HUT73297A - Bone stimulating factor - Google Patents

Description

PTH termelésére képtelen (me1lékpaJ z smir iggye1 nem fokozza a csont ásványi anyag lerakodási sebességét. A polipeptidet két alakban izolálták; a nagyobb alak a kisebb polipeptid molekulatömegének körülbelül kétszeresével rendelkezik.

A kisebb polipeptid első aminosavát Gly Pro

Gly Gly Alá

Gly Glu Thr Lys

Pro

Ile szekvenciaként, a nagyobb polipeptid első hét aminosavát pedig Gly

Pro Gly Gly

Alá Gly Glu szekvenciaként határozták meg.

A nagyobb polipeptid a kisebb peptid dimere lehet.

Humán magzati máj cDNS-könyvtár screeneléséhez a patkány peptiden alapuló nukleinsav-próbát alkalmaztak, és kémiai úton egy

Gly

Ile

Gly

Lys Arg Thr

Asn Glu His Thr

Alá

Asp Cys Lys

Ile

Lys

Pro

Asn

Thr Leu His

Lys Lys Alá Alá

Glu

Thr Leu Net

Val

Leu

Asp

Gin

Asn Gin

Pro aminosav-szekvenciájú polipeptidet szintetizáltak.

Patkányokban a csontlerakódás sebessége e kémiai úton szintetizált vegyület beadásával dózisfüggő módon növekszik.

82407-7584-GI

	KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY
Képviselő:

DANUBIA Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

CSONTNÖVEKEDÉST SERKENTŐ FAKTOR

OSTEOPHARM Limited, Etobicoke, Ontario, CA

Feltaláló:

TAM Cherk Shing, Oakville, Ontario, CA

A bejelentés napja: 1994. 03. 14.

Elsőbbségei:

1993. 03. 12. (08/031 386) US 1993. 09. 13. (08/120 217) US

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/CA94/00144

A nemzetközi közzététel száma: WO94/20615

82407-7584-GI/gcs ·· ···· · · ·· • · · · · · • · · ·«···

A találmány tárgya csontnövekedést stimuláló proteinek és polipept. idek.

Ismeretes, hogy a csontok, még felnőtt emberben is, turnover-rel fejlődhetnek. Bizonyos helyeken, mint például a belső hallótokban, a szerv kialakulás után láthatóan nincs turnover. Más helyeken, különösen a gerincben, úgy tűnik, a turnover a felnőtt kor alatt is folyamatos. A csont-turnover a létező csont — proteinből, elsősorban kollagénből, és ásványi anyagokból álló — csontalapállományának (mátrix) felületén játszódik le. A csont turnover-ét az alapállomány csontfalósejtek (oszteoklasztok) által végzett lebontása (csontfelszívódás) indítja be. Az csontfalósejtek sokmagvú sejtek, melyek savat és proteolitikus enzimeket választanak ki, ami a csontalapállományt képező kollagén lízisét és az ásványi anyagok extracelluláris folyadéktérbe való kiszabadulását eredményezi. A csont lebontásának e kezdeti szakasza (reszorpciós fázis) után megkeződik a csont új protein alapállományának kialakulása. Az új csont-proteinek lerakódnak, majd valamivel később az ásványi anyagok elkezdenek beépülni az újonnan kialakult alapállományba. A csontalapállomány kialakítását és az ásványi anyagok beépítését a csontképző sejtek (oszteoblasztok) végzik, melyek egymagvú sejtek. A csontépítési fázist gyakran egy inaktív periódus követi (Tam, C.S., The Pathogenesis of Metabolic Boné Disease: An Overview, Metabolic Boné Disease: Cellular and Tissue Mechanisms. szerk.: Tam, C.S.

és mtsi, CRC Press, Boca Raton, 1989; Parfitt, A. M. és mtsi, Metab. Boné Dis. Rel. Rés.. 2(S), 213, 1980). A felszívódási fázis in vivő szoros összefüggésben áll a csontépítési fázissal (Parfitt, A.M., Metab. Boné Dis. Rel. Rés., 4, 1, 1982) Ilyenformán, a csont-turnover egy eseménysorozat, melynek helye csont anyagcsere egységként (Boné Metabolism Unit; BMU) ismert. A csont-turnover feltételezett közvetítőiről, az oszteoblasztokról és oszteoklasztokról úgy tartják, hogy két különálló sejtvonalba tartoznak. Ebbe a két sejttípusba nem előre kialakult. sejtek tartoznak, hanem olyanok, amelyek a sejtaktiválás útján prekurzoraikból differenciálódnak (Coccia, P.F. és mtsi, New Eng. J. Med., 32Q., 701, 1980; Marks, S.C. Jr. és D.G. Walker, Am. J. Anat., IfiJL, 1, 1981; Owen, M., Lineage of osteogenic cells and their relationship to the stromal system, Boné and Mineral Research, 3. kötet, szerk. Peck, W.A., Amsterdam 1., 1985).

A csontalapállomány fenntartható a csont turnover-ének teljes megszüntetésével, mint a belső hallótok csontjának esetében, vagy a csontépülés és -felszívódás közötti egyensúly kialakításával. A csontváz korral kapcsolatos változásaival foglalkozó sok vizsgálatban a növekedési időszak alatt a test összes csontmennyiségének gyarapodása tapasztalható, s a csontváz tömege a korai felnőttkorban éri el maximumát. A gyarapodást az életkor előrehaladtával a csont mennyiségének csökkenése követi. Nőkben egy lassab, egyenletesebb szakaszt megelőzően, a menopausa időszakában gyakran egy gyorsabb csontleépülési szakasz játszódik le.

Emiatt nőkben a csontleépülés sokkal súlyosabb. mint a férfiakban. A csontanyagcsere egyensúlyának megértése kulcsfontosságú lehet a csontozat korosodása patogenezisének megértésében. A csont-turnovert szabályozó mechanizmusok minden esetben összetettek, s jelenleg nem tisztázottak. A szabályozó mechanizmusok összetettsége a csontleépülés csökkentésének számos különböző megközelítési módját eredményezte.

Általánosan elmondható, hogy a csont-turnover két különböző szinten szabályozható. A szabályozás történhet egyrészt a prekurzor sejtek aktiválásának szintjén. A celluláris aktiválás szabályozói nemcsak a csontvázban lévő aktív BMU-k számát, de feltehetően az egyes BMU-kban lévő oszteoklasztok és oszteoblasztok számát is képesek szabályozni. A csont-turnover másrészt a differenciálódott csontsejtek szintjén szabályozható.

A csontsejtek rendszerének összetettsége megnehezíti e két szabályozási szint elkülönített vizsgálatát (Parfitt, A.M., ld. fentebb).

A csontsejtek regulátorai két kategóriába tartoznak. Az egyik kategóriába tartozók a sejtmembránokon lévő specifikus receptorokkal lépnek kölcsönhatásba. E regulatorok egyik csoportja a protein-kináz K rendszerre ható második hírvivőként (messenger) intracelluláris cAMP képződésével az adenilát-cikláz rendszeren keresztül fejti működését. A paratiroid hormon (PTH) és a kalcitonin (CT) tartozik ebbe az csoportba (Yamamoto, I., 3, 38, 19Θ5 ). Egy

másik csoport szintén membránreceptorral lép kölcsönhatásba, s egy foszfoinozitidekből származó molekula felszabadulását eredményezi, ami végül is az intracelluláris kalcium mennyiségének fokozásához és a C kináz aktiválásához vezet. Egy harmadik csoportban a regulátor egy sejtfelületi receptorral lép kölcsönhatásba, de a receptormolekula önmaga képez egy második jelet, amit a tirozin-kináz aktiválása követ. A növekedési faktorok közül sok ezen a módon működik (Canalis, Ε., Endocrinol., 118. 74, 1986; Centrella, M. és E. Canalis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 32, 7355, 1985; Canalis, Ε., Clin. Orthop., 183, 246, 1985; Chyun, Y.S. és L.G. Raisz, Prostaglandins, 27. 97, 1984; Canalis, E., J. Clin. Invest., £6, 709, 1980; Kiéin. D.C. és L.G. Raisz, Endocrinol, 26, 1436, 1970; Tashjian, A. H. Jr. és mtsi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 22, 4535, 1985; és Chen, T.L. és mtsi, J. Bioi. Chem., 257, 13563, 1982). A második kategóriába tartozó regulatorok nem lépnek kölcsönhatásba sejtmembrán-receptorral, de képesek áthatolni a sejtmembránon, hogy a citoszólban elhelyezkedő receptorhoz kötődjenek. A regulátort ezután a receptor átszállítja a sejtmag membránján, hogy kölcsönhatásba lépjen a DNS-sel. ami specifikus gének fokozott transzkripcióját eredményezi. Úgy tűnik, a szteroid hormonok, beleértve a D vitamint, ezen a módon működnek (Roodman, G.D., J. Boné Miner. Rés., Z, 475, 1992).

Sok hormon serkenti az oszteoklasztok proliferációját. Ezek közé tartozik az l,25(0H)2D, a ΡΊΉ és a prosztaglandinok. Az • · ···· ·· • · · · · oszteoklasztok PTH és 1.25(ΟΗ)ξΌ receptorait idáig nem azonosították. Ügy látszik, ez a két hormon tenyészetben nem hat az oszteoklasztokra. Amennyiben az oszteoklasztokat oszteoblaszt-szerű sejtvonalakkal együtt tenyésztjük, a PTH és az l,25(0H)zD serkenti az oszteoklasztok proliferációját. Az IL-1 és a TNF hasonlóan működik, mint a PTH és az l,25(0H)2D. Egyéb növekedési faktorok, mint az EGF. TFG és PDGF a PGE fokozott termelése útján serkentik az oszteoklasztokat. A kalcitonin és a kortikoszteroidok ismert oszteoklaszt-inhibitorok, csakúgy, mint pl. a difoszfonátok.

Jelenleg úgy tartják, hogy az interleukin 1 serkentheti a kollagén és a nem kollagén csont-proteinek és DNS

szintézisét.	A csont-proteinek szintézisére gyakorolt hatást
gátolja az	indometacin, ami azt sugallja, hogy az
IL-1 ezen	működését a PGE közvetíti. Ügy tűnik, az
indometacin	nem befolyásolja az IL-1 oszteoblaszt

DNS-szintézisre gyakorolt hatását. Tenyészeti vizsgálatokban a PTH vagy a D vitamin visszaszorítja a kollagén-szintézist. A PTH ezen in vitro hatása ellentétes az emberekben és kísérleti állatokban megfigyelt in vivő hatásával.

Patkányokban	és mellékpajzsmirigy-túlműködésben szenvedő
betegekben	kimutatták, hogy a PTH képes serkenteni a
mineralizált	(meszesedett) csontalapállomány lerakódását. A
PTH 1-34.	aminosavaiból álló fragmens csontritkulás
kezelésében	mutatott hatékonyságával végzett előzetes

klinikai kísérletek azt jelzik, hogy ez a PTH-fragmens képes fokozni a trabekuláris csont mennyiségét. E különbözőség oka nem teljesen világos.

A paratiroid hormon érett formájában 84 aminosavas peptid. Az eredetileg transzlálódő pre-pro-paratiroid hormon sokkal nagyobb, s ennek pre-szekvenciája jelzőszekvencia, amely lehasitódik a pepiidről, amikor az eléri a durva endoplazmatikus retikulumot. A Golgi-apparátusban a proszekvencia válik le, s az érett hormon szekréciós szemcsében veszi fel végleges alakját. Ogy tűnik, a szekréció sebességének szabályozását nem elsősorban az intracelluláris peptid termelődésének sebessége, hanem az intracelluláris lebomlás sebessége és a szekréció sebessége irányítja. Az érett peptid intracellulárisan mind az N-, mind a C-terminálison megrövidül. A csonkított peptid inaktív fragmensként szekretálódhat a keringésbe. Az érett peptid szekréciója az extracelluláris kalcium-koncentáció hirtelen növelésével serkenthető. A vérszérum növelt kalcium-koncentrációja másrészt, úgy tűnik, visszaszorítja a PTH szekrécióját. A keringésbe kerülve az érett peptid a májban gyorsan sok helyen hasítódik, többek között a 38. aminosav körüli részen. A vese, a bélrendszer és a csont vonatkozásában a hormon valamennyi ismert működését az N-terminális végen lévő kisebb fragmens hordozza, amely az első 34 aminosavat foglalja magában. Ez a fragmens teljes egészében kötődik a sejtmembrán receptorhoz, miáltal serkenti a cAMP termelődését. Az 1-38. aminosavakat magában foglaló fragmens szintje a vérszérumban normális esetben nem mérhető, ami azt jelzi, hogy a keringésben rövid élettartamú. A nagyobb inaktív C-terminális fragmens viszonylag hosszú felezési idővel rendelkezik, s a keringési rendszerben az immunreaktív PTH legnagyobb hányadát hordozza. A keringésben valamennyi fragmens időnként lebomlik a vesében és a májban. A vese keringési rendszert inaktív PTH-fragmensektől megszabadító egyik mechanizmusa a glomeruláris szűrletképzés (Segre, G.V., Secretion. metabolism and circulating heterogeneity of parathyroid hormoné, Primer in Metabolic Boné Diseases and Disorders of Mineral Metabolism, szerk.: Favus, M.J., Kelseyville, California, 1. kiadás, 1990).

A PTH részt vesz a kalcium-anyagcserében és a csontozat homeosztázisában. A PTH serkenti a kalcium vesében történő tubuláris reszorpcióját, s gátolja a foszfát- és bikarbonát-ionok proximális vesetubulusok általi reabszorpcióját. A PTH vesére gyakorolt másik hatása az 1,25(0H)sD-termelés serkentése. Ez a D vitamin anyagcsertermék az oszteoklasztok in vivő stimulátora, valamint a belső kalcium-abszorpció fokozó ágense. A PTH in csontfelszívását, miközben fel. A PTH továbbá az vivő serkenti az oszteklasztok a keringésbe kalcium szabadul oszteoblasztok proliferációját eredményezi (Selye Η., Endocrinol, Ifi, 547, 1993). Sok mellékpajzsmirigy-túlműködéses esetben a csontváz leépülése tapasztalható. Az elsődleges mellékpajzsmirigy-túlműködés néhány esetében a gerinc sűrűségének növekedéséről számoltak be (Aitken, R.E. és mtsi, Am. J. Med., 37. 813, 1964;

Connor, T.B. és mtsi, Trans Am. Clin. Climatol. Assoc., fifi,

185. 1973; Germánt. H.K. és mtsi. Am. J. Med.. 59, 104,

1975). hasonlóan a vese leromlásával komplikált másodlagos mellékpajzsmirigy-túlműködéshez. Kalu és Walker megfigyelték, hogy patkányokban a mellékpajzsmirigy-kivonat alacsony dózissal, hosszú időn keresztül végzett beadása a csontok elmeszesedéséhez (mineralizációjához) vezet (Kalu, D.N. és mtsi. Láncét., 1, 1363, 1970). Tam és munkatársai patkányokban tetraciklines jelöléssel azt vizsgálták, hogy az alacsony kalcium-koncentrációjú étrend hogyan hat a csontokban az ásványi anyagok lerakodási sebességére. Azt találták, hogy az ásványi anyagok lerakodási sebessége — a csontfelszívódás másodlagos mellékpajzsmirigy-túlműködés eredményeként bekövetkező növekedésének ellenére — fokozódott (Tam, C.S. és mtsi, Metabolism, 27, 143, 1978). Azt találták továbbá, hogy a csont és ásványi anyagok lerakodási sebessége 23, enyhe pajzsmirigy-túlműködésben szenvedő páciensben növekedett (Tam, C.S. és mtsi, Boné biopsy in the diagnosis of primary hyperparathyroidism, Endocrinology of Calcium Metabolism, szerk.: Copp, D.H. és Talmage, R.V., Excerpta Medica, Amsterdam, 427. oldal (kivonat), 1978). Négy páciensben a mellékpajzsmirigy-daganat sikeres eltávolítása után a lerakodási sebesség a kontroll páciensekben megfigyelt szintre csökkent. Kimutatták továbbá, hogy a PTH dózisfüggő módon serkenti az ásványi anyagok lerakodási sebességét. Az 1-34.

aminosavakból álló fragmens moláris alapon körülbelül összefüggést mutat azzal a és a teljes PTH hormon hatása azonosnak mutatkozik. Ez ténnyel, hogy a PTH molekula

1-34. aminosavakból álló fragmense hordozza az ép hormon biológiai aktivitását. Megfigyelték azt is, hogy a PTH beadásának a csontozat homeosztázisára gyakorolt hatása attól függ, hogy milyen módon történik a beadás. Azonos napi dózist figyelembe véve, ha a hormon napi dózisát egyetlen injekcióval adjuk be.

ugyanezt a csontmennyiség dózisfüggő módon a napi dózist bőr alá helyezett miniozmotikus pumpával folyamatos infúzióval adjuk be, csontleépülés gyakorlatilag nem befolyásolja a vérszérum kalcium-szintjét, míg az infúzió a vérszérum kalcium-koncentrációjának dózisfüggő növekedését okozza. Az e két módon beadott PTH a csont ásványi anyag lerakodási sebességére gyakorolt hatása (a tetraciklines Jelöléssel mérve) azonos. Nem világos, hogy mi a felelős ezért az eltérő hatásért (Tam, C.S. és mtsi,

Endocrinol, 110. 506, 1982).

