 6-hydroxynikotinové)

V okamžiku, kdy optická hustota při 550 nm dosáhne hodnotu mezi 5 až 20, nasadí se biomasa, aby se spektrofotometricky měřila specifická rychlost tvorby kyseliny 6-hydroxynikotinové. Biomasa se nejdříve pro tento účel promyje 0,9 % (hmotn./obj.) roztokem NaCl. Pak se 10 μΐ této buněčné suspenze přidá do předehřáté kyvety Quarz (1 cm světelné dráhy) na 30 °C, která obsahuje 2990 μΐ roztoku, složeného z 6,5 g kyseliny nikotinové/1 a 10,1 g K₂HPO₄/1 a 4,0 g KH₂PO₄/1, pH 7,0. Pak se měří absorpce kyvety . při 550 nm a pak se vypočte ze stejné kyvety lineární přírůstek absorpce při 295 nm za minutu.

Specifická aktivita (U) se určí podle následujícího vzorce:

^A295nm -60

U = ---------:------------:---------^OD550 nm · ⁿⁱⁿ

Fermentace se zopakují se vzorkem kalu z čisticího zařízení Zermatt, se vzorky půdy z Visperterminen a vzorky půdy z Lac de Joux, Švýcarsko a se vzorkem půdy ze Santander, Španělsko (tabulka 2 ) .

Příklad 2

Příprava kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové

Biomasy z fermentací 4,5 a 6 (tabulka 2) se odstředí a promyjí se jednou v 0,9 % (hmotn./obj.) roztoku NaCl. Pak se buňky resuspendují v litru roztoku, který obsahuje 0,5 mol (70 g) amonné soli kyseliny pyrazinkarboxylové, pH 7,0. Optická hustota při 650 nm je pak 20. Po inkubaci 16 hod. za aerobních podmínek při pH 7,0 a teplotě 30 °C se pomocí UV-spektroskopie stanoví kvantitativní přeměna kyseliny pyrazinkarboxylové na kyselinu 5-hydroxypyrazinkarboxylovou. Vytvořená kyselina 5-hydroxypyrazinkarboxylová není mikroorganismy odbourávána.

Při kontrolním pokusu se pěstuje podle shora uvedeného postupu mikroorganismus Pseudomonas acidovorans D3 (DSM 4746), který je obzvláště vhodný pro průmyslovou výrobu kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové. Ten se použije pro reakci podle postupu, popsaného v evropské patentové přihlášce 92110425.3. Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 1

Složení média, obsahujícího minerální soli

MgCl₂ .	6H₂O	0,8	g/i
CaCl₂		0,16	g/i
Na₂SO₄		0,25	g/i
K3PO4 .	^2H2°	0,7	g/i
Na₃PO₄.	12H₂O	2,4	g/i
SLF		1,0	g/i
FeEDTA		15,0	g/i

Složení stopových prvků (SLF) v médiu, obsahujícím minerální soli

- KOH	15,0	g/i
- EDTANa₂ . 2H₂O	100,0	g/1
- ZnSO₄ . 7H₂O	9,0	g/i
- MnCl₂ . 4H₂O	4,0	g/i
- h₃bo₃	2,7	g/i
- COC1₂ . 6H₂O	1,8	g/i
- CuCl₂ . 2H₂O	1,5	g/i
- NÍC1₂ . 6H₂O	0,18	g/i
- Na₂Mo0₄ . 2H₂O	0,2	g/i
Složení FeEDTA:
- EDTA Na₂ . 2H₂O	5,0	g/i
- FeSO₄ . 7H₂O	2,0	g/i

(pH roztoku se upraví na hodnotu 7,0)

Tabulka 2

Inokulum	OD550 před měřením aktivity	Spec, aktivita (A₂95 . OD₅₅₀ *)
(1) ARA LONZA	5,3	35,5
(2) Lac de Joux	14	20

-12CZ 279304 B6

(3) ARA	26
Zermatt	9,6
(4) vinice V terminen	12	44
(5) půda Španělsko	10	32
(6) kontrola: Pseudomonas acidovorans	3,5 8	35,1} dvojí 39 }stanovení

Místo nálezu:

(1) kal z čisticího zařízení firmy LONZA ve Visp/Švýcarsko (2) půda z břehu Lac de Joux, Le Sentier/Švýcarsko (3) kal z čisticího zařízení v Zermatt/Švýcarsko (4) půda z vinice ve Visperterminen u Visp/Švýcarsko (5) půda z městského parku ve Santander ve Španělsku

Příklady 3-6

Z biomasy, pěstované podle příkladu la), lze obohatit následující mikroorganismy:

Pseudomonas acidovorans DSM 7205 Pseudomonas acidovorans DSM 7203 Alcaligenes faecalis DSM 7204 Mikroorganismy s označením DSM 7202

Tyto mikroorganismy se pěstují za dále popsaných podmínek a použijí se pro hydroxylaci kyseliny nikotinové na kyselinu 6-hydroxynikotinovou. Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce 3.

Mikroorganismy se pěstují v 7 litrovém fermentoru, který obsahuje 5 1 A-N-média (tabulka 4) s 2 g nikotinátu sodného na litr při teplotě 30 °C a pH 7,0. K regulaci pH se použije 5 N NaOH a 8,5 % (obj./obj.) H₃P0₄. Po 18 h. růstu se k fermentačnímu roztoku přidají dodatečně 2 g nikotinátu sodného na litr. V okamžiku, kdy jsou buňky v exponenciální růstové fázi, fermentace se přeruší a mikroorganismy se centrifugací oddělí od média. Pak se buňky resuspendují v 500 ml roztoku, který obsahuje 0,27 mol (40 g) nikotinátu sodného, pH 7,0. Hodnota optické hustoty pak je 20. Hydroxylace kyseliny na 6-hydroxynikotinovou se sleduje spektrofotometričky (tabulka 3).

