CZ279006B6 - Creatinamidine hydrolase, process of its preparation and use - Google Patents
Creatinamidine hydrolase, process of its preparation and use Download PDFInfo
- Publication number
- CZ279006B6 CZ279006B6 CS883118A CS311888A CZ279006B6 CZ 279006 B6 CZ279006 B6 CZ 279006B6 CS 883118 A CS883118 A CS 883118A CS 311888 A CS311888 A CS 311888A CZ 279006 B6 CZ279006 B6 CZ 279006B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- hydrolase
- creatinamidine
- dsm
- gene
- expression
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 10
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 9
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims abstract description 9
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims description 34
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims description 27
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 18
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 claims description 9
- 239000006046 creatine Substances 0.000 claims description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 claims description 6
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 claims description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims 1
- 108010077078 Creatinase Proteins 0.000 abstract description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 abstract description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 abstract 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 abstract 1
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- -1 creatinine amine Chemical class 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- ZPEZUAAEBBHXBT-RZVRUWJTSA-N l-valine l-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O.CC(C)[C@H](N)C(O)=O ZPEZUAAEBBHXBT-RZVRUWJTSA-N 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000009595 pap smear Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
- Y10S435/877—Pseudomonas putida
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká stabilní kreatinamidinhydrolázy, která je dokonce stálejší než enzym tzv. divokého typu a z tohoto důvodu je i vhodnější k enzymatickému stanovení obsahu kreatinu v krevním séru, v plasmě nebo v moči. Vynález se týká také způsobu výroby tohoto enzymu.
Dosavadní stav techniky
Enzym kreatinamidinhydroláza EC 3.5.3.3 má své použití v průmyslu při stanovení kreatininu. Mimo jiné se tento enzym užívá pro klinické zjištění diagnózy ledvinových onemocnění, při nichž se v krevním séru nebo v moči vyskytují hladiny kreatinu, které jsou odlišné od hladin ve zdravém organismu. Jsou známy mikroorganismy, například čeledi Pseudomonas, které při indukci přidáním kreatinu jsou schopné produkovat kreatinamidinhydrolázu v množství, které je z hospodářského hlediska výhodné, avšak pracovní i časové náklady na kultivaci těchto mikroorganismů a náklady na izolaci enzymů stále ještě převyšují limitující faktory pro průmyslové použití enzymu. V DOS č. 35 00 184 se popisuje, že je možno z Pseudomonas putida izolovat gen, který je kódem pro kreatinamidinhydrolázu a tento gen včlenit například do plasmidu pBR322. Po transformaci mikroorganismu z čeledi E. coli nebo Pseudomonas putida je potom možné získávat pěstováním těchto mikroorganismů konstitutivně kreatinamidinhydrolázu. Toto získávání uvedeného enzymu pomocí genetického inženýrství je účinnější a snadnější než izolace enzymu z mikroorganismu, který takový plasmid neobsahuje po svrchu uvedené indukci. Tento postup má však tu nevýhodu, že takto získaný enzym divokého typu má pouze omezenou stálost při vyšší teplotě a za přítomnosti smáčedel a z těchto důvodů není optimální pro použití při klinických zkouškách.
Vynález si klade za úkol získat mutanty, produkující kreatinamidinhydrolázu, které by však byly prosté shora uvedených nevýhod známých postupů nebo by tyto nevýhody podstatným způsobem omezovaly.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří kreatinamidinhydroláza, katalyzující reakci kreatin + H2O ---------> sarkosin + močovina stejně jako enzymy divokého typu, avšak oproti enzymům divokého typu má vyměněnou alespoň jednu aminokyselinu v poloze 109. Tato výměna se týká aminokyseliny alaninu, která je nahrazena valinem. Takto pozměněný enzym má daleko větší stálost než enzym divokého typu. Kromě této záměny aminokyselin může být v aminokyselinovém řetězci provedena ještě jiná mutace bez ovlivnění enzymatické účinnosti, někdy je dokonce možno získat ještě vyšší stabilitu enzymu. Výhodný enzym tohoto typu obsahuje ve svém řetězci kromě výměny aminokyseliny v poloze 109 ještě další výměnu v poloze
-1CZ 279006 B6
355, kde je valin nahrazen methioninem.
