CZ20033085A3

CZ20033085A3 - @}Fenylpiperidin@ylidenmethylB benzamidové deriváty a jejich použití pro ošetřování bolestiŹ úzkosti nebo gastrointestinálních poruch

Info

Publication number: CZ20033085A3
Application number: CZ20033085A
Authority: CZ
Inventors: Brownáwilliam; Walpoleáchristopher
Original assignee: Astrazenecaáab
Priority date: 2001-05-18
Filing date: 2002-05-16
Publication date: 2004-05-12
Also published as: EP1395576A1; MXPA03010439A; CA2446332A1; DE60205894T2; HUP0401096A2; ZA200308633B; CN1509282A; EP1395576B1; BG108326A; US20040142967A1; AR035973A1; PL366640A1; NO20035116D0; US7074808B2; SK13952003A3; WO2002094812A1; SE0101765D0; ATE303379T1; KR20040000467A; JP2005510457A

Description

4-(Fenylpiperidin-4-ylidenmethyl)benzamidové deriváty a jejich použiti pro ošetřování bolesti, úzkosti nebo gastrointestinálních poruch

Oblast techniky

Přítomný vynález je zaměřen na nové sloučeniny, způsob jejich přípravy, jejich použití a farmaceutické prostředky obsahující tyto nové sloučeniny. Nové sloučeniny jsou vhodné pro terapii a obzvláště léčení bolesti, úzkosti a funkčních gastrointestinálních poruch.

Dosavadní stav techniky

Bylo identifikováno, že δ-receptor má určitou roli v mnoha tělesných funkcích, například v oběhovém systému a systému bolesti. Proto ligandy δ-receptoru mohou nalézt potenciální využití jako analgetika a/nebo antihypertenzivní prostředky. Dále se ukázalo, že ligandy δ-receptoru mají imunomodulační účinky.

V současné době je dobře ustanovena identifikace alespoň tří různých populací opioidních receptorů (μ, δ a κ) a všechny tři zmíněné populace jsou patrné jak v centrálním, tak v periferním nervovém systému mnoha druhů včetně člověka. Při aktivaci jednoho či více z těchto receptorů byla na různých zvířecích modelech pozorována analgézie.

S několika výjimkami platí, že v současné době dostupné selektivní ligandy opioidních δ-receptorů jsou svou povahou peptidické sloučeniny a nejsou vhodné pro systémové podávání. Jedním příkladem non-peptidického ·· · • ·· ......* ;

·· ·· ·· ·· ·· · agonisty δ-receptoru je sloučenina SNC80 (E.J.Bilsky a kol., Journal of Pharmacology and Experimental

Therapeutics, 273 (1), 359 až 366 (1995)). Nicméně nadále existuje potřeba selektivního agonisty δ-receptoru, který by měl ne pouze zlepšenou selektivitu, ale též vylepšený profil vedlejších účinků.

Proto cílem přítomného vynálezu je nalezení nových analgetických prostředků s lepšími analgetickými účinky a též s vylepšeným profilem vedlejších účinků při porovnání s nyní používanými agonisty μ-receptoru, stejné tak se zdokonalenou systémovou účinností.

Analgetika, která byla do současné doby identifikována a patří k dosavadnímu stavu techniky, mají mnoho nevýhod v tom smyslu, že mají špatnou farmakokinetiku a nemají analgetické účinky, pokud se podají systémově. Též je zdokumentováno, že výhodné sloučeniny, které jsou agonisty δ-receptoru, popsané v dosavadní ve stavu techniky, vykazují při systémovém podávání významné konvulzivní účinky.

Původci přítomného vynálezu nyní nalezli určité sloučeniny, které vykazují překvapivě zdokonalené vlastnosti, mimo jiné lepší δ-agonistickou účinnost, lepší účinnost in vivo, lepší farmakokinetiku, biologickou dostupnost, stabilitu in vitro a/nebo nižší toxicitu.

Podstata vynálezu

Nové sloučeniny podle přítomného vynálezu jsou definovány obecným vzorcem I • · • «

ve kterém

R¹ je vybrán z jakékoliv

i) fenylové skupiny ii) pyridylové skupiny iii) thienylové skupiny iv) furylové skupiny

v) imidazolylové skupiny vi) triazolylové skupiny

vii) pyrrolylové skupiny

viii) thiazolylové skupiny ix) pyridyl-N-oxidu;

O

I

M

kde každý R¹ fenylový kruh a R¹ heteroaromatický kruh může být popřípadě a nezávisle dále substituován 1, 2 nebo 3 substituenty nezávisle vybranými z přímé nebo rozvětvené alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, N0₂, CF₃, alkoxyskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, atomu chloru, atomu fluoru, atomu bromu a atomu jodu; přičemž substituenty na fenylovém kruhu a na heteroaromatickém kruhu mohou být umístěny v jakékoliv poloze zmíněného kruhového systému.

Dalším ztělesněním přítomného vynálezu je sloučenina obecného vzorce I, kde R¹ má význam vymezený výše a každý R¹ fenylový kruh a R¹ heteroaromatický kruh mohou být nezávisle dále substituovány methylovou skupinou.

• ·· • · · ·

Dalším ztělesněním přítomného vynálezu je sloučenina obecného vzorce I, kde R¹ je fenylová skupina, pyrrolylová skupina, pyridylová skupina, thienylová skupina nebo furylová skupina, popřípadě s 1 nebo 2 výhodnými substituenty na R¹ fenylovém kruhu nebo R¹heteroaromatickém kruhu.

