CZ254498A3 - Analogy coralynu jako inhibitory topoisomerasy - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se týká analogů coralynu jako inhibitorů topoizomerasy pro léčbu nádorů.

I Dosavadní stav techniky

DNA topoisomerasy představují jedinečnou třídu jaderných enzymů, které mění topologický stav DNA rozpojováním a opětovným spojováním fosfodiesterového skeletu DNA. Savčí topoisomerasa I je schopná alterovat topologii DNA přechodným rozpojením jednoho řetězce DNA, zatímco topoisomerasa II způsobuje rozpojení dvou řetězců. Inhibice topoisomeras byla nedávno poznána jako atraktivní farmakologický cíl pro vývoj nových protinádorových chemoterapeutických činidel. Alkaloidy a jejich deriváty byly zkoumány jako potenciální protinádorová činidla, včetně camptothecinu a berberínu (Hahn et al., Antibiotics, Svazek 3, Got.tlieb et al., (vyd.), Springer: New York, str. 577 - 584 (1975); Shideman, Bull. Nati. Fórmulary Committee, 18:3 (1950); Bhakunni et al., The Alkaloids,, svazek 28, Brossi, A. (vyd.), Academie Press: New York, str. 95 - 181 (1986); Suffness et al., The Alkaloids, svazek XXV, Brossi, A. (vyd.), Academie Press: New York, str. 178 - 197 (1985).

I | Rozsáhlé studie s camptothecinem a jeho deriváty určily, že buněčná topoisomerasa I je molekulárním cílem pro protinádorový alkaloid camptothecin (Hsiang et al., Cancer Res., 48: 1722 - 1726 (1988)). Nicméně, některé linie nádorových buněk vykazovaly resistenci na camptothecin.

• 9 9 9 99

Důkaz, že topoisomerasa I je molekulárním cílem pro camptothecin stimuloval další identifikaci a vývoj dalších protinádorových sloučenin zaměřených na topoisomerasu I (inhibitory topoisomerasy I). Mezi tyto patří aktinomycin D, morfolinodoxorubicin, bis- a tris-benzimidazoly vážící se na menší drážku DNA, indolkarbazolové deriváty, bulgarein, intoplicin, saintopin, indolochinolindiony, nitidinové deriváty a berberinové deriváty. Mnoho z těchto sloučenin jsou také duální inhibitory topoisomerasy I a II. Ačkoliv počet nových inhibitorů topoisomerasy I rychle, vzrůstá, nebylo pro žádný jiný inhibitor topoisomerasy I kromě camptothecinu prokázáno, že by byl odpovědný za usmrcování-'buněk. Podobně, je nejasné, zda interkalační model DNA vazby, který je zásadní pro ovlivnění topoisomerasy I, je odpovědný za ovlivnění topoisomerasy I pro duální inhibitory.

Mnoho studií zaměřilo pozornost na široce rozšířenou třídu alkaloidů, jejichž struktura je příbuzná s izochinolinovým kruhem. Dvě z těchto sloučenin, benzofenantridin, nitidin a příbuzný alkaloid fagaronin, mají značný potenciál pro indukci topoisomerasou I zprostředkovaného štěpení DNA in vitro (Wang et al., Chem. Res. Toxicol. 6: 813 - 818 (1993)), U několika sloučenin patřících do rodiny protoberberinů, u kterých jsou známé jejich protinádorové aktivity u zvířat, byla také ukázána ovlivnění topoisomerasy I. Berberin představuje jeden z nej intenzivněji studovaných přirozeně se vyskytujících protoberberlnových alkaloidů a popisuje se u něj slabá protinádorová aktivita proti P-388 leukémii u myší (Suffness et al., The Alkaloids, Svazek XXV, Brossi, A. (vyd.), Academie Press: New York, str. 178 - 197 (1985).

• · • · ··

Coralyn, alkaloidový analog protoberberínu, má výraznější pr.otinádorovou aktivitu ve srovnání s berberinem a vykazuj-e signifikantní aktivitu in vivo u myší. proti L1210 a,P388 leukémiím (Zee-Cheng et al.,J. Med. Chem. 17: 347 (1974); Zee-Cheng et al., J. Med. Chem. 19: 882 (1976)). Ačkoliv molekulární základ jeho protinádorové aktivity nebyl identifikován, spekulovalo se, že schopnost vázat se na duplexní a triplexní DNA může způsobovat pozorovanou aktivitu proti leukémii (Wilson et al., J. Med. Chem. 19: 1261 (1976); Lee et al., Biochemistry 32: 5591 - 5597 (1993)). Protinádořová aktivita coralynu, ve spojení s jeho relativně nízkou toxicitou, vyvolala •i; studie syntesy mnoha derivátů (Zee-Cheng et alf, j. Med. Chem.

17: 347 (1974), a-ukázalo se, že přítomnost methylového substituentu v 8-pozici a nenasycená vazba v 5,6-pozici coralynu jsou silně asociovány s jeho protinádorovou aktivitou proti L1210 a P388 leukémiím u myší (Messmer et al., J. Pharm. Sci., 61: 1858 - 1859 (1972); Cushman et al., J. Med. Chem., 28: 1031 - 1036 (1985); Stermitz et al., J. Med. Chem. 18: 708 - 713 (1975);

Janin et al., J. Med. Chem. 36: 3686 - 3692 (1993)).

Nicméně, i přes snahy o vývoj bezpečných a účinných terapeutik 'existuje potřeba protinádorových činidel se zlepšenou cytotoxičitou, která jsou účinná proti nádorovým'buňkám resistentním na léky.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje sloučeniny podle vzorce:

(I) « · • ·* to' to · * · · * • ··♦ · * · · λ ·· · · · to kde R_x, R₂, R₃, R_g a R₇ jsou nezávisle vybrány z H, OH a (C_i__e) alkoxy, preferovaně -OCH₃; R^ je H nebo (C_x)alkyl, preferovaně -OCH₃; R_s je Η, (0_χ__β)alkyl, preferovaně -CH , nebo není přítomen; a R_e a R^jsou -CH=CH-, -(CH_a)₂ nebo nejsou přítomny.

Alternativně jsou R_, a R₃ společně -OCH₂O-; R a R_a jsou společně -OCH^O-; R_g a R^ jsou společně -OCH^O-.

V jednom provedení jsou R₂ a R₃ dohromady -OCH^O-. Podle dalšího provedení je R₀ -CH=CH-, R_g není přítomen a R₃ je Η. V jiném provedení je R_g .CH=CH- nebo -{CH/λ, R^ nebo R₂ je H a R_s a Κθ nejsou přítomny. V ještě dalším provedení jsou R_g a R_e oba nepřítomny.

Sloučeniny podle vzorce I vykazují zlepšenou inhibiční aktivitu topoisomerasy I, ve vztahu k výchozím sloučeninám, 'a jsou také účinnými inhibitory topoisomerasy II. Předkládané sloučeniny jsou také účinnými cytotoxickými činidly pro nádorové buňky a mají cytotoxickou aktivitu pro lidské nádorové buněčné linie resistentní na camptothecin.

Dále jsou poskytnuty metody pro inhibici růstu nádorových buněk, kde uvedené metody obsahují podání množství sloučeniny podle vzorce (I) savcům postiženým nádorem, kde uvedené množství je účinné pro inhibici růstu takových nádorových buněk. Sloučenina nebo její sole mohou být podány v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

* · • · v ···

DNA topoisomerasy jsou jaderné enzymy odpovědné za modifikaci topologického stavu DNA. Analoga corylanu byla syntetizována a byla hodnocena jejich aktivita na ovlivnění topoisomerasy I a topoisomerasy II. U těchto analogů byla také hodnocena, jejich cytotoxicita pro lidskou lymfoblastovou buněčnou linii RPIM 8402 a její variantu resistentní na camptothecin, CPTK-5; buněčnou linii epidermálního karcinomu KB 3-1; a glioblastomovou buněčnou linii (CNS nádor) SF-268.

Farmakologická aktivita těchto analogů vykazovala silnou závislost na charakteru substituce a na charakteru substituentů. Bylo také syntetizováno několik 1-benzylizochinolinů a ^Λ 3-fenylizochinolinů. Tyto sloučeniny, které inkorporují pouze část kruhové struktury coralynu, byly hodnoceny na svůj účinek jako inhibitory topoisomerasy a na svou cytotoxicitu. Tyto studie struktura-aktivita naznačily, že strukturální rigidita asociovaná se systémem coralynového kruhu může být kritická pro farmakologickou aktivitu. Přítomnost 3,4-methylendioxy substituentu na těchto analogách coralynu byla obecně asociována se zvýšenou aktivitou inhibice topoisomerasy.

5,6-dihydro-3,4-methylendioxy-10,11-dimethyloxydibenzo(a, g) chinolizinium chlorid byl nej silnější inhibitor, topoisomerasy I z hodnocených analogů coralynu a měl podobnou aktivitu jako camptothecin. Tento analog měl také neobyčejnou aktivitu jako inhibitor topoisomerasy II.

Podle vynálezu jsou nádorové buňky inhibovány podáním účinného množství sloučenin podle vzorce (I) savcům postiženým nádorem.

Jak je zde použito, účinné množství je množství, které vede k inhibici růstu cílových nádorových buněk. Jak je zde popsáno, vhodná dávka bude v rozmezí od 0,5 do 100 mg/kg tělesné hmotnosti

0 0 · · « 0 00·· 0 0 00 · · β 0 0 0 ^ř 0 0 » 0 0 · » 000 · 000» « 0 000 · 00»

0000 00« 0« 00 0· 0* a den.

O· přípravcích zde popsaných se soudí, že budou účinné v léčbě solidních savčích nádorů nebo hematologických malignit. Tyto solidní nádory zahrnují nádory hlavy a krku, plic, mesoteliom, nádory mediastina, jícnu, žaludku, slinivky břišní, hepatobiliárního systému, tenkého střeva, tlustého střeva, konečníku, řitě, ledvin, močovodu, močového měchýře, prostaty, močové trubice, pyje, varlat, gynekologických orgánů, vaječníků, prsů, endokriního systému, kůže a centrálního nervového systému; sarkomy měkkých tkání a kostí; a melanom kožního nebo nitroočního původu. Hematologické malignity zahrnují dětské leukemie a lymfomý, Hodgkinovu nemoc, lymfocytární a kožní lymfomy, akutní a chronickou leukémii, neoplasie 2 plasmatických buněk a nádory asociované s AIDS. Preferovaným savčím druhem pro léčbu jsou lidé a domestikovaná zvířata.

Pro přípravu dibenzo(a,g)chinolizinium derivátů byly použity metody podobné metodám popsaným v literatuře (Zee-Chang et al., <a

J. Pharm. Sci. 61: 969 - 971 (1972)). Obecný použitý přístup syntesy je načrtnut ve schématu 1. Reakce vhodně substituovaného dimethoxyfenethylaminu s 3,4-dimethoxyfenylacetylchloridem dává fenylacetamidy, 5a-c, které jsou cyklizovány za přítomnosti oxychloridu fosforitého na 3,4-dihydro-l-benzylizochinolinové meziprodukty, 6a-c. Tyto dihydroizochinolinové meziprodukty mohou být přímo přeměněny na 5,6-dihydrobenzo{a,g)chinolizinium deriváty, 7a-c, za použití anhydridu kyseliny octové za přítomnosti dýmavé H₂SO₄- Alternativně mohou být 6a-c přeměněny na 8a-c, za Vilsmeier-Haackových podmínek (Le Quang et al., Acad.

Sci., ser. C 1340 (1968)). Dihydroizochinolinové meziprodukty,

6a-c, mohou být také oxidovány na své l-benzylizochinolinové « · • · · • ft * · ♦ · ·· • φ · · · φ φ * · φ φ · · ·· φ ’ φφφ · φφφ ·♦· ·« «« ·« deriváty, 9a-c, za použití paladia na uhlíku. Ošetření 9a-c anhydridem kyseliny octové za přítomnosti H^SO^ dává 8-methýldibenzo(a,g)chinolizinium deriváty 2a-c. Za Vilsmeier-Haackových podmínek jsou 9a-c přeměněny na dibenzo(a,g)chinoliziniumchloridové deriváty 10a-c.

Schéma 1

2a-c . «4 = CH3 10a-e. R4 = H

11a Rj = Rj = OCHj 11b. Rl R₂ = -OCÍD-

ÍŠ 14a R,, Π Rj = OCHj

14b, R,. Rj = -OCHjOSyntetické metody pro přípravu l-^methyl-3fenylizochinolinových derivátů jsou načrtnuty ve schématu 2. Friedel-Craftsova acylace 1,2-dimethoxybenzenu a l,2-(methylendioxy)benzenu s 3,4-dimethoxyfenyl-acetylchloridem za použití mírně modifikovaného postupu popsaného v literatuře

Φ » φ · φ · · φφφ* • φφφ φφφφ · φ φφ • Φφφφ φφφ » Φφφ · φ • φ « « φφφ «φφφ φφφ φφ φφ φφ φφ dává ketonové meziprodukty, lla a 11b, v příslušném pořadí. Tyto ketony byly přeměněny na 6,7-dimethoxy-l-methyl-3-(3,4dimethoxyfenyl)izochinolin 12a a 6,7-methylendioxy-l-methyl-3(3,4-dimethoxyfenyl)-izochinolin 12b, reakcí s acetonitrilem za přítomnosti Ρ₂0_ξ.