Vynález se také týká plasmidů pBT 109 a pBT 119. Tyto plasmidy obsahují gen pro kreatininamidinhydrolázu divokého typu, přičemž však v obou plasmidech je již na úrovni DNA připravena záměna aminokyselin v poloze 109 uvedeného enzymu a mimoto v případě plasmidů pBT 119 také v další poloze, v poloze 355, kde se valin nahrazuje methioninem, takže v plasmidů je kodon pro tuto aminokyselinu nahrazen kodonem pro aminokyselinu, která má původní aminokyselinu nahradit. Analýzou sledu plasmidů pBT 119 bylo prokázáno, že v poloze 1063 kódového sledu je nahrazeno G baží A (G ——> A), takže triplet GTG se mění na triplet ATG. Výhodný mikroorganismus z čeledi E. coli, a to kmen DSM 4105 obsahuje plasmid pBT 109, další výhodný kmen DSM 4106 obsahuje plasmid pBT 119.
K produkci pozměněného enzymu způsobem podle vynálezu dochází tak, že se přivede známými metodami genetického inženýrství rekonbinantní DNA ve vhodném systému pro expresi k uskutečnění exprese, přičemž systém pro expresi obsahuje gen pro kreatinamidinhydrolázu s obdobným sledem, jaký má gen pro enzym divokého typu, avšak alespoň v poloze 326 obsahuje tento systém pro expresi místo desoxyribonukleotidu C nukleotid T. S výhodou dochází k expresi genu, v němž je ještě pozměněna v další baze, kde o záměru G v poloze 1063 za A.
S výhodou dochází v případě rekombinantní DNA k expresi některého z plasmidů pBT 109, DSM 4108P nebo pBT 119, DSM 4107P. Jako rekombinantní DNA je možno použít jakékoliv rekonbinantní dna, která obsahuje sled DNA, uvedený v DOS, č. 35 00 184 pro enzym divokého typu nebo jeho ekvivalent, přičemž však místo baze C v poloze 326 desoxyribonukleotidu je v uvedené poloze obsažena baze T. V takové rekombinantní DNA může mimoto dojít ještě k další výměně baží, a to k náhradě G v poloze 1063 baží A.
Jako systém pro expresi je výhodný mikroorganismus z čeledi E. coli nebo Pseudomonas putida. Zvláště výhodný je mikroorganismus E. coli ED 8654, DSM 2102 nebo Pseudomonas putida, DSM 2106. Další postupy podle vynálezu je možno uskutečnit pěstování těchto výhodných mikroorganismů a mimoto použitím mikroorganismu E. coli DSM 4105 a E. coli DSM 4106.
Takto získané nové typy kreatinamidinhydrolázy, které jsou stálejší než enzymy divokého typu, je možno použít ke stanovení obsahu kreatininu v krevním séru, v plasmě nebo v moči.
Při sledování kreatinamidinhydroláz, popsaných v DOS č. 35 00 184 bylo prokázáno, že tento enzym katalyzuje ten stupeň v reakčním schéma kreatinamidinhydroláza kreatin + voda -----------------------> sarkosin + močovina, který’určuje rychlost reakce. Zvýšení rychlosti reakce není jinak možno dosáhnout zvýšením množství enzymu za běžných reakčních podmínek. Při podmínkách pro stanovení obsahu kreatinu v séru, plasmě nebo moči, při nichž se užívá teploty 37 ”C, má však přírodní enzym omezenou stabilitu, což vede ke snížení přeměny
-2CZ 279006 B6 substrátu při uvedené teplotě. Kreatinamidinhydroláza, získaná způsobem podle vynálezu, v níž je alanin v poloze 109 nahrazen valinem má však při různých podmínkách, například při přidání smáčedla, téměř stejnou enzymatickou účinnost při zvýšené stálosti za přítomnosti smáčedla, jak je uvedeno v následující tabulce