A csontnövekedés és szabályozása ismeretében a csont tömegének csökkenésével Járó betegségek és az ezeket kísérő rendellenességek kezelésére az idevonatkozó szabadalmakban különböző megoldásokat sorolnak fel. Például, az 1992. szeptember 17-én közzétett PCT 92/15615 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben a vérszérum kalcium-szintjének növekedését okozó csontbetegségek kezelésében való alkalmazáshoz sertés hasnyálmirigyből származó, a vérszérum kalcium-szintjét csökkentő hatású proteint írnak le. Az 1992. szeptember 23. közzétett 504938 számú európai szabadalmi bejelentésben a cisztein-proteázt gátló di- vagy

tripeptidek csontbetegségekben való alkalmazását írják le.

Az 1992. szeptember 3-án nemzetközi szabadalmi bej -alakfejlődési proteint indukálásához alkalmazható augusztus 19-én közzétett bejelentésben oszteoblaszt-proliferációt közzétett PCT 92/14481 számú elentésben aktivint és csonttartalmazó, csontnövekedés készítményt írnak le. Az 1992. 499242 számú európai szabadalmi okozó hatásuk miatt a csont tömegének csökkenésével járó csontbetegségek kezelésében hasznosnak tartott sejtnövekedési faktor-készítmények alkalmazását írják le. Az 1992. június 17-én közzétett PCT 4039656 számú szabadalmi bejelentésben a humán PTH 1-37. aminosavakat magában foglaló N-terminális fragmensét tartalmazó hatóanyagot írnak le. Az 1991. szeptember 16-án közzétett 451867 számú európai szabadalmi bejelentésben pajzsmirigyhormon peptid-antagonistát írnak le kalciummal és foszforsavval kapcsolatos anyagcserezavar, mint pl. a csontritkulás (osteoporosis) kezeléséhez.

A PTH vérszérumban megfigyelhető viszonylag rövid felezési ideje és az időszakos PTH injektálás viszonylag hosszú hatása arra a következtetésre vezetett, hogy a PTH a keringési rendszerben valamilyen módon egy második faktor indukálását eredményezi. Ennek megfelelően, patkányok és emberek vérszérumában egy ilyen második faktor jelenlétét vizsgáltuk.

Lehetségesnek találtuk, hogy patkány vérszérumból egy polipeptidet izoláljunk, amely a mellékpajzsmirigy műtéti • ·« ···· «· ♦· ··· · · · ·· • · · · ····· • ·« w · · · «·· ·« · · · · · eltávolítása miat PTH termelésére nem képes patkányoknak beadva fokozza a megfigyelt csont ásványi anyag lerakodási sebességet.

sebesség a

Megfigyeltük továbbá, hogy a csontlerakódási beadott izolált anyag dózisának megfelelően fokozódik.

legalábbis az általunk tanulmányozott dózistartományt és időtartamot tekintve. Az anyagot két alakban izoláltuk; egy nagyobb és egy kisebb polipeptid alakjában, mely nagyobb polipeptid molekulatömege a kisebb molekulatömegének kb. kétszerese volt. Meghatároztuk a kisebb polipeptid szekvenciád ának első 11 aminosavát: Gly

Pro Gly Gly Alá

Gly Glu Thr Lys

Pro Ile (1.

azonosítási számú szekvencia). A nagyobb polipeptid első hét aminosavának sorrendje a következő:

Gly Pro Gly

Gly Alá Gly

Glu (2. azonosítási számú szekv.). E két N-terminális szekvencia hasonlósága arra a feltevésre vezetett, hogy a nagyobb polipeptid a kisebb dimere lehet.

A patkány peptid aminosav-szekvenciája alapján nukleinsav próbát szintetizáltunk, és ezt humán csontlerakódási polipeptidet kódoló humán nukleinsav izolálása érdekében humán magzati máj cDNS-könyvtár screeneléséhez használtuk. Ezek alapján kémiai úton egy polipeptidet szintetizáltunk, melynek aminosav-szekvenciája a következő: Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His, Thr Alá Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Alá Alá Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gin Asn Gin Pro (11. sz. szekv.). Lehetségesnek tartjuk, hogy az aktív polipeptid a fenti szekvencia dimere, amely a bemutatott aminosav-szekvenciával rendelkező két polipeptid közötti diszulfid-híddal összekapcsolódva alakul ki.

Megfigyeltük, hogy patkányokban a csontlerakodási sebesség a kémiai úton szintetizált vegyület beadásának hatására dózis-függő módon növekszik.

Az ábrák rövid leírása

Az 1. ábrán egy 48 órás időközzel két intravénás inekcióval kezelt nyúl csonképződési helyén az oxitetraciklin sávok nyomonkövetését mutatjuk be. A függőleges nyilak az injekció beadási pontjait jelölik. A diagramon D jelöli e két pont közötti távolságot. (Optikai nagyítás: 250-szeres; mechanikus nagyítás: 55,6-szeres.) Ez a távolság csúcstól csúcsig is kiszámítható.

A 2. ábrán az MPV-CD készülék csont ásványi anyag lerakodási sebességének méréséhez készített kalibrációs egyenesét mutatjuk be. A készülékben egy mikroszkópos rácsot pásztáztunk végig. A megfigyelt mért távolságokat a rács távolságaival szemben grafikusan ábrázoltuk. A hibát mutató vonalak ± 1 standard eltérést (SD) jelölnek.

A 3. ábrán a Sephadex G50 oszlop kalibrációs görbéjét mutatjuk be. Az oszlop belső átmérője 2,5 cm, magassága 90 cm. A mozgó fázis 2,5 ml/perc átfolyási sebességgel 20 mM Tris/HCl (pH - 7,2) és 50 mM NaCl-oldat volt. Molekulatömeg-standardként humán IgG-t (M - 110 kD), • ·· ···· ·« ·· ··· · 9 9 9 9 • · · · ·· · · · • · · · · · • ·· · · · 9 9 9 · szarvasmarha szérum-albumint (M - 66 kD). ovalbumint (M = 45 kD) és citokróm C-t (M - 12.4 kD) alkalmaztunk. A kalibráció során 10 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. Az ábrán az egyes frakciók 280 nm-nél mért abszorpcióját (optikai denzitás, 0D) mutatjuk be.

A 4. ábrán a vérszérum bizonyos komponenseinek csontképződésre gyakorolt hatását mutatjuk be. A csontképződés sebességét tetraciklines jelöléssel mértük, melynek részleteit a leírásban részletesen ismertetjük. A megfelelő kalciumtartalmú (0.5 % kalcium), illetve a kalcium-hiányos (0,1 % kalcium) étrenden tartott patkányokból származó vérszérumot gélpermeáció alapján meghatározott molekulaméret szerint frakcionáltuk. Az alábbi molekulatömeg-tartományokba eső frakciókat teszteltük: 66-45 kD (a kontroll csoportban a patkányok száma: N=3, a teszt csoportban N=4), 45-12,4 kD (kontroll csoportban N=4; teszt csoportban N =4), 12,4 kD alatt (mindkét csoportban N=4). Két patkányból származó szérum frakcióit egy 250-300 g-os patkányban teszteltük (melynek mellékpajzsmirigyét előzetesen eltávolítottuk). Három kontroll és három teszt csoportot alakítottunk ki. A 12,4 kD alatti molekulatömegű szérum-frakcióval kezelt teszt csoportba tartozó patkányok nagyobb csont ásványi anyag lerakodási sebességet mutattak, mint a megfelelő kontroll csoport (p<0,05). A hibát mutató vonalak + 1 standard hibát (SE) jelölnek.

Az 5-9. ábrákon kalcium-hiányos étrenden tartott • ·

• · · « ·· • ·· · • · ·· • ·· « • ·· patkányokból származó, 12,4 kD alatti molekulatömegű frakciók C18 reverz fázisú HPLC-vel végzett kromatografálásának eredményeit mutatjuk be. Néhány futtatásnál az 55. perc előtt eluálódó csúcs található (50 % feletti CHsC-N-koncent rációnál), melyet C-vel jelöltünk. Azokban a patkányokban tesztelve, melyek mellékpajzsmirigyét eltávolítottuk, ez a csúcs a többi csúcs némelyikéhez (C, B, D, E) képest jelentős serkentő hatást mutatott, A 9. ábrán látható kontroll futtatás normális patkányokból származó szérummal végeztük. A 6. és 8. ábrán a felső görbék 214 nm-nél mért értékek alapján készültek.

A 10. ábrán a C18 oszlopról eluált anyagok biológiai aktivitását mutatjuk be. Az csúcsoknak megfelelő összegyűjtött proteineket liofilizáltuk és 2,5 ml pufferben újra feloldottuk. A kapott oldat 0,4 ml-ét olyan állatba injektáltuk, melynek mellékpajzsmirigyét eltávolítottuk. Egy csúcshoz két állatot alkalmaztunk. Az x jelek az egyes teszt állatoknak megfelelő értékeket jelölik, a hisztogram pedig az átlagot mutatja. A tesztelt állatok kis száma miatt statisztikai analízist nem végeztünk.

A 11. ábrán a C csúcsnak megfelelő anyag csontképződésre gyakorolt dózisfüggő hatását mutatjuk be. A polipeptid-koncentrációkat Belford-reagenssel határoztuk meg. Az első, három patkányból álló csoportban (középső oszlop) patkányonként 6 ^ug-ot, a második, három patkányból álló csoportban (utolsó oszlop) pedig patkányonként 12 ^g-ot

4« «··· · ♦ ··« · · · · · • · · · ·· · • « « « « · · • ·· ·· « · · · ·

- 16 alkalmaztunk. A három patkányból álló kontroll csoportot (első oszlop) a hordozó pufferrel kezeltük. Az alkalmazott állatok mellékpajzsmirigyét előzetesen eltávolítottuk. A kísérlet során dózisfüggő reakciót figyeltünk meg (P<0,05). A hibát mutató vonalak ± 1 standard hibát (SE) jelölnek.

A 12. ábrán kalcium-hiányos étrenden tartott patkány 30 kD és 3 kD közötti molekulatömeg-tartományba eső szérumának akrilamid gélelektroforézisének eredményeit mutatjuk be. A kalcium-hiányos szérumot 30 kD és 3 kD molekulatömegig átengedő (MWCO) membránokon ultrafiltráltuk, hogy 30 kD és 3 kD közötti molekulatömegű frakciót nyerjünk. A Belford-reagenssel meghatározott frakció 100 ug-ját 15 % foszfátot tartalmazó akril-amid gélre vittük. A gélt 100 mM Tris-foszfáttal (pH - 6,9) 0,1 %-os SDS-sel öntöttük ki. A mintát 60 ’C-on 30 percig 100 mM Tris-foszfáttal (pH - 6,9) és 0,1 %-os SDS-sel redukálószer nélkül kezeltük. A mintát ezután felvittük, majd állandó, 100 V-os feszültséggel (kb 8 V/cm) futtattuk és cromassie-kékkel festettük. öt kis molekulatömegü sávot azonosítottunk, melyeket TA-val, TBvel, TE-vel, TF-fel és TG-vel jelöltünk.

A 13. ábrán az akril-amid gélelektroforézissel kapott sávokból eluált anyagok biológiai aktivitását mutatjuk be. A gélen lévő sávokat kivágtuk, majd 20 mM Tris-Cl puffer (pH 7,2), 50 mM NaCl, 0,1 % Triton X, 1 mM DTT és 1 mM PMST elegyében 48 órán keresztül áztattuk. Az eluált anyagokat 20 mM Tris-HCl puffer (pH = 7,2), 50 mM NaCl, 1 mM PMST és 1 mM » *

- 17 DTT elegyével szemben 3.5 kD molekulatömeg átengedés! határral rendelkező MWCO membránnal alaposan dializáltuk, majd 500 ml-re koncentráltuk. A proteintartalmat Belford-reagenssel határoztuk meg, s az anyag 24 pg-ját az előzőek szerint olyan patkányokban teszteltük, melyek mellékpajzsmirigyét előzetesen eltávolítottuk. Kontroll csoportként négy állatot használtunk, melyeket vivőanyag pufferrel kezeltünk. Csak a ΤΑ (N = 3), TB (N = 3) és TE (N=4) sáv tartalmazott elég anyagot a teszteléshez. A TB és TE jelentős serkentő hatást mutatott a csontképződésre (P<0,025), míg a TA nem mutatott ilyen hatást. Az hibát mutató vonalak ± 1 standard eltérést (SD) jelölnek.

A 14. ábrán az E. coli-loan. expresszált humán polipeptid C3 oszlopon HPLC-vel készített kromatogramja látható. Az E. coli tápközeget 12000 x g-vel kétszer 15 percig centrifugáltuk, YMS membránnal (3 kD MWCO) 10-szeresre koncentráltuk. A közeg sókoncentrációját nátrium-foszfáttal (pH = 7,2) végzett bekoncentrálás előtt 100 mM-ra állítottuk be. A humán szérumból izolált polipeptidhez hasonló körülmények között, azaz 62-63 % CHsCN-koncentrációnál, jó felbontású csúcs eluálódott.

A 15. ábrán az E. coli-'ban expresszált humán polipeptid csontképződésre gyakorolt hatását mutatjuk be patkányokban. A kontroll patkányokat (N = 6) a vivőanyag pufferrel oltottuk. A tesztelt patkányok első csoportját (N = 4) az expresszált polipeptid 0,7 OD (280 nm) egységével, a második ··· · ·« * · · · « · · · · 4 • « » « · « · • · · 44 « · · » · csoportot (N = 6) a polipeptid 0,3 OD egységével oltottuk. Az expresszált termék a kontroll csoporthoz viszonyítva biológiai aktivitást mutatott (P<0,05). A hibát mutató vonalak + 1 standard eltérést (SD) jelölnek.

A 16. ábrán a kémiai úton szintetizált humán polipeptid (11. sz. szekv.) tricin-SDS elektroforézis géljét mutatjuk be.

A 17. ábrán patkány jobb alsó combcsontjának (femur) hosszanti metszetét mutatjuk be. Az alsó epifízist az A nyíllal jelöljük. A vonalkázott területek a csontból vett alsó metafízis metszetet (B) és a csont középső metszetét (C) jelzik.

A 18. ábrán a különböző módon kezelt patkányokban megfigyelt csontlerakodási sebességet Qan/nap) mutatjuk be. A vizsgálati állatokat a kémiai úton szintetizált humán polipeptid 25 /Jg-jával oltottuk (N = 9, első oszlop). Az A kontroll csoportot (N = 9, második oszlop) 0,1 %-os ecetsavban készített 1 ml 0,1 %-os BSA-oldattal oltottuk. A B kontroll csoportot (N = 7, harmadik oszlop) 0,1 %-os ecetsavban készített 1 ml 0,1 %-os BSA-oldattal oltottuk, melyet a BSA denaturálása érdekében előzetesen 10 percig forraltunk.

A 19. ábrán patkány jobb felső combcsontjának (femur) hosszmetszeti képét mutatjuk be. A vonalkázott terület a csontlerakódás méréséhez használt alsó epifízis (A)

Λ ·· *<·« «·4« ··· · 9 ·· 9 • « · · ···4· « · * 4 · *· • ♦4 ·· « ««··

- 19 metszetet .jelöli. Az epifízis porckorongot a B nyíllal jelöljük.

A 20. ábrán patkány jobb alsó combcsontjának keresztmetszeti képét mutatjuk be. A csontlerakodási méréseket a combcsont alsó epifízisének csontbelhártya felülete által közrezárt trabekuláris csontban harminc csontképződési helyen végeztük. A bemutatott metszetet szisztematikusan végigvizsgáltuk; az átvizsgált metszeteket szaggatott vonallal jelöljük. A nyilak pedig a mikroszkóp tárgyasztal mozgási irányát mutatják.

A 21. ábrán grafikusan ábrázoljuk patkányokban a csont ásványi anyag lerakodási sebességének (zm/nap) dózisfüggőségét a kémiai úton szintetizált humán polipeptid (11. sz. szekv.) mennyiségének vonatkozásában. A grafikonon a lerakodási sebességet a beadott polipeptid tömegének (um) függvényében mutatjuk be (minden csoportban N = 4).

A 22. ábrán grafikusan mutatjuk be patkányokban a csont ásványi anyag lerakodási sebességének (százalékos változás) dózisfüggőségét a kémiai úton szintetizált humán polipeptid (11. sz. szekv.) mennyiségének vonatkozásában. A grafikonon a lerakodási sebességet a beadott polipeptid tömegének (;m) függvényében mutatjuk be.

