CZ234295A3

CZ234295A3 - Bone stimulation factor

Info

Publication number: CZ234295A3
Application number: CZ952342A
Authority: CZ
Inventors: Cherk Shing Tam
Original assignee: Osteopharm Ltd
Priority date: 1993-03-12
Filing date: 1994-03-14
Publication date: 1996-04-17
Also published as: HU9502659D0; AU678441B2; DE69429082D1; HUT73297A; DE69429082T2; CA2157901A1; BR9406447A; EP0688360A1; JP3733381B2; IL108947A0; EP0688360B1; PL310617A1; AU6179794A; JPH08508158A; NZ262352A; KR960701201A; FI954252A0; PL182236B1; ATE208818T1; ES2168295T3

Description

(57) Polypeptidová látka izolovaná ze séra krys, která při podání krysám nevyvolává PTH (parathyroidektomizované krysy), zvyšuje pozorovanou rychlost přírůstku kostních minerálů. Látka se izolovala ve dvou formách, první větší polypeptid má molekulovou hmotnost asi dvojnásobnou než druhý menší polypeptid. Prvních jedenáct aminokyselin ze sekvence menšího polypeptidů se stanovilo jako Gly ProGly Gly Ala Gly Glu Thr Lys Pro Ile. Prvních sedm aminokyselin ze sekvence většího polypeptidů se stanovilo jako Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu. Větší polypeptid by mohl být dimerem menšího polypeptidů. Vzorek nukleové kyseliny na základě sekvence aminokyselin peptidu krys se použil pro třídění knihovny lidské zárodečné jaterní cDNA. Chemicky se syntetizoval polypeptid podle sekvence Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gin Asn Gin Pro. Rychlost přírůstku kostí u krys roste způsobem závislým na dávce při podávání této chemicky syntetizované sloučeniny.

H

E-I

M o

»e

H

W

Ό

K

H tn

O u

a u

í* a

2.0

1.5

1.0 .5 ríl

CB ΤΛ TB TE t- Stimulační faktor kostí

Oblast techniky **** ₇-_ ___ i

Vynález se týká proteinů a polypeptidů, ktere Stimulují růst kostí.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že dokonce u dospělých lidí může kost podléhat výměně. V různých místech, jako je vnitrní zvuková tobolka, nedochází zvejně k výměně po vytvoření orgánu. V jiných místech, zvláště v centrální kosterní ose se ukazuje, že výměna pokračuje během dospělosti. K výměně kosti dochází na povrchu existující kostní matrice, která je složena z proteinu (hlavně kolagenu) a minerálů. Výměna kosti je zahájena rozpadem kostní matrice osteoklasty. Osteoklast je buňka s několika jádry, která vylučuje kyseliny a proteolytické enzymy, což způsobuje lysi proteinu kolagenové matrice a uvolňování minerálů do extracelulárního kapalného oddělení. Po této počáteční fázi odbourávání kosti, dochází ke tvorbě nové kostní proteinové nebo resorpční fázi matrici. Ukládají se nové kostní začínají zabudovávat minerály do proteiny a o něco později se nově vytvořené matrice. Tvorba kostní matrice a její následná minerálizace jsou funkce osteoFáze tvorby je často 1989; The Pathogenesis Diseas^: An OverView. In Metabolic Disease'Eds. Tam, C.S., Heersche, J.N.M Raton a Parfitt A.M.. VillanueAswanl.S.A. 1980, Metab in vivo je resorpce Metab Bone Dis blastů, což jsou buňky s jedním jádrem následována neaktivním obdobím (Tam, C.S. of Metabolic Bone

Cellular and Tissue Mechanisms. and Murray.T.M. CRC Press, Boča va, A.R., Mathews,C.Η.E Res, 2(S), 213). Zdá se s tvorbou (Parfitt A.M.1982 Kostní výměna je tedy sled jako kostní metabolická

Bone Dis Rel těsně spojena Rel Res 4, 1) .

ze událostí, jehož místo se označuje jednotka (BMU-Bone Metabolic Unit). Osteoblasty a osteoklaty, obecně pokládané za mediátory kostní výměny, tak musí patřit, k odlišným buněčným liniím. Tyto dva buněčné druhy nejsou předvytvořené buňky, ale diferencují se ze svých prekursorů během buněčné aktivace (Cocia.P.E., Křivit, V-,

Červenka,J., Clawson.C., Kersey.J., Kim.T.H., Nesbit,M.E., Ramsey,N.K.C., Warkeutin,P-I. , Teitelbaum,S.L., Kahn.A.J., Brown.D.M., 1980: New Eng J.Med, 320, 701 a Marks,S.C.Jr., Valker.D.G., 1981: Am J Anat 161,1 a Owen M., 1985; Bone and Minerál Research, Vol 3, Ed. Peck W.A. Amsterdam 1).

Kostní matrice se může buď zachovávat při úplném zastavení kostní výměny, jako u kosti vnitřní zvukové tobolky, nebo rovnováhou mezi tvorbou a resorpci. Při mnoha pozorováních kosterních změn ve vztahu k věku, je pozorován přírůstek v celkovém tělesném objemu kostí v období růstu a kosterní hmota dosahuje maxima v časné dospělosti. Za přírůstkem následuje úbytek objemu kostí s postupujícím věkem. U žen se často dostavuje fáze rychlejšího úbytku kostí během perimenopausy před pomalejší stálejší fází. Z tohoto důvodu je úbytek kostí u žen silnější než u mužů. Pochopení kostní rovnováhy v kostní metabolické jednotce je zřejmě důležité pro pochopení patogenese při kosterním stárnutí. V každém případě jsou mechanismy řídící kostní výměnu složité a v současné době nejsou uspokojivě vysvětleny. Komplexnost řídících mechanismů vyústila v různé snahy pro snížení úbytku kost í.

Obecně lze kostní výměnu regulovat ve dvou rozdílných stavech. Lze ji regulovat ve stavu aktivace prekursorových buněk. Regulátory buněčné aktivace mohou řídit nejen počet aktivních BMU v kostře, ale také možná počet osteoklastů a osteoblastů v jednotlivé BMU. Jiná možnost je regulovat kostní výměnu na úrovni diferenciovaných kostních buněk. Komplexnost kostního buněčného systému ztěžuje oddělené studium těchto dvou úrovní regulace CParfitt A.M.1982: Metab Bone Dis Rel Res 4, 1).

Regulátory kostních buněk patří do dvou kategorií. První interagují se specifickými receptory na buněčných membránách. Jedna třída těchto regulátorů působí pomocí adenylátového cyklasového systému za vytvoření intrace1u1árního cyklického AMP jako druhého messengeru působícího na proteinovou kinasu K systému. Do této třídy patří parathyroidní hormon CPTH) a kalcitonin CCT) CYamamoto,I.1985; J.J.B.M. 3,38). Druhá třída rovněž interaguje s membránovým receptorem a výsledkem je intracelulární uvolnění molekuly odvozené od fosfoinositidů, což střídavě vede ke zvýšení intracelulárního vápníku a aktivaci kinasy K. Třetí třída zahrnuje interakci regulátoru s receptorem buněčného povrchu, avšak druhý signál je vyvolán samotnou molekulou receptoru s následnou aktivací tyrosinkinasy. Zdá se, že řada růstových faktorů působí tímto způsobem CCana1is,E.1986; Endocrinol 118, 74; Centralla.M., Canal is , E. , 1985 ; Proč Nat.1 Acad Sci, U.S.A. 82,7355; Canalis,E.1985; Clin Grthop 183,246; Chyun,¥-S., Raisz,L.G.1984;Prostaglandins 27,97; Canalis,E.1980; J Clin Invest 66,709; Klein,D.C., Raisz,L.G.1970; Endocrinol 86, 1436; Tashjian A.H.,Jr., Voekel.E.F., Lazarro.M.,Singer,F.R., Roberts.A., Derynck.R., Vinkler,M.E., Levine.L. 1985; Proč Nati Acad Sci, U.S.A. 82,4535; Chen.T.L., Cone.C.M., Morey-Holton,E., Feldman,D.1982; J.Biol Chem 257,13563). Druhá kategorie regulátorů neinteraguje s receptorem buněčné membrány, ale může přehradit buněčnou membránu tak, aby se spojila s cytosolickým receptorem. Regulátor je pak transportován cytosolickým receptor přes buněčnou membránu, aby interagoval s DNA, což způsobuje zvýšenou transkripci specifických genů. Zdá se, že steroidní hormony, včetně vitaminu D, takto působí CRoodman,G.D.1992; J.Bone Miner Res 7, 475).

Mnoho hormonů stimuluje proliferaci osteoklastů. Ty zahrnují l,25C0H)2D, PTH a prostaglandiny. Receptory PTH a l,25C0H)2D v osteoklastech zjevně zatím nebyly identifikovány. Zdá se, že tyto dva hormony nemají vliv na osteoklasty v kultuře. Jsou-li však osteoklasty spo1upěstovány s liniemi buněk podobnými osteoblastům, PTH a l,25C0H)2D stimulují množení osteoklastů. Zdá se, IL-1 a TNF působí podobným způsobem jako PTH a l,25C0H)2D. Jiné růstové faktory, jako EGF, TFG a PDGF zřejmě stimulují osteoklasty pomocí zvýšené tvorby PGE. Kalcitonin a kortikosteroldy jsou známé inhibitory osteoklastů spolu s chemikáliemi jako jsou difosfonáty.

Předpokládá se, že interleukin 1 zřejmě stimuluje kolagen a nekolagenový protein kostí a DNA syntézu. Vliv na syntézu kostních proteinů je blokován indomethacinem, což vede k předpokladu, že tento účinek IL-1 je zprostředkován pomocí PGE. Zdá se, že indomethacin nemá vliv na účinek IL-1 na syntézu DNA osteoblastů. Pozorování kultur linií buněk podobných osteoblastům vede k předpokladu, že některé místně produkované růstové faktory stimulují syntézu DNA a kolagenu. V kulturách kostních buněk potlačují PTH a vitamin D syntézu kolagenu. Tento účinek PTH in vitro je rozdílný s in vivo účinkem pozorovaným u lidí a pokusných zvířat. U krys a lidských hyperparathyroidních pacientů se ukázalo, že PTH může stimulovat ukládání mineralizované kostní matrice. Předběžné klinické zkoušky na účinnost PTH 1-34 aminokyselinového fragmentu při léčení osteoporosy ukázaly, že tento PTH fragment může zvýšit trabekulární objem. Důvod tohoto rozporu není zatím zcela vysvětlen.

Parathyroidní hormon je peptid s 84 aminokyselinami ve své zralé formě. Počátečně translatovaný pre-pro-parathyroidní hormon je mnohem delší, pře sekvence je signální sekvence, která se rozštěpí, když peptid vstoupí do nehotového endoplasmatického reticula. V golgiho aparátu se pro-sekvence rozštěpí a ponechá se intaktní zralý hormon sbalený v sekrečních granulích. Zdá se, že regulace rychlosti sekrece je ovládána ne tak rychlostí produkce intracelulárního hormonu, nýbrž rychlostí intracelulárního odbourávání a rychlostí sekrece. Intracelulárně je zralý peptid osekán na obou koncích, na aminovém a na karboxylovém konci. Dsekaný peptid může být sekretován do oběhu jako inaktivní fragment. Sekrece zralého peptidu může být stimulována poklesem extracelulární koncentrace vápníku. Na druhé straně se zdá, že zvýšená koncentrace vápníku v séru potlačuje sekreci PTH. V oběhu je zralý peptid rychle rozštěpen v játrech na mnoha místech molekuly včetně oblasti 38 aminokyselinového zbytku. Menší fragment na aminovém konci, který obsahuje prvních 34 aminokyselin, nese úplnou známou biologickou aktivitu ve smyslu jeho účinku na ledviny, vnitřnosti a kosti. Také se plně váže na receptář buněčné membrány, aby stimuloval produkci cAMP- Hladina fragmentu 1-38 v séru je normálně neměřitelná, což ukazuje na krátký oběhový život. Větší inaktivní fragment karboxylového konce má relativně dlouhou poloviční dobu života a nese největší část imunoreaktivniho PTH v oběhovém systému. Všechny fragmenty v oběhovém systému jsou nakonec odbourány v ledvinách a játrech. Jeden z renálních mechanismů pro zbavení se cirkulujícího inaktivního PTH fragmentu je glomerulární filtrace CSegre G.V. 1990 Secretion, metabolism and circulating heterogeneity of parathyroid hormone. In Přiměř in Metabolic Bone diseases and Disorders of Minerál Metabolism. První vydání. ed. Favus M.J.,

Kelseyville, California).

PTH se účastní homeostasi vápníku a kostry. PTH stimuluje tubulární resorpci vápníku ledvinami a inhibuje reabsorpci fosfátu a kyselého uhličitanu blízkými renálními tubuly. Druhý účinek PTH na ledviny je stimulování produkce l,25(0H)2D. Tento metabilit vitaminu D je in v ivo stimulátorem osteoklastů a také zvyšuje absorpci vápníku vnitřnostmi. Zvýšení absorpce vápníku vnitřnostmi následující po PTH stimulaci je zprostředkováno tímto metabolitem vitaminu D. In v ivo stimuluje PTH osteoklastovou resorpci kostí s uvolněním vápníku do oběhu. PTH rovněž způsobuje množení osteoblastů (Selye H. 1933, Endocrinol 16, 547). V mnoho případech hyperparathyroidismu dochází ke kosternímu úbytku. Avšak bylo popsáno zvýšení specifické hmotnosti páteře v některých případech primární

R.E., Ker J.L., Loyd H.M., 1964,

Ereijances J., Stoner R.E.

Trans Am Clin Climatol Assoc 85, 185; Gennant H.K., Baron Paloyan E., Jovsey J., 1975, Am J Med 59, 104) stejně jako hyperparathyroidismu komplikujícího renální nedostatek. Kalu a Valker pozorovali, že trvalé podávání malých dávek parathyroidního extraktu vedlo ke skleróze kostí u krys (Kalu D.N., Pennock J., Doyle E.H., Foster G.V. 1970 Lancet 1, 1363). Tam a spol. studovali vliv nízko- vápníkové diety na rychlost přírůstku kostních minerálů u krys značeným tetracyklinem a zjistili, že navzdory úbytku kostí z důvodu zvýšení kostní resorpce histologicky (jako výsledek sekundárního hyperparathyroidismu) byla zvýšena rychlost přírůstku kostních minerálů (Tam hyperparathyroidismu Am J Med 37, 813;

Martin L.G., Jovsey J.

(A i tken Connor T.B 1973 J.M.

u sekundárního

C.S., Harrison J.E., Reed R.

Cruickshank B. 1978, Metabolism

27, 143). Bylo rovněž zjištěno, že rychlost přírůstku kostních minerálů se zvýšila u 23 lidských pacientů s mírným primárním hyperparathyroi d i smem

Bayley T.A., Harrison J.E.

(Tam C.S.

Murray T.M. , Birkin Eí.L. , Thompson D. 1978. Bone biopsy in the diagnosis of priraary hyperparathyroidism. V Copp D.H., Talmage R.V. (eds) Endocrino logy of Calcium Metabolism. Excerta Medica, Amsterdam, str. 427 (Abstract)). Po úspěšném odstranění parathyroidního adenomu u čtyř z pacientů, rychlost se vrátila na úroveň kontrolních osob. Bylo rovněž zjištěno, že se jedná o stimulaci rychlosti přírůstku minerálů závislou na dávce PTH.

Schopnost fragmentu 1-34 a intaktního PTH hormonu se zdá být přibližně stejná na molární bázi.To je v souladu s fragmentem 1-34 molekuly PTH nesoucí biologickou aktivitu intaktního hormonu. Bylo rovněž pozorováno, že konečný výsledek podávání PTH na kosterní homeostázi závisí na tom, jak je hormon podáván. Při stejné denní dávce, objem kostí ukazuje zvýšení závislé na dávce, jestliže je denní dávka hormonu podána jako jedna injekce. Avšak je-li denní dávka podána kontinuální infuzí s podkožní miniosmotickou pumpou, výsledkem je úbytek kostí. Občasná injekce neměla prakticky žádný vliv na hladiny vápníku v séru, přičemž infuze způsobila zvýšení sérového vápníku závislé nadávce. Účinky PTH podávaného těmito dvěma způsoby na rychlost přírůstku kostních minerálů, měřeno značením tetracyklinu, jsou stejné. Co způsobuje tyto rozdílné účinky se neví (Tam C.S., Heersche

Murray T.M., Parsons J.A. 1982, Endocrinol 110, 506).