I. V tabulce II je uvedeno chování enzymu za různých teplot.
Tabulka I
Enzymatické stanovení při teplotě 37 ”C
| doba | kreatinamidinhydroláza | kreatinamidinhydroláza | podmínky pokusu |
| (min) | divokého typu (DOS 35 00184) | mutanta s valinem v | |
| DSM 3143 - srovnávací látka | poloze 109, DSM 4105 podle vynálezu | ||
| 0 | 3,3 U/ml účinnost = 100 š | 3,0 U/ml účinnost = 100 í | zkušební směs 1 ze |
| 15 | 1,9 U/ml zbytková | 3,0 U/ml zbytková | zkušebního balíčku |
| účinnost = 59 ? | účinnost = 100 š | creatinin-PAP | |
| I. | BM č. 839 434 | ||
| 30 | 0,6 U/ml zbytková | 2,7 U/ml zbytková | |
| účinnost = 18 % | účinnost = 91 % | ||
| 60 | 0,2 U/ml zbytková | 2,5 U/ml zbytková | |
| účinnost = 6 % | účinnost = 83 % | ||
| 0 | 3,3 U/ml účinnost = 100 % | 3,0 U/ml účinnost = 100 í | ve 125 mmol/l fosfátového |
| 15 | 0,7 U/ml zbytková | 2,7 U/ml zbytková | pufru + smáčedlo |
| účinnost = 21 $ | účinnost = 91 % | ||
| II. | |||
| 30 | 0,0 U/ml zbytková | 2,7 U/ml zbytková | |
| účinnost = 0 % | účinnost = 91 š | ||
| 60 | 0,0 U/ml zbytková | 2,1 U/ml zbytková | |
| účinnost = 0 % | účinnost = 71 % |
U = jednotka
Enzymy se inkubují za uvedených podmínek, stanovení se provádí při použití zkušebního balíčku Harnstoff (BM Best. č. 124 770)
-3CZ 279006 B6
Tabulka II
Stanovení enzymu za optimálních podmínek při různých teplotách
Podmínky pokusu: 20 mmol/1 fosfátového pufru o pH 8,0
1. creatinamidinhydroláza divokého typu s obsahem 1,05 mg bílkoviny/ml, účinnost 8,0 U/mg
2. kreatinamidinhydroláza podle vynálezu, 1,10 mg bílkoviny/ml, účinnost 8,7 U/mg, aminokyselinou v poloze 109 je valin.
| teplota | Zbytková účinnost kreatinázy v % (inkubace | v min) 120 | ||||
| 1. (DSM 3143) | 2. 30 | (DSM 4105) 60 | ||||
| 3 0 min | 60 | 120 | ||||
| 37 °C | 100 | 86 | 80 | 100 | 96 | 90 |
| 42 °C | 57 | 36 | 13 | 84 | 73 | 63 |
| 47 °C | 1 | 0,4 | 0 | 42 | 2 | 0 |
| 52 °C | 0 | - | - | 3 | - | - |
| Enzymy byly inkubovány za prováděno při použití balíčku | . uvedených Harnstoff | podmínek, stanovení bylo ( BM Best. č. 124 770) . |
Enzym kreatinamidinhydroláza, získaný způsobem podle vynálezu, který kromě uvedené mutace obsahuje ještě jednu vyměněnou aminokyselinu má při stejné výchozí enzymatické účinnosti ještě vyšší stálost ve srovnání s enzymem divokého typu, jak je uvedeno v tabulce III v příkladu 1.
Při použití mutant kreatinamidinhydrolázy, získaných způsobem podle vynálezu je možno zabránit ztrátám enzymatické účinnosti při stanovení kreatininu, které dříve při použití enzymů divokého typu vznikaly v důsledku nestálosti těchto enzymů v nepřítomnosti smáčedel a při vyšší teplotě, takže tato stanovení je možno provádět také po delší časové období. Vzhledem k výhodnějším vlastnostem uvedených enzymů je také možno snížit množství enzymů při provádění zkoušek.
Praktické provedení způsobu podle vynálezu bude osvětleno následujícími příklady.
Příklad 1
Buňky E. coli DSM 4105, E. coli DSM 4106 a pro srovnání také buňky E. coli DSM 3143 podle DOS 35 00 184, byly pomnoženy přes noc ve fermentorech o obsahu 1 litru v živném prostředí následujícího složení: _ Úplné prostředí (kvasnice/extrakt z peptonu)
0,4 % glukózy
100 mmol/1 fosfátového pufru
-4CZ 279006 B6
Po 15 minutovém odstředění při 8 000 ot/min byly buňky rozdrceny v lisu a kreatinamidinhydroláza byla čištěna frakcionací při použití molekulárního síta (Sephacryl S 200).
