CZ279006B6 - Creatinamidine hydrolase, process of its preparation and use - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká stabilní kreatinamidinhydrolázy, která je dokonce stálejší než enzym tzv. divokého typu a z tohoto důvodu je i vhodnější k enzymatickému stanovení obsahu kreatinu v krevním séru, v plasmě nebo v moči. Vynález se týká také způsobu výroby tohoto enzymu.

Dosavadní stav techniky

Enzym kreatinamidinhydroláza EC 3.5.3.3 má své použití v průmyslu při stanovení kreatininu. Mimo jiné se tento enzym užívá pro klinické zjištění diagnózy ledvinových onemocnění, při nichž se v krevním séru nebo v moči vyskytují hladiny kreatinu, které jsou odlišné od hladin ve zdravém organismu. Jsou známy mikroorganismy, například čeledi Pseudomonas, které při indukci přidáním kreatinu jsou schopné produkovat kreatinamidinhydrolázu v množství, které je z hospodářského hlediska výhodné, avšak pracovní i časové náklady na kultivaci těchto mikroorganismů a náklady na izolaci enzymů stále ještě převyšují limitující faktory pro průmyslové použití enzymu. V DOS č. 35 00 184 se popisuje, že je možno z Pseudomonas putida izolovat gen, který je kódem pro kreatinamidinhydrolázu a tento gen včlenit například do plasmidu pBR322. Po transformaci mikroorganismu z čeledi E. coli nebo Pseudomonas putida je potom možné získávat pěstováním těchto mikroorganismů konstitutivně kreatinamidinhydrolázu. Toto získávání uvedeného enzymu pomocí genetického inženýrství je účinnější a snadnější než izolace enzymu z mikroorganismu, který takový plasmid neobsahuje po svrchu uvedené indukci. Tento postup má však tu nevýhodu, že takto získaný enzym divokého typu má pouze omezenou stálost při vyšší teplotě a za přítomnosti smáčedel a z těchto důvodů není optimální pro použití při klinických zkouškách.

Vynález si klade za úkol získat mutanty, produkující kreatinamidinhydrolázu, které by však byly prosté shora uvedených nevýhod známých postupů nebo by tyto nevýhody podstatným způsobem omezovaly.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří kreatinamidinhydroláza, katalyzující reakci kreatin + H₂O ---------> sarkosin + močovina stejně jako enzymy divokého typu, avšak oproti enzymům divokého typu má vyměněnou alespoň jednu aminokyselinu v poloze 109. Tato výměna se týká aminokyseliny alaninu, která je nahrazena valinem. Takto pozměněný enzym má daleko větší stálost než enzym divokého typu. Kromě této záměny aminokyselin může být v aminokyselinovém řetězci provedena ještě jiná mutace bez ovlivnění enzymatické účinnosti, někdy je dokonce možno získat ještě vyšší stabilitu enzymu. Výhodný enzym tohoto typu obsahuje ve svém řetězci kromě výměny aminokyseliny v poloze 109 ještě další výměnu v poloze

-1CZ 279006 B6

355, kde je valin nahrazen methioninem.

Vynález se také týká plasmidů pBT 109 a pBT 119. Tyto plasmidy obsahují gen pro kreatininamidinhydrolázu divokého typu, přičemž však v obou plasmidech je již na úrovni DNA připravena záměna aminokyselin v poloze 109 uvedeného enzymu a mimoto v případě plasmidů pBT 119 také v další poloze, v poloze 355, kde se valin nahrazuje methioninem, takže v plasmidů je kodon pro tuto aminokyselinu nahrazen kodonem pro aminokyselinu, která má původní aminokyselinu nahradit. Analýzou sledu plasmidů pBT 119 bylo prokázáno, že v poloze 1063 kódového sledu je nahrazeno G baží A (G ——> A), takže triplet GTG se mění na triplet ATG. Výhodný mikroorganismus z čeledi E. coli, a to kmen DSM 4105 obsahuje plasmid pBT 109, další výhodný kmen DSM 4106 obsahuje plasmid pBT 119.