V patentové literatuře jsou uvedena obecná vysvětlení pro růst kostí a jeho regulaci, různé způsoby léčení chorob zahrnujících úbytek hmoty kostí a doprovodných nemocí a jsou uvedeny příklady. Například PCT patentová přihláška č. 9215615 publikovaná 17. září 1992 popisuje protein získaný z vepřového pankreatu, který snižuje hladiny sérového vápníku pro léčení nemocí kostí, které způsobují zvýšení hladin sérového vápníku. Evropská patentová přihláška č. 504938 publikovaná 23. září 1992 popisuje použití dipeptidů nebo tripeptidů, které inhibují cysteinproteasu při léčení onemocnění kostí. PCT patentová přihláška č. 9214481 publikovaná 3. září 1992 popisuje směs pro indukci růstu kostí, směs obsahuje aktivin a kostně morfogenní protein. Evropská patentová přihláška č. 499242 publikovaná 19. srpna 1992 popisuje použití směsí buněčných růstových faktorů považovaných za užitečné pro kostní onemocnění zahrnující snížení kostní hmoty, protože způsobují množení osteoblastů. PCT patentová přihláška č. 4039656 publikovaná 17. června 1992 popisuje léčivo obsahující lidský N-koncový PTH fragment 1-37. Evropská patentová přihláška č. 451867 publikovaná 16. září 1991 popisuje antagonisty peptidu parathyroidního hormonu pro léčení dysbolismu spojeného s vápníkem nebo kyselinou fosforečnou, jako je osteoporosa.

Podstata vynálezu

Poměrně krátký Čas poloviční doby života PTH v krevním séru a poměrně dlouhý účinek podkožní injekce PTH vedl současného vynálezce k hypotéze, že PTH může nějakým způsobem indukovat druhý faktor v oběhovém systému. Přítomnost takového druhého faktoru v krevním séru krys a lidí byl zjištěn.

Podařilo se izolovat z krevního séra krys polypetidovou látku, která při podávání krysám neschopným produkovat PTH Cparathyroidektomizované krysy) zvýšila rychlost pozorovaného přírůstku kostních minerálů. Dále se zjitilo, že rychlost kostního přírůstku roste s dávkou podávané izolované látky, alespoň v rozsahu dávky a časového úseku během pozorování. Látka se izolovala ve dvou formách, první delší polypeptid měl dvojnásobnou molekulovou hmotnost než druhý kratší polypetid. Prvních jedenáct aminokyselin sekvence kratšího polypetidu bylo stanoveno takto: Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr Lys Pro Ile CSEQ ID NO:í ) . Prvních sedm aminokyselin delšího polypetidu bylo stanoveno takto: Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu CSEQ ID N0:2). Podobnost těchto dvou NH2-koncových sekvencí vedlo k předpokladu, že delší polypetid by mohl být dimer prvního.

Byl syntetizován vzorek založený na sekvenci aminokyselin peptidů krys a použit pro screenlng lidské fetální knihovny cDNA ledvin, aby se izolovala sekvence lidské nukleové kyseliny, která kóduje lidský polypetid kostního přírůstku. Byl chemicky syntetizován polypeptid podle sekvence Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gin Asn Gin Pro CSEQ ID NO:11). Předpokládá se, že aktivní polypetid je dimer předchozí sekvence, dimer je tvořený disulfidlckým můstkem mezi dvěma polypeptidy s uvedenou sekvencí.

Bylo zjištěno, že rychlost kostního přírůstku u krys roste dávkově závislým způsobem při podávání této chemicky syntetizované látky.

Stručný popis výkresů

V následujícím popisu jsou odkazy na přiložené výkresy, kde Obr. 1 znázorňuje sledování oxytetracyklinových svazků v kostním útvaru králíka po dvou intravenosních injekcích tetracyklinu podaných odděleně v rozmezí 48 hodin. Vertikální šipky ukazují body, ve kterých se injekce aplikovaly. D znamená vzdálenost mezi těmito body na diagramu sledování. Optické zvětšení x 250: mechanické zvětšení x 55,6. Tento odstup může být také zjištěn od píku k píku.

Obr. 2 znázorňuje kalibraci přístroje MPV-CD pro měření rychlosti přírůstku kostních minerálů. V zařízení je snímána mikroskopická mřížka. Pozorované měřené vzdálenosti jsou zakresleny proti vzdálenostem mřížek. Rozmezí chyb je + 1 odchylky standardu <S.D.).

Obr. 3 znázorňuje kalibraci sloupce Sephadexu G50. Sloupec má vnitřní průměr 2,5 cm a délku 90 cm. Pohyblivá fáze byla 20 mM Tris.Cl <pH 7,2) a 50 mM NaCl s průtokovou rychlostí 2,5 ml/min. Jako standardy molekulové hmotnosti se použily lidský IgG <MH 110K), hovězí serumalbumin <MH 66K), ovalbumin <45K) a cytochrom C <12,410. Vzorky byly sbírány v 10 ml frakcích. Jsou znázorněny absorpce 0.D.280 jednotlivých frakcí.

□br. 4 znázorňuje vliv různých složek séra na tvorbu kostí. Rychlost tvorby kostí je měřena značením tetracyklinu, podrobnosti metody jsou popsány v textu. Sérum krys buď při dietě s dostatkem vápníku <0,5 % vápníku) nebo dietě s nedostatkem vápníku <0,1 % vápníku) se frakcionuje podle molekulové velikosti gelovou propustností. Testované frakce mají molekulovou hmotnost mezi 66K a 45K <počet krys v kontrolní skupině = 3: počet krys v testované skupině = 4), mezi 45K a 12,4K <N=4 pro kontrolní skupinu: N=4 pro testovanou skupinu), a pod 12,4K <N=4 pro každou skupinu). Frakce séra dvou krys se testovaly v jedné 250-300 g parathyroidektomizované kryse. Jsou tři kontrolní a tři testovací skupiny. Testovaná skupina, která obdržela sérovou frakci s molekulovou hmotností pod 12,4K měla vyšší rychlost přírůstku kostních minerálů než odpovídající kontrolní skupina <P<0,05). Meze chyb byly + 1 standardní chyby <S.E.)

Obr. 5 až 9 jsou velikostní frakce s molekulovou hmotností

MH<12,4K z krys s nedostatkem vápníku chromatografovane C18 HPLC s reverzní fází. Je jeden pík v některých pokusech, který se eluuje před 55 min. při CH3CN nad 50 % (označený c)- Při testování na parathyroidektomizovaných krysách, tento pík ukázal zřejmý stimulační účinek ve srovnání s některými jinými píky (označené C.B.D.E). Kontrolní pokus zobrazený na Obr. 9 byl se sérem z normálních krys. Na Obr. 6 a 8 je většina sledování při 214 nm.

Obr. 10 ilustruje biologické aktivity látek eluovaných ze sloupce C18. Sebrané píky se lyofi 1izovaly a znovu rozpustily v 2,5 ml pufru. Z toho 0,4 ml se injikovalo do parathyroidektomizovaného testovaného zvířete. Pro jednotlivý pík se použila dvě zvířata. x znamená rychlost jednotlivého testovaného zvířete a histogram představuje průměr-Z důvodu malého počtu zvířat, nebyla provedena statistická analysa.

Obr. 11 ukazuje závislot tvorby kostí na dávce látky v píku C. Koncentrace polypeptidů se stanovily pomocí Belfordova činidla. V první skupině tří krys (střední sloupec v grafu) se použilo 6 pg na krysu a ve druhé skupině tří krys (poslední sloupec) 12 pg na krysu pro ostatní. Kontrolní skupina tří krys (první sloupec) dostala nosičový pufr. Použitá zvířata byla před-parathyroidektomizována. Jedná se o odpověď závislou na dávce (P<0,05). Meze chyb vykazují ± 1 standardní chyby (S.E.).

Obr. 12 ukazuje elektroforesu na akrylamidovém gelu frakce séra krysy s nedostatkem vápníku s molekulovými hmotnostmi 30-3K. Sérum při nedostatku vápníku se podrobilo ultrafiltraci s MVCO (molecular weight cut off) membránami 30K a 3K, aby se získala frakce s MH mezi 30K a 3K. 100 pg frakce zjištované Belfordovým činidlem se naneselo na 15¾ fosfátoakrylamidový gel. Gel se prolil 100 mM Tris-fosfátem, pH 6,9 s 0,1% SDS- Vzorek se ošetřil 100 mM Tris-fosfátem, pH 6,9 a 0,1% SDS při 60 °C po dobu 30 min bez redukčního činidla. Pak se vzorek nanesl a podrobil elektroforese při konstantím napětí 100 V (okolo 8 V/cm) 2 hod. a se obarvil chromasinovou modří. Bylo identifikováno pět pruhů o nízké molekulové hmotnosti a označena jako TA,TB,TE,TF,TG.

Obr. 13 ukazuje biologické aktivity látky eluované z pruhů při elektroforese na akrylamidovém gelu. Pruhy v gelech se vyřízly, louhovaly a namočily v 20 mM Tris-Cl CpH 7,2), 50 mM NaCl, 0,1% Triton X 1 mM DTT a 1 mM PMST po 48 hod. Eluované látky se značně dialysovaly proti pufru 20 mM Tris-Cl CpH 7,2), 50 mM NaCl, 1 mM PMST a 1 mM DTT s MWC0 membránou 3,5K a zahustily se na 500 ml. Obsah proteinů byl stanoven Belfordovým činidlem a 24 pg látky se testovalo v pre-parathyroidektomizovaných krysách jako předtím. Použila se čtyři zvířata pro kontrolní skupinu, která dostala nosičovy pufr. Pouze pruhy TA CN=3), TB CN=3) a TE CN=4) obsahovaly dostatek látky pro testování. TB a TE vykazovaly významný stimulační účinek na tvorbu kostí CP<0,025), přičemž TA neměl žádný účinek. Meze chyb byly + 1 standardní odchylky (S.D.).

Obr. 14 je chromatogram CHPLC na sloupci C3) lidského polypeptidu expresovaného v E. coli. Medium E.coli se odstředilo při 12,0000 dvakrát pokaždě patnáct minut. Medium se zahustilo lOx membránou YMS CMVCO 3K). Koncentrace soli v mediu se upravila na 100 mM před zahuštěním fosfátem sodným CpH 7,2). Velmi dobře rozlišený pík se eluoval za podmínek podobných těm při isolaci polypeptidů z lidského séra, to jest při 62-63% CH3CN.

Obr. 15 ilustruje účinek lidského polypeptidů expresovaného v E.coli na tvorbu kostí u krys. Kontrolním krysám CN=6) se injikoval nosičový pufr. První skupina testovaných krys CN=4) se iniikovalo 0.7 O.D. C280 nm) jednotek expresovaného polypeptidů a druhá skupina testovaných krys CN=6) se injikovala 0,3 0-D. jednotkami polypeptidů. Expresovaný produkt měl biologickou aktivitu CP<0.05) srovnanou s kontrolní skupinou. Meze chyb byly ± 1 S.D.

Obr. 16 ukazuje tricin SDS elektroforetický gel lidského chemicky syntetizovaného polypeptidů CSEQ ID NO:11).

□br. 17 ukazuje podélný řez spodní pravé stehenní kosti krysy. Spodní epifysa je označena šipkou A. Šrafované plochy představují spodní metafysu B a střední C části kosti.

Obr. 18 ukazuje rychlost přírůstku kostí Cum za den) u krys injikovaných 25 pg chemicky syntetizovaného lidského polypeptidu, první sloupec CN=9). Kontrolní skupina A, druhý sloupec, CN=9) byla injikována 1 ml roztoku 0,1% BSA v 0,1% kyselině octové. Kontrolní skupina B, třetí sloupec, CN=7) byla injikována 1 ml roztoku 0,1% BSA v 0,1% kyselině octové, který byl zahříván k bodu varu deset minut pro denaturování BSA.

Obr. 19 ukazuje podélný rez spodní pravé stehenní kosti krysy. Vyšrafovaná oblast představuje část spodní epifysy A kosti brané pro měření kostního přírůstku. Epifyseální chrupavka je označena šipkou B.

Obr. 20 ukazuje průřez spodní pravé stehenní kosti krysy. Měření kostního přírůstku se prováděla ve třiceti místech kostního útvaru v trabekulární kosti obalené endostealním povrchem spodní stehenní epifysy, znázorněná řezná plocha je soustavně pokrývána, snímané části jsou znázorněny přerušovanými čárami a šipky ukazují růst mikroskopického stupně pokrytí plochy.

Obr. 21 graficky znázorňuje dávkovou závislost rychlosti přírůstku kostních minerálů (jam za den) u krys na množství chemicky syntetizovaného lidského polypeptidu (SEQ ID NO:11) jako funkci hmotnosti (jjg) podávaného polypeptidu (N=4 pro všechny skupiny).

Obr. 22 graficky znázorňuje dávkovou závislost rychlosti přírůstku kostních minerálů (procento změn) u krys na množství chemicky syntetizovaného lidského polypeptidu CSEQ ID NO:11) jako funkci hmotnosti (pg) podávaného polypeptidu.

Příklady provedení vynálezu

OBECNÁ METODOLOGIE

INDUKCE HYPERPARATHYROIDNÍHO STAVU U KRYS

Dieta s nedostatkem vápníku (Katalog č. 113034, Lot č.0186-3) použitá pro vzbuzení hyperparathyroidního stavu byla koupena od Dyets, 2508 Easton Avenue, Bethlehem, Pennsylvania 18017, U.S.A. Tato strava obsahovala 0,1 % vápníku a 0,05 % fosforu. Dieta s dostatkem vápníku (Katalog č. 113035, Lot č. 01864) použitá pro kontrolní zvířata obsahovala 0,5 % vápníku a 0,05 % fosforu, jak je uvedeno výrobcem Dyets. Obě diety obsahovaly vitamin D v koncentraci 1 i.u./g. Diety jsou granulovány v paletách a každé zvíře dostalo 10 granulí denně s demineralizovanou vodou. Testovaná zvířata se vystavila těmto dietám po dobu dvou týdnů.

POKUSNÉ KRYSY

Standardním testovaným zvířetem byla krysa Sprague-Davley od Charles River Laboratory. Použili se samečci krys o hmotnosti mezi 200 až 250 g v době nákupu, krysy se umístily v párech ve shodných klecích.

ZNAČENÍ KOSTI TETRACYKLINEM PRO STANOVENÍ RYCHLOSTI PŘÍRŮSTKŮ KOSTNÍCH MINERÁLU U KRYS (Tam C.S., Anderson V. 1980, Calcif Tiss Res 30, 121)

Bylo předvedeno, že dávka tetracyklinu 24 mg/kg tělesné hmotnosti injikovaná intravenosně krysám se během půl hodiny odstranila z oběhu. To znamená, že při takovém čase hladina sérového tetracyklinu není měřitelná pomocí bioassaye. Také se ukázalo, že střídavé značící dávky od 6 do 24 mg/kg tělesné hmotnosti způsobily stejnou měřenou rychlost přírůstku kosti. Tedy tetracyklin podávaný střídavě, to jest jako značené pulsy v tomto rozsahu dávek se zdá být dostačujícím způsobem značení kostí pro studium rychlosti přírůstku kostních minerálů.

Rovněž se ukázalo, že v oblasti tvorby kosti BMU může být ukládání mineralizované kostní matrice přerušeno. Nejvíce k takovému přerušení dojde tehdy, jestliže je doba mezi dvěma dávkami tetracyklinu delší než 7 dní. Takové přerušení je možná proto, že se tam aktivuje víc než jedna skupina osteoblastů, která nastoupí ve stejném místě povrchu matrice. Taková aktivace osteoblastů může být nahodilá nebo nenahodilá. Z důvodu předejití takovému vlivu na měření rychlosti ukládání kostních minerálů, se použilo 48 hodinových intervalů mezi značeními. Výhradně se používal tetracyk1inhydrochlorid, ketrý má sérovou poloviční dobu života 8 hodin, když se použije terapeutická dávka.

Tetracyklin se excituje při dlouhém UV světle Ct.j. rozsahem blízkým k modrému rozsahu a je emitována jasně žlutá fluorescence, tato fluorescence je detekovatelná v kostních řezech pozorovaných fluorescenčním mikroskopem. Tetracyklin značí povrch kosti, když nově vytvořená kolagenová matrice začíná zabudovávat vápník a když se takový povrch rozřeže, tetracyklin se projeví jako žlutý fluoreskující pruh. Následovně podaná dávka tetracyklinu se projeví jako druhý pruh umístěný na povrchu k prvnímu pruhu. Vzdálenost mezi oběma pruhy představuje tloušťku kostní matrice vytvořené v intervalu mezi dvěma dávkami. Rychlost kostního ukládání se může vypočítat dělením vzdálenosti časovým intervalem mezi dávkami. Chyby se mohou vnést řezy, které nejsou kolmé k rostoucímu povrchu kosti. Pro zmenšení této chyby se použila pouze místa, kde dva pruhy byly oddělené od sebe a byly rovnoběžné vůči sobě. Zvolila se měření na 10 nahodile vybraných místech, která splňovala tento požadavek, pro získání hodnot blízkých aritmetickému průměru rychlosti.