Štěpení methoxy skupin 12a bylo provedeno za použití borontribromidu v chloroformu za zisku tetrahydroxyderivátu 13. Sloučeniny 12a, 12b a 13 byly přeměněny na jejich

2-methylizochinolinium deriváty 14a, 14b a 15, v příslušném pořadí, ošetřením dimethylsulfátem.

Relativní aktivita coralynu a příbuzných sloučenin jako inhibitorů savčí topoisomerasy je uvedena v tabulce l v příkladech. Jak je ukázáno v této tabulce, coralyn a jeho analoga mají zvýrazněnou aktivitu, v některých případech srovnatelnou s camptothecinem, jako inhibitory savčí topoisomerasy I. Předešlé studie zabývající se vlivem struktury serie derivátů coralynu na 1.1210 a P388 leukemie u myší ukázaly, že přítomnost 8-alkylové substituce, ploŠnost a strukturální rigidity, jsou kritickými faktory pro protinádorovou aktivitu. V této studii byla hodnocena analoga, která mají methoxy substituenty v místech, která jsou ekvivalentní bud' 2,3-pozici (2a, 7a, 8a, 9a, 10a) nebo 3,4-pozici (2b, 7b, 8b, 9b, 10b) coralynu. Kromě toho byla také syntetizována 3,4-methylendioxy-substituovaná analoga (2c, 7c, 8c, 9c, 10c) a byly hodnoceny jejich farmakologické aktivity. Methylendioxy skupina ve 3,4-pozici těchto coralynových analog se zdá být obecným faktorem asociovaným s jejich potenciálem inhibice topoisomerasy. Methylendioxy deriváty 2c, 7c, 8c a 10c nemají pouze inhibiční aktivitu pro topoisomerasu I srovnatelnou s coralynem, ale mají také významnou • ♦ ·<

-- v »1 »» » • · « · '-··· • · «fcfcfc ·ββ fc O • fc · · · * fcfc fcfc fcfc fc· aktivitu jako inhibitory topoisomerasy II. Protože zde není žádný důkaz, který by naznačoval, že molekulární mechanismus inhibice topoisomerasy I je ve vztahu k mechanismu odpovědnému za inhibici topoisomerasy II, bylo pozorování, že pro tyto analogy je pozorována zvýšená aktivita pro obě topoisomerasy neočekávané.

Tyto výsledky jsou, nicméně, konzistentní, z hlediska skutečnosti, že tato modifikace charakteru substituce a substituentů umožňuje těmto molekulám blíže napodobit charakter alkoxy substituce silného inhibitoru topoisomerasy I a II, nitidinu.

Při hodnocení relativní síly serie coralynových analogů jako inhibitorů topoisomerasy bylo také zaznamenáno několik rozdílů v těch strukturálních požadavcích, které zvyšují aktivitu ve srovnání se vztahy struktura-aktivita popsanými pro in vivo protinadorovou aktivitu různých derivátů coralynu. Je zejména zajímavé, že nej lepší inhibitor topoisomerasy I v této sérii sloučenin (8c) nemá 8-alkylový substituent, což neodpovídá studiím struktura-aktivita protinádorové aktivity u myší. Silná aktivita 8c se projevuje úplným štěpením DNA pozorovaným v přítomnosti topoisomerasy I, které probíhá při téměř ekvivalentních koncentracích pro 8c (0,27 μΜ, 0,1 Mg/ml) a camptothecin (0,29 μΜ, 0,1 Mg/ml).

Kromě toho, 8c má smyčku ve své jinak plošné molekule, způsobenou nenasycením 5,6-pozice. V předešlých studiích protinádorové aktivity derivátů coralynu u myší byla přítomnost nenasycené vazby v této pozici asociována se zmenšením aktivity. Všechny ostatní podobně substituované molekuly 2c, 7c a 10c, které jsou buď plošné a/nebo mají 8-methylový substituent, jsou jako inhibitory topoisomerasy I 10-krát méně aktivní ve srovnání s 8c. Berberin, který je poziční izomer 8c, je jako inhibitor • * « * • ··

Φ · φ φ * * φ * e · · · ·· • ♦·· « ··· · · • · Φ · · · »· ·· * · · · topoisomerasy I inaktivní při testování za stejných podmínek. Sloučeniny 2b, 7b, 8b a 10b nevykazují signifikantní aktivitu jako inhibitory topoisomerasy I. Tak, ve vztahu k

3.4- methylendioxy substituentu, dimethoxy substituce ve

3.4- pozici těchto analog coralynu dramaticky mění jeich· potenciál jako inhibitorů topoisomerasy I. Zatímco 8c vykazuje mírnou aktivitu jako inhibitor topoisomerasy II, několik z těchto analogů, včetně 2c a 10c, vykazuje silnou aktivitu jako inhibitory topoisomerasy II (tabulka 1) .

Všechny 2,3-dimethoxy coralynové deriváty, s výjimkou 10a, jsou selektivní inhibitory topoisomerasy L-bez signifikantní aktivity jako inhibitory topoisomerasy II. Oproti výsledkům pozorovaným pro 2a, 7a, 8a byla sloučenina 10a neaktivní jako inhibitor topoisomerasy I a vykazovala signifikantní aktivitu proti topoisomerase II. Základ pro tento výjimečný rozdíl v aktivitě asociovaný se schopností 10a a jiných 2,3-dimethoxy coralynových derivátů inhibovat topoisomerasy je v této době nejasný.

Strukturální rigidita může být zásadním požadavkem pro zachování aktivity inhibice topoisomeras v této sérii sloučenin.' Sloučeniny 9a, 9b a 9c mohou být považovány za analogy coralynu s otevřeným kruhem, které nemají uhlík v 8-pozici stejně jako kationtový náboj asociovaný s kvartérní ammoniovou skupinou. Všechny tři tyto analogy vykazují velmi slabou aktivitu jako inhibitory topoisomerasy I nebo II.

l-methyl-3-fenyl izochinolinové deriváty 12a a 12b a jejich N-methylované kvarternizované analogy 14a a 14b mohou být považovány za analogy s otevřeným kruhem bez C₅-C_g skupiny » φ φ φ·· «V » φ'... Φ φ Φ φ φ φ φ φφφ φ φφφφ φφφφ φ φ φ φ φ φ * φφ φφ φφ · · coralynu, které nevykazují signifikantní inhibiční aktivitu topoisomerasy. Také sloučeniny 13 a 15, které jsou polyfenolické analogy sloučenin 12a/12b a 14a/14b, v příslušném pořadí, byly relativně neúčinné jako inhibitory topoisomerasy I nebo II.

Cytotoxicita coralynu a těchto analog pro lidskou lymfoblastovou buněčnou linii RPMI 8402 je shrnuta v tabulce 1. Nebyla pozorována žádná jasná korelace mezi cytotoxicitou, jak je určena v MTA testu, a účinností jako inhibitor buď topoisomerasy I nebo II. Oproti camptothecinu existují tyto deriváty jako kvarterní amoniové sloučeniny. Na základě vnitřní aktivity několika těchto derivátů inhibovat topoisomerasu I je možné, že kvarterní amoniová funkce asociovaná se strukturou strukturálně rigidních analog coralynu může být hlavním faktorem v limitování buněčné absorpce a zmírňování jejich cytotoxické aktivity. U fúzovaných plošných kationtových aromatických kruhových systémů coralynu a berberinu bylo ukázáno, že způsobují interkalaci s DNA. Kromě toho, bylo ukázáno, že coralyn se váže na DNA triplexy. Rozsah, ve kterém jsou tyto procesy ve vztahu k inhibici topoisomeras a role kationtové skupiny v těchto molekulárních interakcích nebyla dosud plně určena.

Několik ze syntetizovaných analogů, které byly testovány na cytotoxicitu v této studii a které byly inaktivní jako inhibitory topoisomeras, vykazovalo signifikantní cytotoxicitu. Konkrétně, sloučeniny 9c, 13, 14b a 15 měly významnou cytotoxicitu pro RPMI 8402 buňky. V těchto případech je specifický farmakologický cíl asociovaný s jejich cytotoxicitou neznámý.

Cytotoxická aktivita těchto sloučenin byla také hodnocena na buněčné linii resistentní na camptothecin, CPT-K5, která obsahuje • ··· mutantní formu topoisomerasy I. Při 2koumání cytotoxicity silnějších inhibitorů topoisomerasy I v této studii (2a, 2c, 7a, 8a, 8c, 10c) zde byly rozdíly mezi IC_so hodnotami získanými pro CPT-K5 buňky ve srovnání s hodnotami získanými pro RPMI 8402 buňky. Tato data mohou být považována za náznak toho, že farmakologicky cíl asociovaný s cytotoxicitou těchto coralynových derivátů souvisí s jejich inhibiční aktivitou pro topoisomerasu I. Nicméně, z hlediska podobných rozdílů, které mohou být zaznamenány pro analogy, které byly inaktivní jako inhibitory topoisomerasy I, není možné připsat tento rozdíl v účinku specificky mutantní formě topoisomerasy I v CPT-K5. Je také zřejmé, že jakýkoliv rozdíl v cytotoxicitě mezi těmito'buněčnými liniemi pro hodnocené sloučeniny je minimální ve vztahu ke camptothecinu.

Tato studie ukazuje, že malé strukturální variace mezi analogy coralynu mohou mít významný účinek na jejich aktivitu buď jako inhibitorů topoisomerasy I, nebo topoisomerasy II. Analogy coralynu vykazují zvýšenou aktivitu jak jako inhibitory topoisomerasy I, tak topoisomerasy II v těch případech, kde je methylendioxy substituent v 3,4-pozici. Tyto výsledky odpovídají silné aktivitě nitidinu jako inhibitoru topoisomerasy II a prostorovým vztahům mezi nitidinem a těmito deriváty coralynu. V této studii měly analogy coralynu se silnou aktivitou jako inhibitory topoisomerasy I s nízkou aktivitou jako inhibitory topoisomerasy II methoxy substituent v 2,3-pozici. Tato data naznačují, že podobně substituované analogy nitidinu, t.j.

1,2-dimethoxy deriváty v protikladu k jeho 2,3-methylendioxy substituentu, by mohly vykazovat podobnou selektivitu z hlediska jejich potenciálu inhibovat buď savčí topoisomerasu I nebo II.

··* > · · * · · ·» « * ··· ♦ ·*· « * η · t · · *

Η Α· ·· **

Sloučenina 7c byla také testována na glioblastomové buněčné linii SF-268. Výsledky jsou presentovány v tabulce 2. Účinnost a selektivita analogu proti takovým nádorovým buňkám naznačuje, že může probíhat aktivní transport. Podání analogů podle předkládaného vynálezu iňtřathekální injekcí může poskytnout prostředky pro dosažení selektivní cytotoxicity proti nádorům CNS s malou systémovou toxicitou.

Mohou být použity farmakologicky přijatelné sole biologicky aktivních sloučenin zde popsaných, stejně jako mohou být použity při provádění nárokovaných způsobů. Farmaceuticky přijatelné sole mohou být tvořeny za použití organických nebo anorganických baží, jako je NaOH, Na(CO₃)₂, NaHCO₃, KOH a podobně, stejně jako za použití kyselin, jako je kyselina chlorovodíková a sulfoocotvá a podobně.

Ačkoliv sloučeniny zde popsané a/nebo jejich sole mohou být podány jako Čisté chemické látky, je preferováno dodání aktivní složky ve formě farmaceutického přípravku. Vynález tak dále poskytuje použití farmaceutického přípravku obsahujícího jednu nebo více sloučenin a/nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí spolu s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči a, volitelně, jinou terapeutickou a/nebo profylaktickou přísadou. Nosič musí být přijatelný ve smyslu kompatibility s jinými složkami přípravku a nesmí být škodlivý pro příjemce přípravku.

Farmaceutické přípravky zahrnují ty, které jsou vhodné pro orální nebo parenterální (zahrnující intramuskulární, subkutánní a intravenosní) podání. Přípravek může být, pokud je to vhodné, předkládán v oddělených jednotkových dávkových formách a může být •*· * ··* · • · · • · · · ’ připraven jakýmikoliv metodami dobře známými v oboru farmacie. Také metody obsahují kroky asociování aktivní sloučeniny s kapalnými nosiči, pevnými matricemi, semi-solidními nosiči, jemně dělenými pevnými nosiči nebo jejich kombinacemi, a potom, pokud je to nutné, krok tvarování produktu do požadovaného systému pro podání.

Farmaceutické přípravky vhodné pro orální podání mohou být dodány ve formě jednotkových dávkových forem jako jsou kapsle z tuhé nebo měkké želatiny, oplatky nebo tablety, každá obsahuje předem určené množství aktivní složky; ve formě prášku nebo granulí; ve formě roztoku, suspenze nebo jako emulse. Aktivní složka může být také ve formě bolusu, lektvaru nebo pasty.

Tablety a kapsle pro orální podání mohou obsahovat běžné přísady jako jsou pojivá, plnidla, kluzná činidla, činidla podporující rozpadavost, nebo zvlhčovači činidla. Tablety mohou být potaženy metodami dobře známými v oboru, např. enterálním potahem.

Orální kapalné přípravky mohou být ve formě, například, vodných nebo olejových suspensi, roztoků, emulsí, syrupů nebo elixírů, nebo mohou být dodány ve formě suchého produktu pro rekonstituci vodou nebo vhodným vehikulem před použitím. Takové kapalné přípravky mohou obsahovat vhodné přísady jako jsou suspendující činidla, emulsifikační činidla, non-vodná vehikula (kterými mohou být jedlé oleje) nebo konzervační činidla.