Získané enzymy byly inkubovány za podmínek, uvedených v tabulce III, potom bylo provedeno enzymatické stanovení při použiti zkušebního baličku Harnstoff (BM Best. č. 124 770).
V tabulce III je uvedena stálost mutant kreatinamidinhydroláz podle vynálezu ve srovnání s enzymem divokého typu podle DOS 35 00 184 /E. coli DSM 3143).
Tabulka III
Stálost při teplotě 37 °C
Podmínky pokusu: zkušební směs 1 ze zkušebního baličku Creatinin-PAP (BM Best. č. 839 434)
Výchozí účinnost : 12 U/ml - 100 % kmen kreatinamidinhydroláza zbytková účinnost po z E. coli 15 30 45 60 min kódový plasmid (% výchozí účinnosti)
| DSM | 3143 | pBT | 2a-l | DSM | 3148P | 69 | 51 | 39 | 27 |
| DSM | 4105 | pBT | 109 | DSM | 4108P | 96 | 90 | 84 | 84 |
| DSM | 4106 | pBT | 119 | DSM | 4107P | 102 | 102 | 102 | 102 |
Srovnání Michaelisových konstant (Km) při 37 °C
Podmínky pokusu: 0,1 mol/1 tris-HCl, pH 8,0 (optimální podmínky)
| kmen | kódový plasmid | Km, mmol/1 |
| DSM 3143 | pBT 2a-l DSM 3148P | 25 |
| DSM 4105 | pBT 109 DSM 4108P | 20 |
| DSM 4106 | pBT 119 DSM 4107P | 16 |
Příklad 2
Stabilní mutanta kreatinamidinhydrolázy z mikroorganismu E. coli, DSM 4105, který obsahuje plasmid pBT 109, byla izolována ze 100 litrů fermentačního prostředí způsobem, popsaným v DOS č. 35 00 184. Bylo získáno 121 g bílkoviny se specifickou účinností 10,4 U/mg. To odpovídá celkovému výtěžku 63 %. -
Claims (12)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Kreatinamidinhydroláza, katalyzujicí reakci kreatin + voda ----> sarkosin + močovina, v níž v poloze 109 řetězce aminokyselin enzymu divokého typu je alanin nahrazen aminokyselinou valinem.
- 2. Kreatinamidinhydroláza podle nároku 1, která obsahuje navíc v poloze 355 místo valinu methionin.
- 3. Plasmid pBT 109, DSM 4108P, obsahující gen pro kreatinamidinhydrolázu podle nároku 1.
- 4. Plasmid pBT 119, DSM 4107P, obsahující gen pro kreatinamidinhydrolázu podle nároku 2.
- 5. Mikroorganismus E. coli, DSM 4105, obsahující plasmid pBT 109.
- 6. Mikroorganismus E. coli, DSM 4106, obsahující plasmid pBT 119.
- 7. Způsob výroby kreatinamidinhydrolázy podle nároku 1, při němž se genetickým inženýrstvím dosáhne v mikrobiální produkční buňce exprese rekonbinantní DNA, obsahující gen pro kreatinamidinhydrolázu, vyznačující se tím, že se jako gen pro kreatinamidinhydrolázu užije gen, který v poloze 326 přírodního genu místo C obsahuje desoxynukleotid T nebo DNA, obsahující ve svém genetickém kódu ekvivalentní řetězec pro stejný sled aminokyselin a jako systém pro expresi se užije mikroorganismus z čeledi E. coli nebo Pseudomonas putida.
- 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se jako exprese rekombinantni DNA dosáhne exprese plasmidu pBT 109, DSM 4108P.
- 9. Způsob výroby kreatinamidinhydrolázy podle nároku 2, při němž se dosáhne genetickým inženýrstvím ve vhodném systému pro expresi exprese rekombinantni DNA, která obsahuje gen pro kreatinamidinhydrolázu, vyznačující se tím, že se jako gen pro kreatinamindinhydrolázu užije gen, který kromě záměny baze C za bázi T v poloze 326 přírodního genu obsahuje ještě další mutaci v poloze 355, při které je valin nahrazen methioninem.