Použitý měřící systém byl Leitzův snímací světelný mikroskopický fotometr MPV-CD s UV zdrojem opatřeným 100 W stabilizovaným rtuťovým horákem. Řezy se obyčejně zvětšily použitím 16x objektivu při použití pohyblivé snímací štěrbiny, intenzita fluorescenčního pásu se zesílila a zaznamenala. Světelný signál se převedl do číselného výstupu a profil intensity tetracyklinu se zaznamenal. Vzdálenost, mezi píky intensity se brala jako vzdálenost mezi dvěma tetracykllnovými pruhy znázorněnými na Obr. 1. Zařízení má mechanickou chybu menší než 5 %. Měřená vzdálenost se pravidelně kalibrovala mikroskopickou mřížkou a nalezl se dobrý vzájemný vztah, jak je znázorněno na Obr. 2.

KOSTERNÍ MÍSTO PRO STUDIUM RYCHLOSTI PŘÍRŮSTKŮ KOSTNÍCH MINERÁLU U KRYS

Spodní metafysa pravé stehenní kosti se obecně vybrala jako místo měření, pokud není jinak vyznačeno. Toto místo je umístěno asi 1 mm nad spodní stehenní růstovou deskou a rozkládá se vzhůru k tělu (dříku) na vzdálenost asi 5 mm.

HISTOLOGICKÝ PREPARÁT KOSTNÍHO MATERIÁLU KRYS

Vzorek kosti se vyříznul ze zvířete po úhynu. Kostní vzorek se hned stabilizoval v 10%ním vodném roztoku formaldehydu pufrovaném na pH 7,2 50 mM fosfátovým pufrem. Mírné pH způsobí vyloužení tetracyklinu z kostní matrice. Po 24 hod. stabilizační době se vzorek zpracoval následovně.

80% ethanol	24	hod.
95% ethanol	24	hod.
absolutní ethanol	24	hod.
absolutní ethanol	24	hod.
aceton	24	hod.
Spurrsovo medium: acetonu ±-.±	24	hod.
Spurrsovo medium acetonu 1 = 4	24	hod.
Spurrsovo medium	24	hod.

Vzorek se pak vložil do čerstvě vyměněného Spurrsova media a ošetřil při 45 °C po dobu 24 hod. a pak se ošetřil při 80 °C po dalších 24 hod.

Ošetřený špalík se rozřezal na 400 μη tlusté řezy použitím Leitzovy mikrotomové pilky vybavené diamantovým pilovým listem. Relativně tlusté řezy se obrousily mezi dvěma brusnými skleněnými deskami předen zdrsněnými karborundovým práškem na konečnou tlouštku asi 10 μη, použila se voda jako brusný lubrikant. Tenké řezy se sušily a umístily se neobarvené do Permount CFisher).

PARATHYROIDEKTOMIZACE KRYS PRO ZJIŠTĚNÍ ÚČINKU TESTOVANÝCH LÁTEK NA PŘÍRŮSTEK KOSTÍ

Samečci krys Sprague-Dawley mezi asi 200 až 250 g se parathyroidektomizova1 i za celkové anestese nembutalem. Parathyroidní žlázy se rozložily opakovaným zmražením a roztáním. Týden po chirurgickém ošetření se zvířata opět. podrobila anestesi a odebralo se 0,5 ml krve z ocasní žíly. Zvíře pak bylo bez potravy přes noc. Druhý den ráno se zvíře opět podrobilo anestesi a odebralo se mu 0,5 ml krve z ocasní žíly. Měřil se sérový vápník před a po půstu. Úbytek sérového vápníku během půstu na

1,8 mM nebo níže se považoval za znak úspěšného chirurgického zásahu. Testovaná látka se pak injikovala do ocasní žíly následována první dávkou tetracyklinu nebo se injikovala intramuskulárně. Druhé tetracyk1 i nové značení bylo po 48 hodinách později a zvíře se usmrtilo 24 hodin potom narkosou oxidem uhličitým. Pak se odebral vzorek kosti pro měření rychlosti přírůstku kostních minerálů.

„ , ~ , „ . ο »

POČÁTEČNÍ TRIDENI SÉROVÝCH PROTEINU A PEPTIDŮ KRYS GELOVOU PERMEACÍ

Rozsah molekulových hmotností proteinů a peptidů v séru je široký a počet proteinů a peptidů obíhajících v krvi je velmi velký. Použila se gelová permeace pro počáteční třídění proteinových složek séra při různém rozsahu velikosti molekul a pro testování biologického účinku těchto tříd na přírůstek mineralizované kostní matrice.

MATERIÁL A POSTUPY

Použil se skleněný válec Pharmacia o vnitřním průměru 2,5 cm a délce 90 cm. Použil se Sephadex G 50 od Sigmy, který má středně jemně zrnitou matrici. Suchá Sephadexová matrice <25 g) se nasypala do 1000 ml konické baňky a přidalo se 800 ml deinizované vody obsahující 0,02¾ NaN3 pro nabobtnání suché matrice. Toto se ponechalo přes noc při teplotě místnosti pro dokonalé nabobtnání matrice.

Po nabotnání Sephadexové matrice se zásobní nádoba s náplní spojila s horním koncem sloupce a nabobtnalá matrice si sedala ve sloupci asi tři hodiny. Zásobník se pak odstranil, připevnila se horní armatura sloupce a sloupec se ekvllibroval pufrem složeným z 20 mM Tris.HCl pH 7,2 a 50 mM NaGl- Pufr se čerpal měřícím peristaltickým čerpadlem (Pharmacia) rychlostí 2,5 ml za min.

Během tohoto postupu si matrice ve sloupci ještě sedala a bylo nutné doplňovat sloupec opakovaně dokud nebyl úplně plný. Sloupec se opět ekvilibroval stejným pufrem další tri hodiny při 4 °C.

Sloupec Sephadexu G 50 se kalibroval molekulárními markéry složenými z^:

lidský IgG	M.H.	110	000	6,00	mg
BSA	M.H.	66	000	10,00	mg
Ova1bum i n	M.H.	45	000	8,25	mg
Cytochrom C	M.H.	12	400	4,00	mg

Tyto látky se získaly od Sigma a rozpustily se ve 2 ml deionizované vody pro nanesení. Molekulární markéry se nanesly a promývaly kalibračním pufrem rychlostí 2,5 ml za min. a sebra16 lo se 50 frakcí po 10 ml. Absorpce UV při 280 nm jednotlivých frakcí se měřila spektrofotometrem Varian UV/VIS.

Použilo se 40 samečků krys Sprague-Davley, kteří vážili mezi 173 až 212 g při dopravení do laboratoře. Čtyry krysy během pokusu onemocněly (s diagnosou respirační infekce) a ty se vyřadily. 36 zbylých krys se rozdělilo do testovaných a kontrolních skupin po 18 krysách na skupinu. Krysám testované skupiny se podávala potrava s nedostatkem vápníku a krysám z kontrolní skupiny se podávala potrava s dostatkem vápníku, jak bylo popsáno výše. Všechny krysy se pak utratily a sérum se sebralo a spojilo. Koncentrace vápníku a fosforu ve spojeném séru se měřily za použití kolorimetrických metod a souprav koupených od Vorthington.

PŘÍPRAVA SÉRA KRYS PRO BÉLOVOU PERMEACI

Posmrtné krevní vzorky získané od jednotlivých krys se odstřeďovaly při 2000 otáčkách za min. po dobu 15 min. v centrifuze Beckman J6B při použití rotoru JS 4,2. Sérum krys ze stejné skupiny se spojilo. Přidalo se PMSF (Sigma) a dithiothreitol (Biorad) každého v koncentraci 1 mM. Sérum se pak skladovalo zmrazené při - 85 °C. Pro gelovou permeaci se zmrazené sérum nechalo roztát a odstředilo se v centrifuze Beckman J2-21 při 12000 otáčkách za min. po 30 min. za použití rotoru JA 17 pro oddělení ze vzorku částic a lipidu.

BÉLOVĚ PERMEAČNÍ CHROMATOGRAFIE OŠETŘENÉHO SÉRA KRYS ml séra se naneslo a chromatografoválo stejným pufrem použitým pro ekvilibraci. Před nanesením se sloupec ekvilibroval tři hodiny pufrem a vzorek se pak proraýval průtokovou rychlostí 2,5 ml za min. a sbíral se eluát v 10 ml frakcích.

Sebrané frakce se pak spojily podle molekulové hmotnosti, potom se dialyzovaly v 1000 ml 20 mM Tris.Cl pH 7,2 obsahujících 1 mM každého z PMSE a DTT za použití 2,5 cm dialyzačních střev Spectrophor s MWCO 3500. Dialýza se uskutečnila přes 24 hod. při 4 °C při třech výměnách dialyzačního pufru. Dialyzované vzorky se pak lyofi 1izovaly v lyofi 1izačnim zařízení Virtus a skladovaly při -20 °C.

TEST BIOLOGICKÉ AKTIVITY SÉROVÝCH FRAKCÍ

Je jistá nesnáz ve srovnávání aktivit u frakcí podle hmotnosti z důvodu rozdílných koncentrací složek ve frakcích. Nezávisle, se podávaly odpovídající frakce ze dvou krys jednomu testovanému zvířeti. Dávka se rozpustila v 0,5 ml 20 mM Tris.Cl pH

7,2 a 50 mM NaCl a intramuskulárně injikovala do PTX testovaného zvířete. Potom okamžitě následovala intravenosní dávka tetracyklinhydrochloridu způsobem popsaným výše. Po 24 hod. se podala další intravenosní dávka tetracyklinu a po 24 hod. se krysa usmrtila a zjišťovala se rychlost přírůstku kostních minerálů jak uvedeno výše.

POČÁTEČNÍ VÝSLEDKY PŘI IZOLACI POLYPEPTIDU KRYS

Profil eluce molekulárních markérů je na Obr. 3 a v tabulce 1.

i TABULKA 1 -Profi 1 eluce molekulářních	markér	při gelové	permeac i
I 1 i Molekulová Hmotnost j i 1	Eluční	Objem
I 1 i > 110 000 i	100	ml
i 110 000 - 66 000 i	100	m 1
i 66 000 - 45 000 \|	70	ml
i 45 000 - 12 400 \|	40	ml
Í < 12 000 í	100	ml	i

Nebyl nalezen žádný nepochybný rozdíl mezi koncentracemi vápníku a fosforu v séru krys na potravě s nedostatkem vápníku a krys na potravě s dostatkem vápníku, ačkoli se koncentrace vápníku jevila jako nižší u dříve uvedeného séra (2,55 mM ve srovnání s 2,85 mM pro sérum krys na potravě s dostatkem vápníku). Koncentrace fosforu byla 0,33 mM pro první sérum a 0,43 mM pro druhé sérum. Tyto rozdíly mohou být výsledkem kompenzačního sekundárního hyperparathyroidismu u krys na potravě s nedostatkem vápníku. Avšak to se nepotvrdilo PTH assayí u krys na potravě s nedostatkem vápníku.

Sérové frakce kontrolních a testovaných krys se spojily podle rozsahů molekulových hmotností uvedených v tabulce 1.

Ze 40 krys podrobených parathyroidektomii jen 25 přežilo operaci. Sérový vápník v ne postním stavu u těchto 25 krys byl 2,57 + S.D. 0,05 mM a ve stavu půstu 1,70 + S.D. 0,04 mM. Byl učiněn závěr, že u těchto zvířat byla operace úspěšná. Frakce s molekulovou hmotností větší než 110 000 a mezi 110 000 a 66 000 se netestovaly nebot množství přítomných proteinů bylo příliš velké, aby se mohlo podat v jedné dávce bez špatného vlivu na zvíře. Proto se testovaly pouze tři frakce pro sérum s dostatkem vápníku a sérum s nedostatkem vápníku. Pro každou frakci se použila 4 zvířata. Jedna krysa, která dostala frakci ze séra s dostatkem vápníku s molekulovou hmotností mezi 66 000 a 45 000 uhynula během anestéze, když se intravenozně podal tetracyklin. Výsledky jsou uvedeny na Obr. 4.

Byl zjištěn statisticky významný rozdíl mezi přírůstkem kostních minerálů krysy, která dostala frakci s dostatkem vápníku s molekulovou hmotností menší než 14 500 a krysami, které obdržely odpovídající frakci ze séra s nedostatkem vápníku (P<0,05).

Tyto předběžné výsledky ukázaly, že frakce séra obsahující složky o molekulové hmotnosti menší než 14 500 má asi stimulační vliv na rychlost přítůstku mineralizované kostní matrice.

POKUSY SE SLOŽKAMI SÉRA S NÍZKOU MOLEKULOVOU HMOTNOSTÍ ZÍSKANÝMI ZE SÉRA KRYS S NEDOSTATKEM VÁPNÍKU

MATERIÁL A METODY

Použilo se 50 samečků krys Sprague-Dawley každý vážící mezi 200 a 250 g. Polovina krys byla na potravě s nedostatkem vápníku a polovina na potravě s dostatkem vápníku. Tyto krysy se usmrtily narkózou oxidem uhličitým po tom, co byly dva týdny na určité dietě. Posmrtná krev se okamžitě po úhynu odebrala kardiopunkcí do sérové vakuové zkumavky. Sérum se sebralo odstředěním v centrifuze Beckman J6B při 2000 otáčkách za min. po dobu 20 min. při 4 °C. Vzorky séra se pak spojily podle testovaného séra (nedostatek vápníku) a kontrolního séra (dostatek vápníku) a 100 nl se odebralo pro zjištění koncentrací vápníku a fosforu. PMSE (fenylmethylsulfonylfluorid) a DTT (dithiothreitol) se při19 daly každý v koncentraci 1 mM. Sérum se pak zmrazilo při - 85 °C

GELOVA PERMEACE

NÁSLEDNOU HPLC S se sloupcem Sephadexu G 50 se Frakce s molekulovou hmotností mM PMSF; a 1 mM DTT. odstředění sedimentovaly

FRAKCIONACE SERA KRYS:

OBRÁCENOU FÁZÍ

Počáteční gelová permeace uskutečnila jak je popsáno výše.

< 14 500 se sebrala, dialyzovala a lyofi 1izovala jak uvedeno výše.

Lyof11 izovaná látka se rozpustila v 5 ml pufru složeného z 25 mM Tris.Cl pH 7,5; 150 mM NaCl;

Některé látky byly nerozpustné a při v centrifuze Beckman J2-21 při 12000 g při použití rotoru JA 17 a odstranily se. 800 jul rozpuštěných látek se použilo pro stanovení proteinů.

Podle toho se 0,5 mg látky v 1 ml shora uvedeném pufru před nanesením filtrovalo přes filtr vzorků od Hewlett Packer. Použitý sloupec byl preparativní sloupec C18 od Beckmana, 2,12 x 150 cm. Čerpací systém roztoku byl Beckamnův čerpací systém s gradientem rozpouštědla model 126 s Beckmanovým ÚV detektorem model 167. Data se analyzovala za použití softwaru Beckman System Gold. Vzorek se ručně injikoval přes injektor Valco a eluoval při průtokové rychlosti 2 ml za min. Použil se následující gradient Roztok A^: Voda s 0,1% kyselinou trifluoroctovou

Roztok B^: 95% acetonitril ve vodě s 0,1% kyselinou trifluoroctovou

Program 0 - 5' 100% A

- 75 ' 40% A

- 80 ' 100% A konec

Frakce se sbíraly každou 0,5 frakcí model 202 a odpovídající a lyofi 1izovaly.

Koncentrace vápníku spojeného testovaného séra byla 2,50 mM a u spojeného kontrolního séra 2,87 mM. Koncentrace fosforu byla 0,35 mM pro testované sérum a 0,45

Koncentrace proteinů znovu rozpuštěného

0%

60% B 0% B minutu v Gilsonově sběrači píky čtyř běhů se spojily mM pro kontrolní sérum, lyofilizátu byly 1,2 mg na ml pro testovaný vzorek a 1,5 mg na ml pro kontrolní vzorek. Eluční profily pro testované a kontrolní látky jsou znázorněny na Obr. 5 až 9. Byl zjištěn nějaký rozdíl mezi elučními profily u běhů pro testované sérum a kontrolní sérum. U testovaného materiálu byl zřetelný pík eluovaný těsně před 55 minutami u tří ze čtyř běhů. U kontroly byly dva píky těsně po 55 minutách.