K produkci pozměněného enzymu způsobem podle vynálezu dochází tak, že se přivede známými metodami genetického inženýrství rekonbinantní DNA ve vhodném systému pro expresi k uskutečnění exprese, přičemž systém pro expresi obsahuje gen pro kreatinamidinhydrolázu s obdobným sledem, jaký má gen pro enzym divokého typu, avšak alespoň v poloze 326 obsahuje tento systém pro expresi místo desoxyribonukleotidu C nukleotid T. S výhodou dochází k expresi genu, v němž je ještě pozměněna v další baze, kde o záměru G v poloze 1063 za A.

S výhodou dochází v případě rekombinantní DNA k expresi některého z plasmidů pBT 109, DSM 4108P nebo pBT 119, DSM 4107P. Jako rekombinantní DNA je možno použít jakékoliv rekonbinantní dna, která obsahuje sled DNA, uvedený v DOS, č. 35 00 184 pro enzym divokého typu nebo jeho ekvivalent, přičemž však místo baze C v poloze 326 desoxyribonukleotidu je v uvedené poloze obsažena baze T. V takové rekombinantní DNA může mimoto dojít ještě k další výměně baží, a to k náhradě G v poloze 1063 baží A.

Jako systém pro expresi je výhodný mikroorganismus z čeledi E. coli nebo Pseudomonas putida. Zvláště výhodný je mikroorganismus E. coli ED 8654, DSM 2102 nebo Pseudomonas putida, DSM 2106. Další postupy podle vynálezu je možno uskutečnit pěstování těchto výhodných mikroorganismů a mimoto použitím mikroorganismu E. coli DSM 4105 a E. coli DSM 4106.

Takto získané nové typy kreatinamidinhydrolázy, které jsou stálejší než enzymy divokého typu, je možno použít ke stanovení obsahu kreatininu v krevním séru, v plasmě nebo v moči.

Při sledování kreatinamidinhydroláz, popsaných v DOS č. 35 00 184 bylo prokázáno, že tento enzym katalyzuje ten stupeň v reakčním schéma kreatinamidinhydroláza kreatin + voda -----------------------> sarkosin + močovina, který’určuje rychlost reakce. Zvýšení rychlosti reakce není jinak možno dosáhnout zvýšením množství enzymu za běžných reakčních podmínek. Při podmínkách pro stanovení obsahu kreatinu v séru, plasmě nebo moči, při nichž se užívá teploty 37 ”C, má však přírodní enzym omezenou stabilitu, což vede ke snížení přeměny

-2CZ 279006 B6 substrátu při uvedené teplotě. Kreatinamidinhydroláza, získaná způsobem podle vynálezu, v níž je alanin v poloze 109 nahrazen valinem má však při různých podmínkách, například při přidání smáčedla, téměř stejnou enzymatickou účinnost při zvýšené stálosti za přítomnosti smáčedla, jak je uvedeno v následující tabulce

I. V tabulce II je uvedeno chování enzymu za různých teplot.

Tabulka I

Enzymatické stanovení při teplotě 37 ”C

doba	kreatinamidinhydroláza	kreatinamidinhydroláza	podmínky pokusu
(min)	divokého typu (DOS 35 00184)	mutanta s valinem v
	DSM 3143 - srovnávací látka	poloze 109, DSM 4105 podle vynálezu
0	3,3 U/ml účinnost = 100 š	3,0 U/ml účinnost = 100 í	zkušební směs 1 ze
15	1,9 U/ml zbytková	3,0 U/ml zbytková	zkušebního balíčku
	účinnost = 59 ?	účinnost = 100 š	creatinin-PAP
I.			BM č. 839 434
30	0,6 U/ml zbytková	2,7 U/ml zbytková
	účinnost = 18 %	účinnost = 91 %
60	0,2 U/ml zbytková	2,5 U/ml zbytková
	účinnost = 6 %	účinnost = 83 %
0	3,3 U/ml účinnost = 100 %	3,0 U/ml účinnost = 100 í	ve 125 mmol/l fosfátového
15	0,7 U/ml zbytková	2,7 U/ml zbytková	pufru + smáčedlo
	účinnost = 21 $	účinnost = 91 %
II.
30	0,0 U/ml zbytková	2,7 U/ml zbytková
	účinnost = 0 %	účinnost = 91 š
60	0,0 U/ml zbytková	2,1 U/ml zbytková
	účinnost = 0 %	účinnost = 71 %