- 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se dosáhne exprese genu pro rekombinantni kreatinamidinhydrolázu, který v poloze 1063 obsahuje mutaci, spočívající ,v záměně baze G za bázi A.
- 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se jako exprese rekombinantni DNA dosáhne exprese plasmidu pBT 119,. DSM 4107P.-6CZ 279006 B6
12.Způsob podle nároku 8, vyznačující s e t i m, že se užije E. coli ED 8654, DSM 2102. 13.Způsob podle nároku 8, vyznačující s e t i m, že se užije Pseudomonas putida DSM 2106. 14.Způsob podle nároků 7 a 8, vyznaču j i c i s e tím, že se pěstuje E. coli, DSM 4105. 15.Způsob podle nároků 9 a 10 nebo 11, v y z n a č u j i c i se t i m, že se pěstuje E. coli, DSM 4106. - 16.Použití kreatinamidinhydrolázy podle nároků 1 a 2, ke stanovení obsahu kreatinu v séru, plasmě nebo moči.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3715841 | 1987-05-12 | ||
| DE3803175A DE3803175A1 (de) | 1987-05-12 | 1988-02-03 | Stabile creatinamidinohydrolase-mutanten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ311888A3 CZ311888A3 (en) | 1994-04-13 |
| CZ279006B6 true CZ279006B6 (en) | 1994-11-16 |
Family
ID=25855502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS883118A CZ279006B6 (en) | 1987-05-12 | 1988-05-06 | Creatinamidine hydrolase, process of its preparation and use |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4990453A (cs) |
| EP (1) | EP0291055B1 (cs) |
| JP (1) | JPS63287484A (cs) |
| KR (1) | KR900007648B1 (cs) |
| AU (1) | AU593438B2 (cs) |
| CA (1) | CA1339103C (cs) |
| CZ (1) | CZ279006B6 (cs) |
| DE (2) | DE3803175A1 (cs) |
| DK (1) | DK251788A (cs) |
| ES (1) | ES2059431T3 (cs) |
| HU (1) | HU204093B (cs) |
| IE (1) | IE60307B1 (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6437292A (en) * | 1987-08-04 | 1989-02-07 | Toyo Jozo Kk | Dna having genetic information of creatinase and use thereof |
| JP2000157279A (ja) | 1998-11-25 | 2000-06-13 | Kikkoman Corp | クレアチンアミジノハイドロラーゼ及びその製造法 |
| JP3773160B2 (ja) * | 1999-01-01 | 2006-05-10 | キッコーマン株式会社 | 耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼ及びその製造法 |
| CA2404293C (en) | 2001-09-20 | 2007-05-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Variants of an erwinia-type creatinase |
| CN116694608B (zh) * | 2023-06-15 | 2025-09-05 | 上海天鹜科技有限公司 | 一种具备更高热稳定性的肌酸脒基水解酶突变体及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2122294C3 (de) * | 1971-05-05 | 1979-08-16 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase |
| US4039384A (en) * | 1975-04-05 | 1977-08-02 | Noda Institute For Scientific Research | Creatinine amidohydrolase and creatine amidinohydrolase and process for producing them |
| JPS59232088A (ja) * | 1983-06-15 | 1984-12-26 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | Ｌ−アスパラギン酸の製法 |
| DE3500184A1 (de) * | 1985-01-04 | 1986-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Mikroorganismus und plasmid fuer konstitutive creatinamidinohydrolase-bildung sowie verfahren zur herstellung derselben |
| DE3707172C2 (de) * | 1986-03-07 | 1995-09-21 | Kikkoman Corp | Rekombiniertes DNA-Molekül, das ein Kreatinasegen codiert, rekombinanter Vektor, der diese DNA-Sequenz umfaßt, sowie Verfahren zur Herstellung von Kreatinase unter Verwendung eines Stammes vom Genus Escherichia, der diesen rekombinanten DNA Vektor enthält |
-
1988
- 1988-02-03 DE DE3803175A patent/DE3803175A1/de not_active Withdrawn
- 1988-04-06 IE IE101688A patent/IE60307B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-04-27 AU AU15186/88A patent/AU593438B2/en not_active Ceased
- 1988-04-29 CA CA000565576A patent/CA1339103C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-05-06 DK DK251788A patent/DK251788A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-05-06 CZ CS883118A patent/CZ279006B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1988-05-11 DE DE88107636T patent/DE3884045D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-05-11 HU HU882374A patent/HU204093B/hu not_active IP Right Cessation