Mellékpajzsmirigy-túlműködés indukálása patkányokban • ·· ·*«« ·♦ Í9 *«· · * · · · « · · « ·· ·*· • · * · · · · ♦ ♦· ·« 9 «« ··

A mellékpajzsmirigy-túlműködés indukálásához alkalmazott kalcium-hiányos táplálékot (katalógusszám: 113034, tételszám: 0186-3) a Dyets-től (2508 Easton Avenue, Betlehem, Pennsylvania 18017, Amerikai Egyesült Államok) vásároltuk. Ez a táplálék 0,1 % kalciumot és 0,05 % foszfort tartalmaz. A kontroll állatokhoz alkalmazott, elégséges mennyiségű kalciumot tartalmazó táplálék (katalógusszám: 113035, tételszám: 01864) a gyártó (Dyets) meghatározása szerint 0,5 % kalciumot és 0,05 % foszfort tartalmaz. Mindkét táplálék 1 NE/g koncentrációban tartalmaz D vitamint. A táplálékokat formázólapon tablettákká formáztuk, s valamennyi állatnak ásványi anyagok nélküli vízzel együtt napi 10 tablettát adtunk. A teszt állatokat két hétig ezen az étrenden tartottuk.

Kísérleti patkányok

Standard teszt állatként a Charles River Labotatory-ból származó hím Sprague-Dawley patkányokat használtuk, melyek testtömege a beszerzéskor 200-250 g volt. Az állatokat egyforma ketrecekben párosával tartottuk.

**<«* *· ·* • · · · »«·» · · « ·* »·· • · · ♦ · · · ··· ·· · ·« ·A csont tetraciklines__jelölése a__oaímt__ásványi__anyag lerakodási__sebességének meghatározásához patkányokban (Tam,

C.S. és W. Andersen. Calcif. Tiss. Rés.. 30, 121._198.Q)

Korábban bebizonyítottuk, hogy a 24 mg/testtömeg-kilogramm dózisban intravénásán patkányba injektált tetraciklin a keringésből fél órán belül kitisztul. Szintén kimutattuk, hogy a 6-24 mg/testtömeg-kilogramm időszakos jelölő dózisok a csontlerakódás hasonló mért sebességét eredményezik. Az időszakosan adott tetraciklin, vagyis az említett dózistartományban alkalmazott impulzus-jelölés a csont ásványi anyag lerakodási sebességének vizsgálatához való jelölésének kielégítő módjának tűnik.

Kimutattuk azonban azt is, hogy a csontképződés helyén (BMU) a mineralizált csontalapállomány lerakódása megszakítható. Az ilyen megszakítás legnagyobb valószínűséggel akkor következik be, amikor a tetraciklin két dózisa kötött hét napnál hosszab idő telik el. A lerakódás ilyen szünetelése feltehetően annak köszönhető, hogy ugyanazon alapállomány felületén több oszteoblaszt csoport aktiválódik. Az oszteoblasztok ilyen aktiválása lehet véletlenszerű vagy nem véletlenszerű. E jelenség csont ásványi anyag lerakodási sebességének mérését befolyásoló hatásának elkerülése érdekében a jelöléseket 48 órás időközökkel végeztük. A kísérletekhez kizárólag tetraciklin-hidrokloridot alkalmaztunk, melynek felezési ideje a vérszérumban (gyógyászati dózis alkalmazása esetén) nyolc óra.

- 22 A tetraciklint hosszúhullámú UV fénnyel (azaz a kék tartományhoz közeli hullámhosszú fénnyel) gerjesztettük, és élénksárga fluoreszcencia emittálódott. A tetraciklin akkor jelöl egy csontfelszínt, amikor egy újonnan képződött kollagén alapállományba kalcium kezd beépülni, majd amikor a felületből metszetet készítünk, a tetraciklin sárga fluoreszcens sávként jelenik meg. A tetraciklin következőként beadott dózisa második sávként az első sávhoz képest a felszín felé helyezkedik el. A két sáv közötti távolság a két dózis beadása között képződött csontalapállomány vastagságát mutatja. A csontlerakódás sebességét úgy számíthatjuk ki, hogy a sávok közötti távolságot elosztjuk a két dózis beadása között eltelt idővel. A metszetek készítésekor a növekedő csont felületére nem merőleges vágással hibákat okozhatunk. E hiba csökkentése érdekében csak azokat a helyeket használjuk fel az analízishez, melyeknél a két sáv egymástól elhatárolható és egymással párhuzamos volt. A lerakodási sebesség számtani közepéhez közeli eredmények érdekében tíz véletlenszerűen kiválasztott, a fenti követelményeknek megfelelő helyen végeztünk méréseket.

Mérési rendszerként Leitz MPV-CD pásztázófényes mikroszkóp fotométert alkalmaztunk, melyhez UV-forrásként 100 W-os higanygőzlámpát használtunk. A metszeteket általában 16-szoros nagyítású objektívvei, mozgó látótér-kerettel vizsgáltuk, a fluoreszcens sáv intenzitását felerősítettük és regisztráltuk. A fényjelet digitális kimenő információvá alakítottuk. s regisztráltuk a tetraciklin intenzitás! profilját. Az intenzitási csúcsok közötti távolságot két tetraciklin sáv közötti távolságként kaptuk (ld. 1. ábra). A készülék mechanikus hibája 5 %-nál kisebb. A mért távolságot időnként mikroszkópos ráccsal kalibráltuk, s jó egyezést tapasztaltunk (ld. 2. ábra).

Δ__csont__ásványi__anyag__lerakodási sebességének patkányok végzett vizsgálatához alkalmazott mérési helyek

Ha másként nem jelöljük, mérési helyként rendszerint a jobb combcsont alsó metafízisét választottuk. Ez a hely kb. 1 mm-rel a combcsont alsó növekedési lemeze felett található, s tengelyirányban kb. 5 mm-ig terjed.

A patkánvcsont szövettani előkészítése

Az állat leölése után a csontmintát kimetszettük, majd azonnal 10 %-os vizes formaldehid-oldatban fixáltuk (melyet 50 mM foszfát-pufferrel pH - 7,2-re puftereltünk. Az alacsony pH a tetraciklin csontalapállományból történő kiázását okozná. 24 órás fixálás után a csontmintát az alábbiak szerint kezeltük.

80 %-os etanol	24 óra
95 %-os etanol	24 óra
Abszolút etanol	24 óra
Abszolút etanol	24 óra

Aceton óra

Spurr-közeg/aceton 1:1 óra

Spurr-közeg/aceton 1:4 óra

Spurr-közeg óra

A mintát ezután frissen cserélt Spurr-féle közegbe merítettük és 45 °C-on 24 órán keresztül, majd 80 °C-on újabb 24 órán keresztül hőkezeltük.

A hőkezelt tömbből gyémántélű pengével 400 /.an vastagságú metszeteket készítettünk. A viszonylag vastag metszeteket előzetesen szilícium-karbid porral érdesített két csiszoló-üveglemez között kb. 10 um vastagságúra csiszoltuk, melynek során kenőanyagként vizet használtunk. A vékony metszeteket megszáritottuk, és festés nélkül Permount tárgylemezre (Fischer) rögzítettük.

Δ____patkányok____melLékBajzsmir jgyének____ejtávojltága____a tesatanvagok_____caontlexakódásra_____gyakorolt____hatásának vizsgálatához

200-250 hím

Sprague-Dawley patkányok mellékpajzsmirigyét hagyományos nembutal altalás közben eltávolítottuk.

mellékpajzsmirigyeket ismételt fagyasztással és felolvasztással pusztítottuk el. A műtét után egy héttel az állatokat ismét elaltattuk, és farki vénájukból 0,5 ml vért vettünk. Az állatot ezután egy éjszakán át éheztettük. A következő reggelen az állatot ismét elaltattuk, és farki vénájából 0,5 ml vért vettünk. A koplalás előtt és után vett szérum kalcium-koncentrációját megmértük. A szérum-kalcium koplaláskor 1,8 mM vagy kisebb koncentrációra való csökkenését tekintettük a sikeres műtét feltételének. Ezek után a tesztanyagot a farki vénába injektáltuk, majd a tetraciklin első dózisát is beadtuk (intramuszkulárisan is adhtató) . A második tetraciklines jelölést 48 órával később végeztük, majd 24 óra múltán az állatot szén-dioxidos narkózissal leöltük. A csont ásványi anyag lerakodási sebesség méréséhez csontmintát vettünk.

A patkány szérum-proteinek és -peptidek kezdeti vizsgálata gélpermeációs analízissel

A vérszérumban lévő proteinek és peptidek molekulatömeg-tartománya széles, és a vérben nagy számú protein és peptid kering. A gélpermeációt (gélen való áthatolóképesség) a szérum protein-komponenseinek bizonyos molekulaméret-tartományba történő besorlolás alapj án végzett osztályozásához, és ezen osztályok .mesze sédét t (mineralizált) csontalapállomány lerakódására gyakorolt biológiai hatásának teszteléséhez alkalmaztuk.

Anyagok és módszerek

2,5 cm belső átmérőjű és 90 cm hosszúságú

Pharmacia üvegoszlopot használtunk.

Töltetként Sephadex

G50 gélt alkalmaztunk, amely közepesen finom szemcsézetü. A szárított

Sephadex alapanyagot (25 g) 1000 ml-es Erlenmeyer-lombikba • · töltöttük, és felduzzasztása érdekében 0,02 % NaN3-t tartalmazó 800 ml ionmentesített vizet adtunk hozzá. A lombikot az anyag alapos felduzzadásáig szobahőmérsékleten egy éjszakára félretettük.

A Sephadex gél felduzzadását követően az oszlop felső végéhez egy tartályt csatlakoztattunk, s a duzzadt gélt kb. három óra hosszat az oszlopba leülepedni. A tartályt eltávolítottuk, az oszlopot beállítottuk, majd 20 mM TrisCl-ot (pH - 7,2) és 50 mM NaCl-ot tartalmazó pufferrel ekvilibráltuk. A puffért perisztaltikus pumpával (Pharmacia)

2,5 ml/perc sebességgel adagoltuk. Az ekvilibrálás alatt a gél tovább ülepedett az oszlopban, ezért időnként fel kellett tölteni géllel az oszlopot, míg az teljesen meg nem telt. Az oszlopot ezután a fentivel azonos pufferrel 4 ’C-on további három órán keresztül ekvilibráltuk.

A Sephadex G 50 oszlopot az alábbi molekulatömeg-markerekkel kalibráltuk:

Humán IgG	M = 110000	6,00 mg
BSA	M = 66000	10,00 mg
Ovalbumin	M = 45000	8,25 mg
Citokróm C	M = 12400	4,00 mg

A markereket a Sigma-tól kaptuk, s a feltöltéshez 2 ml ionmentesitett vízben oldottuk. A feltöltést és a futtatást

2,5 ml/perc átfolyási sebességgel a kalibráló pufferrel végeztük, és 50 tíz ml-es frakciót gyűjtöttünk. Az egyes frakciók UV abszorpcióját

280 nm-nél Varian UV/VIS spektrofotométerrel mértük.

Negyven hím

Sprague-Dawley patkány használtunk, melyek testtömege a laboratóriumba való érkezéskor 173 g és 212 g között volt.

A patkányok közül négy a kísérlet közben megbetegedett diagnózis szerin légzőszervi fertőzés miatt), s ezeket kihagytuk a kísérletből. A megmaradt 36 állatot tagú teszt csoportra és 18 tagú kontroll csoportra fentebb állatokat osztottuk. A teszt csoportba tartozó patkányokat a leírt kalciumhiányos étrenden, míg a kontroll kielégítő mennyiségű kalciumot tartalmazó étrenden tartottuk. Valamennyi patkányt leöltük, vérszérumukat összegyűjtöttük és egyesítettük. Az összevont szérum kalcium- és foszfor-koncentrációját a Worthington-tól vásárolt készlet alkalmazásával kolorimetriás eljárással mértük.

Patkány vérszérum előkészítése a gélpermeáclós vizsgálathoz

Az egyes patkányokból leölés után vett vérmintákat Beckman J6B centrifugában (JS 4.2 forgórész alkalmazásával) 2000-es percenkénti fordulattal 15 percig centrifugáltuk. Az azonos csoportba tartozó patkányokból származó vérszérumokat egyesítettük. A szérumhoz PMSF-et (Sigma) és ditio-treitolt (Biorad) adtunk (mindkettőt 1 mM koncentrációban). A vérszérumot -85 °C-on fagyasztva tároltuk. A gélpermeáclós vizsgálathoz a fagyasztott vérszérumot felolvasztottuk és

Beckman J2-21 centrifugában (JA 17-es forgórész alkalmazásával) 30 percig 12000 x g-vel centrifugáltuk, hogy megtisztítsuk a mintát a szemcsés anyagoktól és lipidektől.

A kezelt -patkány vér szérum gélpermeációs kromatográfiája

A vérszérum 10 ml-ét felvittük az oszlopra, és az ekvilibráláshoz használttal megegyező pufferrel kromatográfáltuk. A szérum feltöltése előtt az oszlopot három órán keresztül a pufferrel ekvilibráltuk, majd a mintát a 10 ml-es frakciókként összegyűjtött eluenssel 2,5 ml/perc áramlási sebességgel futtattuk.

Az összegyűjtött frakciókat molekulatömeg szerint egyesítettük, majd 2,5 cm széles, 3500 D molekulatömegig áteresztő (MWCO

3500) Spectrophor dializáló zsák alkalmazásával 1 mM PMSF-et és 1 mM DTT-t tartalmazó 1000 ml mM Tris-Cl (pH = 7,2) pufferben dializáltuk. A dialízist ’C-on 24 óra hosszat végeztük, melynek során a dializáló puffért háromszor cseréltük. A dializált mintákat Virtus liofilizáló készülékben liofilizáltuk, majd -20 ’C-on tároltuk.

A vérszérum-frakciók biológiai aktivitásának tesztelése

A molekulatömeg szerint szétválasztott frakciók aktivitásának összehasonlítása bizonyos nehézségekbe ütközik, mivel a frakciókban lévő frakciók változó • ·

- 29 koncentrációban vannak .jelen. Egy teszt állatnak önkényesen két patkányból származó, megfelelő frakciókat adtunk be. A dózist 20 mM Tris-Cl puffer (pH - 7,2) és 50 mM NaCl 0,5 ml elegyében oldottuk, és intramuszkulárisan egy PTX teszt állatba injektáltuk. Közvetlenül ezután, a fentebb leírt módon, intravénásán tetraciklin-hidrokloridot adtunk be. 24 óra elteltével a tetraciklin újabb intravénás dózisát adtuk be, majd újabb 24 óra elteltével a patkányt leöltük és a csont ásványi anyag lerakodási sebességét a fentebb leírtak szerint mértük.

A patkány polipeptidek__izolálásával__kapott__kiindulási eredmények

A molekulatömeg-marker elúciós profilt a 3. ábrán és az I. táblázatban mutatjuk be.

I. TÁBLÁZAT

A gélpermeációs kromatográfiával kapott molekulatömeg-marker profil

Molekulatömeg

Elúciós térfogat > 110 000 100 ml

110	000 -	66	000	100	ml
66	000 -	45	000	70	ml
45	000 -	12	400	40	ml

< 12 000

100 ml

A kalciumhiányos étrenden és a kielégítő kalciumtartalmú étrenden tartott patkányokból származó vérszérumok kalciumés foszfor-koncentrációja között nincs nyilvánvaló különbség, bár az előbbiekből származó szérum kalcium-koncentrációja alacsonyabb (2,55 mM, szemben az elegendő kalciumot tartalmazó étrenden tartott patkányok szérumának 2,85 mM kalcium-koncentrációjával). Az előbbi esetében a foszfor-koncentráció 0,33 mM, az utóbbi esetében 0,43 mM. Ezek a különbségek a kalciumhiányos étrenden tartott patkányban kialakuló másodlagos kiegyenlítő hatású mellékpajzsmirigy-túlműködés eredményei lehetnek, a kalciumhiányos étrenden tartott patkányokkal végzett PTH vizsgálat azonban ezt nem igazolta.

A kontroll és teszt állatokból származó szérum-frakciókat az

I. táblázatban bemutatott molekulatömeg-tartományok szerint összevontuk.

A 40 patkány közül, melyek mellékpajzsmirigyét eltávolítottuk, csak 25 élte túl a műtétet. E 25 patkány szérum-kalcium koncentrációja nem koplalási körülmények között 2,57 + 0,05 (SD) mM, koplaláskor 1,70 ± 0,04 (SD) mM volt. Ezekből az eredményekből arra következtettünk, hogy e 25 állat esetében az operáció sikeres volt. A 110000 D-nál nagyobb és a 110000 D és 66000 D közötti molekulatömeggel rendelkező frakciókat nem teszteltük, mivel az ezekben jelenlévő proteinmennyiség túl nagy volt ahhoz, hogy az állat megbetegedése nélkül egy dózisban lehessen beadni.