TEST FRAKCÍ ZÍSKANÝCH ZE SÉRA KRYS NA SÉRIM S NEDOSTATKEM VÁPNÍKU NA RYCHLOST KOSTNÍHO PŘÍRŮSTKŮ

MATERIÁL A METODY

Biologické testy vlivu různých frakcí na rychlost přírůstku mineralizované kosti se provedly pouze u testovaného séra, cílem těchto pokusů bylo nalézt jednu složku s biologickou aktivitou. Odpovídající píky ze 4 běhů se spojily a rozpustily v 2,5 ml 10 mM Tris.Cl pH 7,2 a 50 mM NaCl. 0,8 ml tohoto materiálu se použilo pro testování, zbylý matriál se zmrazil pro budoucí použití.

Sprague-Dawley krys se parathyroidektomizovaly a 0,4 ml látky z každého píku se injikovalo do každého testovaného zvířete. Použila se dvě zvířata pro každý z pěti sebraných píků označených A až E na Obr. 5A až 8. Rychlost přírůstku kostních minerálů se zjišťovala značením tetracyk1 inem podle již popsané metody.

Z pěti testovaných píků ukázaly píky A,B,D a E skoro stejný účinek na rychlost přírůstku kostních minerálů, zatímco pík C zřejmě způsobuje vyšší rychlost než ostatní skupiny, viz Obr. 10.

ZÁVISLOT RYCHLOSTI PŘÍRUSTKU KOSTNÍCH MINERÁLU NA DÁVCE ZVLÁŠTNÍ FRAKCE IZOLOVANÉ ZE SÉRA KRYS POMOCÍ HPLC S OPAČNOU FÁZÍ

Látka z píku C (1,7 ml) se nechala roztát a odebralo se 400 μΐ a zředilo na 800 jul pro stanovení koncentrace proteinů metodou podle Belforda. Zbylá část se upravila stejným rozpouštěcím pufrem na koncentraci 3 ug na 100 μΐ a devět krys se parathyroidektomizovalo, jejich koncentrace sérového vápníku při půstu a bez půstu prokázaly úspěšnost operací- Tři krysy dostaly 6 gg testované látky z píku C v objemu 200 jul intravenosní injekcí. Tři krysy dostaly 3 jug látky s objemem Injekce upraveným na 200 jal rouzpouštěc ím pufrem. Tři krysy dostaly 200 pl rouzpouštěcího pufru jako kontrolu. Rychlost přírůstku kostních minerálů se zjišťovala podle shora popsaného postupu.

Rychlost přírůstku kontrolních krys byla 0,81 pm/den CS.D. = 0,09): u krys, které dostaly 3 pg píku C, 1,51 pm/den CS.D.=0,23): a u krys, které dostaly 6 pg píku C, 2,36 pm/den CS.D. = 0,25), byl významný rozdíl mezi slkupinámi <P<0,05), viz Obr. 11.

Tak se předvedlo, že třída proteinů nebo peptidů nalezených v séru krys na potravě s nedostatkem vápníku po dobu dvou týdnů, je schopná stimulovat přírůstek kostních minerálů v kryse. Tento účinek je závislý na dávce do 6 pg na přibližně 300 g krysu.

ELEKTROFORETICKÁ ERAKCIONACE NÍZKOMOLEKULÁRNÍ FRAKCE SÉRA KRYS NA POTRAVĚ S NEDOSTATKEM VÁPNÍKU

Složky séra o molekulových hmotnostech menších než 30 000 se chromatografovály molekulárně hmotnostní elektrofořežou na polyakrylamidovém gelu.

MATERIÁL A METODY

Dvaceti samečkům Sprague-Dawley se podávala potrava s nedostatkem vápníku po tři týdny. Jejich hmotnost při příchodu byla mezi 209 a 245 g. Po dvou týdnech na dietě byla jejich hmotnost mezi 248 a 302 g. Krysy pak byly usmrceny narkózou oxidem uhličitým a posmrtná krve se odebrala kardlopunkcí. Vzorky séra se sebraly a spojily, jak bylo popsáno výše. Množství sérového vápníku bylo nalezeno 2,56 mM a fosfátu 0,33 mM. Celkový objem séra byl 92 ml. Pridsalo se do 1 mM PMSF a DTT od každého. Sérum se pak odstředilo při 12 000 g 30 min. v centrifuze Beckman J2-2Í s rotorem JA 17.

Sebrala se frakce s molekulovou hmotností mezi 3 000 a 30 000 a zahutila u1trafi 1trací. Sérum se nejprve ultrafi 1trovalo v zahušťovači Amicon 50 ml opatřeném membránou YM 30, bod molekulárního ukončení je 30 000. Filtrát, se sbíral. Když se zbylý objem zmenšil z původních 92 ml na 10 ml, přidalo se 40 ml pufru složeného z 10 mM Tris.Cl pH 7.2, 50 mM NaCl, 1 mM PMFS a 1 mM DTT a ultraf1ltrace pokračovala dokud zbylý objem se opět

- 22 nezmenšil na 10 ml. Tento druhý filtrát se spojil s prvním a zbylý objem se odstranil.

Spojený filtrát se dále ultrafiltroval stejnou jednotkou používající membránu YM 3 s bodem molekulárního ukončení 3 000. Tentokrát se filtrát odstranil a zbylý objem uchoval. Když se zbylý objem zmenšil na 10 ml, přidalo se 40 ml stejného pufru a ultrafiltrace pokračovala. Tento postup se jednou zopakoval. Když se konečný zbylý objem zmenšil na 10 ml, přenesl se do jiného zahuštovače Amicon s kapacitou 10 ml, a dále zahustil na konečný objem 1 ml. Ultrafiltrace se uskutečnila při 55 x 6,895 = 379,225 kPa předčištěného dusíku při 4 °C.

ELEKTROFOREZA NA AKRYLAMIDOVÉM GELU

Použilo se vertikální gelové zařízení Hoeffer Mighty Smáli. Nalil se 0,75 mm tlustý 15¾ fosfátový gel a běžel jak následuje:

Dělící gel	30¾ akrylamid (19=1) 1 M Tris.fosfát pH 6,9 10¾ SDS 10¾ amonium persulfát TEMED voda do	15 ml 3 ml 0,3 ml 150 ul 50 ul 30 ml
Kupící gel	30¾ akrylamid (19=1) 1 M Tris.fosfát pH 6,9 10¾ SDS 10¾ amonium persulfát TEMED voda do	2,3 ml 1 ml 0,1 ml 50 ul 30 ul 10 ml
Promývac i	1 M Tris.fosfát pH 6,9	15 ml
pufr	10¾ SDS	3 ml

voda do 300 ml

Gel předtím běžel při konstantním napětí 100 V po 30 minut.

Vzorky běžely při konstantním napětí 100 V po 2 hodiny. Voda při °C cirkulovala přes chladící jednotku zařízení.

Koncentrace proteinu se zjišťovala metodou podle Belforda.

Tris.fosfát pH 6,9 a SDS se přidaly ke vzorku na konečnou koncentraci shodnou s koncentrací promyvacího pufru. Koncentrace proteinu se upravila na 100 pg na 15 μΐ. Celkový objem vzorku byl 1,65 ml. Vzorek se inkuboval 30 minut při 60 °C před nanesením .

Nízkomolekulární markér od BDH se zpracoval stejným způsobem jako vzorek. Koncentrace se upravila na 1 pg jednotlivých markérů na 12 ml. 15 μΐ vzorku a markéru se naneslo do 0,5 cm širokých prohlubní.

Výsledky fosfátové gelové elektrofořezy jsou znázorněny na Obr. 12. Je tam jeden obrovský a několik malých pruhů o vyšší molekulové hmotnosti. Je tam také několik pruhů o nízké molekulové hmotnosti a jsou označeny jako TA až TE.

BIOLOGISKÉ ÚČINKY SLOŽEK SÉRA KRYS ERAKCIONOVANÝCH ELEKTROEOREZOU NA AKRYLAMIDOVÉM GELU

Testovaly se biologické aktivity jednotlivých pruhů fosfátového gelu uvedeném na Obr. 12.

1,5 ml zbytku z ultrafiltrovaného vzorku předešlého odstavce se chromatografoválo a testovalo. Koncentrace vzorku se upravila stejným nanášecím pufrem složeným ze 100 mM Tris.fosfátu CpH 6,9), 0,1% SDS. Upravený vzorek se pak inkuboval při 60 °C po 30 minut před nanesením.

Akrylamidový gel se připravil stejným způsobem jako předešlé části, s tou výjimkou, že tiouštka gelu byla 1 mm. Objem při nanášení byl 20 μΐ na prohlubeň. Gel předem běžel půl hodiny a vzorek běžel při konstantním napětí 100 V dvě hodiny. Celkový objem 1,5 ml běžel v 10 gelech.

Látky o vyšší molekulové hmotnosti se netestovaly. Pět pruhů TA až TE se vyřízlo po obarvení chromasinovou modří. Příslušné pruhy se spojily a rozdrtily na malé kousky v si 1ikonizované skleněné zkumavce a namočily se v 5 ml pufru složeného z 10 mM Tris.Cl CpH 7,2), 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF a 0,1% Triton X-100 24 hodin při 4 °C. Namáčecí pufr se pak přenesl do spektroforního dialyzačního střeva s MVCO 3 500. Látky se dialyzovaly proti 100 x objemu pufru obsahujícímu Tris.Cl CpH 7,2), 50 mM NaCl a 1 mM DTT při 4 °C 48 hodin při 5 výměnách pufru. Dialyzované vzorky se pak zahustily na 500 μΐ zahuštovačem

Amicon o kapacitě 10 ml při použití memdrány YM 3 s MWCO 3 000.

Vzorek (80 pl) se zředil vodou na 800 pl a koncentrace proteinů se zjišťovala Belfordovým činidlem. Koncentrace vzorků se upravila dialyzačním puftem na koncentraci 12 pg na 100 pl.

samečků krys Sprague-Dawley se parathyroidektomizovala pro testování se značením tetracyklinem jak je popsáno výše. Jejich hladina sérového vápníku pro pre-PTX byla 2,51 (S.D. = 0,002) a pro post-PTX 1,53 (S.D. = 0,001). Testované látky (200 pl) se injikovaly do kažého zvířete. Čtyry krysy se použily pro testování aktivity materiálu eluovaného z každého pruhu. Ctyry krysy kontrolní skupiny se injikovaly 200 pl nosičového pufru.

Tři pruhy z pěti sebraných obsahovalo dostatek materiálu pro testování. Množství látek k dispozici bylo 50 pg pro pruh TE, 55 pg pro pruh TB a 59 pg pro pruh TA. Koncentrace proteinů pro pruhy TC a TD byly příliš nízké, aby se daly detegovat a proto se pruhy netestovaly. Jedna krysa, která dostala TA a jedna krysa, která dostala TB, při anestezl během žilní punkce uhynula.

Obr. 13 ukazuje účinky testovaných látek na rychlost přírůstku kostních minerálů u parathyroidektomizovaných krys. Kontrolní krysy, které dostaly pufr, měly rychlost přírůstku 1,27 pm/den (S.D. = 0,21). Krysy, které dostaly testované látky, měly rychlosti 1,27 pm/den (S.D. = 0,21), 2,14 pm/den (S.D. = 0,14) a 2,24 pm/den (S.D. = 0,28) pro pruhy TA, TB a TE. Rychlosti pro pruh TB a pruh TE byly významně vyšší než rychlosti pro kontrolu a pruh TA (P<0,025). Zdá se, že kontrolní rychlost v tomto pokusu byla vyšší než u předešlého pokusu z důvodů, které jsou nejasné.

Zdá se, že tam jsou alespoň dva polypeptidy o molekulových hmotnostech asi 6 až 6,5 kilodaltonů (TB) a 12 až 13 kilodaltonů (TE), vztah mezi oběma peptidy je na základě těchto výsledků neznámý.

STANOVENÍ SEKVENCÍ AMINOKYSELIN PRUHU IZOLOVANÝCH Z ELEKTROEORETICKÉ FRAKCE SÉROVÝCH SLOŽEK KRYS

MATERIÁL A METODY

Asi 100 pl látky z předchozí ultrafiltrace se použilo pro sekvenování. Látka se naředila na koncentraci 100 pg v 15 jul při použití pufru o následujícím složení: 100 mM Tris.fosfát pH 6,9; 0,1% SDS; 1 mM DTT a 50 mM NaCl. Fosfátová gelová elektroforéza se uskutečnila stejným způsobem jako v predcházející části. Tlouštka gelu byla 1 mm. 100 μΐ materiálu se naneslo do 5 žlábků a použily se nízkomolekulární markéry BDH.

Použila se malá Hoefférová jednotka transferu proteinů. Gel se umístil na PVDF membránu CMillipore) a transfer při konstantním napětí 250 V probíhal 1 hodinu. Použila se dvouvrstevná membrána, aby se zajistilo, že všechny proteiny v gelu se membránou zachytí. Po transferu se membrána obarvila chromasinovou modří Jednotlivé pruhy se vyříznuly pro značení.

Sekvence se stanovily v sekvenční laboratoři podle dobře známého postupu:

TB sekv.CSEQ ID Č:l): Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr Lys Pro Ile TE sekv.CSEQ ID Č:2): Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu

Bylo zjištěno, že TB a TE jsou příbuzné peptidy v tom, že alespoň prvních šest aminokyselin jejich N-konců mají stejné sekvence aminokyselin. Z těchto výsledků není jasné, zda je TB aktivní fragment TE nebo je TE dimer nebo polymer TB.

POKUSY SE SYNTETICKÝMI LIDSKÝMI POLYPEPTIDY

SCREENING LIDSKÉ cDNA KNIHOVNY PRO SEKVENCI DNA KÓDUJÍCÍ OBĚHOVÉ POLYPEPTIDY

Vzorek nukleové kyseliny se syntetizoval na základě sekvence aminokyselin zjištěné pro polypeptid izolovaný ze séra krys a screenovala se knihovna pro lidskou cDNA. Ví se, že hlavním místem pro syntézu oběhových sérových peptidů a proteinů jsou játra a je známo, že pacienti trpící chronickým onemocněním jater často trpí úbytkem kostí. Proto se screenovala lidská cDNA knihovna z jaterní tkáně.

MATERIÁL A METODY

IZOLCE cDNA Z FETÁLNÍ KNIHOVNY

Použila se lidská cDNA knihovna od Clontech. Knihovna byla připravena z lidského zárodku nespecifikovaného pohlaví v 22 týdnu těhotenství. Matka měla krevní skupinu 0 (katalog #HL1064A). Izolovaná jaterní mRNA se primoval pomocí příměru oligodT a použitím reverzní transcriptazy se syntetizovalo první vlákna cDNA. Potom následovalo štěpení pomocí Sl nukleasy a syntéza druhého vlákna pomocí DNA polymerasy. Dvojvláknová cDNA se stejnoměrnými konci (blunt-ended) se ligovala do ECoR 1 línkem a klonovala do lambda gtlO.

cDNA knihovna se pak propagovala- Provedly se série zředění knihovny s SM mediem. Připravila se kultura E.coli C600 hf1 v LB živném prostředí s 0,2% maltosou a ta se kultivovala v ustálené pozdní růstové fázi (obvykle kultivace přes noc). Objem 100 pl zředěné suspenze knihovny se přidal k 300 pl SM a 600 pl noční kultury E.coli C600 hf1 a to se inkubovalo 20 minut při 37 °C. Suspense se pak dala do 3 ml 0,7 % agarosy vrchol agar a udržovala se v roztaveném stavu při 50 °C. To se okamžitě vylilo na 90 mm kruhovou agarovou desku předehřátou na 37 °C. Vrchní měkká agarosa se nechala tuhnout při teplotě místnosti, a kultivační desky se pak inkubovaly při 37 °C dokud byl vidět plak, to jest o něco méně než 1 mm v průměru. Zaznamenalo se zředění, při kterém byl titr 30 000 plaků na desku a použilo se pro budoucí propagaci.

cDNA knihovny se pak imobi1izovaly na nitrocelulosových membránách. Každá cDNA knihovna se umístila v koncentraci 30000 plaků na 90 mm desku. Jakmile plak dosáhl průměru trochu menšího než 1 mm, desky se umístily do chladničky přes noc při 4 °C. Následujícího dne se rozprostřel na vrch měkké agarosy nitrocelulosový filtrační papír (0,45 u od Amersham) a ponechán po 3 minuty. Za použití jehly se membrána propíchla ve třech nebo více symetrických místech do agarové desky pro budoucí vyrovnání membrány (nebo jejího radigrafu) na desky. Membrána se pak zvedla a umístila se vzhůru DNA stranou na kultivační desku obsahující 0,4 N NaOH a zaplavila v této poloze 20 minut. Pak se přenesla do 6xSSC na 20 minut a sušila vzduchem za účelem hybridizace.