Sloučeniny mohou být také formulovány pro parenterální podání (např. injekcí, například bolusovou injekcí nebo kontinuální infusí) a mohou být dodávány ve formě jednotlivých dávek jako ampule, předem naplněné injekční stříkačky, malé bolusové infusní vaky nebo jako zásobníky s více dávkami s přidaným konzervačním *

«0 0 0 0

9 0

0« 0« činidlem. Přípravek může mít formu suspenzí, roztoků nebo emulsí v olejovém nebo ve vodném vehikulu a může obsahovat činidla pro formulování jako jsou suspendující, stabilizující a/nebo dispersní činidla. Alternativně může být aktivní složka ve formě prášku, získaném aseptickou izolací sterilní pevné látky nebo lyofilizací z roztoku, pro rekonstituci vhodným vehikulem, např. sterilní apyrogenní vodou, před použitím.

Pro lokální podání na epidermís může být sloučenina formulována jako mast, krém nebo lotio, nebo jako aktivní složka transdermální náplasti. Vhodné systémy pro transdermální podání jsou popsány například v Fisher et al., (U.S. patent č. 4788603) nebo Bawas et al., (U.S. patent č. 4931279, 4668504 a 4713224). Masti a krémy mohou být, například, formulovány s vodným nebo s olejovým základem s přidáním vhodného zahuščujícím a/nebo gelotvorného činidla. Lotia mohou být formulována s vodným nebo s olejovým zákadem a obecně budou obsahovat jedno nebo více emulsifikačních činidel, stabilizujících činidel, disperzních Činidel, suspendujících činidel, zahuščovacích činidel nebo barvících činidel. Aktivní složka může být také podána iontoforesou, například jak je to popsáno v U.S. patentech č. 4140122, 4383529 nebo 4051842.

Sloučeniny vhodné pro lokální podání.do úst obsahují jednotkové dávkové formy jako jsou pastilky obsahující aktivní složku v ochuceném základu, obvykle sacharose nebo akacii nebo tragantu; pastilky obsahující aktivní složku v inertním základu jako je želatina a glycerin nebo sacharosa a akacia;

mukoadherentní gely a kloktadla obsahující aktivní složku ve vhodném kapalném nosiči.

β β ·*·· ···

Pokud je to žádoucí, mohou být výše popsané přípravky adaptovány tak, aby byly poskytnuty přípravky se zpomaleným uvolňováním aktivní složky, například jejich kombinováním s určitými hydrofilními polymerovými matricemi, jako jsou například přirozené gely, syntetické polymerní gely nebo jejich směsi.

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu mohou také obsahovat další přísady, jako jsou ochucovací látkyt, barviva, antimikrobiální činidla nebo konzervační látky.

Dále bude ujasněno, že množství sloučeniny, nebo její aktivní soli nebo derivátu, nutné pro použití v léčbě, se bude lišit nejenom podle určité vybrané soli, ale také podle způsobu podání, charakteru léčeného stavu a věku a stavu pacienta, a bude určeno ošetřujícím lékařem nebo klinikem.

Nicméně, obecně bude vhodná dávka v rozmezí od asi 0,5 do asi 100 mg/kg, například od asi 10 do asi 75 mg/kg tělesné hmotnosti a den, jako je například dávka od asi 3 do asi 50 mg na kilogram tělesné hmotnosti příjemce a den, preferovaně bude v rozmezí 6 až 90 mg/kg/den a nejlépe bude v rozmezí 15 až 60 mg/kg/den.

Sloučenina je výhodně podána v jednotkové dávkové formě, například ve formě obsahující 5 až 1000 mg, lépe 10 až 750 mg a nejlépe 50 až 500 mg aktivní složky na jednotkovou dávkovou formu.

Ideálně by měla být aktivní složka podána tak, aby dosáhla píku plasmatické koncentrace aktivní sloučeniny od asi 0,5 až 75 μΜ, preferovaně okolo l až 50 μΜ a nejlépe okolo 2 až asi 30 μΜ. Tohoto může být dosaženo, například, intravenosní injekcí 0,05 až *

Β Β φ » ♦ ΒΒΒ φ 9 Β Β · φ ' · ·· · ·

Φ Β Β Β Β · · *Φ ·· ·* ··

5% roztoku aktivní složky, volitelně v salinickém roztoku, nebo orálním podáním bolusu obsahujícího okolo 1 - 100 mg aktivní složky. Požadované krevní hladiny mohou být udržovány kontinuální infúsí s rychlostí podání 0,01 - 5,0 mg/kg/hodinu nebo přerušovanou infusí obsahující okolo 0,4 - 15 mg/kg aktivní složky.

Požadovaná dávka může být vhodně přítomna v jediné dávce nebo může být rozdělena do několika dávek podaných ve vhodných intervalech, například jako dvě, tři, čtyři nebo více dávek za den. Jednotlivé rozdělené dávky mohou být dále děleny, například do mnoha jednotlivých volně oddělených podání, jako jsou opakované inhalace z inhalátoru nebo aplikace mnoha kapek do oka.

Vynález byl popsán s ohledem na různá specifická a preferovaná provedení a techniky. Nicméně,, mělo by být jasné, že může být provedeno mnoho variací a modifikací, které Spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Následující příklady jsou míněny jako ilustrace, nikoliv jako omezení vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - obecně

Body tání jsou určeny Thomas-Hoover Unimelt kapilárním přístrojem pro měření bodu tání. Data infračerveného spektra (IR) jsou získána na Perkin-Elmer 1600 Fourier Transform spektrofotometru a jsou vyjádřena v cm¹. Protonové (^XH NMR) a uhlíkové (^X3C NMR) nukleární magnetické resonance jsou * fl ·· • · • fl · · «« · fl • · · ♦ · ·· zaznamenávány na Varian Gemini-200 Fourier Transform spektrometru při 200 MHz a 50 MHz, v příslušném pořadí. NMR spektra jsou zaznamenávána v CDC1₃ (pokud není uvedeno jinak) s chemickými posuny popisovanými v δ jednotkách dolů od tetramethylsilanu (TMS). Interakční konstanty jsou popsány v hertzech. Hmotnostní spektra jsou získána od Washington University Resource for Biomedical and Bio-Organic Mass Spectrometry. Chromatografie na koloně označuje rychlou chromatografii provedenou na SiliTech 32 - 63 μπι, (ICN Biomedicals, Eschwegge, Ger.) za použití ukázaného systému rozpouštědel. Elementární analýzy jsou provedeny Atlantic Microlabs, lne., Norcross, GA.

Příklad 2 - Obecný postup pro syntesu 8-methyldibenzo-(a,g)chinoliziniumacetosulfatů (2a-c)

Dýmavá (20%) kyselina sírová (1 ml) se přidá ke 4 ml čerstvě destilovaného anhydridů kyseliny octové vzešlého z prudké exotermické reakce a směs se stane vínově zbarvenou. Tato směs se zahřeje na 85 - 90 °C na 10 minut. Potom se přidá roztok 1-benzylizochinolinu (9a-c, 2,35 mmol v i ml čerstvě destilovaném anhydridů kyseliny octové) za dusíku do vínově červeného roztoku kyseliny sírové a vzniklá směs se zahřeje na 85 - 90 °C na dobu 30 - 60 minut. Reakční směs se potom ochladí na pokojovou teplotu a po kapkách se přidá 5 ml methanolu a směs se míchá po dobu 30 minut. Směs se potom ochladí v ledové lázni a míchá se po dobu dalších 30 minut. Získaný pevný produkt se fitruje a postupně se dvakrát promyje 2 ml destilované vody, dvakrát 2 ml methanolu a dvakrát 10 ml etheru. Surový produkt se potom rekrystalizuje z horkého methanolu za získání 90 - 95% zisku požadovaného produktu jako žlutého krystalického materiálu.

• « ·· ft ft« *_r · · ♦· • · · · · ·*·'« «·« · * • « · · » · * • · ··« ·· ·· · · *»

8-methyl-2,3,10,11-tetramethoxydibenzo (a, g) chinolizinium acetosulfat (2a): připravený z 9a; mp 280 °C; IR 1735; ^XH NMR (DMSO-d_s) δ 3,28 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 4,03 (s, 3H) , 4,09 (s,

6H), 7,42 (s, 1H), 7,53 (s, 1H) , 7,80 (d, 1H, J = 8,0), 7,98 (s, 1H) , 8,70 (d, 1H, J = 8,0), 9,28 (s, 1H); ¹³C NMR (DMSO-d*) δ

17,5, 56,2, 56,6, 57,2, 104,1, 105,0, 107,3, 108,1, 116,0, 119,9,

120.8, 121,9, 123,7, 124,7, 133,5, 134,5, 145,5, 151,6, 152,7,

152.9, 156,3;Analýza počítána pro C, 57,25, H, 5,00,

N, 2,78; Zjištěno: C, 57,07, H, 5,17, N, 2,72.

8-methyl-3,4,10,11-tetramethoxydibenzo (a, g) chinoližinium acetosulfat (2b): připravený z 9b; mp 267 - 269 °C dec (lit.¹⁴ mp 267 - 269 °C dec) ; IR (Nujol) 2762, 1702, 1642, 1595, 1546;. ^ΧΗ NMR (DMSO-d_e) δ 3,40 (s, 3H) , 3,43 (ε, 3H), 4,00 (s, 3H) , 4,09 (S, 3H), 4,13 (s, 6H), 7,77 (s, 1H) , 7,85 (d, 2H, J = 8,0), 8,01 (d, 1H, J = 8,1), 8,75 (d, 1Ή, J = 8,0), 8,88 (d, 1H, J = 8,0), 9,67 (s, 1H) ; ¹³C NMR (DMSO-dJ δ 17,7, 56,8, 56,9, 57,3, 61,6,

104.9, 105,5, 115,1, 116,3, 117,1, 119,5, 121,3, 122,3, 122,9,

126.9, 134,5, 135,5, 147,2, 153,1, 153,7, 156,9; Analýza počítána pro C₂₄H₂₅NO₉S: C, 57,24, H, 5,00, N, 2,78; Zjištěno: C, 57,08, H, 5,35, N, 2,75.

-methyl -3,4 -methylendioxy -10,11 -dime thoxydibenzo (a, g) chinoliziniumacetosulfat (2c) : připravený z 9c; mp > 270 °C dec; IR (Nujol) 3417, 1727, 1648, 1615, 1551; ¹H NMR (DMSO-dJ 3,41 (s, 3H), 4,13 (S, 3H), 6,46 (s, 2H) , 7,70 (d, 1H, J = 8,7), 7.76 (s, 1H), 7,81 (d, 1H, J = 8,0), 7,89 (S, 1H), 8,58 (d, 1H, J = 8, 7), 8,84 (d, 1H, J = 8,0), 9,64 (s, TH); Analýza počítána pro ^c23H_2iN0₉S.2,25 H₂0: C, 52,32, H, 4,44, N, 2,65; Zjištěno: C, 52, 21, H, 4,24, N, 2,68. HRMS počítáno pro C^H^NO^: 384,1236; zjištěno 348,1237.

Příklad III - Obecný postup pro syntesu fenylacetamidů (5a-c)

Roztok 3,4-dimethoxyfenylacetylchloridu (4 mmol) v chloroformu {6 ml) se po kapkách přidá za dusíku do směsi vhodně substituovaného fenethylaminu (4 mmol), chloroformu {6 ml), a 2 M uhličitanu sodného (3 ml) při 0 °C za důkladného míchání. Míchání pokračuje při 0 °C dokud není reakce dokončena (1-3 hodiny). Reakční směs se přenese do separační nálevky za použití dalších 2 ml chloroformu a 2 ml vody. Organická fáze se separuje a vodná fáze se extrahuje 5 ml chloroformu. Kombinovaný chloroformový extrakt se postupně promyje 5 ml 0,1 N NaOH, 5 ml 0,1 N HCl a 5 ml nasyceného roztoku NaCl. Chloroformový extrakt se suší (Na₂S0₄) a odpaří se. Surový produkt se krystalizuje z methanolu za vzniku 95 - 100% zisku čistého amidu jako bílých jehliček.

N-(3,4-dimethoxyfenylethyl)-2-(3,4-dimethoxyfenyl)acetamid (5a) : připravený z. 3,4-dimethoxyfenylethylaminu. a 3,4-dimethoxyfenylacetylchloridu; mp 125 °C (lit.³·'⁷ 123 - 125 °C); IR (KBr) 3327, 3064, 3007, 2916, 2840, 1642, 1608, 1591; ^XH-NMR δ 2,67 (t, 2H), 3,40 - 3,47 (m, 4H) , 3,83 (s, 6H) , 3,86 (s, 3H), 3,88 (s, 3H), 5,30 (brs, 1H), 6,52 - 6,86 (m, 6H); ¹³C ΝΜΕ'δ 35,6, 41,2, .43,5, 56,3, 56,4, 70,5, 111,7, 112,2, 115,8,

121,1, 127,5, 127,9, 128,5, 129,1, 131,1, 131,6, 137,3, 148,1,

149,5, 158,5, 171,8.

N-(2,3-dimethoxyfenylethyl)-2-(3,4-dimethoxyfenyl)acetamid (5b): připravený z 2,3-dimethoxyfenylethylaminu (Lindemann, Helv. Chim. Acta, 1949, 32: 69 - 75) a 3,

4-dimethoxyfenylacetylchloridu; mp 80 °C (lit.^2£> 79 - 80 °C) ; IR 3315, 2962, 2838, 1636, 1593, 1548 ^XH-NMR δ 2,61 (t, 2H), 3,22 - 3,30 (m, 4H), 3,58 (s, 3H), 3,64 (s, 6H) , 3,67 (s, 3H), 6,22 v · (brs, ÍH), 6,44 - 6,79 (m, 6H); ^l3C NMR Ó 30,0, 41,0, 43,7, 55,9,

56,2, 56,3, 60,9, 111,2, 111,9, 112,9 122,0, 122,6, 124,4, 127,9,

133,1, 147,5, 148,5, 149,5, 153,1, 171,9.