Következésképpen. az elegendő mennyiségű kalciumot tartalmazó étrenden tartott állatokból és a kalciumhiányos étrenden tartott állatokból származó vérszérumokból csak három frakciót teszteltünk. Mindegyik frakció esetében négy állatot alkalmaztunk. Az egyik patkány, amelyet az elegendő mennyiségű kalciumot tartalmazó étrenden tartott állatokból származó szérum 66000

D és 45000 D közötti frakciójával kezeltünk, az altatás a tetraciklin intravénás beadásakor elpusztult.

Az eredményeket a 4. ábrán mutatjuk be.

A 14500 D-nál kisebb molekulatömegű, elégséges kalciumtartalmű frakcióval kezelt patkány és a kalciumhiányos szérűmből származó megfelelő frakcióval kezelt patkányok esetében a csont ásványi anyag lerakodási sebessége kötött statisztikailag szignifikáns különbséget találtunk (P < 0,05).

Ezek a bevezető eredmények azt jelzik, hogy a 14500 D-nál kisebb molekulatömegű komponenseket tartalmazó szérum-frakció serkentheti a meszesedett (mineralizált) csontalapállomány lerakodási sebességét.

• *·

- 32 Kalciumhiányos patkány vérszérumból nyert kis molekulatömegú szérumkomponensekkel végzett kísérletek

Anyagok és módszerek

A kísérletekhez ötven, 200-250 g testtömegű hím Sprague-Dawley patkányt használtunk. Huszonöt patkányt kalciumhiányos étrenden, másik huszonötöt elégséges mennyiségű kalciumot tartalmazó étrenden tartottunk. A patkányokat a speciális táplálékkal való kéthetes etetés után szén-dioxidos narkózissal leöltük. Közvetlenül leölésük után szívpunkcióval vákuumos szérumcsöbe vért vettünk. A vérszérumot 4 °C-on Beckman J6B centrifugával 20 percig 2000-es percenkénti fordulatszámmal végzett centrifugálással gyűjtöttük össze. A szérum-mintákat teszt szérumként (kalciumhiányos) és kontroll szérumként (elgséges kalciumkoncentráció) vontuk össze, és a kalcium- és foszfor-koncentráció értékeléséhez 100 μΐ-t szérumot használtunk. Ehhez 1 mM koncentrációban PMSF-et (fenil-metil-szulfonil-fluorid), illetve DTT-t (ditio-treitol) adtunk. A vérszérumot ezután -85 °C-on lefagyasztottuk.

Patkány vérszérum frakcionálása gélpermeációs kromatográfia, majd reverz fázisú HPLC alkalmazásával

A kezdeti gélpermeációs kromatográfiát Sephadex G 50 oszlop alkalmazásával a fentebb leírtak szerint végeztük. A 14500 D alatti molekulatömegű frakciót a fentiek szerint •« «··· ·· ·· * · · · ♦ · • · · ··««« összegyűjtöttük, dializáltuk és liofilizáltuk

A liofilizált anyagot 5 ml pufferben (25 mM Tris-Cl [pH = 7,2], 150 mM NaCl, 1 mM PMSF. 1 mM DTT) feloldottuk. Néhány anyag nem oldódott fel, ezért ezeket Beckman J2-21 centrifugával (JA 17-es forgórészt alkalmazva) 12000 x g-vel végzett centrifugálással leülepítettük, s az üledéket kidobtuk. A feloldott anyag 800 ul-ét használtuk a protein-meghatározáshoz.

A feltöltés előtt a fenti puffer 1 ml-ében 0,5 mg anyagot Hewlett Packer mintaszűrőn átszűrtük. A vizsgálathoz preparatív C18 oszlopot (Beckman; 2,12 cm x 150 cm) használtunk. Vivőanyag-rendszerként Beckman Gradient Solvent vivőanyag-rendszert (126-os modell), a kimutatáshoz pedig Beckman UV-detektort (126-os modell) használtunk. Az adatokat Beckman System Gold software alkalmazásával analizáltuk. A mintát manuálisan Valco befecskendezővei fecskendeztük be, s 2 ml/perc áramlási sebességgel eluáltuk.

Az alábbi gradienseket alkalmaztuk:

A oldószer: 0,1 % trifluor-ecetsavat tartalmazó víz

B oldószer: 0,1 % trifluor-ecetsavat tartalmazó vízben % acetonitril

Eluálási program:

0-5. perc

5-75. perc

75-80. perc

100 1	Ő A	0 ?	á B
40 ?	í A	60 ?	ί B
100 5	S A	0 ?	ί B

Program vége

80. perc

- 34 Félpercenként Gilson Model 202 frakciógyűjtőben frakciókat gyűjtöttünk, s a négy futtatás megfelelő csúcsait egyesítettük és liofilizáltuk.

Az összevont teszt szérum kalcium-koncentrációja 2,50 mM-nak, az összevont kontroll szérum kalcium-koncentrációja pedig 2,87 mM-nak bizonyult. A teszt szérum foszfor-koncentrációja 0,35 mM, a kontroll szérumé 0,45 mM volt. Az újra feloldott liofilizált anyag protein-kocentrációja a teszt mintában 1,2 mg/ml, a kontroll mintában 1,5 mg/ml volt. A teszt anyag és a kontroll anyag elúciós profiljait az 5., 6., 7., 8. és 9. ábrán mutatjuk be. A teszt szérum és a kontroll szérum futtatásaiból származó elúciós profilok között bizonyos különbségeket találtunk. A teszt anyagban négy futtatás közül háromban közvetlenül az 55. perc után eluálódott elhatárolható csúcsot mutattunk ki. A kontroll anyagban közvetlenül az 55. perc után két csúcs eluálódott.

A__kalciumhiányos__étrenden__tartott patkányok vérszérumából nvert____frakciók___csontlerakódási sebességre___gyaksroli hatásának tesztelése

Anyagok és módszerek

A különböző frakciók meszesedett (mineralizált) csont lerakodási sebességére gyakorolt hatásának biológiai tesztelését csak a teszt szérummal végeztük. Ezen kísérletek • · célja az volt, hogy találjunk egy biológiai aktivitású komponenst. A négy futtatásból származó megfelelő csúcsokat összevontuk és 2.5 ml pufferben (10 mM Tris-Cl [pH = 7,2] és 50 mM NaCl) feloldottuk. A teszteléshez az anyag 0,8 ml-ét használtuk, a megmaradt anyagot pedig későbbi felhasználásig lefagyasztottuk.

Tíz Sprague-Dawley patkány mellék-pajzsmirigyét eltávolítottuk, és mindegyik állatba az egyes csúcsokból származó anyagok 0,4 ml-ét injektáltuk. Az öt összegyűjtött csúcs (az 5/A-8. ábrán A-tól E-ig jelöltek) mindegyikéhez két állatot használtunk. A csont ásványi anyag lerakodási sebességét a fentebb ismertetett tetraciklines jelöléssel értékeltük.

A tesztelt öt csúcs közül az A, B, D és E csúcs a csont ásványi anyag lerakodási sebességére körülbelül egyforma hatást gyakorolt, míg a C csúcs, úgy tűnik, nagyobb sebességet eredményezett, mint a többi (ld. 10. ábra).

Δ___csont__ásványi__anyag__lerakodási__sebességének__patkány vér szérumból_____izolált____adott____frakciókra____vonatkozó dózisfüggősége

A C csúcsból származó anyagot (1,7 ml) felolvasztottuk, 400 pl-ét 800 μΐ-re hígítottuk, és protein-kocentrációját a Belford módszerrel meghatároztuk. A megmaradt részt azonos szolubilizáló pufferrel 30 pg/ml koncentrációra hígítottuk, • ·« ···« ·· ·· ♦ · · · ♦ » · · • * · · ·· *·-· ·« · «· · · s kilenc patkány mellékpajzsmirigyét eltávolítottuk (a rendes táplálkozás idején és koplaláskor mért vérszérum-kalcium koncentrációk jelzik a sikeres operációt). Három patkánynak intravénás injekcióval 200 pl térfogatban 6 pg, C csúcsból származó teszt anyagot adtunk. Másik három patkánynak az anyag 3 pg-ját adtuk (az injektált térfogatot a szolubilizáló pufferrel 200 ul-re állítottuk be). További három patkánynak kontrollként a szolubilizáló puffer 200 pl-ét adtuk be. Az ásványi anyagok csontba történő lerakódásának sebességét a fentebb leírtak szerint határoztuk meg.

A kontroll patkányokban a lerakodási sebesség 0,81 pm/nap (SD = 0,09); a C csúcsból származó anyag 3 pg-jával kezelt patkányokban 1,51 pn/nap (SD = 023); a C csúcsból származó anyag 6 pg-jával kezelt patkányokban pedig 2,36 um/nap (SD = 0,25) volt (a csoportok között szignifikáns különbséggel; P < 0,05) (ld. 11. ábra).

A fentiek szerint bebizonyosodott, hogy a két hétig kalciumhiányos étrenden tartott patkányok vérszérumában egy olyan peptid vagy protein osztály található, amely patkányokban képes a mineralizált csont lerakódását serkenteni. Ez a hatás kb. 300 g-os patkány testtömegre vonatkoztatva 6 pg-ig dózisfüggő.

csökkent, 40 ml puffért (10 mM Tris-Cl [pH = 7,2], ml-re mM

NaCl mM

PMSF, mM DTT) adtunk hozzá, s az ultrafiltráciőt addig folytattuk, amíg a visszamaradt térfogat ismét ml-re csökkent.

A második szűrletet összevontuk az elsővel, s az utolsó visszamaradt térfogatot eldobtuk.

Az összevont szűrletet a fentivel megegyező készülékben tovább ultrafiltráltuk, de 3000 D molekulatömegig átengedő YM 3-as membránt használtuk. Ebben az esetben a szűrletet dobtuk el, és a visszamaradt térfogatot tartottuk meg. Amikor a visszamaradt térfogat 10 ml alá csökkent, a fentivel azonos puffer 40 ml-ét adtuk hozzá, s folytattuk az ultrafiltráciőt. Ezt az eljárást még egyszer megismételtük. Amikor az utolsó visszamaradt térfogat 10 ml-re csökkent, egy másik, 10 ml-es Amicon készülékbe vittük át, s 1 ml térfogat eléréséig tovább koncentráltuk. Az ultrafiltráciőt 4 ’C-on 3,81 x 10⁵ Pa (55 psi) nyomású nitrogéngázzal végeztük.

Akril-amid gélelektroforézis

Az elektroforézishez Hoeffer Mighty Small, függőleges gélt tartalmazó berendezést használtunk. 15 % foszfátot tartalmazó 0,75 mm vastag gélt öntöttünk, s a futtatást az alábbiak szerint végeztük:

Resolving (feloldó) gél 30 % akril-amid (19:1)

ml

M Tris-foszfát (pH = 6,9) 3 ml % SDS

0,3 ml % ammónium-perszulfát 150 ul

TEMED ul

Ví ml-re

Stacking (felhalmozó)	30 % akril-amid (19:1)	2,3 ml
gél	1 M Tris-foszfát (pH - 6,9)	1 ml
	10 % SDS	0,1 ml
	10 % ammónium-perszulfát	50 ul
	TEMED	30 ul
	Víz	10 ml-re
Futtató puffer 1 M	Tris-foszfát (pH - 6,9)	15 ml
10 ?	á SDS	3 ml

Víz 300 ml-re

A gélt előzetesen 100 V-os állandó feszültséggel 30 percig futtatuk. A mintákat 100 V-os állandó feszültséggel két óra hosszat futtattuk. A készülék hűtőjében 20 °C-os vizet keringettünk.

A protein-koncentrációt a Belford-módszerrel határoztuk meg.

A mintához a futtató pufferével azonos végkoncentrációban Tris-foszfátot (pH = 6,9) és SDS-t adtunk. A protein koncentrációját 100 ug/15 μΙ-re állítottuk be. A minta össztérfogata 1,65 ml volt. A mintát feltöltés előtt 30 percig 60 °C-on inkubáltuk.

A BDH-tól származó kis molekulatömegű markert a mintával megegyező módon kezeltük. Az egyes markerek koncentrációját 1 ;;g/12 ml-re állítottuk be. 0,5 cm széles üregekbe 15 pl mintát és markert töltöttünk.

A foszfát gélelektroforézis eredményeit a 12. ábrán mutatjuk be. Egy nagyon nagy és több kicsi, nagy molekulátömegü sávot figyeltünk meg. Több kis molekulatömegű sáv is jelen volt, melyeket TA-tól TE-ig jelöltünk.

Az___akril-amid gélelektroforézissel__frakcionált patkány vérszérumkomoonensek biológiai aktivitása

A foszfáttartalmú gél 12. ábrán bemutatott egyes sávjainak biológiai aktivitását teszteltük.

Az ultrafiltrációs minta korábbi szakaszban megmaradt 1,5 ml-ét kromatografáltuk és teszteltük. A minta koncentrációját azonos felvivő pufferrel (100 mM Tris-foszfát [pH = 6,9], 0,1 % SDS) állítottuk be. A mintát ezután a felvitel előtt 60 °C-on 30 percig inkubáltuk.

Az akril-amid gélt az előző szakaszban leírt módon készítettük, azzal a különbséggel, hogy a gélt 1 mm vastagságúra öntöttük. A felviteli térfogat üregenként 20 pl volt. A gélt előzetesen fél óráig futtattuk, majd a mintát β 4 ·

100 V-os állandó feszültséggel két órán keresztül futtattuk. Tíz gélen összesen 1,5 ml össztérfogatot futtattunk.

A nagyobb molekulatömegű anyagokat nem teszteltük. Az öt sávot (TA - TE) cromassie-kékkel végzett festés után kivágtuk. A megfelelő sávokat egyesítettük, szilíciummal telített üvegcsőben felaprítottuk, majd 5 ml pufferben (10 mM Tris-Cl [pH =7,2], 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF és 0,1 % Triton X-100) 4 ’C-on 24 óra hosszat áztattuk. Az áztató puffért ezután 3500 D molekulatömegig áteresztő (MWCO 3500) Spectrophor dializáló zsákra vittük. Az anyagokat a Tris-Cl-ot (pH = 7,2), 50 mM NaCl-ot és 1 mM DTT-t tartalmazó puffer 100-szoros térfogatával szemben 4 °C-on 48 órán keresztül dializáltuk, melynek során a puffért ötször cseréltük. A dializált mintákat ezután 10 ml-es Amicon koncentráló készülékben 3000 D molekulatömeg áteresztőképességű YM 3-as membrán alkalmazásával 500 ul-re koncentráltuk.

A mintát (80 /.71) vízzel 800 jjl-re hígítottuk, s a protein-koncentrációt Belford-reagenssel határoztuk meg. Az anyagok

koncentrációj át állítottuk be.	a	dializáló	pufferrel 120	/;g/ml-re
A fentebb	leírt	tetraciklines jelöléssel	végzett
teszteléshez	16	hím	Sprague-Dawley	patkány

mellékpajzsmirigyét eltávolítottuk. Pre-PTX és poszt-PTX szérum-kalcium szintjük 2,51 (SD = 0,002), illetve 1,53 • · · · · · · · · ···· · < · · • ♦ · · ·· · · · • · · · · · ··· ·« · ·· ·.

- 42 (SD = 0,001) volt. Valamennyi állatba 200 pl teszt anyagot injektáltunk. Mindegyik sávból eluált anyag aktivitásának teszteléséhez négy patkányt használtunk. A kontroll csoportot képező négy patkánynak a vivőanyag puffer 200 pl-ét adtuk be.

Az öt sáv közül három tartalmazott elegendő anyagot a teszteléshez. A TE sávból 50 pg, a TB sávból 55 pg, a TA sávból 59 pg anyagot vontunk ki. A TC és TD sáv protein-koncentrációja túl alacsony volt a kimutatáshoz, így ezeket a sávokat nem teszteltük. Az egyik TA-val kezelt és az egyik TB-vel kezelt patkány a farki vénapunkció közben az altatás során elpusztult.

A 13. ábrán a tesztelt anyagoknak patkányokban (melyek mellékpajzsmirigyét eltávolítottuk) a csont ásványi anyag lerakodási sebességére gyakorolt hatásait mutatjuk be. A pufferrel kezelt kontroll patkányokban a lerakodási sebesség 1,27 pm/nap (SD = 0,21) volt. A tesztelt anyagokkal kezelt patkányokban a lerakodási sebesség a TA sáv esetén 1,27 pn/nap (SD = 0,21), a TB sáv esetében 2,14 pm/nap (SD = 0,14), a TE sáv esetében pedig 2,24 pm/nap (SD = 0,28) volt.

A TB és TE sáv esetében a lerakodási sebesség lényegesen nagyobb volt, mint a kontroll és a TA sáv esetében (P < 0,025). Ogy tűnik, ebben a kísérletben a kontoll patkány eredménye — ismeretlen okok miatt — nagyobb volt, mint az előzőben.

·· ·

- 43 A fentiek alapján úgy tűnik, legalább két aktív polipeptid létezik, melyek molekulatömege kb. 6-6,5 kD (TB) és 12-13 kD (TE). A két peptid közötti kapcsolat ezen eredmények alapján nem ismert.