Syntetizoval se 32 měrní oligonukleotidový vzorek oligonukleotidovým syntetizátorem Cyclone-plus (milligen) za použití fosfoarmiditové chemie. Vzorek se syntetizoval s DMT skupinou nechanou int-aktní pro následující čištění pomocí HPCL s obráce27 nou fází. Vzorek se syntetizoval v 0,2 pmol měřítku. Po synteze se vzorek podrobil odstranění ochranných skupin pomocí 4 ml hydroxidu amonného po 24 hodin při teplotě místnosti. Materiál bez ochranných skupin se sušil v zahuštovacím zařízení Speed-vac ve 4 alikvotních částech. Použitý vzorek nukleové kyseliny má následující sekvenci (SEQ ID Č:3):

Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr Lys Pro 5 -GG(TC)CC(TC)GG(TC)GG(TC)GC(TC)GG(TC)GA(AG)AC(TC)AA(AG)CC(TC)AT-3

Báze v kulatých závorkách znázorňují degenerované kodony. Hypotetickému proteinu, kterému odpovídá nukleová kyselina, se dá označení SEQ ID Č-4.

Vzorek se čistil pomocí HPLC s reversní fází. Alikvotní část vysušeného materiálu se rozpustila v 1 ml 100 mM TEAA (pH 7,0). Vzorek se filtroval filtrem vzorků Hewlett Packer a nanesl se na semiprep sloupec C18 Beckman, 7,5 x 150 mm. Vzorek se chromatografoval v Beckmanově zařízení jak bylo dříve popsáno. Gradientový program byl následovný:

Rozpouštědlo A

Rozpouštědlo B Čas (minuty)

100 mM TEAA pH 7,2

Aceton1tri 1

Trvání

0	95%A	5%B
5	80%A	40%B	15
25	50%A	50%B	10
40	95%A	5%B	5
65	Konec

Chybná sekvence se eluovala první a intaktní sekvence později asi při 35 min. Pík se sebral a sušil. Pak se přidal 1% TFA pro detritylaci DMT a pak se opět sušil. Pak se přidal 3% hydroxid amonný v objemu 100 μΐ pro neutralizaci TFA zbylého po sušení. Materiál se opět sušil a znovu rozpustil ve vodě. 100 μΐ rozpuštěné látky se nechalo protékat. 0,1 ml odstředěným sloupcem G25 a pak se koncentrace DNA měřila absorpcí při 260 nm. 1 O.D. jed28 notka při 260 nm se považovala za koncentraci asi 33 jug na ml.

Vzorek se pak podrobil působení kinasy. 50 pmolů vzorku se podrobilo působení T4 DNA kinasy (Pharmacia) s 50 pmoly ³²P značeného ATP s aktivitou >3000 Ci na mMol a 10 uCi/μΙ (Amersham).

Vzorek se pak hybridizoval pomocí DNA imobi1izované na nitrocelulosové membráně. Suché nitrocelulosové membrány se inkubovaly při 42 °C v předhybridizačním roztoku po 2 hodiny. Objem byl 50 ml. Pak se přidalo 50 pmolů značeného vzorku a nechalo hybridizovat při 42 °C přes noc. Počet membrán byl 50 v 50 ml hybridizačního roztoku. Následující den se membrána čtyřikrát promyla 300 ml 2xSSC při teplotě místnosti pokaždé asi 5 minut. Membrány se pak inkubovaly v 50 ml lxSSC při 68 °C jednu hodinu, jednou se propláchly v lxSSC při teplotě místnosti a sušily. 1 μΐ radioaktivního inkoustu (0,5 ml mělo cps 1000) se nanesl na každou propíchnutou část filtru pro označení polohy membrány- Membrány se pak exponovaly na Amershamův hyper film 18 hodin při 85 °C se zesilující clonou. Film se vyvolal a přiřadil se k agarosovým deskám pro identifikaci klonu. Positivní klon se vybral a repropagoval jednou v agarosové desce a pro ověření se rehybridizova1.

Indetifikoval se jeden pozitivní klon po prověření 300 000 plaků.

Fritsch 1989. Positivní naneslo v pruhu až se objevily

ZESÍLENI cDNA SEKVENCE LIDSKÉHO OBĚHOVÉHO RŮSTOVÉHO FAKTORU KOSTÍ

Klon cDNA se rozšířil podle postupů uvedených v Molecular Cloning. A Laboratory Manual (2. vydání): Sambroot J.

E.E., Maniatis T., Cold Spring Harbor Press, plak HL 1-7 se sebral sterilní pasterovanou pipetou a umístil do 1 ml 60% SM 40% glycerolu, nejprve při 37 °C na 2 hodiny a pak při 4 °C přes noc. Jedna kolonie E.coli C6000 hfl se inokulovala v 10 ml LB živného prostředí s 0,2% maltosy. Kultura se pěstovala přes noc při 37 °C v třepacím inkubátoru (Queue) při 200 otáčkách za minutu. Následující ráno se 100 μΐ suspenze HL 1-7 inokulovalo ve 300 μΐ SM a 600 μΐ E.coli C600 hfl noční kultury a inkubovalo se při 37 °C 20 minut. Očko této kultury se pak na LB agarovou desku a inkubovalo se při 30 °C viditelné kolonie. Vybralo se několik kolonií a očíslovaly se a každá kolonie se nanesla v pruhu na dvě LB agarové desky. Jedna deska se inkubovala při 30 °C a druhá při 40 °C. Ty kolonie, které rostly pouze při 30 °C a lysovaly při 40 °C se použily pro propagaci HL 1-7.

Jedna HL 1-7 lysogenní kolonie se inokulovala v 10 ml LB živného prostředí s 0,2¾ maltosy a kultivovala se v třepacím inkubátoru při 30 °C dokud kultura nezhoustla. O.D. se měřila při 600 nm. Jedna O.D. jednotka při 600 nm představovala koncentraci E.coli 8x10® buněk na ml. Použilo se 500 ml předehřátého media NZCYM pro inokulaci 10^1θ buněk a dalších 500 ml media se podobně inokulovalo. Obě baňky media se kultivovaly přes noc v třepacím inkubátoru při 200 otáčkách za minutu při 37 °C. Následující ráno se přidalo 10 ml chloroformu ke každé 500 ml kultuře a pokračovalo se v inkubaci 30 minut. Potom co se kultury ochladily na teplotu místnosti se přidaly se DNAasa a RNAasa A v koncentraci 1 ug na ml. Kultury se udržovaly na teplotě místnosti půl hodinu a přidal se NaCl v koncentraci IM. Kultury se nechaly na ledě půl hodiny a pak se bakteriální zbytky odstřeďovaly 10 minut při síle g ne větší než 11 000. Pak se ke každé 500 ml kultuře přidalo 50 g PEG 8000 a nechaly se na ledě další hodinu poté, co se PEG rozpustilo. Fág jako sbalek klesl dolů při odstředění při 4 °C při 11 000 g po dobu 10 minut a supernatant se odstranil. Precipitát se resuspendova1 s 16 ml TM a roztok se jednou extrahoval se shodným objemem chloroformu. K vodné fázi se přidaly 4 ml glycerolu a uskutečnila se následující gradientově odstředění.

Na dno ultračisté ultracentrifugační kyvety se dala vrstva CsCl Cs.gr 1,6) a na vrch spodní vrstvy se dala vrstva CsCl Cs.gr. 1,4). Suspenze HL 1-7 se navrstvila na gradient CsCl a odstřeďovala se při 35 000 otáčkách za minutu při 4 °C dvě hodiny v u1tracentrifuze Beckman L8-70 při použití rotoru Ti60 s pevným uhlem. Fágové částice se projevily jako modrý pruh mezi dvěma vrstvami CsCl gradientu. Fágové částice se odsály z centrifugační kyvety propíchnutím stěny při použití jehly připojené k injekční stříkačce. Suspenze se jednou extrahovala fenolem, pak jednou fenolem/chloroformem 1-1 a pak dvakrát chloroformem. Eágová DNA se získala precipitací ethanolem (přidal se NaCl na koncentraci 0,5 M a 2 objemy ethanolu a 10 minut se mrazilo při

-85 °C). Množství přítomné DNA se zjišťovalo absorpcí při 260 nm.

Velikost DNA Insertu se pak zjišťovala agarosovou gelovou elektrof ořežou. 15 ul DNA HL 1-7 se štěpilo ve 150 ul štěpícího pufru složeného z 2x pufru Pharmacia one-phor-al1. Štěpení se uskutečnilo s 25 jednotkami ECoRí CPharmacia) při 37 °C po dobu 1,5 hodiny. Po štěpení se DNA čistila extrakcí fenol-chloroformem a precipitací ethanolem jak bylo popsáno výše. Nalil se 0,5 cm tlustý 1,2% seakem gel agarosy jakosti GTG. Použil se hřeben s 8 mm širokými prohlubněmi. Rozštěpená DNA se nanesla do jedné prohlubně a markér Pharmacia Φ X 174 použitý jako standard. Gel běžel v TBE pufru při 8 V na cm gelu. Gel se pak obarvil ethidlum bromidem.

Koncentrace roztoku DNA ve vodě 10 μΐ/ml se použila pro určení velikosti kapilární elektrofořežou. Pufr použitý při elektrofořeze byl 89 mM kyselina boritá a 89 mM Tris pH 8,5, 2 mM EDTA a 0,5% hydroxypropylmethylcelulosa (Sigma). Zařízení bylo Beckamnova jednotka pro kapilární elektrofořezu model 2100. Vzorek se nanesl do 27 cm dlouhé kapiláry s pláštěm DBI7 se 100 pm vnitrním průměrem CJ&W Scientific lne) při elektrokinetické síle 7 kV po 7 sekund. Pak následovala 5 sekund tlaková injekce vodní zátky. Elektroforéza se prováděla při konstatním napětí 6,26 kV 12 minut. Absorpce při 260 nm se zaznamenávala zařízením Beckman System Gold Software. Jako standard se použil DNA molekulární markér VI Boehringer Manheim.

Fágová DNA se pak podrobila PCR amplifikaci. Fágová DNA se vysrážela z 1 ml fágové suspenze precipitací ethanolem. Proteiny přidružené k fágu se odstranily 4 M sodlum perchlorátem a následujícími dvěma extrakcemi s fenol/chloroformem a pak se provedli další dvě extrakce s chloroformem. DNA se získala dvojnásobnou precipitací ethanolem a promytím vodou přes centricon 30 CAmlcon). Konečný objem roztoku DNA se upravil vodou na 0,5 ml.

PCR se uskutečnila s termocyklerem CM.J.Research lne.). Pufr se skládal z 50 mM KC1, 10 mM Tris.Cl CpH 8,3), 2,5 mM MgCl2, 0,1% želatiny, 0,45% Tween 20 a 0,45% NP 40. Pufr obsahoval 50 pmolfl každého z amplifikačních primerů CClontech cat.#5411), 125 mM dNTPs, 1 mM DTT a 2,5 jednotek Tag DNA polymerasy. Jako šablona se použilo 10 ul čištěného fágu. Jeden při31 mer primoval s DNA v Hind III místě 5 proti směru místa ECoRl a měl následující sekvenci: 5 -AAG CTT CAC ACC ACG AAC CAG -3 CSEQ ID N0^:5). Jiný přiměř primoval sekvenci HL 1-7 3 ve směru místa ECoRl a měl následující sekvenci: 5 -TTA TGA GTA TTT CTT CAA GGG -3' CSEQ ID NO:6).

PCR program byl následující:

Stupeň Crainuty) Teplota (°C) Čas cyklus ke stupňům 4-6 x 30 95 konec cyk 1 ů

Produkt se jednou extrahoval chloroform/fenolem, dvakrát chloroformem, vysrážel ethanolem a znovu rozpustil ve 100 jol vody. Výtěžek fágové DNA byl asi 15 až 18 jug na litr kultury. Získaná DNA byla odpovídajícím stupněm čistá s poměrem 260 až 280 přibližně 1,7.

Výsledek určení velikosti oběma elektroforezami, agarosovou a kapilární, ukázal velikost insertu asi 300 párů bází. Velikost zjištěná kapilární elektroforézou je asi 600 párů bází, avšak ta obsahuje zvláštních 285 párů bází 5 z vektoru Cod místa Hind

III do ECoRl.)

SEKVENOVÁNÍ EÁGOVÉ HL 1-7 cDNA jug fágové DNA se denaturovalo hydroxidem sodným a přec ipitovalo octanem sodným CpH 4,5) a ethanolem. To bylo spojeno s jedním z primerů CClontech Cat # 6184 a 6186). Sekvenování se uskutečnilo terminací dideoxy řetězce podle Sangera použitím sekvenovací soupravy Pharmacia T7 DNA polymerasa. Jako radioaktivní značení se použil ³²P dATP CAmersham sp.aktivita > 3 000

Ci/mMol a 10 ijCi/μΙ). Sekvenování se uskutečilo v gelu 45 cm dlouhém při použití Base Runner Unit (IBI). Sekvenování se uskutečllo při konstatním síle 45 watů. Gel se po skončení sušil a exponoval na Amersham Hyperfilm přes noc při -85 °C a pak se vyvolal.

Výsledky sekvenování jsou uvedeny níže. Dospělá cDNA kóduje 53 aminokyselin. Prvních 17 může představovat signální sekvenci.

5' -

TTT

GGC

TTT

ATT

CAT

AGC

GGT

AAT

TAA

TGA

TCA

AGA

CAG

TTG

ATT

ACT

Met

Thr

Ala

Gin

Asn

Thr Asp

Leu

ΡΓ2Τ

aan

CAC

TAT

TAA

AAA

TTT

GCA

ATG

ACT

GCT

CAA

AAT

ACA

GAC

CTT

w\J A Asn

Gin

Leu

Ser

Asn

Ser

Phe

Thr

Leu Gly

Ile Gly Lys

Arg

Thr

Asn

AAC

CAA

CTA

TCC

AAC

AGT

TTC

ACT

TTA

GGG

ATC

GGA

AAA

CGA

ACA

AAT

Glu

His

Thr

Ala

Asp

Cys

Lys

Ile

Lys

Pro

Asn

Thr

Leu

His

Lys

GAA

CAT

ACG

GCA

ΠΑΤ

TGT

AAA

ATT

AAA

CCG

AAC

ACC

TTG

CAT

AAA

Ala

Glu

Thr

Leu

Met

Val

Leu

Asp

Gin

Asn

Gin

Pro

TER

GCT

GCA

GAG

ACT

TTA

ATG

GTQ

CTT

GAC

CAA

AAT

CAA

CCA

TAA

AGG

ATC

TGC

AGC

TTA

TGT

CTT

CTA

GTT

TAT

CTT

TTG

CAT

AAA

GCT

GCA

GAG

ACT

TTA

ATG

GTA

ATT

GCC

AAA

ATC

AAC

CAT

AAA

GGA

TCT

GC

-3'

Shora uvedená sekvence nukleové kyseliny je označena jako SEQ ID NO-7; sekvence aminokyselin je označena jako SEQ ID N0^;8. Velikost polypeptidu bez leadera je asi 4000. To je srovnatelné s velikostí TB pruhu polypeptidu izolovaného ze séra krys.

Sekvence nukleové kyseliny obsahující část shora uvedené sekvence označené jako SEQ ID NO:9, se pak klonovala do plasmidu pro expresi, jak je dále popsáno. Předpokládá se, že by odborník mohl získat podobné výsledky při použití vhodných vektorů a nosičů exprese jiných než zde zvolených.

EXPRESE SEKVENCE DNA KÓDUJÍCÍ ČÁST SEKVENCE cDNA ODVOZENÉ Z

LIDSKÉ ZÁRODEČNÉ JATERNÍ cDNA KNIHOVNY

Následující sekvence se syntetizovala oligonuk1eotidovou syntézou pro klonování do plasmidu pro expresi.