N-(2,3-methylendioxyfenylethyl)-2-(3,4-dimethoxyfenyl)acetamid (5c): připravený z 2, 3-methylendioxyfenylethylaminu^2S a 3,4-dimethoxyfenylacetylchloridu; mp 124 °C; IR (KBr)

3297, 3084, 2935, 1643, 1458; ^XH-NMR δ 2,66 (t, 2H), 3,36 - 3,42 (m, 4H), 3,75 (s, 3H), 3,79 (S, 3H), 5,73 (s, 2H), 5,81 (brs, ÍH), 6,61 - 6,76 (m, 6H) ; ¹³C NMR fi 29,8, 39,7, 43,8, 56,4, 101,0, 107,5, 111,9 112,9, 120,7, 122,0, 122,1, 123,3, 127,7', 146,0, 147,5, 148,7, 149,6, 171,8. Analýza počítána pro ^CiAi^NOs^{: C}' ⁶⁶'⁴⁶' ^{H 6}'¹⁶' ^{N 4}-^θθ; Zjištěno: C 66,31, H 6,16,

N 4,07.

Příklad IV - Obecný postup pro syntesu dihydroizochinolinů (6a-c).

Acetamid (5a-c, 2,47 mmol) se refluxuje s oxychloridem fosforečným (5,69 mmol) a suchý toluen (10 ml) za dusíku, po dobu 20 - 60 minut. Rozpouštědlo se potom pečlivě odpaří a zbytek se rozpustí v « 5 ml methanolu. Tento roztok se nalije na * 10 - 15 ml studené vody. Po dvojnásobném promytí 10 ml etheru se přidá 10 g ledu do vodné vrstvy. Mezitím, co dusík probublává skrz ledem chlazenou vodnou vrstvu se upraví pH na pH 10 koncentrovaným hydroxidem ammoným. Vodná vrstva se potom nasytí chloridem sodným a potom se 5-krát extrahuje 20 ml etheru. Kombinované etherové extrakty se potom suší přes anhydrický uhličitan draselný, filtrují se a odpaří se za zisku dihydroizochinolinů 6a-c. Protože tyto sloučeniny snadno oxidují, je nutné vyloučit kontakt se vzduchem. Dihydroizochinoliny byly • · «

V V « • ··· * · · « O ···*·· 9 9 99

999 9 ·

9 ·

99 použity bez dalšího přečištění pro přípravu 7a-c, 8a-c a 9a-c.

Příklad 5 - Obecný postup pro syntesu

5,6-dihydro-8-methyldibenzo(a,g)chinoliziniumacetosulfatů (7a-c)

Každý z dihydroizochinolínů (6a-c, 2,35 mmol) je rozpuštěn v 1,0 ml čerstvě destilovaného anhydridu kyseliny octové. Je použit postup podobný postupu použitému pro syntesu 8-methyldibenzo(a,g)chinoliziniumacetosulfatů (2a-c). Příslušné dihydroizochinolinové meziprodukty jsou použity místo odpovídajících i-benzylizochinolinových meziproduktů použitých v předešlém postupu. Získané produkty jsou krystalizovány z. vroucího methanolu za zisku 85 - 90% světle žlutého krystalického produktu.

5.6- dihydro-8-methyl-2,3,10,11-tetramethoxydibenzo(a,g) chinoliziniumacetosulfat (7a); připravený z 6a; mp 278 - 279 °C (lit¹³ 177 - 179 °C); IR (KBr) 3450, 2946, 1725, 1611, 1567; ^XH NMR (DMS0-d_e) 6 3,18 (t, 2H) , 3,23 (s, 3H) , 3,40 (s, 3H) , 3,89,, (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 4,08 (S, 6H), 4,75 (t, 2H), 7,13 (s, 2H) ,

7,63 (s, 2H) , 7,80 (S, ÍH) , 8,74 (s, ÍH) ; ¹³C NMR (DMSO-dJ δ 17,

8, 26,2, 49,8, 56,1, 56,3, 56,8, 57,3, 106,2, 106,4, 109,1, 110,

9, 117,5, 120,0, 122,2, 128,6, 135,6, 139,0 148,9, 151,6, 152,2, 155,4, 156,9, 167,5.

5.6- dihydro-8-methyl-3,4,10,ll-tetramethoxydibenzo(a,g) chinoliziniumacetosulfat (7b): připravený z 6b; mp 255 - 256 °C; IR (KBr) 3432, 2946, 1723, 1609, 1567, 1429; ^XH NMR (DMSO-dJ ó 3,20 (t, 2H) , 3,22 (s, 3H), 3,82 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 4,07 (s,

6H) , 4,74 (t, 2H), 7,26 (d, ÍH, J = 8,9), 7,67 (s, ÍH), 7,78 (s,

ÍH) , 7,87 (d, 1H, J = 8,9), 8,67 (s, ÍH) ; ¹³C NMR (DMSO-dJ δ 17,

7.i.

, 21,0, 49,4, 56,3, 56,8, 57,3, 60,7, 106,3, 112,7, 117,6, 121, 3 122,3, 122,9, 128,9, 135,5, 138,9, 144,7 152,3, 154,6, 155,3,

156,9, 167,6. Analýza počítána pro C₂₄H₂₇NO₉S.1,25 ΙΓΟ: C, 54,59, H, 5,63, N, 2,65; Zjištěno: C, 54,59, H, 5,60, N, 2,67. HRMS počítáno pro C^H^NO^: 366,1705; zjištěno 366,1706.

5,6-dihydro-8-methyl-3,4-methylendioxy-10, ll-dimethoxydibenzo > (a,g)chinoliziniumacetosulfát (7c): připravený z 6c; mp > 270 °C;

IR (KBr) 3434, 2920, 1724, 1617; NMR (DMSO-dJ δ 3,16 (t, 2H) , 3,23 (S, 3H), 3,40 <£, 3H), 4,08 (s, 6H), 4,76 (t, 2H), 6,23 }s, 2H], 7,17 (d, 1H, J = 8,0), 7,67 (s, 1H), 7,70 (d, 1H, J = 8,0), 7,81 (s, 1H) , 8,69 }š, 1H] ; ¹³C NMR (DMSO-dJ δ 17, 9 , 20,8, 49, 2, 56,8, 57,3, 102,7, 106,3, 106,5, 108,5 116,2, 118,1, 121,2, 122,4, 122,7, 135,5 139,0, 144,2, 149,6, 152,4, 155,6, 157,0,

167,6. Analýza počítána pro C₂₃ ^H23^NOs,^s-H₂O: 54,43, H, 4,96, N,

2,76; Zjištěno; C, 54,39, H, 4,96, N, 2,74. HRMS počítáno pro C H NO : 350,1392; zjištěno 350,1384.

20 4 ii J

Příklad VI - Obecný postup pro syntesu 5,6-dihydrodibenzo(a,g) chinoliziniumchloridů (8a-c)

Oxychlorid fpsfprečný (7,42 mmol) se. po kapkách přidá do studeného (0 °C) dimethylformamidu za dusíku. Směs se míchá po dobu 15 minut při 0 °C. Roztok příslušného dihydroizochinolinu (2,7 mmol) v 5,5 ml dimethylformamidu se potom přidá a míchá se při 0 °C po dobu 1-2 hodin. Reakční směs se potom na dobu 1 - 2 hodin zahřeje na 100 °C. Reakční směs se ochladí na pokojovou teplotu a nalije se na směs obsahující 20 g ledu a 10 ml 6N HCl. Vzniklá sraženina se filtruje a postupně se promyje dvakrát 5 ml studené vody a dvakrát 10 ml etheru. Konečný produkt se v každém případě rekrystalizuje z methanolu.

• φ φ

0· ·

ΦΦ « « <

ό Φ i • Φ φφ

5,6-dihydro-2,3,10,11-tetramethoxydibenzo(a,g) chinoliziniumchlorid (8a): připravený z 6a; mp 261 - 262 °C ;IR (Nujol) 1664, 1660, 1564; ’Ή NMR (CD_aOD) 6 3,35 (t, 3H), 3,91 (s, 3H) , 4,02 (S, 3H), 4,10 (s, 3H), 4,17 (s, 3H), 5,04 (t, 2H) , 7, (S, 1H), 7,78 (S, 1H), 8,60 (s, 1H), 9,64 (s, 1H), 10,12 (s, 1H); ¹³C NMR (CD₃OD) Ó 28, 1, 56,4, 56,7, 56,9, 57,3, 57,8, 104, 4, 106,6, 107,5, 108, 1, 108,2, 109,0, 110,2, 112,4, 112,5, 112,

115,4, 117,7, 119,6, 130,4, 146,5. Analýza počítána pro ^C=x^H22^NY^C1·⁰'^{75 H}2^0: Č' ⁶²'⁸⁴' ^H- 5,90, N, 3,49; Zjištěno: C, 62,79, H, 5,84, N, 6,46. HRMS počítáno pro C_2iH₂_NO : 352,1549; zjištěno 352,1549.

5,6-dihydro-3,4,10,il-tetramethoxydibenzo(a,g) chinoliziniumchlorid (8b): připravený z 6b; mp 252 °C; IR (Nujol) 3383, 1632, 1600; ^XH NMR (DMSO-d_e) δ 3,27 (t, 2H) , 3,81 (S, 3H), 3,95 (s, 3H), 4,01 (s, 3H), 4,08 (s, 3H), 4,80 (t, 2H), 7,29 (d, 1H, J = 8,9), 7,68 (S, 1H), 7,73 (s, 1H), 7,96 (d, 1H, J = 8,9), 8,82 (s, 1H), 9,60 (s, 1H) ; ¹³C NMR (DMSO-dJ δ 20, 9 , 54,4, 56, 3, 56,6, 56,9, 60,6, 105,7, 106,7, 112,7, 118,4 120,4, 122,4,

122,6, 129,1, 136.,8, 138,5 145,2, 145,7, 152,5, 154,9, 157,6. Analýza počítána pro C_2;lH₂₂NO₄C1.1,5 H^O: C, 60,79, H, 5,71, N, 3,38; Zjištěno: C, 60,79, H, 5,71, N, 3,38. HRMS počítáno pro Yo^Hxe^N04^: 336,1236; zjištěno 336,1244.

5,6-dihydro-3,4-methylendioxy-10,11-dimethoxydibenzo (a,g)chinoliziniumchlorid (8c): připravený z 6c; mp > 280 °C; IR (Nujol) 2725, 1622, 1574; ^XH NMR (CD3OD) δ 3,27 (t, 2H), 4,07 (s, 3H), 4,13 (s, 3H) , 4,62 (t, 2H) , 6,16 (s, 2H) , 7,03 (d, 1H, J = 8,4), 7,60 (s, 1H), 7,63 (s, 1H), 7,75 (d, 1H, J = 8,4), 8,60 (s, 1H), 9,34 (S, 1H); ^X3C NMR (CDaOD) δ 22,2 , 56,0, 57,3, 57,7, 104,3, 106,6, 107,5, 109,6 117,3, 120,1, 122,3, 122,9, 124,6,

139,2 146,5, 146,6, 152,0, 155,0, 160,3. Analýza počítána pro C^H^NO^Cl.2^0: C, 58,89, H, 5,43, N, 3,43; Zjištěno: C, 58,74, H, 5,39, N, 3,45. HRMS počítáno pro C^H^NO^: 336,1236; zjištěno 336,1244.

Příklad VII - Obecný postup pro syntesu 1-benzylizochinolinů (9a-c)

Vhodný dihydroizochinolin (3,4 mmol) se refluxuje při 220 230 °C s 0,3 g 10% paladíana. uhlíku v 5 ml tetralinu (probublaném dusíkem po dobu 20 minut před použitím) po dobu 3 4 hodin. Reakční směs se potom ochladí na 180 °C a filtruje se za dusíku za použití Schlenkova typu filtrační jednotky (Aldrich Chemical Co.) .' Po ochlazení na pokojovou teplotu se filtrát ochladí na 0 °C a přidá se chlorovodík (1,0 M v anhydrickém etheru) pro úpravu pH směsi na pH 1,0. Sráží se chlorovodíková sůl 1-benzylizochinolinu. Sraženina se filtruje, třikrát se promyje 10 ml anhydrického etheru a suší se za zisku příslušné 1-benzylizochinolinhydrochloridové sole v 90 - 100% zisku. Sušené hydrochloridové sole se potom rozpustí v minimálním množství methanolu (2-5 ml), ke kterému se přidá 10 g ledu. Do ledově chladného vodného roztoku se přidá koncentrovaný hydroxid ammóný pro úpravu pH na 10. Vodná vrstva se nasytí chloridem sodným a potom se extrahuje 10 ml objemy chloroformu. Kombinovaný chloroformový extrakt se suší (Na₂SO_A) a odpaří se za zisku 9a-c.