A patkány vérszérum komponenseinek elektroforézises frakcionálásával kapott sávokból származó polipeptidek aminosav-szekvenciájának meghatározása

Anyagok és módszerek

A szekvenáláshoz a korábbi ultrafiltrációból származó anyag kb. 100 μΙ-ét használtuk. Ezt az anyagot 100 yg/15 μΐ koncentrációjúra hígítottuk, amelyhez 100 mM Tris-foszfátot (pH = 6,9), 0,1 % SDS-t, 1 mM DTT-t és 50 mM NaCl-ot tartalmazó puffért használtunk. A foszfát-gélelektroforézist az előző szakaszban leírt módon végeztük. A gél vastagsága 1 mm volt. Az anyag 100 μΙ-ét öt sávban vittük fel, és kis molekulatömegű BDH markereket használtunk.

A vizsgálathoz kis Hoeffer protein-átviteli készüléket használtunk. A gélt PVDF membránra (Millipore) helyeztük és 250 V-os állandó feszültséggel egy órán keresztül elektroforizáltuk. Annak biztosítása érdekében, hogy a gélen lévő valamennyi protein a membránra kerüljön, kettős membránréteget alkalmaztunk. Az átvitel után a membránt cromassie-kékkel festettük. A különálló sávokat kivágtuk a jelöléshez.

A szekvenciák meghatározását szekvenáló laboratóriumban, jól ismert eljárások szerint végeztük.

TB	szekvencia: Gly Pro	Gly	Gly	Alá Gly	Glu	Thr (1.	Lys sz.	Pro Ile szekv.)
TE	szekvencia: Gly	Pro	Gly	Gly	Alá	Gly	Glu	(2.	sz.	szekv.)

A TB és TE ilyenformán rokon peptidek, N-terminális végük első hat aminosava megegyezik. Ezekből az eredményekből nem világos, hogy a TB a TE aktív fragmense, vagy a TE a TB polimere.

Szintetikus humán polipeptiddel végzett kísérletek

Humán cDNS-könyvtár screenelése polipeptidet kódoló DNS-szekvencia a keringésben található megtalálására

A patkány vérszérumból izolált polipeptid meghatározott aminosav-szekvenciája alapján nukleinsav próbát szintetizáltunk, mellyel humán cDNS-könyvtárat screeneltünk.

keringésben lévő szérumpeptidek és -proteinek szintézisének fő helyeként a máj ismert, s beszámoltak arról, hogy páciensekben krónikus máj elégtelenségben szenvedő gyakran előfordul a csontleépülés. Emiatt máj szövetből származó humán cDNS-könyvtárat screeneltünk.

cDNS izolálása magzati cDNS-könvvtárból

A Clontech-tól kapott humán cDNS-könyvtárat alkalmaztuk. A • ·» *«*w ·· ·· • 4 · t· · · e ♦ • · · · ·« «*« • * <r · · « • · · «« « »* · könyvtár hetes, meghatározatlan nemű humán magzatból készült.

Az anya vércsoportja 0 volt (katalógusszám:

HL1064A).

Az izolált máj mRNS-hez primerként oligodT primert használtunk, és reverz transzkriptáz alkalmazásával a cDNS első szálát szintetizáltuk. Ezután

SÍ nukleázzal emésztést végeztünk, és

DNS-po1imerázzal a második szálat

A tompa végű kétszálú cDNS-t EcoRI linkerhez ligáltuk és lambda gtlO-be klónoztuk.

A cDNS-könyvtárat ezután felszaporítottuk. SM tápközeggel elkészítettük a könyvtár sorozathígítását. 0,2 % maltózt tartalmazó LB tápközegben C600 hfl E. coli tenyészetet készítettünk, s ezt egyensúlyi növekedési fázisban tenyésztettük (rendszerint egy éjszakán át). A hígított könyvtár szuszpenzió 100 pl-ét 300 ul SM tápközeghez és az egy éjszakás C600 hfl E. coli tenyészet 600 yl-éhez adtuk, majd 37 ’C-on 20 percig inkubáltuk. A szuszpenziót ezután 0,7 % agarózt tartalmazó fedőagarba helyeztük, és 50 ’C-on olvadt állapotban tartottuk. Ezt azonnal 37 °C-ra előmelegített 90 mm átmérőjű kör alakú LB lemezre öntöttük. A lágy fedőagart szobahőmérsékleten hagytuk megszilárdulni, majd a tenyészeti lemezeket 37 ’C-on addig inkubáltuk, míg a plakkok láthatók lettek (vagyis 1 mm-nél kicsit kisebb átmérőt értek el). A lemezenként 30000 plakkot adó hígítást feljegyeztük, és ezt használtuk a későbbi szaporításhoz.

A cDNS-könyvtárakat ezután nitrocellulóz membránokon rögzítettük. A cDNS-könyvtárakat 90 mm-es lemezenként 30000 • ♦· ··«· ·* «« ♦· · · · ♦ · · • * · « ·· ··· • * · · · « · ♦ ·· ·· · «· · plakk koncentrációban szélesztettük. Amikor a plakkok kevéssel 1 mm alatti átmérőt értek el, a lemezeket egy éjszakán át 4 °C-on tartottuk. A következő napon a lágy agaróz tetejére nitrocellulóz szűrőpapírt (Amersham, 0,45 μ) helyeztünk, s 3 percig rajta hagytuk. A membránt egy tűvel három vagy több asszimetrikus helyen az agarlemezbe szúrtuk, hogy később elősegítsük membrán (vagy radiográfja) lemezhez való illesztését. A membránt ezután leemeltük és DNS-t tartalmazó oldalával felfelé 0,4N NaOH oldatot tartalmazó tenyészető csészébe helyeztük, s ebben a helyzetben 20 percig áztattuk. A membránt ezután 20 percre 6xSSC-be helyeztük, majd a hibridizáláshoz levegőn szárítottuk.

A foszfor-amidites eljárás alkalmazásával Cyclone-plus oligonukleotid-szintetizáló készülékkel (Milligen) 32mer oligonukleotid próbát szintetizáltunk. A próbát úgy szintetizáltuk, hogy a DMT-csoportot a reverz fázisú HPLC-vel végzendő tisztításhoz szabadon hagytuk. A próbát 0,2 umólos nagyságrendben szintetizáltuk. A szintézis után a próba védőcsoportját 4 ml ammónium-hidroxid-oldattal szobahőmérsékleten 24 óráig végzett kezeléssel távolítottuk el. A védőcsoport nélküli anyagot Speed-vac bekoncentráló készülékben 4 részletben szárítottuk. Az alkalmazott nukleinsav-próba szekvenciája a következő (3. sz. szekv.):

Gly Pro Gly Gly Alá Gly Glu Thr Lys

5'-GG(TC)CC(TC)GG(TC)GG(TC)GC(TC)GG(TC)GA(AG)AC(TC)AA(AG)

Pro

CC(TC)AT-3'

·· 4«

V · ·· 4·4 «4 ·· 4

- 47 A zárójelbe tett bázisok degenerált kodonokat jelölnek. A feltételezett proteint (melynek a nukleinsav megfelel) 4. azonosítási számú szekvenciaként jelöljük.

A próbát reverz fázisú HPLC-vel tisztítottuk. A szárított anyag egyik részét 1 ml 100 mM TEAA pufferben (pH = 7,0) feloldottuk. A mintát Hewlett Packer mintafilteren szűrtük.

majd C18 félpreparatív Beckman oszlopra (7,5 mm x 150 mm) vittük. A Beckman készülékben a mintát a korábban leírtak szerint kromatográfáltuk. Az alábbi gradiens programot alkalmaztuk:

A oldószer:

B oldószer:

Idő (perc)

5.

25.

40.

100	mM TEAA	(pH = 7,2)
Acetonitril
			Időtartam
95 %	A	5 % B
80 %	A	40 % B	15
50 %	A	50 % B	10
95 %	A	5 % B	5

A program vége

65.

Először a hiányos szekvencia, majd kb. a 35. percnél a teljes szekvencia eluálódott. A csúcsnak megfelelő anyagot összegyűjtöttük és szárítottuk, majd a DMT trifenil-metil-gyökének eltávolítása érdekében 1 %-os TFA-t adtunk hozzá és ismét megszárítottuk. A szárítás után megmaradt TFA semlegesítése érdekében 100 pl 3 %-os ammónium-hidroxid oldatot adtunk hozzá. Az anyagot ismét szárítottuk, majd vízben újra feloldottuk. A feloldott anyag 100 pl-ét 0,1 ml • ·· ···· ·· ·· ·· · · · · 9 9 • 99 9 99 ·99 • · · » · · · ··♦ ·· · ·» · t» centrifugált G25 oszlopon engedtük át, majd a DNS-koncentrációt 260 nm-nél megfigyelt abszorpció alapján mértük. 260 nm-nél 1 0D egység kb. 33 pg/ml koncentrációt jelent.

A próba 50 pmólját 50 pmól ³²P-izótóppal jelölt ATP (Amersham) (aktivitás > 3000 Ci/mmól és 10 pCi/pl) alkalmazásával T4 DNS-kinázzal (Pharmacia) kezeltük.

A próbát ezek után a nitrocellulóz membránon rögzített DNS-sel hibridizáltuk. A szárított nitrocellulóz membránokat 42 ’C-on két óra hosszat 50 ml előhibridizáló oldatban inkubáltuk, majd hozzáadtuk az 50 pmól jelölt próbát, s a hibridizálást 42 ’C-on egy éjszakán át végeztük. 50 ml hibridizáló oldatba 50 membránt tettünk. A következő napon a membránt szobahőmérsékleten négyszer 300 ml 2xSSC-vel mostuk, minden alkalommal kb. 5 percig. A membránokat ezután 68 ’C-on egy óra hosszat 50 ml lxSSC-ben inkubáltuk, majd szobahőmérsékleten IxSSC-vel egyszer leöblítettük és szárítottuk. A filter átszűrt részeire 1 pl radioaktív tintát (0,5 ml aktivitása 1000 cps) cseppentettünk, hogy megjelöljük a membrán helyzetét. A membránokat erősítőernyő alkalmazásával 85 ’C-on 18 órán keresztül Amersham Hyper filmre exponáltuk. A filmet előhívtuk, és a klón azonosítása érdekében az agaróz lemezekkel párba állítottuk. A pozitív kiónt kivettük, és igazolása érdekében agarózgélen egyszer újra elszaporítottuk és ismét hibridizáltuk.

• 99 9999 9999 ·· · · 9 99 9

9 9 9 99 999 • 9 · ♦9 9

999 99 9 999

Körülbelül 300000 plakk screenelése után egy pozitív kiónt azonosítottunk.

Δ____humán____keringési____csontnövekedési faktor cDNS

-szekvenciájának amplifikálása

A cDNS kiónt Mániátis és munkatársai eljárásai (Sambrook,

J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, A

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 2. kiadás, 1989) szerint amplifikáltuk. A HL 1-7 pozitív plakkot steril Pasteur-pipettával kivettük és 60 % SM és 40 % glicerin 1 ml-nyi elegyébe helyeztük; először 37 ’C-on két órára, majd ’C-on egy éjszakára. A

E. coli C600 hfl egy telepét 0,2 % maltózt tartalmazó 10 ml LB tápközegbe oltottuk. A tenyészetet ’C-on egy éjszakán keresztül rázó i nkub át o rb an (Queue) (200-as percenkénti fordulat) növesztettük.

A következő reggelen a HL 1-7 szuszpenzió 100 μΙ-ét 300 ml

SM-be és az egy éjszakás E. coli C600 hfl tenyészet 600 inkubáltuk. A μΐ-ébe oltottuk, majd 20 percig 37 ’C-on tenyészetből egy oltókacsnyi mennyiséget LB agarlemezre kentünk, majd 30 ’C-on látható telepek megjelenéséig inkubáltuk. Több telepet kiválasztottunk, ezeket megszámoztuk, s mindegyiket két LB agarlemezre kentük. Az egyik lemezt 30 ’C-on, a másikat 40 ’C-on inkubáltuk. A HL 1-7 szaporításához azokat a telepeket használtuk fel, amelyek csak 30 ’C-on nőttek (40 ’C-on lízist szenvedtek).

• ·· ·ν·· ·« ·· ·· · · · * · · • · · · ·· ··« • · · t · · · • ·· ·· « ·· ·

Egy lizogén HL 1-7 telepet 0,2 % maltózt tartalmazó 10 ml LB tápközegbe oltottunk, és rázó inkubátorban 30 °C-on besürűsödésig tenyésztettük. Az optikai denzitást (0D) 600 nm-nél mértük. 600 nm-nél 1 0D egység 8 x 10® sejt/ml E. coli mennyiséget jelölt. Kétszer 500 ml előmelegített NZCYM tápközeget egyenként 10¹⁰ darab sejttel oltottunk be. Mindkét palackot 37 ’C-on 200-as percenkénti fordulatszámmal rázó inkubátorban egy éjszakán át inkubáltuk. A következő reggelen mindkét 500 ml tápközeghez 10 ml kloroformot adtunk, s az inkubálást 30 percig folytattuk. Miután a tenyészeteket szobahőmérsékletre hűtöttük, 1 pg/ml koncentrációban DNázt és RNáz A-t adtunk hozzájuk. A tenyészeteket fél órán át szobahőmérsékleten tartottuk, és 1 M koncentrációban NaCl-ot adtunk hozzájuk. A tenyészeteket egy órára jégen tartottuk, majd a baktériumtörmeléket 11000 x g-nél nem nagyobb fordulatszámmal 10 perc alatt lecentrifugáltuk. Ezután mindkét 500 ml-es tenyészethez 50 g PEG 8000-et adtunk, s a PEG feloldódása után a tenyészeteket további egy óra hosszat jégen tartottuk. A fágot 4 ’C-on 10 percig 11000 x g-vel végzett centrifugálással leülepítettük, s a felülúszót eldobtuk. A csapadékot 16 ml TM-mel újraszuszpendáltuk, majd az oldatot egyenlő térfogatú kloroformmal extraháltuk. A vizes fázishoz 4 ml glicerint adtunk, s az alábbiak szerint gradiens centrifugálást végeztünk.

Egy tökéletesen tiszta Beckman ultracentrifugáló cső aljára CsCl-oldatot (1,6 s. gr.), az alsó réteg tetejére pedig • 4

- 51 újabb CsCl-oldatot (1.4 s. gr.) rétegeztünk. A HL 1-7 szuszpenziót a CsCl-gradiensre rétegeztük, és Beckman L8-70 ultracentrifugában (Ti60 állandó szögű rotor alkalmazásával) 4 °C-on két óra hosszat 35000 x g-vel centrifugáltuk. A fágrészecskék a két CsCl-gradiens réteg között kék sávként jelentek meg. Egy fecskendőre szerelt tűvel a centrifugáló cső falát átszúrva a fágrészecskéket kiszívtuk a csőből. A szuszpenziót egyszer fenollal, egyszer 1:1 arányú fenol/kloroform eleggyel, majd kétszer kloroformmal extraháltuk. A fág DNS-t etanolos kicsapással nyertük ki (az extraktumhoz 0,5 M NaCl-ot és két térfogat etanolt adtunk, s 10 percre -85 °C-ra hűtöttük. A jelenlévő DNS mennyiségét 260 nm-nél mért abszorpcióval határoztuk meg.

A DNS inszertet agaróz gélelektroforézissel méret szerint osztályoztuk. A HL 1-7 DNS 15 pg-ját 150 pl, 2x Pharmacia one-for-all pufferből álló emésztő pufferrel emésztettük, amit 37 °C-on 1,5 óra hosszat 25 egység EcoRl alkalmazásával végeztünk. Az emésztés után a DNS-t a fentebb leírtak szerint fenol/kloroform extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítottuk. 0,5 cm vastag 1,2 % seakem GTG-grade agaróz gélt öntöttünk, öt darab 8 mm széles foggal rendelkező fésűt használtunk. Az emésztett DNS-t az egyik kialakított üregbe helyeztük, és standardként $X 174-es markert alkalmaztunk. A gélt TBE pufferben, a gélre vonatkoztatva 8 V/cm-nél futtattuk. A gélt ezután etídium-bromiddal festettük.

A kapilláris elektroforézissel végzett méret szerinti osztályozáshoz 10 pg/ml koncentrációjú vizes DNS-oldatot használtunk. A futtató puffer 8 mM bórsav, 89 mM Tris (pH=8,5), 2 mM EDTA és 0,5 % hidroxi-propil-metil-cellulóz (Sigma) elegye volt. Az elektroforézist Beckman kapilláris elektroforézis készülékkel (2100-as modell) végeztük. A mintát 7 másodpercig 7 kV-os elektrokinetikai erővel 27 cm hosszú, 100 μαι belső átmérőjű, DB17 bevonatú kapilláris csőbe (J&W Scientific Inc.) juttattuk. Ezután 5 másodpercig nyomás alatt vízdugót fecskendeztünk be. Az elektroforézist 6,25 kV-os állandó feszültséggel 12 percig végeztük. A 260 nm-nél mért abszorpciót Beckman System Gold Software alkalmazásával rögzítettük. Standardként Boehringer Mannheim DNA molecular marker Vl-ot használtunk.