Gly Ile Gly Lys Arg Thr GGG ATC GGA AAA CGA ACA CCC TAG CCT TTT GCT TGT

ECoR 1 START

5' - AATTCTTAGGATCCTAGGATG

GAATCCTAGGATCCTAC

Ala	Asp	Cys	Lys	Ile	Lys	Pro	Asn	Thr
GCA	GAT	TGT	AAA	ATT	AAA	CCG	AAC	ACC
CGT	CTA	ACA	TTT	TAA	TTT	GGC	TTG	TGG
Thr	Leu	Met	Val	Leu	Asp	Gin	Asn	Gin
ACT	TTA	ATG	GTC	CTT	GAC	CAA	AAT	GAA
TGA	AAT	TAC	CAG	GAA	CTG	GTT	TTA	CTT

Asn Glu His Thr AAT GAA CAT ACG TTA CTT GTA TGC

Lys Ala Ala Glu AAA GCT GCA GAG TTT CGA CGT CTC

TCT TGA TCGA -5 AGA ACT HIND III

Stejnosměrné splétání shora uvedené nukleokyselinové sekvence je označena jako SEQ ID NO:9; protisměrné splétání sekvence je označeno jako SEQ ID N0^:10: a shora uvedená sekvence polypeptidu je označena jako SEQ ID NCPll.

V této výstavbě jsou dvě restrikční místa pro llgacl do pUC 8 plasmidu spojená EC.OR í a Hind III. Konstruovaný plasmid se pak vnesl do JM 103 kmenu E.coli. Transformované klony se selektují umístěním bakterie na LB agarovou desku obsahující 35 pg na ml ampicilinu.

Konstruovaná sekvence vylučuje to, co je považováno za signální sekvenci kodovanou v cDNA klonu. Aminokyselinová sekvennce Gly-Ile-Gly-Lys- má některé podobnosti s prvními čtyřmi aminokyselinami sekvence polypeptidu krys, předpokládá se, že toto je počátek dospělého peptidu v lidském polypetidu.

Bakterie se kultivovala v mediu Terrific 8 hodin, aby se dosáhla pomalá růstová fáze. Medium Terrific je složeno z 17 mM pufru fosfátu draselného při pH 7.2, 4% gylcerolu a 35 ug/ml ampicilinu jako přídavek k tryptonu a extraktu kvasinek v LB

Po 8m i hodinovém pěstování se bakterie usadily odstředěním pro výměnu media pro expresi- Expresní medium je složeno z: 17 mM fosfátového pufru (pH 7,2); glycerolu; 40 μη thiaminu; 2 mM IPTG; a 35 pg/ml ampicilinu.

Bakteriální sbalek se resuspendoval v tomto mediu v objemu shodném s původním objemem media Terrific. Pěstování pokračovalo v třepacím inkubátoru při 37 °C přes noc při 200 otáčkách za minutu.

Kultura se odstředila dvakrát (15 minut pokaždé při 12 000 g), aby se úplně bakterie sbalily zahustilo lOx membránou YM3. 1 ml a usadily dole. Medium se pak tohoto materiálu se podrobil

HPLC s C3 obracenou fází za stejných podmínek jak popsáno výše.

Jeden dobře lu. Doba eluce z lidského séra 1 mg polypetidu rozpustný pík se eluoval při 62-63¾ acetonitrije stejná jako u pólypeptidu izolovaného a je na Obr. 14. Z 50 ml kultury se získal asi čištěním sledovaným Belfordovým činidlem.

BIOLOGICKÁ AKTIVITA EXPRESOVANEHO PRODUKTU

400 - 420 g se použili k testování, nosičový pufr 50 mM fosforečnanu skupina dostala 0,7 O.D. a jiná testovaná skupina Jak je ukázáno na Obr. 15 testovaná

Intaktní samečci krys Kontrolní skupina dostala sodného (pH 7,2). Jedna jednotky expresovaného polypeptidu, dostala 0,3 O.D. jednotky polypeptidu zřejmě má expresovaný produkt stimulační účinek na tvorbu kostí.

POKUSY ZAHRNUJÍCÍ CHEMICKY SYNTETIZOVANÝ LIDSKÝ POLYPEPTID

Polypeptid se sekvencí aminokyselin odpovídající vybrané sekvenci nukleové kyseliny determinované z knihovny cDNA (SEQ ID N0^;7) se syntetizoval podle běžných chemických metod v pevné fázi (Organická chemie, vyd. Loudon, G.Marc (Ed), Addison-Vesley Publishing Company, Massachusetts, 1984). Vybraná sekvence byla následující (SEQ ID NO:11):

Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gin Asn Gin Pro

Syntetický peptid byl čistý 99¾ na základě jeho HPLC profilu. Nezávisle se peptid identifikoval hmotovou spektrometrií a aminokyselinovou analýzou. Zjištěna molekulová hmotnost byla zjištěna 4043,36 daltonfl, teoretická hmotnost monomeru 4043,66 daltonfl. Aminokyselinová analýza peptidu byla následující:

Asp (5) 5,23, Thr (4) 3,74, Glu (4) 4,49, Oly (2) 1,72. Ala (3) 3,09, Val (1) 1,09, Met (1) 1,04, Ile (2) 1,54, Leu (3) 3,20, His (2) 2,07, Lys (5) 4,90, Arg (1) 0,99, Pro (2) 2,15.

Před použitím se 15 mg polypeptidu rozpustilo v 15 ml 0,1¾ kyseliny octové, rozdělilo do patnácti částí po 1 ml a lyofi 1izovalo. Peptid se uchovával při -20 °C.

Před testováním se syntetický polypeptid podrobil gelové elektroforéze Tricine SDS. Na Obr. 16 je vidět, že je velká část polypeptidu v dimerní formě.

Testovací roztok peptidu se připravil pro podání rozpuštěním 1 dílu peptidu (1 mg) v 1 ml deionlzované vody, aby se dosáhla koncentrace lpg na μΐ. K 350 μΐ tohoto roztoku se přidalo 1% teplně inaktivovaného BSA v 0,1¾ kyselině octové (viz další odstavec) na konečný objem 14 ml. Tím se dosáhla konečná koncentrace peptidu 25 pg na ml.

Hovězí sérum se připravilo rozpuštěním 0,5 g BSA (Sigma) ve 40 ml deionizované vody. Po přidání 50 μΐ kyseliny octové se objem upravil na celkový objem 50 ml deionizovanou vodou. Konečná směs byla tedy 1¾ BSA v 0,1¾ kyselině octové. Tento nosič pro injikování se inkuboval v 56 °C teplé vodní lázni 90 minut pro inakt-ivování BSA. Roztok se skladoval při 4 °C.

Tepelně inakt-ivovaný peptid pro kontrolní skupinu B (viz další část) se připravil rozpuštěním 350 pl peptidu, připraveného jak bylo dříve popsáno v této části, v deionizované vodě. To se vařilo v zavřené polypropylenové zkumavce (Sarsted) v mikrovlně troubě 10 minut. Roztok se ochladil. K tomu se přidal nosič připravený pro aktivní peptid na konečný objem 14 ml. Tím byla koncentrace inaktivovaného peptidu také 25 pg na ml.

Tetracyk1 inový značící roztok se připravil rozpuštěním 360 mg base tetracyklinu (Sigma) v 50 ml deionizované vody pro vytvoření koncentrace 7,2 mg na ml. Každá krysa vážila asi 300 g. takže množství podávaného tetracyklinu (1 ml značícího roztoku) bylo asi 24 mg na kg telené hmotnosti.

BIOLOGICKÁ AKTIVITA CHEMICKY SYNTETIZOVANÉHO PEPTIDU

Použili se samečci krys Sprague-Dawley z Charles River

Laboratory s hmotností asi 250 g. Zvířata se umístila po jednom v kleci a držela na neomezené potravě a vodě ze zásobníku (stále k dispozici) a Purina Rat Chow.

Do stehna se intramuskulárně podal 1 ml každého roztoku.

Bylo dvanáct krys na pokusnou skupinu:

Kontrolní skupina A - Každé zvíře dostalo 1 ml 0,1¾ BSA v 0,1¾ kyselině octové intramusku1ární injekcí do pravého gluteus maximus. Pak následovala injekce 1 ml tetracyklinového značícího roztoku intraperitoneá1ně.

Kontrolní skupina B - Každé zvíře dostalo 1 ml 0,1¾ BSA v 0,1¾ kyselině octové obsahující peptid, který se 10 minut vařil (viz nahoře), intramuskulární injekcí do pravého gluteus maximus. Pak následovala injekce 1 ml tetracyklinového značícího roztoku intraperitoneálně.

Testovaná skupina - Každé zvíře dostalo 1 ml testovaného roztoku (25 ug peptidu v 1 ml nosiče, viz nahoře) intramuskulární injekcí do pravého gluteus maximus. Pak následovala injekce 1 ml tetracyklinového značícího roztoku intraperitoneálně. Tetracyklinový značící roztok se podal každé kryse znovu po asi 48 hodinách později. Zvířata byla usmrcena narkosou oxidem uhličitým 24 hodin po druhé dávce tetracyklinu.

Vzorky krve se odebraly kardiopunkcí okamžitě po uhynutí zvířete. Asi 3 ml heparinizovaně krve se odebralo pro měření kostní alkalinfosfatasy. To je sérový index pro tvorbu kostí. Měření se prováděla podle rutinních běžných postupů pro lidskou kostní alkalinfosfatasu. Výsledky nebyly nezvratné.

Kostní vzorky pro histologická sledování a pro stanovení rychlosti růstu kostí se vybraly takto: pravá stehenní kost, pravá holenní kost, pravá ramenní kost, pravá kyčelní kost a tělo pátého křížového obratlů (právý femur, pravá tibia, pravý humerus, pravá kost iliac a tělo pátého lumbarního vertebralu). Vzorky se uchovávaly při 4 °C před pitvou.

PITVA PRAVÉHO FEMURU PRO HISTOLOGICKÁ VYŠETŘENÍ A PRO ZJIŠTĚNÍ RYCHLOSTI UKLÁDÁNÍ KOSTNÍCH MINERÁLU CHEMICKY SYNTETIZOVANÉHO POLYPEPTIDŮ

Odřezaly se svaly, šlachy a okost-ice připojené k pravému femuru (stehenní kosti) zvířat tří skupin. Příčný řez nižší metaphysou a středním tělem této kosti se udělal jak je níže popsáno a jak je znázorněno na Obr. 17.

Příčné kostní řezy se přenesly do 80¾ ethanolu a mírně protřepávaly přes noc.

Příčné řezy stehenní kosti se podrobily následujícím krokům:

1. Dehydratace 2 výměnami 100¾ ethanolu - 2 hodiny pro každou výměnu.

2. Odtučnění 100¾ acetonem 2 hodiny.

3. Aceton/Spurrsovo medium 1:1 přes noc.

Složení Spurrsova media je následující:

NSA (nonenyIsukcinanhydrid) 130 g ERL (vinylcyklohexendioxid) 50 g DER (diglycidylether propylenglykolu) 30 g DMAE (dimethylaminoethanol) 2 g

Kostní příčné řezy se přenesly do 100% Spurrsova media a nechaly se 6 hodin působení infiltrace media do kostní tkáně. Medium se pak vyměnilo novou dávkou media. Pak se působilo 15 minut podtlakem 25 x 6,895 kPa.

Příčné řezy spodní metafysy se orientovaly spodní řeznou plochou směrem ke dnu licí formy a polymerace pryskyřice tj. Spurrsova media, se uskutečnila přes noc při 55 °C. Částečně polymerované špalíky tkáně spodní stehenní metafysy se dále ošetřovaly při 80 °C dalších dvanáct hodin. Mezitím se střední tělesa nechala v kapalné pryskyřici druhou noc a pak se ošetřovala dvanáct hodin při 80 °C.

Další den se vyříznul 400 pm tlustý řez ve střední rovině mezi dvěma povrchovými řezy tkáňových špalíků získaných ze spodní stehenní metafysy. Tyto tlusté řezy se ručně obrousily na tloušťku mezi dvěma skleněnými deskami zdrsněnými práškem karborunda ( hrubý s brusným číslem 100) na konečnou tloušťku asi 8 pm. Pro broušení se použila voda jako lubrikant. Obroušené tenké řezy se pak postávali neobarvené pro zkoumání. Podobně se připravila část z každého středního těla stehenní kosti ze střední roviny mezi dvěma řeznými povrchy stehenního špalíku. Tkáňové řezy ze stehenní metafysy se nepravidelně označily pro slepá měření přírůstku kostí.

Neobarvené měkké vložené řezy se systematicky sledovaly fluorescenčním mikroskopem s xl6 objektivem a xlO sklíčky vzhledem k pokrytí trabekulární kosti v prostoru uzavřeném endostealním povrchem. Místa tvorby kostí ostře určené dvěma tetracyklinovými svazky se nepravidelně zvolila k měření, pro snížení chyby na minimum z důvodu křivých řezů skrz vytvořené povrchy. Vzdálenost mezi dvěma tetarcyklinovými svazky v pm se zaznamenala a dělila 2 (interval značení byl dva dny), aby se získala rychlost v pm na den. 30 náhodně vybraných míst z každého zvířete se měřila a použil se aritmetický průměr pro statistickou analysu?/

- 38 Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 a na Obr. 18-

Tabulka 2: Srovnání skupinových aritmetických průměrů mezi skupinami
	Testovaná skupina	Kontrolní skupina A	Kontrolní skupina B
Průměr	1,35 pm/d	1,03 pm/d	0,99 pm/d
S.D.	0808 pm/d	0,04 pm/d	0,07 pm/d
N	9	9	7
	t	d.f.	P
Test.skupina proti kontrol.skupině A	11,18	16	<0,001
Test.skupina proti kontrol.skupině B	3.96	14	<0,005
Kontrol.skupina A vs.kontr.skupina B	0,62	14	>0,5

ÚČINEK ZÁVISLÝ NA DÁVCE CHEMICKY SYNTETIZOVANÉHO PEPTIDU NA RŮST KOSTÍ samečků krys Sprague-Dawley rozdělených do čtyř skupin po deseti- Průměrná hmotnost skupin od 1 do 4 byla 294, 297, 296 a 279 g.

Jako v předchozí sadě pokusů, připravil se zásobní roztok peptidu o koncentraci 1 mg na ml v lt kyselině octové. Vynechal se BSA. Připravili se 3 roztoky každý s jinou koncentrací chemicky syntetizovaného polypeptidu jak následuje:

Peptldový roztok 1: 1,1 ml zásobního roztoku se zředilo na 5,5 ml 0,1¾ kyselinou octovou pro dosažení koncentrace peptidu 100 pg na 0,5 ml roztoku.

Peptidový roztok 2^: 0,55 ml zásobního roztoku se zředilo na 5,5 ml 0,1¾ kyselinou octovou pro dosažení koncentrace peptidu 50 pg na 0,5 ml objemu.

Peptidový rozotk 3-' 0,3 ml zásobního roztoku se zředilo na 6 ml

0,1¾ kyselinou octovou pro dosažení koncentrace peptidu 25 pg na 0,5 ml objemu.

Tetracyklinový značící roztok se připravil rozpuštěním 288 mg tetracyklinové báze ve 40 ml deionizované vody pro získání koncentrace 7,2 mg na ml. Každá krysy dostala (viz dole) 1 ml roztoku, to jest asi 24 g na kg telené hmotnosti.

Čtyři skupiny krys se ošetrévaly následovně:

Testovaná skupina A - Každé zvíře dostalo 1 intramuskulární injekci 0,5 ml peptidové roztoku 1 (100 pg peptidů) s následujícím 1 ml roztoku tetracyklinu aplikovaného intraperitoneálně.

Testovaná skupina B - Každé zvíře dostalo 1 intramuskulární injekci 0,5 ml peptidové roztoku 2 ( 50 pg peptidů) s následujícím 1 ml roztoku tetracyklinu aplikovaného intraper i toneá1ně.

Testovaná skupina C - Každé zvíře dostalo 1 intramuskulární injekci 0,5 ml peptidové roztoku 3 ( 25 pg peptidů) s následujícím 1 ml roztoku tetracyklinu aplikovaného intraper i toneá1ně.

Testovaná skupina D - Každé zvíře dostalo 1 intramuskulární injekci 0,5 ml 0.1% kyseliny octové s následujícím 1 ml roztoku tetracyklinu aplikovaného intraperitoneálně- Každá krysa nedostala peptid.

Druhý tetracyklinový značící roztok se připravil rozpuštěním 288 mg tetracykllnové báze (Sigma) ve 40 ml deionizované vody pro vytvoření koncentrace 7,2 mg tetracyklinu na ml.

Každá krysa dostala 1 ml tetracykllnového značícího roztoku (asi 24 mg na kg tělesné hmotnosti) intraperitoneálně asi 48 hodin po počátečním podání a usmrtila se narkosou oxidem uhličitým asi 24 hodin později.

Asi 3 ml posmrtné krve se odebraly od každé krysy kardiopunkcí a daly do heparinizované zkumavky. Plasma se pak uchovávala zmražená při -20 °C.