5,6-dimethoxy-l-(3,4-dimethoxybenzyl)Í2ochinolinhydrochlorid (9b): připravený z 6b; mp 206 - 208 °C (lit,¹⁴ 206 - 208 °C);IR (Nujol) 2676, 1630, 1625, 1588; Ή NMR (CD^OD) δ 3,76 (s, 3H) , 3, 81 (s, 3H), 4,03 (s, 3H), 4,15 (s, 3H) , 4,87 (s, 2H) , 6,86 (t,

2H), 7, 07 (s, 1H), 7,92 (d, 1H, J = 1), 8,31 (d, 2H, J = 5,7), w- W V » ^w >

« * * t ·♦· · »*· ·· α * a β « β «« ·♦ ♦ ·

8,55 (d, 1H, J= 1); ¹³C NMR (CD₃OD) δ 38,1, 56,9, 57,1, 58,1, 62,5, 113,7, 114,2, 119,2, 120,8, 122,5, 122,8, 127,7, 129,1,

131.2, 135,9, 143,5, 150,5, 151,3, 158,5, 160,2.

5,6-methylendioxy-l- (3,4-dimethoxybenzyl) izochinolin (9c) : připravený z 6c; mp 111 °C; IR (KBr) 3429,. 3064, 3003, 2930; ¹H NMR (DMSO-dJ S 2,93 (s, 3H) , 4,03 (ε, 3H), 4,04 (s, 3H), 6,01 (s, 2H) , 6,91 (d, 1H, J = 8,8), 7,07 (s, 1H) , 7,25 (S, 1H), 7,60 (m, 2H) , 7,68 (s, 1H); ¹³C NMR (CD₃OD) δ 23,2, 56,5, 76,9 , 77,4,

78.2, 101,6, 104,4, 106,0, 107,8, 109,9, 114,1, 121,0, 122,5, 134,0, 135,2' 148,1, 149,2, 150,1, 153,1, 156,2. Analýza počítána pro C₁₉H₁₇O₄: C, 70,58, H, 5,30, N, 4,33; Zjištěno: C, 70,85, H, 5,51, N, 4,31.

Příklad VIII - Obecný postup pro syntesu dibenzo(a,g)chinoliziniumchloridů (lOa-c)

Použitý postup byl podobný postupu použitému pro syntesu

5,6-dihydrodibenzo(a,g)chinoliziniumchloridů 8a-c. 1-benzylizochinolínové meziprodukty byly nahrazeny za odpovídající dihydroizochinolinové meziprodukty v předcházejícím postupu. Získané produkty byly krystalizovány ze směsi 1:1 ledové kyseliny octové a 6 N HCl za vzniku zisku v rozsahu od 92 - 98% lOa-c jako žlutých krystalických produktů.

2.3.10.11- tetramethoxydibenzo(a,g)chinoliziniumchlorid (10a): připravený z 9a; mp, IR, ^H-NMR, ^l3C-NMR jsou stejné jako bylo popsáno dříve.¹²

3.4.10.11- tetramethoxydibenzo(a,g)chinoliziniumchlorid (10b): připravený z 9b; mp 223 - 225 °C dec; IR (KBr) 3394, 2947, 2843, v: V « w « ·, fc » ·· • O 9 · ► ♦· · ··« · • ·

1626, 1598, 1561, 1503, 1433; ¹H-NMR {za použití koaxiální trubice s 9b rozpuštěným v kyselině trifluoroctové v zevní trubici ή s oxidem deuteria ve vnitřní trubici) δ,4,51 (s, 3H) , .4,55 (s, 6H) , 4,61 (s, 3H) , 7,94 (s, 1H) , 7,96 (s, 1H), 8,06 (d, 1H, J = 9,2), 8,46 (d, 1H, J = 7,3), 8,78 {d, 1H, J = 7,3), 9,01 (d, 1H, J = 9, 2), 9,56 (S, 1H) , 9,83 (s, 1H); ^r3C-NMR (za použití koaxiální trubice s 9b rozpuštěným v kyselině trifluoroctové v zevní trubici a s oxidem deuteria ve vnitřní trubici) 6 58,4, 58,8, 59,1, 64,7, 107, 0, 107,2, 118,9, 119,2,

119,7, 121,6, 125,0, 126,8, 127,2, 132,0, 139,4, 139,5, 140,0,

145,1, 156,6, 157,9, 161,1; Analýza počítána pro ^C21^H2ON°₄ ^C1.1,²⁵ H₂O: C, 61,76, H, 5,55, N, 3,43; Zjištěno: C, 60,67, H/5,37, N, 3,43. HRMS počítáno pro C^H^NO^: 350, 1392; zjištěno 350,1392.

3,4-methylendioxy-10,11-dimethoxydibenzo (a, g) chinoliziniumchlorid (10c): připravený z 9c; mp > 270 °C dec; IR (KBr) 3414, 3015,

2928, 1620, 1564, 1488; ^H-NMR (za použití koaxiální trubice se sloučeninou rozpuštěnou v kyselině trifluoroctové v zevní trubici a s oxidem deuteria ve vnitřní trubici) δ 4,55 (ε, 3H), 4,60 (s, 3H) , 6,67 (s, 2H), 7,81 (d, 1H, J = 8,5), 7,92 (s, 2H), 8,18 (d, 1H, J = 7,7), 8,68 (t, 2H) , 9,47 (s, ΪΗ) , 9,83 (s, 1H) ; ¹³C-NMR (za použití koaxiální trubice se sloučeninou rozpuštěnou v kyselině trifluoroctové v zevní trubici a s oxidem deuteria ve vnitřní trubici) δ 58,8, 59,1, 106,7, 107,0, 107,1, 115,2,

115,7, 118,4, 119,8, 121,7, 121,8, 126,6, 131,1, 139,5, 139,9, 140,3, 147,1, 153,6, 156,4, 161,1; Analýza počítána pro ^C20H₁₆N0₄ ^C1.1,75 H₂0: C, 59, 86, H, 4,90, N, 3,49; Zjištěno: C, 59,72, H, 4,93, N, 3,48. HRMS počítáno pro C^H^NO^: 334, 1079; zjištěno 334,1075 • ♦ » • ♦··.« ·, S ·Λ ’ Γ ·.%

V • ♦i

- ‘ · * t

Příklad IX - 3,4,3¹,4’-tetramethoxydesoxybenzoin (lla)

Práškový anhydrický chlorid hlinitý (0,78. g) se pomalu přidá , do míšené směsi l,2-dimethoxybenzenu (0,64 g,.4,66 mmol) a 3,4-dimethoxyfenylacetylchloridu (1,0 g, 4,66 mmol) v 10. ml čerstvě destilovaného suchého dichlormethanu. Proběhne exotermická reakce. Oranžový roztok zhnědne, jak je směs refluxována. Reakční směs se zahřívá do refluxu po dobu dalších 2 hodin a potom se ochladí na pokojovou teplotu. Ochlazený roztok se naleje na směs obsahující 5 g drceného ledu a 5,5 ml 7,5 N HC1. Organická fáze se separuje a vodná fáze se extrahuje třikrát 10 ml dichlormethanu. Kombinovaný dichlormethanový extrakt se suší (Na_,SO₄) , filtruje a odpaří se za zisku bílé pevné látky, která se rekrystalizuje z methanolu za zisku čistých bílých jehliček lla při 98% zisku; mp 105 - 107 °C (lit.³⁰ mp 104 - 106 ?C); ¹H-NMR δ 3,85 (s, 6H), 3,91 (s, 3H) , 3,94 (s, 3H), 4,18 (s, 2H), 6,8l(m, 2H) , 6,91 (m, 2H), 7,56 (d, 1H, J = 2,0), 7,66 (dd, 1H, J = 8,4, 2,0}; ¹³C NMR δ 45,2, 56,3, 56,4, 56,5, 110,4, 111, 1, 111,8, 112,8, 121,3, 121,9, 123,9, 127,9, 130,2, 149,5, 153,8, 197,0. Příklad X - 3,4-dimethoxy-34¹-methylendioxydesoxybenzoin (11b)

Roztok 3,4-dimethoxyfenylacetylchloridu (3,25 g, 15 mmol) v 15 ml čerstvě destilovaného suchého dichlormethanu se po kapkách přidá do míšené směsi 1,3-benzodioxolu (1,83 g, 15 mmol) a tin(IV)chloridu (4,6 g, 17,6 mmol) v 15 ml dichlormethanu při -10 °C. Směs se potom nechá zahřát na pokojovou teplotu a míchá se po dobu dalších 2 hodin.. Reakční směs se potom nalije na 25 ml 6N HC1 a míchá se po dobu 16 hodin. Organická fáze se potom \· · · r • ·. ··· >·' ·· ft- · * • »·;· « »» ftftm ?*· separuje a vodná fáze se extrahuje třikrát 20 ml aliguotami dichlormethanu. Kombinovaný dichlořmethanový extrakt se postupně promyje 20 ml 0, 1 N NaOH a 20 ml destilované vody.

Dichlormethanový extrakt se potom suší (Na^SO^), filtruje a odpaří se za zisku krémově zabarvené pevné látky. Surový produkt se rekrystalizujě z ethanolu za zisku 3,0 g bílých jehliček 11b při 66% zisku; mp 110 - 111 °C; IR (Nujol) 2725, 1675, 1519; ^H-NMR 5 3,80 (s, 3H), 3,81 (s, 3H) , 3,09 {s, 2H), 5, 96 (s, 2H), 6,76 (m, 4H); 7,42 (d, 1H, J = 1,5), 7,58 (dd, ÍH,

J = 6,4, 1,5); ¹³C NMR δ 45,3, 56,3, 102,3, 108,3 , 108,7, 111,8,

112,7, 112,9, 121,9, 125,4, 127,7, 131,8, 148,4, 148,6, 149,4,

152,2, 196,4; Analýza počítána pro C H O : C, 67,99 , H, 5,37; Zjištěno: C, 67,98, H, 5,32.

Příklad XI - Obecný postup pro syntesu l-methyl-3-fenylizochinolinů (12a, 12b)

Anhydrický oxid fosforečný (4 mmol) se přidá ve třech částech do 10 ml roztoku (100 mM) příslušného desoxybenzoinu v acetonitrilu. Reakční směs se míchá za dusíku po dobu 18 - 20 hodin. Reakční směs se utlumí přidáním 10 ml vody. Vzniklá suspenze se neutralizuje 10% NaOH a extrahuje se třikrát 10 ml částmi dichlormethanu. Kombinovaná organická fáze se suší (Na SO ), filtruje a odpaří se za zisku krémově zabarveného zbytku. Tento zbytek se podrobí chromatografii na silikagelu za použití 95:5 směsi dichlormethanu a octanu etylnatého, v příslušném pořadí, jako eluens za zisku odpovídajícího l-methyl-3-fenylizochinolinu, 12a a 12b, při zisku 75 - 85%.

6,7-dimethoxy-l-methyl-3-(3,4-dimethoxyfenyl)izochinolin (12a): připravený z 11a; mp 168 - 169 °C (lit.³¹ 168 - 170 °C) ;

* β ··

IR (Nujol) 2725, 1621, 1573, 1508; ^XH-NMR δ 2,95 (s, 3H), 3,93 (s, 3H), 4,02 (s, 9H), 6,96 (d, 1H, J = 8,4), 7,08 (S, 1H), 7,25 (s, 1H), 7,60 (dd, 1H, J = 8,4, 2,0), 7,71 (s, 2H); ¹³C NMR Ó

23,2, 56,4, 104,3, 105,9, 110,4, 111,7, 113,9, 119,5, 122,4, 133,6, 149,2, 149,6, 149,7, 150,0, 153,1, 156,2.

6,7-dimethoxy-l-methyl-3-(3,4-methylendioxyfenyl)izochinolin (12b): připravený 2 11b; mp 174; IR (Nujol) 2727, 1622, 1573, 1504; ¹H-NMR δ 2,93 (s, 3H), 4,03 (s, 3H), 4,04 (s, 3H), 6,00 (s, 2H), 6,91 (d, 1H, J ± 8,8), 7,07 (s, 1H), 7,25 (s, 1H), 7,60 (m, •2H), 7,67 (s, 1H); ¹³C NMR 6 23,2, 56,5, 101,6, 104,4, 106,0,

107,8, 108,9, 114,1, 121,0, 122,5, .133,9, 135,2, 148,1, 148,6,

149,2, 150,1, 153,1, 156,2; Analýza počítána pro C^H^NO^ : C, 70,58, H, 5,30, N, 4,33; Zjištěno: C, 70,55, H, 5, 28, N 4,30.

Příklad XII - 6,7-dihydroxy-l-methyl-3-(3,4-dihydroxyfenyl) izochinolin (13)

Sloučenina 12a (250 mg, 0,74 mmol) je rozpuštěna v 5 ml suchého chloroformu a ochlazena na -50 °C za použití směsi suchého ledu a acetonu. Do této směsi se po kapkách přidá 7,4 ml 1,0 M roztoku tribromid boru v dichlormethanu. Reakční směs se nechá zahřát na pokojovou teplotu během 4 hodin. Sraženina se filtruje a dvakrát promyje 2 ml etheru. Tento surový produkt se rekrystalizuje z ethanolu za vzniku 13 při 98% zisku jako bílé jehličky mp > 280 °C dec.; IR (Nujol) 3326, 1602, 1531; ^XH-NMR (CD₃0D) δ 3,08 (s, 3H), 6,98 (d, 1H, J = 8,1), 7,19 (dd, 1H, J =

8,1, 1,9), 7,24 (s, 1H), 7,37 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,94 (s,

1H),; ¹³C-NMR (CD₃OD) δ 17,8, 109,6, 110,6, 116,1, 117,3, 119,6,

121,2, 122,8, 125,6, 138,4, 142,5, 147,7, 149,5, 152,0, 154,3, 158,3; HRMS počítáno pro C_i6H_i3NO₄: 283,0844; 2jištěno 283,0839.

• ·,. ·. 4 tor > φ ·

•r ·»·’ ··· 4?