A fág DNS-t ezután PCR-ral amplifikáltuk. A fág DNS-t 1 ml fágszuszpenzióból etanolos kicsapással nyertük ki. A fággal kapcsolatos proteineket 4 M nátrium-perklorát oldattal választottuk le, majd fenol/kloroform eleggyel két extrakciót, ezután pedig kloroformmal még két extrakciót végeztünk. A DNS-t kétszeri etanolos kicsapással és centricon 30-as szűrőn (Amicon) keresztül vízzel végzett mosással nyertük ki. A DNS-oldat végtérfogatát vízzel 0,5 ml-re egészítettük ki.

A PCR-t PCR készülékben (thermocycler; M.J. Research Inc) végeztük. A puffer összetétele: 50 mM KC1, 10 mM Tris-Cl (pH = 8,3), 2,5 mM MgsiCl, 0,1 % zselatin, 0,45 % Tween 20 és 0,45 % NP40. A puffer valamennyi amplifikáló primerből (Clontech, katalógusszám: 5411) 50 pmólt, a dNTP-kből 0,125 mM-t, 1 mM DTT-t és 2,5 egység Tag DNS-polimerázt tartalmazott. Templátként a tisztított fág 10 jul-ét alkalmaztuk. Az egyik primer az EcoRl helytől 5' (upstream) irányban lévő HindiII helynél szolgál a DNS primeréül, és az alábbi szekvenciával rendelkezik: 5'-AAG CTT CAC ACC ACG AAC CAG-3' (5. sz. szekv.). A másik primer a HL 1-7 EcoRl helytől 3' (downstream) irányban lévő szekvenciája primeréül szolgál, s az alábbi szekvenciával rendelkezik: 5'-TTA TGA GTA TTT CTT CAA GGG-3' (6. sz. szekv.).

A PCR-t az alábbi program szerint végeztük:

Lépés	Hőmérséklet (’C)	Idő (perc)
1.	95	5
2.	56	1
3.	74	3
4.	95	1
5.	56	1
6.	74	3
7.	a 4-6 lépés ismétlése 30-szor
8.	95	1
9.	56	1
10.	74	7
11.	4	5
12.	Program vége

A terméket egyszer kloroform/fenol eleggyel és kétszer kloroformmal mostuk, etanollal kicsaptuk és 100 pl vízben újra feloldottuk. A fág-DNS hozama a tenyészet térfogatára vonatkoztatva kb. 15-18 pg/liter volt. A kinyert DNS meglehetősen tiszta volt, 260-280 : kb. 1,7 arányban.

Az agaróz gélelektroforézissel és a kapilláris elektroforézissel végzett méret szerinti meghatározás eredménye szerint az inszert mérete egyaránt kb. 300 bázispárnak bizonyult. A kapilláris elektroforézissel megfigyelt méret kb. 600 bázispár, de ez magában foglal egy 285 básipár hosszúságú, a vektortól 5' irányban elhelyezkedő szakaszt is (a HindlII-tól az EcoRI helyig).

A HL .1-7 fág-DNS szekvenálása

A fág-DNS 15 pg-ját nátrium-hidroxiddal denaturáltuk és nátrium-acetáttal (pH = 4,5) kicsaptuk. Ezt az egyik primerrel (Clontech; katalógusszám: 6184 és 6186) hibridizáltuk. A szekvenálást Pharmacia T7 DNS-polimeráz szekvenáló készlet alkalmazásával a Sanger-féle didezoxi láncterminációs eljárás szerint végeztük. Radioaktív jelként ³²P-izotóppal jelölt dATP-t használtunk (Amersham sp. aktivitás > 3000 Ci/mmól és 10 pCi/pl). A szekvenálást a Base Runner Unit (IBI) felhasználásával 45 cm hosszú gélben 45 W állandó teljesítménnyel végeztük. A gélt a futtatás után megszárítottuk és -85 ’C-on egy éjszakán keresztül Amersham Hyperfilmre exponáltuk, majd előhívtuk.

A szekvenálás eredményeit az alábbiakban mutatjuk be. Az érett cDNS 53 aminosavat kódol, melyek közül az első 17 jelzőszekvenciát képez.

5'-TTT GGC TTT ATT CAT AGC GGT AAT TAA TGA TCA AGA CAG TTG

Met

Thr

Alá

Gin

Asn

ATT

ACT

CGT

AAG

CAC

TAT

TAA

AAA

TTT

GCA

AIG

ACL

GG1

..GAA.

-AAT

Thr

Asp

Leu

Asn

Gin

Leu

Ser

Asn

Ser

Phe

Thr

Leu

Gly

Ile

Gly

AGA

GAG

GTT

AAC

GAA

GTA

TGG

AAC

AGT

TTG

ACT

TTA

GGG

ATG

GGA

Lys

Arg

Thr

Asn

Glu

His

Thr

Alá

Asp

Cys

Lys

Ile

Lys

Pro

Asn

AAA

GGA

AGA

AAT

GAA

CAT

AGG

GCA

GAT

TGT

AAA

ATT

AAA

CCG

AAC

Thr

Leu

His

Lys

Lys

Alá

Alá

Glu

Thr

Leu

Met

Val

Leu

Asp

Gin

AGG

TTG

GAT

AAA

AAA

GCT

GGA

GAG

ACT

TTA

ATG

GTG

CTT

GAG

GAA

Asn

Gin

Pro

TÉR

AAT

GAA.

G£A

TAA

AGG

ATC

TGC

AGC

TTA

TGT

CTT

CTA

GTT

TAT

ATT

TTG

CAT

AAA

AAA

GCT

GCA

GAG

ACT

TTA

ATG

GTA

ATT

GCC

AAA

ATC

AAC

CAT

AAA

GGA

TCT

GC-3'

A fenti nukleinsav szekvencia a szekvencialistában a 7. sz. szekv., az aminosav-szekvencia pedig a 8. sz. szekv. A polipeptid vezetőszekvencia nélküli mérete kb. 4000 D, amely hasonló a patkány vérszérumból izolált TB sáv méretéhez.

A fenti szekvencia egy részét tartalmazó nukleinsav-szekvenciát (9. sz. szekv.) a következő szakaszban leírtak szerint expressziós plazmidba klónoztuk. Tudni kell, hogy a szakember az általunk választottaktól eltérő, más alkalmas vektorokkal és expressziós hordozókkal is hasonló eredményeket érhet el.

Δ humán magzat i máj cDNS-könvvtárból származó cDNS-szekvencia egy részét tartalmazó DNS-szekvencia expresszálása

Az alábbi szekvenciát expressziós plazmidba történő klónozáshoz oligonukleotid-szintézissel szintetizáltuk:

EcoRI STARTGly He Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr

AATTCTTAGGATCCTAGGATG GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG

GAATCCTAGGATCCTAC CCC TAG CCT TTT GCT TGT TTA CTT GTA TGC

Alá

Asp

Cys

Lys

He

Lys

Pro

Asn

Thr

Leu

His

Lys

Lys

Alá

Alá

Glu

GCA

GAT

TGT

AAA

ATT

AAA

CCG

AAC

ACC

TTG

CAT

AAA

AAA

GCT

GCA

GAG

CGT

CTA

ACA

TTT

TAA

TTT

GGC

TTG

TGG

AAC

GTA

TTT

TTT

CGA

CGT

CTC

Thr

Leu

Met

Val

Leu

Asp

Gin

Asn

Gin

Pro

TÉR

ACT

TTA

ATG

GTC

CTT

GAC

CAA

AAT

GAA

CCA

TAA

AGA

TCT

TGA TCGA-5'

TGA

AAT

TAC

CAG

GAA

CTG

GTT

TTA

CTT

GGT

ATT

TCT

AGA

ACT HindlII

A fenti nukleinsav-szekvencia értelmes szála a szekvencialistában a 9. sz. szekv., az anti-szensz szál a 10. sz. szekv., a polipeptid-szekvencia pedig a 11. sz. szekv.

Ebben a konstrukcióban a pUC 8 plazmidba történő ligáláshoz két restrikciós hely található (EcoRI és HindlII). Az összeállított plazmidot E. coli JM103 törzsébe vittük be. A transzformált kiónokat a baktériumokat 35 ug/ml ampicillint tartalmazó LB agarlemezre kenve szelektáltuk.

A kialakított szekvenciából hiányzik az a szekvencia, amelyet a cDNS kiónban kódolt jelzőszekvenciának véltünk. A Gly-Ile-Gly-Lys aminosav-szekvencia bizonyos mértékben hasonló a patkány polipeptid első négy aminosavához, így feltételezzük, hogy ez a humán polipeptid érett peptidjének eleje.

A baktériumokat 8 órán keresztül Terrific tápközegben tenyésztettük, hogy a lassú növekedési fázisba jussanak. A Terrific tápközeg az LB tápközegben lévő triptonon és élesztőkivonaton kívül 17 mM kálium-foszfát puffért (pH =7,2), 4 % glicerint és 35 /.zg/ml ampicillint tartalmaz. A nyolc óra hosszat végzett tenyésztés után a baktériumokat lecentrifugáltuk, hogy a tápközeget expressziós tápközgre cseréljük. Az expressziós tápközeg 2 % kazaminosavat, 17 mM foszfát-puffért (pH = 7,2), 4 % glicerint, 40 jjm tiamint, 2 mM IPTG-t és 35 pg/ml ampicillint tartalmazott.

A baktériumüledéket az eredeti Terrific tápközeg térfogatával azonos térfogatú fenti tápközegben új raszuszpendáltűk.

A tenyésztést 37 ’C-on 200-as percenkénti fordulattal rázó inkubátorban egy éjszakán keresztül folytattuk.

A tenyészetet kétszer 12000 x g-vel (egyenként 15 percig) centrifugáltuk, hogy a baktériumok teljesen leülepedjenek. A tápközeget ezután TM3 membránnal tízszeresére koncentráltuk.

Ezen anyag 1 ml-ét a korábban leírt körülmények között C3 reverz fázisú HPLC-nek vetettük alá.

Körülbelül 62-63 % acetonitril-koncentrációnál egyetlen jó felbontású csúcs eluálódott. Az elúciós idő megegyezett a humán szérumból izolált polipeptid elúciós idejével <ld. 14. ábra). A tenyészet 50 ml-éből tisztítással kb. 1 ml polipeptidet kaptunk (Belford reagenssel végzett meghatározás alapján).

Az expresszált termék biológiai aktivitása

A teszteléshez 400-420 g-os egészséges hím patkányokat használtunk. A kontoll csoportnak 50 mM nátrium-foszfát puffért (pH = 7,2) adtunk be. Az egyik teszt csoportnak az expresszált polipeptid 0,7 0D egységnyi mennyiségét, a másik teszt csoportnak a polipeptid 0,3 0D egységnyi mennyiségét adtuk be. Amint a 15. ábrán látható, az expresszált termék serkentő hatást gyakorol a csontképződésre.

Kémiai___úton szintetizált humán__polipeptidekkel__végzett kísérletek

Hagyományos szilárd fázisú eljárással (Organic Chemistry, szerk.: Loudon, G. Marc, Addison-Wesley Publishing Company, Massachusetts, 1984) A cDNS-könyvtárból meghatározott, kiválasztott nukleinsav-szekvenciának (7. sz. szekv) megfelelő aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptidet szintetizáltunk. A kiválasztott szekvencia az alábbi volt:

Gly

He

Gly

Lys

Arg

Thr

Asn

Glu

His

Thr

Alá

Asp

Cys

Lys

He

Lys

Pro

Asn

Thr

Leu

His

Lys

Lys

Alá

Alá

Glu

Thr

Leu

Met

Val

Leu

Asp

Gin

Asn

Gin

Pro

(11-

sz

. szekv.)

>.

A szintetikus peptid HPLC profilja alapján 99 %-os tisztaságú volt. A peptidet egymástól függetlenül tömegspektrometriával és aminosav-analizissel azonosítottuk.

A megfigyelt molekulatömeg 4043,36 D volt (a monomer elméleti molekulatömege 4043,66 D). A peptid aminosav-analízisének eredménye: Asp (5) 5,23; Thr (4) 3,74;

Glu (4) 4,49; Gly (2) 1,72; Alá (3) 3,09; Val (1) 1,09; Met (1) 1,04; He (2) 1,54; Leu (3) 3,20; His (2) 2,07; Lys (5) 4,90; Arg (1) 0,99; Pro (2) 2,15.

A felhasználás előtt a polipeptid 15 mg-ját 15 ml 0,1 %-os ecetsavban oldottuk, tizenöt 1 ml-es részletre osztottuk és liofilizáltuk. A peptidet -20 °C-on tároltuk.

A tesztelést megelőzően a szintetikus polipeptidet Tricine SDS gélelektroforézisnek vettettük alá. Amint a 16. ábrán látható, a polipeptid nagy része dimer alakban van jelen.

A peptid teszt oldatot úgy készítettük elő a beadáshoz, hogy a peptid egy alikvotját (1 mg) 1 ml ionmentesített vízben feloldottuk, hogy 1 mg/ml koncentrációjú oldatot kapjunk. Ennek 350 μΙ-éhez 14 ml végtérfogat eléréséig 0,1 %-os ecetsavban 1 % (hővel inaktivált) BSA-t adtunk (ld. következő bekezdés), miáltal 25 pg/ml peptid-koncentrációjú

oldatot kaptunk.

A szarvasmarha szérumot úgy készítettük, hogy 40 ml ionmentesített vízben 0.5 g BSA-t (Sigma) oldottunk. 50 pl ecetsav hozzáadása után az oldat térfogatát ionmentesített vízzel 50 ml össztérfogatra egészítettük ki. Az oldat végső összetétele így 0,1 %-os ecetsavban 1 % BSA lett. Ezt az injekciós vivőanyagot a BSA inaktiválása érdekében 56 °C-os vízfürdőben inkubáltuk. Az oldatot 4 °C-on tároltuk.

Az e szakaszban fentebb leírt módon előállított peptid 350 μΐ-ének ionmentesített vízben való feloldásával a B kontroll csoport számára hővel inaktivált peptidet (ld. következő szakasz) készítettünk. Ezt kupakos polipropilén csőben (Starsted) mikrohullámú sütőben 10 percig forraltuk. Az oldatot lehűtöttük, s ehhez 14 ml össztérfogat eléréséig az aktív peptidhez készített vivőanyagot adtuk. így az inaktivált peptid koncentrációja is 25 pg/ml lett.

A jelölő tetraciklin-oldat elkészítéséhez 50 ml ionmentesített vízben 360 mg tetraciklin bázist (Sigma) oldottunk, miáltal 7,2 mg/ml koncentrációjú oldatot kaptunk. Valamennyi patkány testtömege kb. 300 g, a beadott tetraciklin mennyisége (1 ml jelölő oldat) pedig kb. 24 mg/testtömeg-kilogramm volt.

- 61 A kémiai úton szintetizált, peotid biológiai aktivitása ·<

A kísérletekhez kb. 250 g testtömegű hím Sprague-Dawley patkányokat (Charles River Laboratory) alkalmaztunk. Az állatokat külön ketrecekben, csapvízen és Purina Rat Chow táplálékon tartottuk.

Az egyes oldatok egy ml-ét intramuszkulárisan az állatok combjába injektáltuk. Minden kísérleti csoportban 12 patkányt teszteltünk.

A kontroll csoport: valamennyi állat jobb oldali gluteus maximus izmába intramuszkuláris injekcióval 1 ml, 0,1 %-os ecetsavban 0,1 % BSA-t tartalmazó oldatot adtunk be. Ezután intraperitoneálisan 1 ml jelölő tetraciklin-oldatot inj ektáltunk.

B kontroll csoport: valamennyi állat jobb oldali gluteus maximus izmába intramuszkuláris injekcióval 1 ml, 0,1 %-os ecetsavban 0,1 % BSA-t és 10 perces forralással inaktivált (ld. fentebb) peptidet tartalmazó oldatot adtunk be. Ezután intraperitoneálisan 1 ml jelölő tetraciklin-oldatot injektáltunk.

Teszt csoport: valamennyi állat Jobb oldali gluteus maximus izmába intramuszkuláris injekcióval 1 teszt oldatot (1 ml vivőanyagban pg peptid, ld.

fentebb). Ezután intraperitoneálisan ml jelölő tetraciklin-oldatot in j ektáltunk.

A jelölő tetraciklin-oldatot kb. 46 órával később valamennyi állatnak ismételten beadtuk. Az állatokat a második tetraciklin dózis után 24 órával szén-dioxidos narkózissal leöltük.

Közvetlenül az állat elpusztulása után sz ivpunkc ióval vérmintákat vettünk.

A csont alkalikus foszfatáz (a csontképződés szérum indexe) méréséhez kb.

ml, heparinnal kezelt vért alkalmaztunk. A méréseket a humán csont alkalikus foszfatáz mérésének hagyományos eljárása szerint végeztük. Az eredmények nem voltak bizonyító értékűek.