U = jednotka

Enzymy se inkubují za uvedených podmínek, stanovení se provádí při použití zkušebního balíčku Harnstoff (BM Best. č. 124 770)

-3CZ 279006 B6

Tabulka II

Stanovení enzymu za optimálních podmínek při různých teplotách

Podmínky pokusu: 20 mmol/1 fosfátového pufru o pH 8,0

1. creatinamidinhydroláza divokého typu s obsahem 1,05 mg bílkoviny/ml, účinnost 8,0 U/mg

2. kreatinamidinhydroláza podle vynálezu, 1,10 mg bílkoviny/ml, účinnost 8,7 U/mg, aminokyselinou v poloze 109 je valin.

teplota	Zbytková účinnost kreatinázy v % (inkubace	v min) 120
1. (DSM 3143)	2. 30	(DSM 4105) 60
3 0 min	60	120
37 °C	100	86	80	100	96	90
42 °C	57	36	13	84	73	63
47 °C	1	0,4	0	42	2	0
52 °C	0	-	-	3	-	-
Enzymy byly inkubovány za prováděno při použití balíčku	. uvedených Harnstoff	podmínek, stanovení bylo ( BM Best. č. 124 770) .

Enzym kreatinamidinhydroláza, získaný způsobem podle vynálezu, který kromě uvedené mutace obsahuje ještě jednu vyměněnou aminokyselinu má při stejné výchozí enzymatické účinnosti ještě vyšší stálost ve srovnání s enzymem divokého typu, jak je uvedeno v tabulce III v příkladu 1.

Při použití mutant kreatinamidinhydrolázy, získaných způsobem podle vynálezu je možno zabránit ztrátám enzymatické účinnosti při stanovení kreatininu, které dříve při použití enzymů divokého typu vznikaly v důsledku nestálosti těchto enzymů v nepřítomnosti smáčedel a při vyšší teplotě, takže tato stanovení je možno provádět také po delší časové období. Vzhledem k výhodnějším vlastnostem uvedených enzymů je také možno snížit množství enzymů při provádění zkoušek.

Praktické provedení způsobu podle vynálezu bude osvětleno následujícími příklady.

Příklad 1

Buňky E. coli DSM 4105, E. coli DSM 4106 a pro srovnání také buňky E. coli DSM 3143 podle DOS 35 00 184, byly pomnoženy přes noc ve fermentorech o obsahu 1 litru v živném prostředí následujícího složení: _ Úplné prostředí (kvasnice/extrakt z peptonu)

0,4 % glukózy

100 mmol/1 fosfátového pufru

-4CZ 279006 B6

Po 15 minutovém odstředění při 8 000 ot/min byly buňky rozdrceny v lisu a kreatinamidinhydroláza byla čištěna frakcionací při použití molekulárního síta (Sephacryl S 200).

Získané enzymy byly inkubovány za podmínek, uvedených v tabulce III, potom bylo provedeno enzymatické stanovení při použiti zkušebního baličku Harnstoff (BM Best. č. 124 770).

V tabulce III je uvedena stálost mutant kreatinamidinhydroláz podle vynálezu ve srovnání s enzymem divokého typu podle DOS 35 00 184 /E. coli DSM 3143).