β ·· • 44 » • · ·· ··

·.

v

Příklad XIII - Obecný postup pro syntesu 1,2-dimethyl-3fenylizochinoliniových derivátů (14a, 14b, 15)

Každý z příslušných l-methyl-3-fenylizochinolinových derivátů (0,67 mmol) se přidá k 1 ml dimethylsulfátu. Tato reakční směs se potom zahřeje na 100 °C na dobu 20 - 60 minut a potom se nechá zchladnout na pokojovou teplotu. Do ochlazené reakční směsi se přidá anhydrický ether (8 ml) a vzniklá suspenze se míchá po dobu 5 minut. Sraženina se filtruje a rekrystalizuje se z methanolu za zisku 95 - 100% odpovídající N-methylizochínoliniových soli.

6.7- dimethoxy-l,2-dimethyl-3-(3,4-dimetoxyfenyl)izochinolinium methosulfat (14a): připravený z 12a; mp 224 - 226 °C; IR (Nujol) 6508, 1640, 1613, 1548, 1506; ^XH-NMR (CD₃OD) δ 3,21 (s, 3H) , 3,67 (S, 3H) , 3,64 (s, 3H) , 3,98 (s, 3H) , 4,11 (ε, 3H) ,' 4,12 (s, 1H) ,

7,20 (d, 1H, J = 8,6), 7,48 (m, 2H) , 7,62 (s, 1H) , 7,66 (s, 1H) ,

8,24 (s, 1H); ¹³C-NMR (CD₃OD) δ 18,0, 56,9, 57,1, 57,3, 57,6,

106,0, 107,5, 112,8, 113,5, 120,7, 122,7, 123,2, 126,4, 139,1, 151,5, 170,4, 170,9, 171,3. Analýza počítána pro ^C22^H2v^NOe^S-¹'^5H2^{O: c} 53,65, H 5,83, N 2,84; Zjištěno C 53,35, H 5,52·, N 2,91.

6.7- dimethoxy-l, 2-dimethyl-3-(3,4-methylendioxyfenyl) izochinóliniummethosulfat (14b): připravený z 12b; mp 235 - 237 °C; IR (Nujol) 3479, 1612, 1568; ^XH-NMR (DMSO-d_g) δ 3,22 (s, 3H) ,

3,38 (s, 3H), 4,06 (s, 6H), 6,20 (s, 2H), 7,14 (m, 2H), 7,23 (m,

1H), 7,70 (s, 1H) , 7,86 (ε, 1H), 8,09 (S, 1H) ; ^X3C-NMR (DMSO-d ) €

δ 18,2, 43,5, 56,8, 59,9, 102,2, 106,2, 106,3, 109,1, 110,0, 122,

9, 123,2, 124, 1, 127,7, 134,7, 144,9, 147,9, 149,0, 152,5, 156,

9, 157,1. Analýza počítána pro C H NO S: C 53,11, H 5,15, N 3, 11; Zjištěno C 53,03, H 5,19, N 2,95.

ť a*·

6,7-dihydroxy-l,2-dimethyl-3-(3,4-dihydroxyfenyl) izochinoliniummethosulfat (15) : připravený z 13; mp 118 - 120 °C; IR (KBr) 3249, 1614, 1528, 1454; ^XH-NMR (CD₃OD). Ó 3,08' (s, 3H) ,

3,68 (S, 3H), 6,98 (d, 1H, J = 8,2), 7,21 (m, 2H), 7,37 (s, ^:1H),

7,61 (S, 1H), 7,94 (s, 1H) ; ¹³C-NMR (CD₃OD) δ Ϊ7,8 , 106,9, ' 110,6 ,

116,1, 117,3, 119,6, 121,2, 122,8, 125,6, 138,4, 142,6, 147,7,

149,5, 152,0, 154,3, 158,3. Analýza počítána pro C^H^NC^S:

C 52,81, H 4,68, N 3, 42; Zjištěno C 52,79, H 4,65, N 3,40.

Příklad XIV - Materiály

Plasmid pETlla a E. coli kmen BL21(DE3) použité pro expresi enzymu byly zakoupeny od Novagen. IPTG byl zakoupen od Sigma. ECL systém použitý pro Western blotovou analýzu bakteriálních lyzátů byl od Amersham (UK). Všechny restrikční enzymy a Vent polymerasa byly od New England Biolabs. Savčí topoizomerasa II byla izolována z telecího brzlíku podle publikovaného postupu (Halligan et al., J. Biol. Chem. 260: 2475 - 2482 (1985)). Jednokopiové kvasinkové plasmidy YCpGALl exprivující různé geny. pro topoizomerasu I v kvasinkovém kmenu JN2-134 byly laskavým darem od Dr. M-A. Bjornsti (Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA). Všechna bakteriální a kvasinková media byla od Difco (Detroit, MI), zatímco buněčná kultivační media byla nakoupena od Gibco-BRL (Gaithersburg, MD).

Příklad XV - Exprese topoizomerasy I v E. coli

Pro získání většího množství lidské topoizomerasy I byla cDNA lidské topoizomerasy I klonována do pET-lla vektoru, ve kterém je transkripce cDNA pod kontrolou indukovatelného T7 promotoru (Stuóier et al., Methods in Enzymology, svazek 185: 60 - 89, San

Diego: Academie Press (1990)). Stručně, 3,4 kb DNA fragment obsahující úplnou kódující sekvenci lidské topoizomerasy I a asi 1 kb netranslatovaného regionu downstream od stop kodonu byl izolován z plasmidu YCpGALl-hTOPl (Bjornsti et al., Cancér Res.

49: 6318 - 6323 (1989)) trávením v BamHI a EcoRI místech. Vektor pET-11 byl tráven stejnými restrikčními enzymy, defošforylován a ligován do insertu ve správném čtecím rámečku downstream od klonovacího místa vektoru. Ligační směs byla použita pro transformaci E, coli, správný klon pETIB byl izolován (mapa viz obrázek 2A) a jeho identita byla potvrzena restrikčním mapováním. Protože translační start v pET je umístěn upstream od Ndel místa má exprivovaná topoízomerasa I 15 aminokyselinovou fúzi ve svém N-konci. pETIB byl potom přenesen do E.coli BL21(DE3) a za indukce 0,4 mM IPTG po dobu 1 hodiny byl bakteriální lyzát analyzován 10% SDS-PAGE. Exprese byla potvrzena Western blottingem za použití králičích protilátek proti lidské topoizomerase I. Izolace exprivovaného proteinu byla provedena jednoduchým postupem. Stručně, buňky E.coli byly lyžovány opakovanými zvukovými rázy. Zvukový extrakt byl vyroben v l M _t NaCl a 6% polyethylenglykolu (PEG) pro odstranění nukleových kyselin. PEG supernatant byl chromatografován přímo na hydroxyapatitové koloně. Topoízomerasa I exprivovaná z lidské DNA eluovala v kroku 0,6 M fosforečnanu draselného. Eluovaný enzym byl dialyzován proti 50% glycerolu, 30 mM fosforečnanu draselného (pH 7,0), 1 mM dithiotreitolu (DTT) a 0,1 mM EDTA a byl skladován při -20 °C. Relaxační aktivita přečištěného enzymu měla specifickou aktivitu asi o dva řády nižší než topoízomerasa I z telecího brzlíku.

• · · • · · ·

• o ·· ··

Příklad XVI - Exprese topoizomerasy I resistentní na camptothecin (CPT-K5) v E.coli

Dva komplementární oligonukleotidy obsahující bodovou mutaci CAG (Asp533) -> CGG (Gly) odpovědnou za resistentní fenotyp v

CPT-K5 (19) bylysyntetizovány a zpracovány v topo I kódující sekvenci za použití metody sekvenční PCR (Currents Protocols in Molecular Biology, v: Ausubel et al., (vyd.) Svazek l, str.

8.5.7. Boston: Wiley Interscience (1991)). Dva oligonukleotidy jsou 5'- CTTCCTCGGGAAGGGCTCCATCAGATAC-3’ (primer XI) a 5’-GTATCTGATGGAGCCCTTCCCGAGGAAG-3’ (primer X2), kde podtržené sekvence představují mutovaný kodon. Každý oligonukleotid byl použit v jednotlivých PCR reakcích pro amplifikaci DNA segmentů sousedících s mutovaným místem, za použití oligonukleotidů 5 ¹ -ACTGTGATCCTAGGG-3 ¹ (A) a 5 ’-CTTCATCGACAAGCTTGCTCTGAG-3 ’ (H) jako příbuzného páru primerů pro XI a X2, v příslušném pořadí. A a H jsou komplementární k lidské topo I sekvenci v okolí jedinečných restrikčních míst AvrlI a HindlII, Po prvním kole PCŘ byly dva amlifikované produkty Xl-H a X2-A denaturováný a tepelně zpracovány jejich komplementární sekvencí o 15 párech baží, díky přesahu oligonukleotidů XI a X2. Toto krátké protažení dvoj řetězcového DNA segmentu bylo potom rozšířeno Vent polymerasou při 72 °C podobu 2 minut na komplentní produkt A-H o předpokládané 748 párech baží. Dva externí primery A a H byly potom použity pro amplifikaci kompletního DNA fragmentu obsahujícího mutovaný topo I fragment. Amplifikovaná mutantní cDNA pro topoizomerasu I byla potom trávena AvrlI a HindlII a klonována do pETlB náhradou odpovídajícího AvrlI/HindiII frakmentu za cDNA sekvenci pro topoizomerasu I. Plasmid pETlB-CPTK5, který obsahoval mutantní CPT-K5 topoizomerasa I cDNA místo přirozeného typu cDNA lidské topoizomerasy I, byl pro • ··· v v * v v « ** • · · · · «»· 9 99·9 *

9- 9 9 9 9 O « · » + * ··* ·*, *? ·· *· expresi transformován do E.coli BL21(DE3). Po indukci IPTG byl protein v lyzátech potvrzen Western blottingem. CPT-K5 topoizomerasa I byla potom přečištěna 2. bakteriálního l.yzátu jak je to popsáno pro'přirozený typ enzymu.

Příklad XVII - Testy štěpení topo I a topo II

Testy štěpení pro rekombinantní topoizomerasy I a topoizomerasy I a II z telecího thymu byly provedeny jak je popsáno (Liu et al., J. Biol. Chem. 258: 15365 - 15370 (1983)). DNA Plasmidu YEpG použitá pro štěpení byla připravena a značena na jejím 3'-konci za použití publikovaných postupů.

Příklad XVIII - Test kvasinkové cytotoxicity

Bylo stanoveno, že kvasinky mohou přežívat, pokud je funkce topoizomerasy I narušena a že inhibice topoizomerasy I zabíjí pouze buňky mající funkční topoizomerasu I (Bjornsti et al., Gancer Res., 49: 6318 - 6323 (1989)). Proto srovnání relativního stupně růstu každého z testovaných kmenů ža přítomnosti různých léčiv s kontrolními plotnami bez léčiv ukazuje: 1) zda má léčivo jakýkoliv cytotoxický účinek na kvasinky, 2) zda je cytotoxicita topo I specifická a 3) zda existuje jakýkoliv rozdíl ve specificitě léčiva pro kvasinkovou ve srovnání s lidskou topo I.

Topoizomerasa I specifický in vivo test cytotoxicity byl adaptován z Knab et al., (Knab et al., J. Biol. Chem. 268: 22322 - 22330 (1993)). Vtomto systému jsou různé topo I geny klonované do jedné kopie kvasinkového plasmidového vektoru, YCpGALl (Knab et al., J. Biol. Chem. 268: 22322 - 22330 (1993)), exprivovány pod kontrolou GAL1 promotoru v JN2-134 kmenu S. cerevisiae (MATa, • « φφ φφφ φ φφφφ · φ · · φ φ φ φ · φφφ — __ = _ * * rad52::LEU2, trpí, ade2-l, his7, ura3-52, isel, top-1, leu2) (Bjornsti et al., Cancer Res., 49: 6318 - 6323 (1989)). Topo I konstrukty ve vektoru jsou, v příslušném pořadí, přirozená kvasinková topo T (YCpGÁL-ScTOPl) , nefunkční kvasinková topo í, ve které je aktivní místo tyrošin-727 mutováno na fenyialanin (YCpGALl-SctoplY727F) (Knab et al., J. Biol. Chem. 268: 22322 - 22330 (1993)) a přirozená lidská topoizomerasa I (YCpGALl-hTOPl) (Bjornsti et al., Cancer Res., 49: 6318 - 6323 (1989)). Pro kvalitativní testování cytotoxicity a topo I specificity léčiva byly kvasinkové buňky obsahující specifický plasmid sériově ředěny (5-krát) a kultivovány v zeslabeném mediu doplněném uracilem a 2% galaktosou. Kromě toho plotny obsahovaly: A: kontrola, žádné léčivo na plotně; B, Camptothecin (CPT), 0,5 μΜ; C: Goraly, 1 μΜ; D: Methylendioxy-dihydro-demethyl-coralyn (MDD-Coralyn), 1 μΜ a E: Nitidin, 1 μΜ. Plotny byly kultivovány po dobu 3 dnů při 30 °C pro hodnocení letálního účinku různých sloučenin na různé.topoizomerasa I enzymy exprivované v S. cerevisiae.

Příklad XIX - Test cytotoxicity

IC_so testovaných léčiv byly určeny MTT-mikrotitračním plotnovým tetrazoliniovým testem cytotoxicity (MTA) (Mosmann, T. , J. Immunol. Methods 65: 55 - 63 (1983); Denizot et al., J.