-13• · *ř

Tabulka 3

Příklady

Čas potřebný pro hydroxylaci 0,27 mol kyseliny nikotinové v 500 ml

Izolované množství kyseliny 6-hydroxynikptinové po okyselení bezbuněčného roztoku

Výtěžky v %, vztaženo na kyselinu nikotinovou

příklad 3: DSM 7202	22 h.	15,7 g (0,11 mol)	41 .%
příklad 4: DSM 7203	9 h.	30,1 g (0,22 mol)	80 %
příklad 5: DSM 7204	10 h.	28,1 g (0,2 mol)	73 %
příklad 6:	5 h.	32,0 g (0,23 mol)	85 %

DSM 7205

Tabulka 4: A-N-médium

Složení:

Na₂HPO₄ kh₂po₄

NaCl

MgCl₂ . 6H₂O

CaCl₂ . 2H₂O

FeCl₃ . 6H₂0 pyridoxalhydrochlorid riboflavin amid kyseliny nikotinové thiaminhydrochlorid biotin kyselina pantotenová p-aminobenzoát kyselina listová vitamín B12

ZnSO₄ . 7H₂O

MnCl₂ . 4H₂O

H3BO3

CoCl₂ . 6H₂O

CuC1₂ . 2H₂O

NíC1₂ . 6H₂O

Na₂MoO₄ . 2H₂O

Koncentrace (mg/1)

2000

1000

3000

400

14,5

0,8

10.10^-35.10”³

5.10^- ³

2.10^- ³2.10³5.10“³5.10'³2.10³5.10“³100-10“³90.10“³300.10“³

200.10^-3

10.10³20.10³30.10“³

-14CZ 279304 B6

EDTANa₂ . 2H₂O

FeSO₄ . 7H₂O

5.10 ³

2.10^-3 (pH roztoku se upraví na hodnotu 7,0)

Průmyslová využitelnost

Uvedené hydroxyheterocyklické karboxylové kyseliny jsou důležitými meziprodukty při výrobě farmaceutických prostředků.

Claims

Způsob mikrobiologické přípravy aromatických hydroxyheterocyklických karboxylových kyselin obecného vzorce I (I) kde Rj_ znamená atom vodíku nebo halogenu a X znamená atom dusíku nebo funkci CR₂, kde R₂ znamená atom vodíku nebo halogenu, vyznačující se tím, že se (a) aerobní biomasa, zužitkující kyselinu nikotinovou nebo její rozpustné soli a obohacená mikroorganismy rodu Pseudomonas a/nebo rodu Alcaligenes a/nebo mikroorganismy s označením DSM 7202, pěstuje s kyselinou nikotinovou nebo jejími rozpustnými solemi a s minerální kyselinou v molárním poměru kyseliny nikotinové nebo jejích rozpustných solí k minerální kyselině od 1 do 8, přičemž se tento poměr udržuje po celou fázi pěstování, a pak se (b) provede hydroxylace odpovídající heterocyklické karboxylové kyseliny obecného vzorce II (II) kde R-j_ a X mají uvedený význam, nebo jejích rozpustných solí, s touto biomasou.
2. Způsob podle nároku 1, v y z n ač u j ící se tím, že se ve stupni a) jako minerální kyselina použije kyselina sírová v molárním poměru kyseliny nikotinové nebo jejích rozpustných solí ke kyselině sírové od 3 do 5.

-15CZ 279304 B6
3. Způsob podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že se v růstové fázi ve stupni a) obohacují mikroorganismy druhu Pseudomonas acidovorans DSM 7205 a/nebo druhu Pseudomonas acidovorans DSM 7203 a/nebo Alcaliqenes faecalis DSM 7204 a/nebo mikroorganismy s označením 7202 a pak se ve stupni b) provede hydroxylace s těmito mikroorganismy.
4. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se ve stupni b) jako heterocyklická karboxylová kyselina hydroxyluje kyselina nikotinová nebo její rozpustné soli na kyselinu 6-hydroxynikotinovou.
5. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se ve stupni b) jako heterocyklická karboxylová kyselina hydroxyluje kyselina pyrazinkarboxylové nebo její rozpustné soli na kyselinu 5-hydroxypyrazinkarboxylovou.
6. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se pěstování ve stupni a) a hydroxylace ve stupni b) provádí při teplotě od 15 do 50 C a při pH od 5 do 9.
7. Mikroorganismy druhu Pseudomonas acidovorans DSM 7205, druhu Pseudomonas acidovorans DSM 7203, druhu Alcaliqenes faecalis DSM 7204 a mikroorganismy s označením DSM 7202, které zužitkují kyselinu nikotinovou, nebo její rozpustné soli.
8. Způsob přípravy podle nároku 1 kyseliny 6-hydroxynikotinové hydroxylací kyseliny nikotinové, vyznačující se ti m, že se hydroxylace provádí pomocí mikroorganismů druhu Pseudomonas acidovorans DSM 7205 a/nebo druhu Pseudomonas acidovorans DSM 7203 a/nebo druhu Alcaliqenes faecalis DSM 7204 a/nebo mikroorganismů s označením DSM 7202, které zužitkují kyselinu nikotinovou, nebo její rozpustné soli.