Tabulka III

Stálost při teplotě 37 °C

Podmínky pokusu: zkušební směs 1 ze zkušebního baličku Creatinin-PAP (BM Best. č. 839 434)

Výchozí účinnost : 12 U/ml - 100 % kmen kreatinamidinhydroláza zbytková účinnost po z E. coli 15 30 45 60 min kódový plasmid (% výchozí účinnosti)

DSM	3143	pBT	2a-l	DSM	3148P	69	51	39	27
DSM	4105	pBT	109	DSM	4108P	96	90	84	84
DSM	4106	pBT	119	DSM	4107P	102	102	102	102

Srovnání Michaelisových konstant (Km) při 37 °C

Podmínky pokusu: 0,1 mol/1 tris-HCl, pH 8,0 (optimální podmínky)

kmen	kódový plasmid	Km, mmol/1
DSM 3143	pBT 2a-l DSM 3148P	25
DSM 4105	pBT 109 DSM 4108P	20
DSM 4106	pBT 119 DSM 4107P	16

Příklad 2

Stabilní mutanta kreatinamidinhydrolázy z mikroorganismu E. coli, DSM 4105, který obsahuje plasmid pBT 109, byla izolována ze 100 litrů fermentačního prostředí způsobem, popsaným v DOS č. 35 00 184. Bylo získáno 121 g bílkoviny se specifickou účinností 10,4 U/mg. To odpovídá celkovému výtěžku 63 %. -

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kreatinamidinhydroláza, katalyzujicí reakci kreatin + voda ----> sarkosin + močovina, v níž v poloze 109 řetězce aminokyselin enzymu divokého typu je alanin nahrazen aminokyselinou valinem.
2. 2. Kreatinamidinhydroláza podle nároku 1, která obsahuje navíc v poloze 355 místo valinu methionin.
3. 3. Plasmid pBT 109, DSM 4108P, obsahující gen pro kreatinamidinhydrolázu podle nároku 1.
4. 4. Plasmid pBT 119, DSM 4107P, obsahující gen pro kreatinamidinhydrolázu podle nároku 2.
5. 5. Mikroorganismus E. coli, DSM 4105, obsahující plasmid pBT 109.
6. 6. Mikroorganismus E. coli, DSM 4106, obsahující plasmid pBT 119.
7. 7. Způsob výroby kreatinamidinhydrolázy podle nároku 1, při němž se genetickým inženýrstvím dosáhne v mikrobiální produkční buňce exprese rekonbinantní DNA, obsahující gen pro kreatinamidinhydrolázu, vyznačující se tím, že se jako gen pro kreatinamidinhydrolázu užije gen, který v poloze 326 přírodního genu místo C obsahuje desoxynukleotid T nebo DNA, obsahující ve svém genetickém kódu ekvivalentní řetězec pro stejný sled aminokyselin a jako systém pro expresi se užije mikroorganismus z čeledi E. coli nebo Pseudomonas putida.
8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se jako exprese rekombinantni DNA dosáhne exprese plasmidu pBT 109, DSM 4108P.
9. 9. Způsob výroby kreatinamidinhydrolázy podle nároku 2, při němž se dosáhne genetickým inženýrstvím ve vhodném systému pro expresi exprese rekombinantni DNA, která obsahuje gen pro kreatinamidinhydrolázu, vyznačující se tím, že se jako gen pro kreatinamindinhydrolázu užije gen, který kromě záměny baze C za bázi T v poloze 326 přírodního genu obsahuje ještě další mutaci v poloze 355, při které je valin nahrazen methioninem.
10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se dosáhne exprese genu pro rekombinantni kreatinamidinhydrolázu, který v poloze 1063 obsahuje mutaci, spočívající ,v záměně baze G za bázi A.
11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se jako exprese rekombinantni DNA dosáhne exprese plasmidu pBT 119,. DSM 4107P.

    -6CZ 279006 B6

    12.Způsob podle nároku 8, vyznačující s e t i m, že se užije E. coli ED 8654, DSM 2102. 13.Způsob podle nároku 8, vyznačující s e t i m, že se užije Pseudomonas putida DSM 2106. 14.Způsob podle nároků 7 a 8, vyznaču j i c i s e tím, že se pěstuje E. coli, DSM 4105. 15.Způsob podle nároků 9 a 10 nebo 11, v y z n a č u j i c i se t i m, že se pěstuje E. coli, DSM 4106.
12. 16.Použití kreatinamidinhydrolázy podle nároků 1 a 2, ke stanovení obsahu kreatinu v séru, plasmě nebo moči.