A szövettani vizsgálathoz és a csontképződés sebességének meghatározásához a csontminták forrásául a jobb combcsontot (femur) jobb sípcsontot (tibia), a jobb humerus-t, a jobb csipőcsontot és az ötödik ágyékcsigyolyát választottuk ki. A mintákat a metszetkészítés előtt 4 ’C-on tároltuk.

A j óbb	combcsont	preparálása sz	övettani vizsgálathoz és a
kémiai	úton szintetizált humán	polipeptid	csont ásvánvi
anyag	lerakodási	sebességére	gyakorolt	hatásának

meghatározásához

A három csoportba tartozó állatok jobb combcsontjához kapcsolódó izmokat, inakat és csonthártyát eltávolítottuk. Az alsó metafízis és a csont középső részének keresztirányú metszeteit az alábbiak szerint készítettük (ld. 17. ábra).

A csont-keresztmetszeteket 80 %-os etanolba helyeztük és egy éjszakán át óvatosan kevertük. A combcsonti keresztmetszeteket az alábbi lépések szerint kezeltük:

1. dehidratálás 100 %-os etanol kétszeri cseréjével (mindegyik cserével két óra hosszat);

2. zsírtalanítás 100 %-os acetonnal két órán át;

3. egy éjszakás áztatás 1:1 arányú aceton/Spurr-közeg elégyben

A Spurr-közeg összetétele:

NSA (nonenil-szukcinsavanhidrid) 130g

ERL (vinil-ciklohexán-dioxid) 50g

DÉR (a propilén-glikol diglicerid-étere) 30g

DMAE (dimetil-amino-etanol) 2g

A csont-keresztmetszeteket 100 %-os Spurr-közegbe tettük és hat óra hosszat benne hagytuk, hogy az oldat behatoljon a csontszövetbe. Az oldatot ezután újabb adag oldattal helyettesítettük, majd 15 percig 1,73 x 10^e Pa negatív nyomáson tartottuk.

Az alsó metafízisből származó keresztmetszeti darabokat úgy helyeztük el, hogy az alsó felszínük az ágyazóminta alja felé nézzen, és a gyantát (azaz a Spurr-közeget) 55 ’C-on egy éjszakánt át hagytuk polimerizálódni. A combcsont alsó metafízisének részlegesen, polimerizálódott tömbjeit 80 ’C-on újabb 12 óra hosszat hőkezeltük. Ezalatt a középső részeket ·· • · ·· a folyékony gyantában egy második éjszakán keresztül állni hagytuk, majd 80 ’C-on hőkezeltük.

A következő napon a combcsont alsó metafisiséből származó szövettömbök két vágott felszíne közötti távolságot megfelező síkban egy 400 pm vastag metszetet vágtunk ki. Ezt a vastag metszetet (100-as szemcséjű) szilícium-karbid porral előzetesen érdesített két üveglemez között kézzel hozzávetőleg 8 pm végső vastagságúra csiszoltuk. A csiszoláshoz kenőanyagként vizet használtunk. A csiszolt vékony metszeteket festetlenül helyeztük a tárgylemezre. A combcsont középső részéből kivágott tömbből a két vágott felület közötti távolságot megfelező síkban hasonlóan készítettünk metszetet. A combcsont metatéziséből készített metszeteket a csontlerakódás vakméréseihez véletlenszerűen kódoltuk.

A műanyagba ágyazott, testetlen metszeteket fluorszcens mikroszkóp alatt 16-szoros nagyítású objektívvei és 10-szeres nagyítású szemlencsével szisztematikusan átvizsgáltuk, hogy végigpásztázzuk a csontbelhártya felülete által határolt térben lévő trabekuláris csontállományt. A jól elkülöníthető két tetraciklines sávval rendelkező csontképződési helyeket választottuk ki a mérésekhez, hogy

minimálisra	csökkentsük a csonképződési felületeken
kérésztülfutó	ferde vágásoknak köszönhető hibát. A két
tetraciklines	sáv közötti távolságot (pm-ben) regisztráltuk

és kettővel osztottuk (a jelölések között két nap telt el), ···· hogy a lerakodási sebességet um/nap értékként kapjuk. Minden állat esetében 30 véletlenszerűen kiválasztott helyen végeztünk méréseket, és a statisztikai analízishez a mért értékek számtani közepét használtuk.

Az eredményeket a II. táblázatban és a 18. ábrán mutatjuk be.

II. TÁBLÁZAT

Az egyes kísérleti csoportok számtani középértékeinek összehasonlítása

Teszt csoport	A	kontroll csop.	”B” kontroll csop
Átlag 1,35 pn/nap		1,03 pm/nap	0,99 pm/nap
SD 0,808 pm/nap		0,04 pm/nap	0,07 pm/nap
N 9		9	7
	t	d.f.	P
Teszt csop.
vs. A kontr.	11,18	16	<0,001
Teszt csop.
vs. B kontr.	3,96	14	<0,005
A kontr.
vs. B kontr.	0,62	14	>0,5

A kémiai .úton szintetizált peptid csontnövekedésre gyakorolt dózisfüggő hatása

Negyven hím Sprague-Dawley patkányt négy, tíz állatból álló csoportra osztottunk. Az 1.. 2.. 3. és 4. csoportban az átlagos testtömeg 294 g, 297 g, 296 g, illetve 279 g volt.

Az előző kísérlethez hasonlóan 1 %-os ecetsavban 1 mg/ml koncentrációjú peptid-törzsoldatot készítettünk. A BSA-t kihagytuk. Három oldatot készítettünk, melyekben a kémiai úton szintetizált peptid koncentrációja eltérő volt.

1- peptid-oldat: a törzsoldat 1,1 ml-ét 0,1 %-os ecetsavval 5,5 ml-re hígítottuk, hogy 0,5 ml térfogatban 100 ;;g peptidet tartalmazó oldatot kapjunk.

2. peptid-oldat: a törzsoldat 0,55 ml-ét 0,1 %-os ecetsavval 5,5 ml-re hígítottuk, hogy 0,5 ml térfogatban 50 pg peptidet tartalmazó oldatot kapjunk.

3. peptid-oldat: a törzsoldat 0,3 ml-ét 0,1 %-os ecetsavval 6 ml-re hígítottuk, hogy 0,5 ml térfogatban 25 pg peptidet tartalmazó oldatot kapjunk.

A jelölő tetraclklin-oldat elkészítéséhez 288 mg tetraciklin bázist 40 ml ionmentesített vízben oldottunk, miáltal 7,2 mg/ml koncentrációjú oldatot kaptunk. Mindegyik patkánynak 1 ml ilyen oldatot adtunk be (ld. alább), ami kb. 24 g/testtömeg-kilogramm dózist jelent.

A négy patkánycsoportot az alábbiak szerint kezeltük:

A teszt csoport: mindegyik patkánynak intramuszkuláris injekcióval 0,5 ml 1. peptid-oldatot (100 pg peptid). majd intraperitoneálisan 1 ml tetraciklin-oldatot adtunk be.

B teszt csoport: mindegyik patkánynak intramuszkuláris injekcióval 0,5 ml 2. peptid-oldatot (50 pg peptid), majd intraperitoneálisan 1 ml tetraciklin-oldatot adtunk be.

”C teszt csoport: mindegyik patkánynak intramuszkuláris injekcióval 0,5 ml 3. peptid-oldatot (25 pg peptid), majd intraperitoneálisan 1 ml tetraciklin-oldatot adtunk be.

D kontroll csoport: mindegyik patkánynak intramuszkuláris injekcióval 0,5 ml 0,1 %-os ecetsavat, majd intraperitoneálisan 1 ml tetraciklin-oldatot adtunk be. Ezeknek a patkányokat peptidet nem adtunk be.

A második jelölő tetraciklin-oldat elkészítéséhez 288 mg tetraciklin bázist (Sigma) 40 ml ionmentesített vízben oldottunk, miáltal 7,2 mg/ml koncentrációjú oldatot kaptunk. Az első Jelölő oldat beadása után mindegyik patkánynak 1 ml ilyen oldatot adtunk be (kb. 24 g/testtömeg-kilogramm dózis), s az állatokat kb. 24 óra elteltével szén-dioxidos narkózissal leöltük.

Mindegyik patkányból heparinnal kezelt csőbe, szívpunkcióval kb. 3 ml posztmortális vért vettünk. A vérplazmát -20 ’C-on fagyasztva tároltuk.

Valamennyi patkányból kivágtuk mindkét combcsontjukat (femur), mindkét sípcsontjukat (tibia), mindkét • ·

- 68 csípőcsontjukat és az első két farokcsigolyájukat. Ezeket a csontmintákat 20 mM foszfát-pufferrel pH = 7,4-re puffereit 10 %-os formaldehidben fixáltuk.

A___jobb combcsont preparálása a csont ásványi anyagok lerakodási sebessége dózisfüggőségének meghatározásához

A jobb combcsont alsó metafizise helyett alsó epifizisét vizsgáltuk. A combcsont alsó epifizisét a 19. ábrán bemutatott módon vágtuk ki.

A csontszövetet 80 %-os etanolban 6 órán keresztül óvatosan kevergettük, majd 95 %-os etanolba helyeztük át. A következő napon a csontszövetet 100 %-os etanolba helyeztük, melye 8 óra elteltével kicseréltünk. A következő napon a csontszövetet acetonba tettük át. Körülbelül 27 óra elteltével a szövetet aceton és Spurr-közeg 1:1 arányú elegyébe helyeztük, majd újabb 18 óra múlva 100 %-os Spurr-közegbe tettük, s kb. 24 óra hosszat óvatosan kevertük. A Spurr-közeget kicseréltük, és a szövetet 37 ’C-on újabb 24 óra hosszat inkubáltuk. Ekkor az alsó epifizisből kivágott tömbök részlegesen polimerizálódottnak tűntek, azaz a műanyag vastag kocsonyává alakult. A tömböket inkubátorba helyeztük és 45 ’C-on kb 4,5 órán keresztül hőkezeltük, hogy a beágyazó közeg megszilárduljon, végül 80 ’C-on 4 órás utolsó hőkezelést végeztünk.

A csonttömb felső vágott felszíne alatt 1 mm távolságban 400

μπη vastagságú metszetet vágtunk ki, melyet előzetesen durva szilícium-karbid porral érdesített két csiszolt üveglemez között kézzel kb. 8 μτη végső vastagságúra csiszoltunk. A csiszoláshoz kenőanyagként vizet használtunk. Ezeket a vékony metszeteket festetlenük Permount tárgylemezre (Fischer) rögzítettük.

A méréshez az előző szakaszban leírt eljárást használtuk. A lerakodási sebességet a combcsont alsó epifizisének csontbelhártya felülete által bezárt trabekuláris csont 30 csontképződési helyén mértük. A 20. ábrán látható módon az egész metszet területét szisztematikusan átvizsgáltuk. A mintákat a mérés előtt kódoltuk.

Az eredményeket a III. táblázatban foglaljuk össze.

III. TÁBLÁZAT

Az egyes csoportok számtani középértékeinek ö sszehason1ítása

	A” csop. (100 pg)	B csop. (50 pg)	C” csop. (25 ug)	”D csop. (0 pg)
Átlag (pm/nap)	1,32	1,15	1,05	0,85
SD	0,07	0,05	0,03	0,04
Csoport		t	d.f.	Ρ
A vs. B		6,64	8	< 0,01
B vs. C		5,46	8	< 0,01
C vs. D		13,80	8	< 0,01

A III. táblázatban felsorolt eredményeket a 21. és 22. ábrán grafikusan ábrázoljuk. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy patkányokban a kémiai úton szintetizált polipeptid serkentő hatása (az alkalmazott dózistartományt és időközöket figyelembe véve) a peptid beadott mennyiségével növekszik.

Tudni kell, hogy (a találmány tárgykörének korlátozása nélkül) az aminosavak sokféleképpen helyettesíthetők, mindaddig, míg ezek a helyettesítések a találmány szerinti polipeptid — csontképződést serkentő hatásáért felelős — háromdimenziós szerkezetét nem változtatják meg. Ilyenformán, lehetőség van az apoláros, alifás neutrális aminosavak (glicin, alanin, prolin, valin és izoleucin) egymás közötti cseréjére. Hasonlóan, a poláros alifás neutrális aminosavak (szerin, treonin, metionin, cisztein.

aszparagin és glutamin) egymás általi helyettesítése is lehetséges. Ilyenformán, a peptidek diszulfid-hídon keresztül történő kapcsolódása jelentős lehet, s így az egyedüli cisztein-gyököt valószínűleg változatlanul kell hagyni, és más, diszulfid-kötés kialakítására képes aminosavak a szekvenciában más helyre nem helyettesíthetők be. A töltéssel rendelkező savas aminosavak (aszparaginsav és glutaminsav) egymással való helyettesítése valószínűleg megvalósítható, csakúgy, mint a töltéssel rendelkező bázisos

aminosavak	(lizin és arginin) esetében. Az aromás oldalláncú
aminosavak	(fenil-alanin, hisztidin, triptofán és tirozin)
egymással	való helyettesítése szintén lehetséges. A
felsorolt	cserék’ és helyettesítések a szakemberek számára
ismertek.	Egyéb szubsztitúciók szintén megvalósíthatók

lehetnek.

Ami az aminosavak delécióját illeti, valószínű, hogy a szekvencia mindkét végén néhány aminosav delécióval eltávolítható.

Ezenkívül szimmetrikus vagy majdnem szimmetrikus deléciók (a háromdimenziós konfiguráció megtartásával) valósíthatók meg legnagyobb valószínűséggel.

Korlátozott mértékben belső deléciók is lehetségesek, melyek maximálian kb.

aminosavat érinthetnek.

A szekvencia végén aminosavak addíciója nagy valószínűséggel megvalósítható; a C- és N-terminálison szimmetrikus vagy közel szimmetrikus addíciók lehetségesek. Korlátozott mértékben belső addíciók is lehetségesek, melyek maximálian kb. 5 aminosavat érinthetnek.

A fentebb felsorolt módosítások közül a szekvencia végén megvalósított addíciók, deléciók vagy szubsztitúciók a legelőnyösebbek, mivel az ilyen módosításoknak számos funkciója lehet, mint pl. radio-immunvizsgálatban alkalmazható azonosító csoportként vagy kapcsoló csoportként.

A kémiai úton szintetizált protein (11. sz. szekv.) elleni antitestek szintézise

A kémiai úton szintetizált proteint (11. sz. szekv.) az alábbiak szerint három különböző kersztkötés-képzővel KLH-hoz (keyhole limpet hemocianin) kapcsoltuk.

Glútáraldehides kapcsolás

2,7 mM KCl-ot, 1,2 mM KH₂P0₄-ot, 138 mM NaCl-ot és 8,1 mM Na₂HP0₄-ot tartalmazó 2,5 ml PBS-oldatban 5 mg peptidet (11. sz. szekv) oldottunk, miáltal 2 mg/ml peptid-koncentrációjú oldatot kaptunk. 5,0 ml PBS-ben 10 mg KLH-t oldottunk, miáltal szintén 2 mg/ml végkoncentrációjú oldatot kaptunk. A KLH-oldat 1,25 ml-éhez a peptid-oldat 1,25 ml-ét adtuk, s ehhez 0,25 % végkoncentrációban glutáraldehidet adtunk. A kapott oldatot szobahőmérsékleten egy órán keresztül kevertük, majd 1 liter PBS-sel szemben dializáltuk. A PBS-t háromszor cseréltük.

Karbodiimides (EDC) kapcsolás

Az előző szakaszban leírtak szerint peptid- és KLH-oldatot készítettünk. 1,25 ml KLH-oldathoz 1,25 ml peptid-oldatot adtunk, majd a kapott oldathoz 2,5 mg EDC-t adtunk. Az oldatot szobahőmérsékleten 4 órán át folyamatosan kevertük, majd 1 liter PBS-sel szemben dializáltuk. A PBS-t háromszor cseréltük.