- 1988-05-11 ES ES88107636T patent/ES2059431T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-11 US US07/192,485 patent/US4990453A/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-05-11 EP EP88107636A patent/EP0291055B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-12 KR KR1019880005487A patent/KR900007648B1/ko not_active Expired
- 1988-05-12 JP JP63113706A patent/JPS63287484A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0336514B2 (cs) | 1991-05-31 |
| DK251788A (da) | 1988-11-13 |
| DE3884045D1 (de) | 1993-10-21 |
| DE3803175A1 (de) | 1988-11-24 |
| EP0291055B1 (de) | 1993-09-15 |
| EP0291055A3 (en) | 1989-11-29 |
| CZ311888A3 (en) | 1994-04-13 |
| AU593438B2 (en) | 1990-02-08 |
| KR880014106A (ko) | 1988-12-22 |
| US4990453A (en) | 1991-02-05 |
| AU1518688A (en) | 1988-11-17 |
| EP0291055A2 (de) | 1988-11-17 |
| KR900007648B1 (ko) | 1990-10-17 |
| IE881016L (en) | 1988-11-12 |
| HUT46942A (en) | 1988-12-28 |
| CA1339103C (en) | 1997-07-29 |
| JPS63287484A (ja) | 1988-11-24 |
| IE60307B1 (en) | 1994-06-29 |
| DK251788D0 (da) | 1988-05-06 |
| HU204093B (en) | 1991-11-28 |
| ES2059431T3 (es) | 1994-11-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4469791A (en) | Genetically engineered microorganisms for massive production of amylolytic enzymes and process for preparing same | |
| EP0821064B1 (en) | Recombinant fructosyl amino acid oxidase | |
| Erarslan et al. | Purification and kinetics of penicillin G acylase from a mutant strain of Escherichia coli ATCC 11105 | |
| CA1170202A (en) | Process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into escherichia coli and bacillus subtilis | |
| Hummel et al. | Leucine dehydrogenase from Bacillus sphaericus. Optimized production conditions and an efficient method for its large-scale purification | |
| US4315988A (en) | Thermophilic collagenases, thermophilic bacteria capable of producing thermophilic collagenases, and process for producing said collagenases | |
| CA2045839C (en) | Cloned n-methylhydantoinase | |
| CZ279006B6 (en) | Creatinamidine hydrolase, process of its preparation and use | |
| US5416019A (en) | Rhodococcus microorganisms that produce phenylalanine dehydroganase | |
| JP3041840B2 (ja) | 新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途 | |
| EP0954571B1 (en) | Biocatalysts with amine acylase activity | |
| EP0260137B1 (en) | Assay method using novel NAD synthetase and a process for production of the enzyme | |
| LeCorre et al. | Use of a lytic enzyme system from Cytophaga sp. in the lysis of Gram-positive bacteria | |
| US4430433A (en) | Production of aryl acylamidases | |
| US5686294A (en) | Protein having heat-resistant malate dehydrogenase activity | |
| US6225100B1 (en) | Arylsulfotransferase | |
| EP0179025A1 (en) | Method for the production of neutral protease | |
| EP0206595B1 (en) | Thermally stable tryptophanase process for producing the same, and thermally stable tryptophanase-producing microorganism | |
| SK7586A3 (en) | Microorganism of race escherichia coli or pseudomonas putida, method of its growing and recombinant dna | |
| JPH1033180A (ja) | 組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ | |
| US7618800B2 (en) | Glycerol kinase, which has high resistance against preservative | |
| KR100358716B1 (ko) | 신규한 단백질분해효소 및 그의 제조방법 | |
| JP3358686B2 (ja) | 新規なグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及び該遺伝子を用いたグルタミン酸デヒドロゲナーゼの製造法 | |
| Jayasekera et al. | Recovery of catalytic activity from an inactive aggregated mutant of L-aspartase | |
| Kim et al. | A Methylobacillus isolate growing only on methanol |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20020506 |