Immunol. Methods 89: 271 - 277 (1986)). Lidské lymfoblastové RPMI 8402 buňky a jejich CPT-K5 buňky resistentní na camptothecin (Andoh et al., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 84: 5565 - 5569 (1987)) byly laskavě poskytnuty Dr. Toshiwo Andoh (Aichi Cancer Center Research Institute, Nagoya, Japan). Buněčné linie A2780 a její derivát CPT-2000 resistentní na camptothecin byly získány od Dr. Jaulang Hwang (Institute of Molecular Biology, Academia sinica, « · · v ··* • fc* · * • · · ♦ · ··

Taiwan)- Buňky (2000 buněk/jamku, v 200 ml kultivačního media) byly kultivovány v suspensi při 37 °C v 5% CO₂ a byly uchovávány pravidelným pasážováním v RPIM mediu doplněném 10% teplem inaktivovaným fetálním hovězím sérem, L-glutaminem (2 mM), penicilinem (100 U/ml)' a streptomyčinem (0,1 mg/ml) .' Buňky byly ystaveny kontinuálně po dobu 4 dní různým koncentracím léku a testovány byly na konči čtvrtého dne. Každá koncentrace a kontrola bez léku byly opakovány alespoň dvakrát v 6 stejných jamkách. Výsledky byly zakresleny do grafu a potom byla měřena IC . Na léčivo sensitivní buněčná linie lidského epidermoidního karcinomu KB 3-1 a její vinblastinem selektované variantní buňky KB-V1 s mnohotnou lékovou resistencí (Akiyama et al., Genetics 11: 117 - 126 (1985) byly získány od Dr. Michael Gottesmann (National Center Institute). Byly kultivovány jako monovrstevné kultury při 37 °C v 5% CO₌ a udržovány pravidelným pasážováním v Dulbeccovu minimálním esenciálním mediu doplněném 10% teplem inaktivovaným fetálním hovězím sérem. KB-Vl buňky byly udržovány za přítomnosti 1 mg/ml vinblastinu.

> * v » » - — • « · · « ··· · ·»♦ * * • · · ο « ♦·· • 0·· ·♦* ·· ·· · ··

Tabulka 1. Topoizomerasou I a topoizomerasou II zprostředkované štěpení DNA s deriváty coralynu a příbuznými sloučeninami

Topo-I zprostř. Topo-II zprostř. Cytotoxicita IC_so ^a

Sloučenina	štěpení DNA13	štěpení DNAC	(μΜ) Buněčné linie RPMI CPT-K5
2a	10	>1000	4,9	20
2b	>1000	100	0,4	2,0
2c	10	10	2,0	41
7a	5	>1000	5,9	>20*
7b	1000	1000	6,9	14
7c	10	30	0,6	6,1
83	20	>1000	10	18
8b	>1000	1000	9,0	6,4
8c	1	50	8,1	27
9a	>1000	1000	24	29
9b	>1000	1000	15	15
9c	>1000	>1000	9,3	15
10a	1000	10	13	>32*
10b	>1000	íoo	2,6	5,2
10c	10	2	0,8	6,8
12a	>1000	>1000	13	24
12b	1000	>1000	22	31
13	>1000	>1000	7,1	99
14a	>1000	>1000	43	39
14b	1000	1000	6,7	11
15	1000	>1000	7,3	>122*
CPT	1	>1000	0,004	>10*
VM-26	>1000	1	0,3	0,5

»·«· ^a IC_go byla počítána po čtyřech dnech kontinuální expozice léčivu.

^b Hodnoty štěpení topoizomeřasou I jsou uvedeny v REC, relativní efektivní koncentraci, t.j. koncentracích vztažených ke camptothecinu (CPT), jehož hodnota je určena jako 1, které jsou schopné produkovat stejné štěpení plasmidové DNA za přítomnosti lidské topoizomerasy I.

^c Hodnoty štěpení topoizomeřasou II jsou uvedeny v REC, relativní efektivní koncentraci, t.j. koncentracích vztažených k VM-26, jehož hodnota je určena jako 1, které jsou schopné produkovat stejné štěpení plasmidové DNA za přítomnosti topoizomerasy II z telecího thymu.

^Λ Nebyl pozorován žádný náznak cytotoxicity, což ukazuje na hodnoty IC_so významně vyšší, než jsou nejvyšší testované hodnoty.

Analog coralynu 7c byl testován na jeho účinnost na glioblastomové buňky. Použitý test byl stejný jako je test použitý výše pro RPMI-8402 buněčnou linii. Výsledky jsou ukázány dále v tabulce 2, která srovnává účinek sloučeniny 7c na leukemickou buněčnou linii (RPMI 8402), epidermální karcinom (KB3-1) a glioblastom (SF-268).

Μ* 4 * « · · • 4 ··

Tabulka 2

Sloučenina	Cytotoxicita (gg/mg)
RPMI 8402	KB3-1	SF-268
coralyn	3,0	0,9	0,1
sloučenina 7c	0,3	0,06	0,008
doxorubicin	0,8	0,1	0,8
camptothecin	0,003	0,004	0,005

Příklad XX - Výsledky

Pro stanovení toho, zda je lidská DNA topoizomerasa I cytotoxickým cílem coralynu a jeho derivátů byla cDNA lidské tοροίzornérasy I exprivována v T7 expresním systému. Exprivovaná lidská DNA topoizomerasa I byla přečištěna jedním chromatografickým krokem. Rekombinantní lidská DNA topoizomerasa I byla použita pro hodnocení aktivity coralynu a jeho derivátů. Rekombinantní lidská DNA topoizomerasa I a topoizomerasa I přečištěná z telecího thymu mají stejnou štěpící aktivitu a produkují podobný charakter štěpení za přítomnosti camptothecinu a coralynu.

Rekombinantní lidská DNA topoizomerasa I indukovala rozsáhlé zlomy DNA v DNA YEpG za přítomnosti buď coralynu, nebo camptothecinu. Ukázalo se, že tyto DNA zlomy odrážejí tvorbu štěpících komplexů topoizomerasy I podle následujících kriterií: (1) Representují jednořetězcové zlomy, protože žádné zlomy nebyly pozorovatelné, pokud reakce nebyly denaturovány před zavedením na neutrální agarosový gel; (2) Bylo ukázáno, že zlomy jsou vázané • · * · · • i · * *«· ··«··· ·· · · ♦· ·· na protein a že jsou reversibilni při zahřátí na 65 °C, charakteristický rys štěpících komplexů topoizomerasy I.

Charakter štěpení indukovaného coralynem je podobný, pokud ne identický, s charakterem produkovaným camptothecinem, což naznačuje, že tyto dvě léčiva mohou mít podobný způsob účinku proti topoizomerase I.

Pro testování toho, zda je coralyn duální inhibitor byla hodnocena aktivita coralynu proti DNA topoizomerase II telecího thymu. Bylo určeno, že coralyn nemá v podstatě žádnou aktivitu proti přečištěné DNA topoizomerase II telecího thymu. Nitidin a VM-26 byly použity jako kontroly pro srovnání. Nitidin, stejně jako VM-26, ale nikoliv jako coralyn, je silným inhibitorem topoizomerasy II.

Skutečnost, že coralyn je spíše specifickým inhibitorem topoizomerasy I umožňuje hodnocení role topoizomerasy I jako cytotoxického cíle pro coralyn-v buňkách. Kvasinkové kmeny s topí delecí exprivující lidskou topoizomerasu I byly úspěšně použity pro důkaz role lidské DNA topoizomerasy I jako jediného cytotoxického cíle camptothecinu v kvasinkových buňkách. Ačkoliv coralyn nevykazoval žádnou cytotoxicitu proti kmenům kvasinek exprivujícím lidskou topoizomerasu I nebo nefunkční kvasinkovou topoizomerasu I byly některé deriváty coralynu značně cytotoxické prro kvasinkové buňky exprivující lidskou topoizomerasu Σ.

POD-coralyn je vysoce cytotoxický pro kvasinkové buňky exprivující jak funkční, tak nefunkční kvasinkovou topoizomerasu

I. Tento výsledek naznačuje, že cytotoxickým cílem MDD-coralynu je lidská topoizomerasa I v kvasinkovém systému. Bylo překvapivé, že kvasinkové buňky exprivující funkční kvasinkovou topoizomerasu I jsou resisteňtní na coralyn, protože jsou dosti sensitivní na »**· t · v * a a a a • » * · « · · a * a a a ♦ a • · 4 a a »*· ·· a a ·· ·« «· aa · · camptothecin. Protože nitidin je strukturálně podobný

MDD-coralynu byla jeho aktivita v kvasinkovém systému také hodnocena. Nitidin, stejně jako MDD-coralyn, je vysoce cytotoxický pro kvasinkové buňky exprivující lidskou' topoizomerasu I, ale není cytotoxický pro kvasinkové buňky exprivující buď funkční, nebo nefunkční kvasinkovou topoizomerasu I. Tento výsledek opět podporuje zjištění, že lidská topoizomerasa I je cytotoxickým cílem pro nitidin a že kvasinková topoizomerasa I je rezistentní na nitidin.

Pro hodnocení možné role topoizomerasy I jako cytotoxického cíle v lidských buňkách byly derivátu coralynu znovu testovány na dvou párech buněčných linií resistentních na camptothecin (RPMI8402/CPT-K5 a A2780/CPT2000). V obou párech buněčných linii byla resistence na camptothecin způsobena mutacemi ve strukturálních genech lidské topoizomerasy I vedoucích k lidcké topoizomeřase I resistentní na camptothecin (Tamura et al., Nucl. Acids Res., 19: 69 - 75 (1991)). Jak je ukázáno v tabulce 1, zatímco index resistence pro camptothecin je v rozmezí 1000 až 10000, index resistence pro deriváty coralynu a nitidin je mezi 1. a 9.

Vzhledem k podobnému charakteru štěpení produkovanému camptothecinem a deriváty coralynu (též nitidinu) je chybění zkřížené resistence buněčných linií resistentních na camptothecin na deriváty coralynu a nitidin překvapující. Toto může naznačovat, že tyto léčiva mají další cytotoxický cíl. Alternativně, topoizomerasa I resistentní na camptothecin v resistentních buňkách prostě neuděluje resistenci na deriváty coralynu a nitidin díky nepřekrývajícím se receptorovým místům. Pro rozlišení mezi těmito dvěma možnostmi byla topoizomerasa I ftftft ft ftftft · ««ftft ft ftft ft .ftftft • ft ·.· ft· ·· resistentní na camptothecin izolována z CPT-K5 buněk a byla testována na řesistenci/sensitivitu na deriváty coralynu a .-nitidin. Naneštěstí, CPT-K5 topoi.zomerasa I přečištěná, z CPT-K5 buněk nebyla dostatečně aktivní pro. získání přesvědčivých: výsledků. Pro překonání· tohoto problému byla-, provedena .in vitro . místně-řízená mutagěnese pro vytvoření A->G přechodné mutace v nukleotidové pozici 1809 v cDNA lidské topoizomerasy .1. Mutace, která způsobuje 2měnu Asp na Gly (a.k. č. 533) v sekvenci aminokyselin proteinu je odpovědná za resistenci na camptothecin (Tamura et al., Nucl. Acids Res., 19: 69 - 75 (1991)). Mutace byla zapracována do cDNA lidské topoizomerasy I na pETIB. Vzniklý plasmid, pETlB/CPT-K5, byl použit pro nadměrnou expresi CPT-K5 topoizomerasy I. Nadměrně exprivovaná rekombinantní CPT-K5 topoizomerasa I byla částečně přečištěna a ukázalo se, že má stejnou specifickou aktivitu jako přirozená lidské topoizomerasa I exprivovaná a přečištěná stejným způsobem. Bylo ukázáno, že rekombinantní CPT-K5 topoizomerasa I je vysoce resistentní (více než 1000-krát) na camptothecin. Nicméně, rekombinantní CPT-K5 topoizomerasa I byla pouze okrajově resistentní na nitidin (méně než 10-krát) a středně resistentní na D-coralyn (asi 30-krát) . Překvapivě, rekombinantní CPT-K5 topoizomerasa I je vysoce resistentní na coralyn, jak je ukázáno v testu štěpení.

Jak je ukázáno v tabulce 2, sloučenina 7c má výjimečnou cytotoxicitu pro glioblastomové buňky, a je více cytotoxická pro tyto buňky CNS nádoru než pro leukemickou buněčnou linii nebo pro buněčnou linii epidermoidního karcinomu.' Účinnost proti SF-268 buňkám naznačuje, že.může být přítomno selektivní vychytávání, této sloučeniny.

Tyto studie ukazují, že .analoga coralynu vykazují zvýšenou »«· · · • · v «* ·· aktivitu jako inhibitory topoizomerasy I a/nebo topoizomerasy II. Tato data naznačují, že podobně substituované analogy nitidinu by mohly vykazovat podobnou selektivitu z hlediska inhibice savčí topoizomerasy I nebo II.

Claims (38)

1. Analogy coralynu obecného vzorce kde

R^, R₂, R₃, R_g a R_? jsou nezávisle H, OH nebo (C_;l-C ) alkoxy;

R_a a R₃ dohromady jsou -OCH^O-; a R_, dohromady jsou -OCH^O-; nebo R^ a R„ dohromady j sou -OCH 0-;

R₄ je H nebo (C_i-C_e)alkyl;

R_s je H, (C -C )alkyl nebo není přítomen; a

R_a a R_g jsou nezávisle -CH=CH-, ~(CH₂)₂ nebo nejsou přítomny; s podmínkou, že pokud je R_a -CH=CH- nebo -{CH)₂~, pak R_g není přítomen a R_a je H; a pokud je R_g -CH=CH- nebo -(CH₂)₂, pak R_± nebo R₂ je H a R_s a R_s nejsou přítomny;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl; pro použití k inhibici růstu nádorových buněk.