M-maleimidobenzoil-N-hidroxi-szukcinimid-észteres (MBS) kapcsolás

500 μΐ vízhez 5 mg peptidet adtunk, s az oldat pH-ját NaOh-dal 8,5-re állítottuk be (az oldat peptid-koncentrációja 10 mg/ml volt). Vízben 10 mg/ml koncentrációjú citrakonsavanhidrid-oldatot készítettünk. Az anhidrid-oldat 500 μΙ-ét 100 μΙ-es részletekben a peptid-oldathoz adtuk, melynek során az egyes részletek hozzáadása között az oldat pH-ját 8,5-re állítottuk. A kapott oldatot szobahőmérsékleten 1 órán keresztül folyamatosan kevertük, ezután 100 μΐ 1 M nátrium-foszfát puffért (pH = 7,2), majd 900 μΐ 100 mM nátrium-foszfát puffért (pH = 7,2) adtunk hozzá. Vízben 25 mg/ml koncentrációjú szulfo-MBS-oldatot

···« ··4« ·* · • ·· ·<·» • · · · « ·4· készítettünk, és ezen oldat 400 μΐ-ét a peptid-oldathoz adtuk, miáltal kb. 5 mg/ml MBS-koncentrációjú oldatot kaptunk. A kapott oldatot szobahőmérsékleten 30 percig folyamatosan kevertük. Az oldathoz 35 mM végkoncentrációban 6 pl β-merkapto-etanolt adtunk, s az új oldatot szobahőmérsékleten 1 órán keresztül folyamatosan kevertük. PBS-ben 3 mg/ml koncentrációban KLH-t oldottunk, s ezen oldat 2,5 ml-ét a peptid-oldathoz adtuk. Az így kapott oldatot szobahőmérsékleten 3 órán keresztül folyamatosan kevertük, majd 1 liter PBS-sel szemben dializáltuk, melynek során a PBS-t háromszor cseréltük. A peptid végkoncentrációja kb. 1 mg/ml, a KLH végkoncentrációja pedig kb. 1,5 mg/ml volt.

Az antitestek kialakítása

A szintetikus peptid oldatával az alábbiak szerint nyulakat oltottunk be. A glutáraldehiddel és az EDC-vel kapcsolt peptid oldatainak 250-250 μΐ-ét együttesen 500 μΐ Freund-féle adjuvánssal elegyítettük, s ezt az oldatot intramuszkulárisan egy nyúl hátsó lábaiba injektáltuk (mindkét lábába

500 μΐ-t). összesen 0,5 mg peptidet injektáltunk be.

A KLH-hoz MBS-sel kapcsolt szintetikus peptid oldatának 500 ul-ét 500 pl Freund-féle adjuvánssal elegyítettük, s ezt az oldatot egy másik nyúl hátsó lábaiba injektáltuk (mindkét lábába 500 //1-t). összesen ebben az esetben is 0,5 mg peptidet injektáltunk be.

• ·· ···* ··4» · > ·· · · · · · ····· • · · » · · ·

V·· ·· · ·»·

A szintetikus peptidet a gél (running [futtató]: 18 %; stacking [felhalmozó]: 5 % két sávjára helyeztük (1,5 pg és 4 pg). A gélt egy éjszakán keresztül 30 V-tal blottoltuk és 3 % tejet tartalmazó PBS-sel blokkoltuk. A gélt egy éjszakán keresztül 1 % tej/PBS-ben 1:250 arányban hígított nyúlszérummal, majd egy óra hosszat 1:1000 arányban hígított kecske anti-nyúl alkalikus foszfatázzal inkubáltuk. A gélt szubsztráttal hívtuk elő. A szintetikus peptidet coomasie-kék festéssel tettük láthatóvá. A peptidet mindegyik nyúlból a második vérvételkor vett szérummal detektáltuk, s egyik nyúl esetében sem tudtuk a peptidet kimutatni az immunizálás előtti szérummal.

Az immobilizált peptid és a szérum antitestek közötti interakciót BIAcore™ alkalmazásával végzett felületi plazmon-rezonancia alapján tovább tanulmányoztuk. A .♦ * szintetikus peptidet amin-kapcsolással dextrán mátrixon kovalensen rögzítettük. A felület köré különböző hígítású nyúlszérumot fecskendeztünk, s meghatároztuk a rögzített peptidhez kötődött antitestek mennyiségét. A titert a szérum utolsó, még pozitív (azaz 50 rezonancia egységnél nagyobb) reakciót adó hígításaként határozzuk meg. Ezzel a módszerrel mindkét nyúlból származó vérszérumban találtunk antitesteket, s azt tapasztaltuk, hogy a kölcsönhatás a vérszérum pepiiddel való előzetes inkubálásával gáltolható. A nyulak szérumában lévő antitestek egy nem rokon, rögzített pepiiddel nem léptek kölcsönhatásba.

A fentiek alapján. a polipeptid elleni antitest alkalmazásával az antitesthez kötődő polipeptid kimutatásához alkalmazható eljárás és termékek fejleszthetők ki. Az antitesteket a polipeptid antitesthez történő pozitív kötődésének jelzésére kialakított, jól ismert jelzőrendszerekhez kapcsolhatjuk vagy konjugálhatjuk. A jól ismert jelzőrendszerek közé tartoznak a radio-immun (RIA) vagy az immun-radiometriás (IRMA) vizsgálatok. Más módon, az enzim-kötött immunszorbens vizsgálat (ELISA) a RIA és IRMA vizsgálatokhoz hasonlóan viszonylag nagyfokú érzékenységet biztosíthat, de rendszerint nem radioaktív izotópok alkalmazására épül. Vizuálisan, vagy legalábbis spektrofotometriásán detektálható anyag állítható elő. A vizsgálandó enzim által kötött anyag fluoreszcenciáján alapuló vizsgálati rendszer is alkalmazható. Tudni kell, hogy a egy bizonyos polipeptid kimutatására a találmány értelmében számos jelzőrendszer alkalmazható. Standardizált mintagyűjteménnyel és kezeléssel a vérszérumban a küszöbérték feletti mennyiségben jelenlévő polipeptid jól meghatározható.

Kifejleszthetünk a kémiai úton szintetizált humán polipeptidre (11. sz. szekv.) adott antigénreakción alapuló eljárást, és a polipeptid kapott változatai (ld. fentebb az aminosavak szubsztitúciójával, deléciójával és addíciójával kapcsolatban) és konjugátumai, mint lehetséges csontképződést serkentő faktorok, előre screenelhetők. A már ismert peptid elleni antitesttel pozitív reakciót mutató • · · ···· · · ·· ···· ···· • · · · · ··· változatokat in vivő csontképződést serkentő hatásukra tesztelhetjük, például a találmányban patkányokhoz leírt rendszer alkalmazásával.

Ilyen antitest-kötött jelzőrendszer alkalmazható annak meghatározására is, hogy egy páciens vérszéruma a polipeptidet hiányos mennyiségben tartalmazza-e. Egy vizsgálandó polipeptid adott típusú páciens vérszérumban megfigyelhető normális küszöbértékének ismeretében tesztelő készletek fejleszthetők ki.

A protein kiméra alakjával további előnyt érhetünk el, amint az jól ismert. Például, teljes proteint vagy a protein egy részét kódoló DNS-szekvenciát az E. coli β-galaktozidáz C-terminális részét kódoló szekvenciához kapcsolhatunk, hogy fúziós proteint állítsunk elő. Az 1994. február 22-én közzétett 5 288 630 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalomban (és az abban felsorolt hivatkozásokban) például humán légzési szincitiális vírus F és G glikoproteinjeihez való expressziós rendszert írnak le.

SZEKVENCIALISTA

SZEKVENCIÁK SZÁMA: 11

TUDNIVALÓK AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 11 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 1. SZ. SZEKV.

Gly Pro Gly Gly Alá Gly Glu Thr Lys Pro Ile

10

TUDNIVALÓK A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 2. SZ. SZEKV.

Gly Pro Gly Gly Alá Gly Glu

5

TUDNIVALÓK A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK

(A)	HOSSZÚSÁG: 32 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	egyszálú
(D)	ALAK:	lineáris

	(xi)	SZEKVENCIA	LEÍRÁS:	3. :	SZ. :	SZEKV.
GGY	CCY	GGY	GGY	GCY	GGY	GAR	ACY	AAR	CCY AT	32
Gly	Pro	Gly	Gly	Alá	Gly	Glu	Thr	Lys	Pro Ile
1				5					10

TUDNIVALÓK A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 4. SZ. SZEKV.

Gly Pro Gly Gly Alá Gly Glu Thr Lys Pro

10

TUDNIVALÓK AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK

(A)	HOSSZÚSÁG: 21 bázispár
(B)	TÍPUS: nukleinsav
(C)	SZÁL: egyszálú
. (D)	ALAK: lineáris

(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 5. SZ. SZEKV.

AAG CTT CAC ACC ACG AAC CAG 21

TUDNIVALÓK A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 6. SZ. SZEKV.

TTA TGA GTA TTT CTT CAA GGG21

TUDNIVALÓK A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK

(A)	HOSSZÚSÁG: 329 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	egyszálú
(D)	ALAK:	lineáris

(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 7. SZ. SZEKV.

TTTGGCTTTA TTCATAGCGG TAATTAATGA TCAAGACAGT TGATTACTCG	50
TAAGCACTAT	TAAAAATTTG	CA ATG	ACT	GCT	CAA	AAT	ACA	GAC	CTT	AAC 99
		Met	Thr	Alá	Gin	Asn	Thr	Asp	Leu	Asn

5

CAA

CTA

TCC

AAC

AGT

TTC

ACT

TTA

GGG

ATC

GGA

AAA

CGA

ACA

AAT

144

Gin

Leu

Ser

Asn

Ser

Phe

Thr

Leu

Gly

He

Gly

Lys

Arg

Thr

Asn

10

15

20

GAA

CAT

ACG

GCA

GAT

TGT

AAA

ATT

AAA

CCG

AAC

AAC

TTG

CAT

AAA

189

Glu

His

Thr

Alá

Asp

Cys

Lys

He

Lys

Pro

Asn

Thr

Leu

His

Lys

25

30

35

AAA

GCT

GCA

GAG

ACT

TTA

ATG

GTC

CTT

GAC

CAA

AAT

CAA

CCA

231

Lys

Alá

Alá

Glu

Thr

Leu

Met

Val

Leu

Asp

Gin

Asn

Gin

Pro

4550

TAAAGGATCT GCAGCTTATG TCTTCTAGTT TATCTTTTGC ATAAAAAAGC281

TGCAGAGACT TTAATGGTAA TTGCCAAAAT CAACCATAAA GGATCTGC

329

TUDNIVALÓK A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK

(A)

HOSSZÚSÁG: 1

53 aminosav

(B)

TÍPUS: aminosav

(D)

ALAK: lineáris

(xi)

SZEKVENCIA

LEÍRÁS:

8. SZ.

SZEKV.

Met

Thr

Alá

Gin

Asn

Thr

Asp

Leu Asn

Gin

Leu

Ser

Asn

Ser

Phe

1

5

10

15

Thr

Leu

Gly

Ile

Gly

Lys

Arg

Thr Asn

Glu

His

Thr

Alá

Asp

Cys

20

25

30

Lys

Ile

Lys

Pro

Asn

Thr

Leu

His Lys

Lys

Alá

Alá

Glu

Thr

Leu

35

40

45

Met

Val

Leu

Asp

Gin

Asn

Gin

Pro

50

TUDNIVALÓK A 9.

SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A)

HOSSZÚSÁG: 141 bázispár (B)

TÍPUS: nukleinsav (C)

SZÁL: egyszálú (D)

ALAK: lineáris (ív) ANTI-SZENSZ: nem (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

9. SZ. SZEKV.

AATTCTTAGG ATCCTAGGAT G GGG

ATC GGA AAA CGA

ACA

AAT

GAA

CAT 48

Gly

Ile Gly Lys Arg

Thr

Asn

Glu

His » ·

ACG

GCA

GAT

TGT

AAA

ATT

AAA

CCG

AAC

ACC

TTG

CAT

AAA

AAA

GCT

93

Thr

Alá

Asp

Cys

Lys

Ile

Lys

Pro

Asn

Thr

Leu

His

Lys

Lys

Alá

10

15

20

GCA

GAG

ACT

TTA

ATG

GTC

CTT

GAC

CAA

AAT

GAA

CCA

TAAAGATCTT

139

Alá

Glu

Thr

Leu

Met

Val

Leu

Asp

Gin

Asn

Gin

Pro

25

30

35

GA

141

TUDNIVALÓK A 10. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK

(A)	HOSSZÚSÁG: 141 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁL:	egyszálú
(D)	ALAK:	lineáris

(iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 10. SZ. SZEKV.

AGCTTCAAGA	TCTTTATGGT	TCATTTTGGT	CAAGGACCAT	TAAAGTCTCT	50
GCAGCTTTTT	TATGCAAGGT	GTTCGGTTTA	ATTTTACAAT	CTGCCGTATG	100
TTCATTTGTT	CGTTTTCCGA	TCCCCATCCT	AGGATCCTAA	G	141

TUDNIVALÓK A 11. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZOSÁG: 36 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 11. SZ. SZEKV.

Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Alá Asp Cys Lys Ile

Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Alá Alá Glu Thr Leu Met Val

25 30

Leu Asp Gin Asn Gin Pro • · ·· · * ·· ·· • · · · · • * ♦· · · ·

Claims (9)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Polipeptid, amelynek aminosav-szekvenciája a következő : NH₂-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-

   -Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu~Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-C0₂H.
2. 2. Dimer polipeptid, amelyben az egyes monomerek a következő aminosav-szekvenciával rendelkeznek: NH₂-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-C0₂H, és a monomerek a cisztein-maradékok közötti diszulfid-hidakkal kapcsolódnak egymáshoz.
3. 3. Polipeptid, amely emlősökben csontstimuáló aktivi- tást fejt ki és a következő aminosav-szekvenciával rendelkező monomert: NH₂-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-G!u-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-C0₂H és ezek dimerjeit tartalmazza, és a monomerek a cisztein-maradékok közötti diszulfid-hidakkal kapcsolódnak egymáshoz.
4. 4. Polipeptid, amely emlősökben csontstimuáló aktivitást fejt ki és amely a következő aminosav-szekvenciával vagy annak részletével rendelkezik: NH₂-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp- ·· ···· ·· ·· « · · · · · • · · ·· ···

   -Gln-Asn-Gln-Pro-CO₂H vagy ennek analógja, ahol a szekvenciában aminosavak vannak kicserélve, kihagyva vagy hozzáadva, mindaddig, míg a szekvencia háromdimenziós formájából adódó, emlősöknél kifejtett csontsitimuláló aktivitás megmarad, továbbá a polipeptid konjugátumai és analógjai.
5. 5. Polipeptid, amely emlősökben csontstimuáló aktivitást fejt ki és a követező aminosav-szekvenciával vagy annak részletével rendelkező peptid dimerjét tartalmazza: NH₂-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val~Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CO₂H, ahol a dimer peptidjei a cisztein-maradékok közötti diszulfid-hidakkal kapcsolódnak egymáshoz, továbbá ezek analógjai, ahol a szekvenciában aminosavak vannak kicserélve, kihagyva vagy hozzáadva, mindaddig, míg a szekvencia háromdimenziós formájából adódó, emlősöknél kifejtett csontsitimuláló aktivitás megmarad, továbbá a polipeptid konjugátumai és analógj ai.
6. 6. Polipeptid, amely emlősökben csontstimuáló aktivitást fejt ki és a követező aminosav-szekvenciával vagy annak részletével rendelkező monomereket tartalmazza: NH₂-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-G!n-Pro-C0₂H és ezek dimerjei, ahol a monomerek a cisztein-maradékok közötti diszulfid-hi- •··· ·· dakkal kapcsolódnak egymáshoz, továbbá ezek analógjai, ahol a szekvenciában aminosavak vannak kicserélve, kihagyva vagy hozzáadva, mindaddig, míg a szekvencia háromdimenziós formájából adódó, emlősöknél kifejtett csontsitimuláló aktivitás megmarad, továbbá a polipeptid konjugátumai és analógj ai.
7. 7. A következő aminosav-szekvenciát vagy annak analógját kódoló DNS-szekvencia: NH₂-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-C0₂H, ahol a szekvenciában aminosavak lehetnek kicserélve, kihagyva vagy hozzáadva, mindaddig, míg a szekvencia háromdimenziós formájából adódó, emlősöknél kifejtett csontsitimuláló aktivitás megmarad az aminosav-szekvenciát taralmazó polipeptid esetén.
8. 8. A következő aminosav-szekvenciát vagy annak analógját kódoló DNS-szekvencia: NH₂-Gly-Ile-Gly-Lys-Arg-Thr-Asn-Glu-His-Thr-Ala-Asp-Cys-Lys-Ile-Lys-Pro-Asn-Thr-Leu-His-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr-Leu-Met-Val-Leu-Asp-Gln-Asn-Gln-Pro-CCbH, ahol a szekvenciában aminosavak lehetnek kicserélve, kihagyva vagy hozzáadva, mindaddig, míg a szekvencia háromdimenziós formájából adódó, emlősöknél kifejtett csontsitimuláló aktivitás megmarad az aminosav-szekvenciát taralmazó polipeptid esetén, továbbá a DNS-hez hibridizálódó olyan szekvenciák, amelyek olyan aminosav• · · ···« ·· ·· • · · · · · ··

   -szekvenciával rendelkező polipeptidet kódolnak, amely emlősöknél csontstimuláló aktivitással rendelkezik.

   9. Vektor, amely a 7. igénypont szerinti DNS- szekvenciát tartalmazza. 10. Vektor, amely a 8. igénypont szerinti DNS-

   szekvenciát tartalmazza.
9. 11. Eljárás fokozott csontképződési sebességet indukáló polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) emlős vérszérum-mintából 3000 és 30 000 dalton közötti molekulatömegű polipeptideket és proteineket izolálunk, és