Z každého zvířete byly vyříznuty následující kostní vzorky: obě stehenní kosti, obě holenní kosti, obě kyčelní kosti a první dva ocasní obratle. Tyto kostní vzorky se fixovaly v 10% formaldehydu pufrovaném na pH 7,4 20 mM fosfátovým pufrem.

ROZŘEZÁNÍ PRAVÉ STEHENNÍ KOSTI PRO STANOVENÍ ZÁVISLOSTI NA DÁVCE RYCHLOSTI PŘÍRŮSTKŮ KOSTNÍCH MINERÁLU

Studovala se spodní epifysa pravé stehenní kosti místo spodní metafysy. Spodní epifysa pravé stehenní kosti se vyřízla jak je znázorněno na Obr. 19.

Kostní tkáň se mírně protrepávala 6 hodin v 80% ethanolu a pak se přenesla do 95% ethanolu. Následující den se kostní tkáň přenesla do 100% ethanolu, který se vyměnil po 8 hodinách. Následující den se kostní tkáň přenesla do acetonu. Po asi 27 hodinách se tkáň přenesla do 1=1 směsi acetonu a Spurrsova media. Po asi 18 hodinách se tkáň přenesla do 100% Spurrsova media a mírně se protrepávala asi 20 hodin. Spurrsovo medium se vyměnilo a tkáň se inkubovala při 37 °C dalších 24 hodin. V tomto okamžiku byly špalíky ze spodní epifysy částečně polymerizované, to znamená měkkost se změnila v hustý rosol. Špalíky se přemístily do inkubátoru a ošetřily se při 45 °C asi 4,5 hodiny do zatvrzení zapuštěného media. Poslední stupeň ošetření při 80 °C se prováděl 4 hodiny.

400 um řez se vyřízl na úrovni kostního špalíku 1 mm pod horní řeznou plochou. Tento tlustý řez se ručně obrousil na na konečnou tlouštku asi 8 um mezi dvěma skleněnými deskami předem zdrsněnými hrubým práškem karborunda. Pro broušení se použila voda jako lubrikant. Tyto tenké řezy se postávali neobarvené do Permount CEisher).

Použil se postup měření popsaný ve spojení s předcházející sadou pokusů. Rychlost se měřila na 30 místech tvorby kostí v trabekulární kosti obalené endostealním povrchem spodní stehenní epifysy. Celý prostor řezu se systematicky pokryl způsobem ukázaným na Obr. 20. Vzorky se před měřením označily.

Výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.

Tabulka 3^: Srovnání aritmetických průměrů u skupin
	Skupina A C100 pg)	Skupina B <50 ug)	Skupina C (25 jug)	Skupina D (0 jjg)
Průměr Cum/den)	1,32	1,15	1,05	0,85
S.D.	0,07	0.05	0,03	0,04
Skupina	t	d.f.	P
A proti B	6,64	8	<0,01
B proti C	5,46	8	<0,01
C proti D	13,80	8	<0,01

Výsledky v tabulce 3 jsou graficky znázorněny na Obr. 21 a 22. Tyto výsledky ukazují, že stimulační účinek u krys chemicky syntetizovaného polypeptidu roste s množstvím podaného peptidu v rozmezí použitých dávek a Časového intervalu.

Samozřejmě se rozumí, že je možná řada substitucí aminokyselin při zachování třírozměrné struktury odpovědné za kostní stimulační účinek polypeptidu podle vynálezu, bez záměru omezit se na to. Je například možné očekávat, že výměna mezi nepolárními alifatickými neutrálními aminokyselinami glycin, alanin, prolin, valin a isoleucln by byla možná. Obdobně by mohly být provedeny substituce mezi polárními alifatickými neutrálními aminokyselinami serin, threanin, methionin, cystein, asparagin a glutamin. Je třeba říct, že vazba peptidů mezi sebou disulfidovým můstkem by mohla být důležitá a jestli tomu tak je, osamělý zbytek cysteinu by měl zůstat intaktní a jiné aminokyseliny schopné tvořit disulfidovou vazbu by neměly být substituované nikde v sekvenci. Substituce mezi kyselými aminokyselinami, kyselinou asparagovou a glutamovou by se asi mohly provést, stejně jako by se mohly provést substituce mezi bazickými aminokyselinami lysinem a argininem. Obdobně by byly možné substituce mezi aromatickými aminokyselinami zahrnujícími fenylalanin, histidin. tryptofan a tyrosin. Takové substituce a vzájemné výměny jsou odborníkům dobře známé. Jiné substituce jsou také dobře možné.

Pokud se týká delece jedné nebo více aminokyselin je pravděpodobné, že delece malého počtu aminokyselin z každého konce sekvence by mohla být možná. Dále, symetrické nebo téměř symetrické delece by zřejmě byly nejuskutečnitelnější při zachování třírozměrné konfigurace. Vnitřní delece by obdobně byly možné v poněkud omezeném rozsahu, mělo by jich být několik a počet by zřejmě neměl být větší než asi 5 aminokyselin.

Adice aminokyselin by pravděpodobně mohly být provedeny na koncích sekvence a stejně jako u deleci, jsou zřejmě možné symetrické nebo téměř symetrické adice na karboxylových a aminových koncích. Vnitrní adice, zřejmě možné v poněkud omezeném rozsahu, mělo by jich být několik a počet by zřejmě neměl být větší než asi 5 aminokyselin, a výhodně méně.

Shora uvedené modifikace sekvence terminální adice, delece nebo substituce jsou pravděpodobně nejužitečnější, nebot taková modifikace může mít řadu funkcí: jako například identifikační skup i na skupina.

pro použití v radioimmunoassay nebo jako vazebná

SYNTÉZA PROTILÁTEK PROTI CHEMICKY SYNTETIZOVANÉMU PROTEINU (SEQ ID NO:11)

Chemicky syntetizovaný protein (SEQ ID NO:11) se připojil k KHL (keyhole 1impet hemacyanin) třemi různými cross-1inkery, jak je níže popsáno.

PŘIPOJENÍ GLUTARALDEHYDU mg peptidů (SEQ ID NO:11) se rozpustilo v 2,5 ml roztoku PBS vytvořeného z 2,7 mM KC1, 1,2 mM KH2PO4, 138 mM NaCl, 8,1 mM NažHPO^. aby se získala konečná koncentrace peptidů 2 mg/ml. 10 mg KHL se rozpustilo v 5,0 ml PBS, aby se získala konečná koncentrace 2 mg/ml. K 1,25 ml rozotku KLH se přidalo 1,25 ml roztoku peptidů. Přidal se g1utara1dehyd na konečnou koncentraci 0,25%. Výsledný roztok se míchal 1 hodinu při teplotě místnosti. Po míchání se roztok dialyzoval proti 1 litru PBS. PBS se třikrát vyměnil.

PŘIPOJENÍ KARBODIIMIDU (EDC)

Roztoky peptidů a KLH se připravily jako v předchozí části. K 1,25 ml roztoku KLH se přidalo 1,25 vzniklému roztoku se přidalo 2,5 mg EDC hodiny při teplotě místnosti a pak se dialyzoval proti 1 litru PBS. PBS se třikrát vyměnil.

ml roztoku peptidů. Ke Roztok se stále míchal

PŘIPOJENI ESTERU M-MALEIMIDOBENZOYL-N-HYDROXYSUKCINIMIDU (MBS)

K 500 ul vody se přidalo 5 mg peptidů a pH se upravilo na

8,5 pomocí NaOH, aby se získala konečná koncentrace 10 mg/ml. Citrátanhydrid se zředil ve vodě na koncentraci 10 mg/ml. 500 μΐ roztoku anhydridu se přidalo ke 100 ul roztoku peptidů současně s úpravou pH na 8,5 mezi každým přidáním. Roztok se pak stále míchal při teplotě místnosti 1 hodinu. Pak následovalo přidání 100 ul 1 M sodium fosfátového pufru (pH 7,2) a pak 900 ul 100 mM sodium fosfátového pufru (pH 7,2). Sulfo-MBS se zředil ve vodě na koncentraci 25 mg/ml a 400 ul tohoto roztoku se přidalo k roztoku peptidů, aby se dosáhla koncentrace MBS asi 5 mg/ml. Roztok se stále míchal při teplotě místnosti 30 minut. Přidalo se 6 ul p-merkaptoethano1u pro konečnou koncentraci B-merkaptoethanolu 35 mM. Roztok se stále míchal při teplotě místnosti 1 hodinu. KLH se rozpustil v PBS při 3 mg/ml a 2,5 ml se přidalo k roztoku peptidů. Roztok se stále míchal při teplotě místnosti 3 hodiny a pak se dialyzoval proti 1 litru PBS při třech výměnách PBS. Konečná koncentrace peptidů byla asi 1 mg/ml a konečná koncentrace KLH byla asi 1,5 mg/ml.

TVORBA PROTILÁTEK

Králíci se injikovaly roztoky syntetického peptidů jak uvedeno níže. 250 ul každého z roztoků peptidů s napojeným glutaraldehydem a EDC se spolu smíchalo s 500 ul Freudova adjuvans. Tento roztok se injikoval intramuskulárně do zadních noh králíků, 500 ul na nohu. Celkové množství injikovaného peptidů bylo 0,5 mg. 500 ul syntetického peptidů připojeného k KLH s MBS se smíchala 500 ul Freudova adjuvans. Tento roztok se injikoval intramuskulárně do zadních noh jiného králíka, 500 μΐ na nohu. Celkové množství injikovaného peptidů bylo 0,5 mg.

positivní reakci, to jest

Syntetický peptid se nanesl na dvě cestičky, 1,5 pg a 4 pg, gelu (18% dělící, 5% hromadící). Gel se nechal tvořit skvrny pres noc při 30 V a zastavil se 3% mlékem v PBS. Gel se inkuboval pres noc s králičím sérem zředěným 1=250 v 1% mléko/PBS s následnou inkubací s anti-krá1 ičí-alka1 ickou fosfatasou z kozy zředěnou 1=1000 1 hodinu. Gel se pak vyvolal se substrátem. Syntetický peptid bylo možné vidět obarvením komasinovou modří. Peptid se zjistil u druhé odběru krve každého králíka a nezjistil se u preimunovaného séra žádného z králíků.

Interakce mezi imobilním peptidem a sérovými protilátkami se dále studovala pomocí povrchové plasmonové resonance použitím BIAcore. Syntetický peptid se kovalentně imobilizoval na dextranovou matrici aminovou vazbou. Králičí séra různých zředění se injikovala přes povrch na pět minut a zjišťovalo se množství protilátky vázané na imobi1izovaný peptid. Titr je definovaný jako poslední zředění séra mající větší než 50 Resonančních Jednotek. Použitím tohoto přiblížení, bylo zjištěno, že jsou protilátky přítomny v séru od obou králíků a interakce může být blokována preinkubací séra s peptidem. Zjistilo se, že protilátky v séru králíků neinteragují s imobilizovaným ne příbuzným peptidem.

Mohou být vyvinuty postupy a produkty za použití protilátky k polypeptidů pro detekci polypeptidů, se kterým se protilátka váže. Například, protilátka se může navázat na nebo konjugovat. s nějakým dobře známým zpravodajským systémem použitým pro indikaci positivně vázaného polypeptidů na protilátku. Dobře známý zpravodajský systém zahrnuje radioimmunoassaye (RIAs) nebo immunoradiometrické assaye (IRMAs). Jiná možnost, enzym-navázaný immunosorbent assay (ELISA) by obecně měl s RIAs a IRMAs relativně vysoký stupeň citlivosti, ale obecně by se nespoléhala na použití radioizotopů. Je možné připravit vizuálně zjistitelnou látku nebo alespoň zjistitelnou spektrofotometricky. Bylo by možné použít assay spočívající na fluorescenci látky vázané zjišťovaným enzymem. Je třeba ocenit, že je řada zpravodajských systémů, které mohou být použity podle vynálezu pro zjištění přítomnosti určitého polypeptidů. Se sbírkou standardních vzorků a postupů, byla dobře zjistitelná přítomnost peptidu nad prahové množství v séru.

Taková metoda založená na antigenní odpovědi na chemicky syntetizovaný lidský polypeptid (SEQ ID NO:11) se mohla vyvinout a varianty získaného polypeptidu, lak je shora popsáno pro aminokyselinovou substituci, deleci a adici, (a konjugáty) se pak mohly předvybrat jako potenciální stimulační faktory kostí. Například by se mohly ty faktory, které reagují positivně s protilátkou k již známému peptidu, testovat na stimulační účinky kostí in vivo použitím systému popsaného zde pro krysy.

Takový zpravodajský systém s vázanou protilátkou by se mohl použít v metodě pro zjištění, zda krevní sérum pacienta má nedostatečné množství polypeptidu. Mohla by se vyvinout testovací souprava na základě normální prahové koncentrace takového polypeptidu v krevním séru určitého typu pacienta.

Další výhodu lze získat pomocí chimérních forem proteinu jak je známé v oboru. Například DNA sekvence kódující celý protein nebo část proteinu by se tak mohla navázat na sekvenci kódující C-koncovou část β-galaktosidasy E.coli, aby produkovala fušovaný protein. Například je popsán expresní systém pro glykoproteiny Fa G lidského respiračního syncytialního viru, v US patentu č. 5,288,630 vydaném 22. února 1994 a v něm uvedené citace.

SEKVENČNÍ PROTOKOL (1) OBECNE INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: Cherk Shing Tam (ii) NÁZEV PŘIHLÁŠKY: STIMULAČNÍ FAKTOR KOSTÍ (iii) POČET SEKVENCÍ: 11 (iv) KORESPONDČNÍ ADRESA:

(A) ADRESA: Blake, Cassels & Graydon (B) ULICE: Box 25, Commerce Court Vest (C) MĚSTO: Toronto (D) STÁT: Ontario (E) ZEMĚ: Kanada (F) ZIP: M5L 1A9 (v) POCITACOVE-CITELNA FORMA:

(A) NOSIČ DAT:disketa,3,5“, 1,4Mb pamět (B) POČÍTAČ: COMPAQ, kompatibilní IBM AT (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: MS-DOS 5.1 (D) SOFTVARE: VORD PEREECT (vi) DATA PŘIHLÁŠKY:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PŘIHLÁŠKY:

(C) TŘÍDA:

(vii) DATA PRIORITNÍ PŘIHLÁŠKY·· (A) ČÍSLA PŘIHLÁŠEK: US 08/031,036;

US 08/120,127 (B) DATA PŘIHLÁŠENÍ: 12-MAR-1993;

13-SEP-1993 (viii) INFORMACE 0 ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: Gray, Brian V.