2. Sloučenina podle nároku 1, kde nádorová buňka je umístěna v centrálním nervovém systému.

* ·Λ* • 9 9 ·'

9' · %·

9'. 9'

3. Sloučenina podle nároku 1, kde nádorem je leukemie nebo melanom.

4. Sloučenina podle nároku 1, kde nádorem je solidní - nádor.

5. Sloučenina podle nároku-1, kde nádorem je nádor prsu, plic, tlustého střeva nebo vajeČníků.

6. Sloučenina podle vzorce:

kde

R^, R₂, R_g a R_v jsou nezávisle H, OH nebo {C_i-C_a)alkoxy;

R a R dohromady jsou -OCH 0-; nebo R a R dohromady jsou • X 2 2 7

-OCH 0-; ^r3 3^{e H}P-₄ je H nebo (C_=L-C_a) alkyl ;

R_g je H, (C_i-C_e)alkyl nebo není přítomen; a R_e je -CH=CH-; a

R_s není přítomen; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

7. Sloučenina podle nároku 6, kde R_g a R₇ jsou -0CH₃.

8. Sloučenina podle nároku 7, kde R_x je -OCH_s.

9. Sloučenina podle nároku 7, kde R je -OCH .

2 3

10. Sloučenina podle vzorce kde

R , R , R , R a R jsou nezávisle H, OH nebo (C -C)aikoxy R_a a R dohromady jsou -OCH₂O-; a R₂ dohromady jsou -OCH₂Qnebo R_e a R_, dohromady jsou -OCH^O-;

R_a je H nebo (C_i-C₈)alkyl;

R_s není přítomen;

R_e není přítomen; a

R₉ je -CH=CH- nebo -(CH₂)₂; s podmínkou, že R nebo R₂ je H;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

11. Sloučenina podle nároku 10, kde R 6 a R 12. Sloučenina podle nároku 11, kde R 4 je ¹ 13 . Sloučenina podle nároku 12, kde R X je :

-OCH.

14. Sloučenina podle nároku 12, kde R_x je H, R₂ a R^ jsou

OCH 0-. 2

15. Sloučenina podle nároku 11, kde R je H.

* 7 I 7 Λ»·’ ¹ ·(···./ β,/ •ί'»' » * · * « ·»<

·„ ‘ ί » .,.

♦ ···> ··» ·· 0«

16. Sloučenina podle nároku 15, kde R^ je H, R₌ a R₃ -och₃.

17. Sloučenina podle nároku 15, kde R_x je H, R₂ a R_s -OCH₂O-.

18. Sloučenina podle vzorce:

j sou j sou kde

R_i? R₂ a R₃ jsou nezávisle H, OH nebo (C^-Οθ)alkoxy; R₂ a R₃ dohromady jsou -OCH₂O-; nebo R_x a R₂ dohromady -OCH₂O-;

R₄ je H nebo {C_i-C_a)alkyl;

R_£ je H, (C_i-C)alkyl nebo není přítomen;

R_g a R_v jsou každý OH; a

R_e a R^ nejsou přítomny; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

jsou

19. . Sloučenina podle nároku 18, kde R 4 je CH . 3 20 , . Sloučenina podle nároku 19, kde R 5 je CH₃. 21. každý . Sloučenina OH. podle nároku 20, kde R 1 je H a R,

3 ^^SOU

0 »· *

0 «

0 i* 0

7 ΙΓ Τ

0 tf 0 90 · •«ί.*·,¹' 0

22. Terapeutický způsob pro inhibici růstu nádorových buněk vyznačující se tím, že savcům postiženým nádorem je podáno množství sloučeniny.podle vzorce:

kde

R ·, R . R , R a R jsou nezávisle H, OH nebo (C -C )alkoxy;

R^ a R₃ dohromady jsou -OCH^O-; R^ a R₌ dohromady jsou -OCH^O-; nebo R_e a R₇ dohromady jsou -OCH^O-;

R₄ je H nebo (C_i-C_a)alkyl;

R je H, (C -C )alkyl nebo není přítomen; a

R_a a R_a jsou nezávisle -CH=CH-, -(CH₂) nebo nejsou přítomny; s podmínkou, že pokud je R_s -CH=CH- nebo -(CH) -, pak R_g není přítomen a R₃ je H; a pokud je R_g -CH=CH- nebo -(CH₂)₂, pak R^ nebo R₂ je H a R_s a R_e nejsou přítomny;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

23. Způsob podle nároku 22 vyznačující se tím, že nádorová buňka je umístěna v centrálním nervovém systému.

Π..

• * ·,· »;f * ·· i·

24. Použití sloučeniny podle vzorce 'b *4 kde

R , R . R . R a R jsou nezávisle H, OH nebo (C -C )alkoxy;

L 2 3 € 7 3. O

R_a a R₃ dohromady jsou -OCH₂0-; R^ a R₂ dohromady jsou -OCH₂O-; nebo R_g a R_, dohromady jsou -OCH₂O-;

R₄ je H nebo (C_i-C_e)alkyl;

R_s je H, (C -C )alkyl nebo není přítomen; a

R_s a R₉ jsou nezávisle -CH=CH-, - (CH ) nebo nejsou přítomny;

s podmínkou, že pokud je R_e -CH=CH- nebo -(CH) pak R_& není přítomen a R_s je H; a pokud je R_p -CH=CH- nebo ~(CH₂)₂, pak nebo R₌ je H a R_s a R_e nejsou přítomny;

nebo její farmaceuticky přijatelné soli. pro přípravu léčiva účinného pro inhibici růstu nádorových buněk u savců s nádory.

25. Použití podle nároku 24, kde savcem je člověk.

26. Použití podle nároku 24, kde nádorem je leukemie nebo melanom.

27. Použití podle nároku 24, kde nádorem je solidní nádor.

28. Použití podle nároku 27, kde nádorem je nádor prsu, plic, tlustého střeva nebo vaječníků.

29. Použití podle nároku 24, kde nádorová buňka je umístěna v centrálním nervovém systému.

30. Použití podle nároku 24, kde sloučenina je podána v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

31. Použití podle nároku 30, kde nosičem je kapalné vehikulum.

32. Použití podle nároku 30, kde nosič je upraven pro parenterální podání.

33. Použití podle nároku 30, kde nosič je tableta nebo kapsle.

34. Farmaceutický přípravek obsahující účinné množství sloučeniny podle vzorce:

kde

R , R , R , R a R jsou nezávisle H, OH nebo (C -C)alkoxy;

X Z 3 £ *7 X S

R_a a R₃ dohromady jsou -OCH_aO-; R^ a R₂ dohromady jsou -0CH₂O-; nebo R a R dohromady jsou -OCH O-;

R₄ je H nebo (C^-Οθ)alkyl;

• · *' *'

«. · *' · « · · b 5 ·· fe ·' ·, ·

R_s je H, (C_x-C₀)alkyl nebo není přítomen; a

R_e a R_s jsou nezávisle -CH=CH-, -{CH₌) nebo nejsou přítomny; s podmínkou, že . .

pokud je R_e -CH=CH- nebo -(CH)₂-, pak R_s není přítomen a'R₃ je H; a pokud je R_s -CH=CH- nebo -(CH₂)₂, pak R^ nebo R_, je Ή a R₌ -a R_e nejsou přítomny;

nebo její farmaceuticky přijatelné soli; v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

35. Sloučenina 8-methyl-3,4,10,11-tetramethoxydibenzo(a,g) chinoliziniumacetosulfat; 8-methyl-3,4-methylendioxy-l0,lldimethoxybenzo(a,g)chinolizinium acetosulfat; 5,6-dihydro-8-methyl3.4.10.11- tetramethoxy-dibenzo(a,g)chinoliziniumacetosulfat;

5,6-dihydro-8-methyl-3,4,10, ll-tetramethoxy-dibenzo (a,g) chinolizinium acetosulfat; 5,6-dihydro-8-methyl-3,4-methylendioxy-l0,11dimethoxydibenzo (a, g) chinoliziniumacetosulfat; 5,6-dihydro-3,4,

10.11- tetramethoxydibenzo(a,g)chinoliziniumchlorid; 5,6-dihydro-3,4methylendioxy-10,11-dimethoxydibenzo(a,g)chinoliziniumchlorid; ¹

3.4.10.11- tetramethoxydibenzo(a,g)chinoliziniumchlorid; nebo

3,4-methylendioxy-10,11-dimethoxydibenzo (a, g) chinoliziniumchlorid; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

36. Sloučenina 6,7-dimethoxy-l-methyl-3-(3,4-methylendioxyfenyl) izochinolin; 6,7-dihydroxy-l-methyl-3-(3,4-dihydroxyfenyl) izochinolin; 6,7-dimethoxy-l,2-dimethyl-3-(3,4-methylendioxyfenyl) izochinolinium methosulfat; nebo 6,7-dihydroxy-l,2-dimethyl-3(3,4-dihydroxyfenyl)izochinolinium methosulfat; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

*| - *1. Φ »! φ* Φ' »>φ· w «;φφ«· ·), ·)«- φ\ # φ,¹ .φφ

Φ φ Φι ♦>· φ φ’φφ^φι «ιβ; · φφ. Φι φ, φ φ: φ- φ.

···!··» ΦΦ} φφ, φφ φφ,

37. Sloučenina podle vzorce kde

R , R , R a R jsou nezávisle H, OH nebo (C-C )alkoxy;

X 2 6 *7 X 8

R a R₂ dohromady jsou -OCH_.O-; nebo R_s a R_, dohromady jsou -OCHO-; R, je H;

2 3“,

R je H nebo {C -C )alkyl;

4 X 8 ^J

R je H, (C-C )alkyl nebo není přítomen; a

R_s je ^-(^Η₂)₂-; a R_s není přítomen; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

38. Sloučenina podle vzorce kde

R , ^Rs' ^r3' ^r6 ^{a R}7 l^sou nezávisle H, OH nebo (C_i-C_a)alkoxy; R₂ a R₃ dohromady jsou -OCH₂O-; nebo R₆ a R_v dohromady jsou -OCH^O-;

•·

*.· · •j ··· • · ·· · « «*· ·' * »·' ·· ·!

·· • α ·- · ·»

R₄ je H nebo (C_x-C_a)alkyl;

R_g není přítomen;

R₀ není přítomen; a R_& je -CH=CH-;

s podmínkou, že R_x nebo R₂ je H; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

39; Sloučenina podle vzorce kde

R , R , R,, R, a R jsou nezávisle H, OH nebo (C -C )alkoxy; R_s a R₃ dohromady jsou -OCH^O-; nebo R₆ a R_, dohromady jsou -OCH^O-; nebo

R je H nebo (C -C )alkyl;

R_g není přítomen;

R_e není přítomen; a

R je -{CH ) -;

s podmínkou, že R_x nebo R_, je H;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

> 4

444 j · 4.

•F ···

4 44« 44· ·( ·· ·' «i 4- 4

44 4»

40. Sloučenina podle vzorce kde

X je OH;

R_z, R₃, R_g a R₇ jsou nezávisle H/ OH nebo (0_χ-0₈)alkoxy; R₂ a R₃.dohromady jsou -OČH_sO-; nebo R_e a R dohromady jsou -OCH₂O-;

R_a je H nebo (Ο^-Οθ)alkyl;

R_s je H, (C_i-C_e)alkyl nebo není přítomen; a

R_a a R_g nejsou přítomny; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

41. Sloučenina podle vzorce kde ^Rx' ^R3' ^Rs ^{a R}v j^sou nezávisle H, OH nebo (C_i~C_s)alkoxy; nebo R_g a R_? dohromady jsou -OCH₂O-; nebo

R₃ je OH;

je H nebo (C₁-C₈)alkyl;

R_s je H, (C^-Οθ)alkyl nebo není přítomen; a R_e a R_g nejsou přítomny;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

42. Sloučenina podle vzorce kde

R₃, R_e a R_? jsou nezávisle H, OH nebo (C₁-C_B)alkoxy; nebo R_g a R₇ dohromady jsou -OCH^O-;

R^ a jsou dohromady -OCH^O-;

P-₄ je H nebo (C_i-C_B)alkyl;

R_s je H, {C_i-C_e)alkyl nebo není přítomen; a R_e a R_& nejsou přítomny;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

43. Sloučenina podle vzorce

R, •'lit * * e^,J · β β ββ _β · t β t »ee β βββ a β βββ β βββ • β βββ ββ ββ ββ β* kde

R_x, R_g a R_? jsou nezávisle H, OH nebo (C_i-C_a)alkoxy; nebo R_g a R_? dohromady jsou -OCH^O-;

R₂ a R₃ jsou dohromady -OCH₂O-;

R^ je H nebo (C_i-C_e)alkyl;

R_g je H, (C-C_a)alkyl nebo není přítomen; a R_a a R_s nejsou přítomny;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

44. Sloučenina podle vzorce

R^, R₂ a R₃ jsou nezávisle H, OH nebo (C_i-C_e) alkoxy; nebo R₌ a R₃ dohromady jsou -OCH₂O-; nebo R_i a R₂ jsou dohromady -OCH₂O

R₄ je H nebo (C^-Cg)alkyl;

R_s je H, (C_i-C_e)alkyl nebo není přítomen;

R_g a R₇ jsou dohromady -0CH₂O-; a R_a a R₉ nejsou přítomny;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.