(B) ČÍSLO REGISTRACE:

(C) ZNAČKA: 46913/00008 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INEORMCE:

(A) TELEFON: (416) 863-3256 (B) FAX: (416) 863-2653 nebo 863-4335 (2) INFORMACE K SEKVENCI ID NO: i (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: ii aminokyselin (B) DRUH: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID N0^: 1

Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr Lys Pro Ile 1 5 10 (2) INFORMACE K SEKVENCI ID NO: 2 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA·' 7 aminokyselin (B) DRUH: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID NO: 2

Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu i 5 (2) INFORMACE K SEKVENCI ID NO: 3 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů bází (B) DRUH: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché CD) TOPOLOGIE-· lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID NO: 3

GGY	CCY GGY GGY	GCY GGY	GAR	ACY	AAR	CCY	AT
Gly	Pro Gly Gly	Ala Gly	Glu	Thr	Lys	Pro	Ile
1		5				10
(2)	INFORMACE K	SEKVENCI	ID	NO:	4

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) DRUH'- aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID NO: 4

Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr Lys Pro 1 5 10 (2) INFORMACE K SEKVENCI ID NO: 5 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA-' 21 párů bází (B) DRUH: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID NO: 5

AAG CTT CAC ACC ACG AAC CAG (2) INFORMACE K SEKVENCI ID NO: 6 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) DRUH: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID NO: 6

TTA TGA GTA TTT CTT CAA GGG (2) INFORMACE K SEKVENCI ID NO = 7 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 329 párů bází (B) DRUH: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA k raRNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID NO: 7

TTTGGCTTTA TTCATAGCGG TAATTAATGA TCAAGACAGT TGATTACTCG TAAGCACTAT 60

TAAAAATTTG CA ATG ACT GCT CAA AAT ACA GAC CTT AAC CAA CTA TCC 108

Met Thr Ala Gin Asn Thr Asp Leu Asn Gin Leu Ser

10

AAC AGT

TTC ACT TTA

GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT

GAA CAT Glu His 25

ACG GCA

156

Asn

Ser

Phe 15

Thr

Leu

Gly

Ile

Gly 20

Lys

Arg Thr

Asn

Thr

Ala

GAT

TGT

AAA

ATT

AAA

CCG

AAC

ACC

TTG

CAT AAA

AAA

GCT GCA

GAG

ACT

204

Asp

Cys

Lys

Ile

Lys

Pro

Asn

Thr

Leu

His Lys

Lys

Ala Ala

Glu

Thr

30

35

40

TTA

ATG

GTC

CTT

GAC

CAA

AAT

CAA

CCA

TAAAGGATCT GCAGCTTATG

251

Leu

Met

Val

Leu

Asp

Gin

Asn

Gin

Pro

50

TCTTCTAGTT TATCTTTTGC ATAAAAAAGC TGCAGAGACT TTAATGGTAA TTGCCAAAAT 311

CAACCATAAA GGATCTGC 329 (2) INFORMACE K SEKVENCI ID NO: 8 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA·' 53 aminokyselin (B) DRUH: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID NO: 8

Met 1	Thr	Ala	Gin	Asn 5	Thr	Asp	Leu
Leu	Gly	Ile	Gly 20	Lys	Arg	Thr	Asn
Lys	Pro	Asn 35	Thr	Leu	His	Lys	Lys 40

Asn Gin Leu Ser Asn Ser Phe	Thr
	10	15
Glu 25	His	Thr	Ala	Asp	Cys 30	Lys	Ile
Ala	Ala	Glu	Thr	Leu	Met	Val	Leu

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Polypeptid mající sekvenci aminokyselin NH2-Gly-Ile-^ly-Lys Arg-Thr-Asn-Gl u-H is-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-I le-Lys-Pro-Asn-Thir-LeuHis-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-ProC0₂H.
2. Dimerní polypeptid, ve kterém každý monomer polypeptidu obsahuje následující sekvenci aminokyselin: Nlfe-Gly-Ile-Gly-LysArg-Thr-Asn-Glu-Hls-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-LeuHis-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-ProCO2H, přičemž jsou monomery navzájem spojeny disulfidovým můstkem mezi zbytky cysteinu jednotlivých sekvencí.
3. Polypeptid projevující kostně stimulační aktivitu u savců, kterýžto polypeptid obsahuje monomer s následující sekvencí aminokyselin: NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-AlaAsp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-ThrLeu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-C02H a jeho dimery, přičemž jsou monomery navzájem spojeny disulfidovým můstkem mezi zbytky cysteinu jednotí 1tých sekvencí.
4. Polypeptid projevující kostně stimulační aktivitu u savců, kterýžto polypeptid má sekvenci odpovídající části nebo celku následující sekvence aminokyselin: NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-ThrAsn-Glu-Hi s-Thr-A1a-Asp-Cys-Lys-11e-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-LysLys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-C02 Η, její analogy , kde aminokyseliny mohou být v sekvenci substituovány, deletovány nebo adovány tak dlouho, dokud je zachována kostně stimulační aktivita u savců pocházející z třírozměrné konfigurace sekvence, a konjugáty polypeptidu nebo jeho analogů.
5. Polypeptid projevující kostně stimulační aktivitu u savců, kterýžto polypetid obsahuje dimer peptidu majícího sekvenci, která odpovídá části nebo celku následující sekvence aminokyselin NH₂-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-IleLys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-LeuAsp-Gln-Asn-Gln-Pro-C0₂Η, přičemž jsou peptidy dimeru navzájem spojeny disulfidovým můstkem mezi zbytky peptidů, její analogy, kde aminokyseliny substituovány, deletovány cysteinu jednotlivých mohou být v sekvenc i tak dlouho, dokud je nebo adovány zachována kostně stimulační aktivita u savců pocházející z třírozměrné konfigurace sekvence, a konjugáty peptidu nebo jeho analogů.
6. Polypeptid projevující kostně stimulační aktivitu u savců, kterýžto polypetid obsahuje monomer mající sekvenci, která odpovídá části nebo celku následující sekvence aminokyselin:

NH₂-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-IleLys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-LeuAsp-Gln-Asn-Gln-Pro-C0₂H a dimery toho, přičemž jsou monomery navzájem spojeny disulfidovým můstkem mezi zbytky cysteinu jednotlivých sekvencí, analogy toho, kde aminokyseliny mohou být v sekvenci substituovány, deletovány nebo adovány tak dlouho, dokud je zachována kostně stimulační aktivita u savců pocházející z třírozměrné konfigurace sekvence, a konjugáty polypeptidu nebo jeho analogů.
7. DNA sekvence kódující následující sekvenci aminokyselinNH₂-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-IleLys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-LeuAsp-Gln-Asn-Gln-Pro-C0₂H a její analogy, přičemž aminokyseliny mohou být v sekvenci substituovány, deletovány nebo adovány tak dlouho, dokud je kostně stimulační aktivita u savců pocházející z třírozměrné konfigurace sekvence zachována v polypeptidu, který obsahuje sekvenci aminokyselin.
8. DNA sekvence kódující následující sekvenci aminokyselin:

NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-IleLys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-LeuAsp-Gln-Asn-Gln-Pro-CCteH a její analogy, přičemž aminokyseliny mohou být v sekvenci substituovány, deletovány nebo adovány tak dlouho, dokud je kostně stimulační aktivita u savců pocházející z třírozměrné konfigurace sekvence zachována v polypeptidu, který obsahuje sekvenci aminokyselin, a sekvence, které hybridi-

zuj í k DNA a kódují sekvenci aminokyselin polypeptidu, který nese kostně stimulační aktivitu u savců. 9. Vektor obsahuj ící DNA podle nároku 7. 10. Vektor obsahuj ící DNA podle nároku 8. 11 . Způsob přípravy polypeptidu schopného indukovat zvýšenou

rychlost přírůstku kostí, vyznačující se tím, že se Ca) izolují ze vzorku savčího krevního séra polypeptidy a proteiny, které mají molekulovou hmotnost menší než asi 30 000 daltonů a větší než asi 3 000 daltonů, a

Cb) získá žádaný polypeptid z výsledného isolovaného polypeptidu odstraněním polypeptidu , který má pí asi 9.
12- Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že se jako savčí krevní sérum použije lidské sérum a ve stupni Cb) se oddělí žádaný polypeptid pomocí aniontoměničové chromatograf ie.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím že se dále rozdělí polypeptid získaný ve stupni Cb) podle molekulové hmotnosti gelovou elektrofořežou.
14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím že se dále z rozděleného polypeptidu izoluje peptid, který má molekulovou hmotnost asi 8000 daltonů.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím že se při izolaci peptidů přenese rozdělený polypeptid na polymerní membránu, oddělí se část membrány obsahující peptid, který má molekulovou hmotnost asi 8000 daltonů a odstraní se peptid z části membrány.
16. Způsob podle nároku 11, vyznačujíc že se ve stupeni (a) filtruje vzorek.
17. Polypeptid připravený podle způsobu v nároku
18. Polypeptid připravený podle způsobu v nároku
19. Polypeptid připravený podle způsobu v nároku
20. Polypeptid připravený podle způsobu v nároku
21. Polypeptid připravený podle způsobu v nároku
22. Polypeptid připravený podle způsobu v nároku tím

11.

12.

13.

14.

15.

16.
23. Protein nároku 1.

který vyvolává antigenní odpověď na polypeptid z
24. Protein nároku 2.

který vyvolává antigenní odpověď na polypeptid z

25. Protein, nároku 3. který vyvolává 26. Protein, který vyvolává nároku 4.

antigenní odpověď na polypepti antigenní odpověď na polypepti

27. Protei η, který vyvolává antigenní odpověď na polypeptid nároku 5. 28. Protein, který vyvo1ává ant i genn í odpověď na polypeptid nároku 6.
29. Protein, který vyvolává antigenní odpověď na polypeptid z nároku 11.
30- Diagnostická souprava pro zjištění přítomnosti polypeptidů z nároku 4, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku k polypeptidů vázanému na ohlašovací systém, přičemž ohlašovací systém vyvolává zjistitelnou odpověď, když jsou předem určené množství polypeptidů a protilátka spolu vázány.
31. Diagnostická souprava pro zjištění přítomnosti polypeptidů získaného podle způsobu z nároku 11, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku k polypeptidů vázanému na ohlašovací systém, přičemž ohlašovací systém vyvolává zjistitelnou odpověď, když jsou předem určené množství polypeptidů a protilátka spolu vázány.
32. Diagnostická souprava podle nároku 30, vyznačující se tím, že ohlašovací systém obsahuje prostředky pro uvedení ve vztah odpověď se jmenovaným předem určeným množstvím polypeptidů.
33. Diagnostická souprava podle nároku 31, vyznačující se tím, že ohlašovací systém obsahuje prostředky pro uvedení ve vztah odpověď se jmenovaným předem určeným množstvím polypeptidů.
34. Polypeptid schopný indukovat zvýšenou rychlost přírůstku kostí, který se získá postupem zahrnujícím stupně:

(a) izolaci ze vzorku savčího krevního séra polypeptidů a proteinů, které mají molekulovou hmotnost menší než asi 30 000 daltonů a větší než asi 3 000 daltonů, a (b) získání žádaného polypeptidů z výsledného isolovaného polypeptidů odstraněním polypeptidů , který má pl asi 9, a jeho analogů, kde aminokyseliny mohou být v sekvenci substituovány, deletovány nebo adovány tak dlouho, dokud je zachována kostně stimulační aktivita u savců pocházející z třírozměrné konfigurace sekvence, a konjugáty peptidů nebo jeho analogů.
35. Způsob přípravy čištěného proteinu schopného indukovat

zvýšenou rychlost přírůstku kostí , v y z n a č u j í c í s e tím. že se-' Ca) kultivují ve vhodnému kultivačním mediu buňky transformované DNA sekvenc í s následující sekvenc í- i GGG , ATG GGA AAA CGA A CA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA, a

Cb) izoluje a čistí uvedený protein z uvedeného kultivačního media.
36. Způsob přípravy čištěného proteinu schopného indukovat zvýšenou rychlost přírůstku kostí, vyznačující se tím, že se=

Ca) kultivují ve vhodnému kultivačním mediu buňky transformované DNA sekvencí kódující následující sekvenci aminokyselin:

NH₂-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-H is-Thr-Ala-Asp-Cys-LysIle-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-MetVa 1 -Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-C02 Η, a (b) izoluje a čistí uvedený protein z uvedeného kultivačního med i a.
37. Hostitelská buňka transformovaná DNA podle nároku 7.
38. Hostitelská buňka transformovaná DNA podle nároku 8.
39. Způsob zjištění přítomnosti proteinu projevujícího kostně stimulační aktivitu u savců, vyznačující se tím že se sbírá vzorek krevního séra savce, a se alespoň část vzorku vystaví působení protilátky vázané na zpravodajský systém, přičemž je protilátka schopná se vázat na polypeptid se sekvencí NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-HisThr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-AlaG1u-Thr-Leu-Met-Va1-Leu-Asp-Gln-Asn-G1n-Pro-C0₂H a kde navázání proteinu s protilátkou způsobuje, že zpravodajský systém indikuje uvedené navázání.
40. Polypeptid mající sekvenci aminokyselin NH2-Gly-Ile-Gly-LysArg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-LeuHis-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-ProCO2H pro terapeutické použití pro zvýšení růstu kostí u savců.
41. Protein obsahující sekvenci aminokyselin dostatečně duplikativní s tou, která je v SEQ ID NCBll, takže při podání savci jako je krysa protein zvýší růst kostí.
42. Protein mající alespoň 50¾ homologii se sekvencí uvedenou v SEQ ID NO:11.
43. Protein obsahující sekvenci aminokyselin dostatečně duplikativní s tou, která je v SEQ ID N0^:ll, takže je protein kodován DNA, která hybridizuje za přísných podmínek s DNA kódující protein uvedený v SEQ ID NO:11.
44. Chimerní kostně stimulační faktor obsahující sekvenci amino kyselin uvedenou v SEQ ID N0:ll, nebo její část.
45. V podstatě čistý oběhový polypeptid izolovaný z krevního séra, který Ca) je schopný indukovat zvýšenou rychlost přírůstku kostí a Cb) má následující N-koncovou sekvenci aminokyselin: Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly-Glu-Thr-Lys-Pro-Ile.
46. Polypeptid podle nároku 45 izolovaný z krevního séra krys.
47. Polypeptid podle nároku 45, přičemž má polypeptid molekulovou hmotnost asi 5 000 daltonů, a jeho diméry a polymery a analogy.
48. Diagnostická souprava pro určení přítomnosti polypeptidu schopného indukovat, zvýšenou rychlost přírůstku kostí ve vzorku, vyzná čující se tím,že^ibsahu je protilátku k polypeptidu s N-koncovou sekvenci aminokyselin Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly-Glu-Thr-Lys-Pro-Ile vázanou na ohlašovací systém, přičemž ohlašovací systém vyvolává zjistitelnou odpověď, když jsou předem určené množství polypeptidu a protilátka spolu vázány.

ise tím, že /
49. Diagnostická souprava podle nároku 48 , vyznaču jící^oh 1ašovací systém obsahuje prostředky pro korelaci odpovědi s uvedeným předem určeným množstvím polypeptidu.
50. Protein, který vyvolává ant-igenní odpověď na polypeptid s N-koncovou sekvencí aminokyselin Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly-Glu-ThrLys-Pro-Ile.
51. Způsob přípravy polapeptidu s N-koncovou sekvencí aminokyselin Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly-Glu-Thr-Lys-Pro-Ile z krevního séra krys, vyznačuící se tím, že se získá proteinová frakce krevního séra, odstraní se frakce proteinů s molekulovou hmotností větší než asi 30 000 daltonů a polypeptid se izoluje.
52. Způsob podle nároku 51, vyznačující se tím, že se pro izolaci polypeptidů sbírá protein z vysoce výkonného sloupce pro kapalnou chromatografií s obrácenou fází.
53. Způsob podle nároku 52, vyznačující se tím, že se pro sběr proteinu eluuje polypeptid z vysoce výkonného sloupce pro kapalnou chromatografií s obrácenou fází naplněného silikagelem s na to navázanými třemi vedlejšími skupinami uhlíkových řetězců, použije se eluční roztok s alespoň asi 62 až 63 % acetonitrilu.

co σ
54. Polypeptid izolovaný ze savčího krevního séra o molekulové hmotnosti asi 5 000 daltonů a s N-koncovou sekvencí aminokyselin

Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly-Glu-Thr-Lys-Pro-Ile pro terapeutické použití pro zvýšení růstu kostí u lidí.

O o

czx

CD o; s .· f
55. Způsob přípravy polypeptidu schopného indukovat zvýšenou rychlost kostního přírůstku ze savce, vyznačující se tím, že se (a) zvíře krmí potravou s nedostatkem vápníku pro zvýšení hladiny polypeptidu v krevním séru savce, (b) izoluje vzorek krevního séra savce a (c) ze vzorku sbírá v podstatě v čisté formě polypeptid s N-kon covou sekvencí aminokyselin Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly-Glu-Thr Lys-Pro-Ile.
56. V podstatě čistý oběhový polypeptid izolovaný z krevního séra, který (a) je schopný zvýšit rychlost přírůstku kostí a (b) má molekulovou hmotnost asi 3 000 daltonů a jeho dimery a polymery a analogy.
57. Způsob diagnostikování chorobného stavu jako je osteoporosa u savce, vyznačující se tím, že se odebere vzorek krevního séra ze savce, zjistí, zda množství polypeptidu schopného indukovat zvýšenou rychlost přírůstku kostí převyšuje předem určenou hladinu, přičemž uvedené množství polypeptidu pod předem určenou hladinu ukazuje na uvedený chorobný stav.
58. Způsob podle nároku 57, vyznačující se ti že ohlašovací systém je vázaný na protilátku uvedeného polypeptidu a že se ve zjišťovacím stupni vystaví alespoň část vzorku protilátce, přičemž spolunavázání polypeptidu a protilátky způsobí vyznačení tohoto navázaní ohlašovacím systémem.
59. Způsob podle nároku 57, vyznačující se t í že se dále izoluje proteinová frakce ze vzorku a odstraní se proteiny s molekulovou hmotností větší než ai 30 000 dal tonů před zjištěním množství polypeptidů.
60. DNA obsahující následující sekvenci nukleové kyseliny:

ATG ACT GCT CAA AAT ACA

GAC CTT AAC CAA CTA TCC AAC AGT TTC ACT TTA GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA.
61. Sekvence DNA kódující následující sekvenci aminokyselin:

NHj-Mct Thr Ala Gin

Asn Thr Asp Leu Asn Gin Leu Ser Asn Ser Phe Thr Leu Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gin Asn Gin Pro-CO₂H.
62. Polypeptid kódovaný sekvencí nukleové kyseliny podle nároku

60.