Dalším ztělesněním přítomného vynálezu je sloučenina obecného vzorce I, kde R¹ je fenylová skupina, pyrrolylová skupina nebo pyridylová skupina, popřípadě s 1 nebo 2 výhodnými substituenty na R¹ fenylovém kruhu nebo R¹ heteroaromatickém kruhu.

Dalším ztělesněním přítomného vynálezu je sloučenina obecného vzorce I, kde R¹ je thienylová skupina nebo furylová skupina, popřípadě s 1 nebo 2 výhodnými substituenty na R¹ fenylovém kruhu nebo R¹ heteroaromatickém kruhu.

V případě, kdy jsou R¹ fenylový kruh a R¹heteroaromatický (-é) kruh (kruhy) substituovány, výhodné substituenty se nezávisle vyberou z CF₃, methylové skupiny, atomu jodu, atomu bromu, atomu fluoru a atomu chloru.

Reakční krok g ve schématu 1 znázorněném dále se provede reakcí intermediární sloučeniny obecného vzorce II • ··

(II) ve kterém

PG je uretanová skupina nebo skupina chránící urethanovou skupinu, například Boc a CBZ, nebo benzylová skupina nebo substituovaná skupina chránící benzylovou skupina, jako je například 2,4-dimethoxybenzylová skupina;

s kyselinou 3-aminofenylboritou, za použití palladiového katalyzátoru, například Pd(PPh₃)₄, za přítomnosti báze, jako je například Na₂CO₃, čímž se připraví sloučenina obecného vzorce III

ze které se posléze za standardních podmínek sejme chránící skupina a alkyluje se za redukčních podmínek sloučeninou obecného vzorce R¹-CHO, čímž se dostanou sloučeniny obecného vzorce I.

«« ··

Nové sloučeniny podle přítomného vynálezu jsou vhodné pro terapii, obzvláště pro terapii různých bolestivých stavů, jako je chronická bolest, neuropatická bolest, akutní bolest, rakovinná bolest, bolest zapříčiněná revmatoidní artritidou, migrénou, viscerální bolest atd. Tento výčet by neměl být nicméně považován za vyčerpávající.

Sloučeniny podle přítomného vynálezu jsou vhodné jako imunomodulátory, obzvláště v případě autoimunních onemocnění, jako je artritida, pro kožní štěpy, orgánové transplantáty a obdobné chirurgické potřeby, v případě kolagenóz, různých alergií, pro použití jako antitumorózní a antivirové prostředky.

Sloučeniny podle přítomného vynálezu jsou vhodné pro chorobné stavy, u kterých je přítomna či na jejichž patogeneze se podílí degenerace nebo dysfunkce opioidních receptorů. Použití může zahrnovat užití izotopově značených verzí sloučenin podle přítomného vynálezu v diagnostických technikách a zobrazovacích metodách, jako je například pozitronová emisní tomografie (PET).

Sloučeniny podle přítomného vynálezu jsou vhodné pro léčení průjmu, deprese, úzkosti a se stresem souvisejících poruch, jako jsou posttraumatické stresové poruchy, panická porucha, generalizovaná anxiozní porucha, sociální fóbie a obsedantně-kompulzivní porucha; inkontinence moči, různé mentální choroby, kašel, edém plic, různé gastrointestinální poruchy, například zácpa, funkční gastrointestinální poruchy, jako je syndrom dráždivého tračníku a funkční dyspepsie, Parkinsonova ·· · · • · · * · ·· ·· ·· nemoc a další motorické poruchy, traumatické poškození mozku, mrtvice, kardioprotekce po infarktu myokardu, poranění míchy a závislost na návykových látkách, včetně léčení zneužívání alkoholu, nikotinu, opioidních a jiných látek, a pro léčení poruch sympatického nervového systému, například hypertenze.

Sloučeniny podle přítomného vynálezu jsou vhodné jako analgetický prostředek pro použití v průběhu celkové anestézie a monitorované anestetické péče. Často se používají kombinace těchto prostředků s různými vlastnostmi za účelem dosáhnout vyvážených účinků nutných pro udržení stavu anestézie (například amnézie, analgézie, svalové relaxace a sedace). Do této kombinace patří inhalační anestetika, hypnotika, anxiolytika, neuromuskulární blokátory a opioidy.

Do rozsahu přítomného vynálezu patří též použití jakýchkoliv sloučenin obecného vzorce I uvedeného výše, pro výrobu léčiva pro léčení jakéhokoliv ze stavů vyčtených výše.

Dalším aspektem přítomného vynálezu je způsob léčení subjektu trpícího jakýmkoliv ze stavů vyčtených výše, přičemž se pacientovi, který zmíněnou léčbu potřebuje, podá účinné množství sloučeniny obecného vzorce I uvedeného výše.

Další aspekt přítomného vynálezu představují meziprodukty obecného vzorce II a III • · · • ·· · · ve kterých

• ·

PG je skupina chránící methanovou skupinu, například Boc nebo CBZ, nebo benzylová skupina nebo skupina chránící substituovanou benzylovou skupinu, jako je 2,4-dimethoxybenzylová skupina.

Dále jsou uvedeny způsoby přípravy.

Příklady provedení vynálezu

Přítomný vynález bude nyní detailněji popsán následujícími schématy a příklady, které nejsou zamýšleny jako limitující pro přítomný vynález.

Schéma 1

->e isobutyl-chlorformiat/EtsN;

Et₂NH

Příklad 1

N,N-Diethyl-4-(3-aminofenylpiperidin-4-ylidenmethyl)benzamid (sloučenina 7)

i) Příprava terc-butylesteru kyseliny 4-(4-methoxy00 ····

0 0 0 · · · ♦ ·

00 0 0 * · · · * • · 0*· · 000 · ···

000 0 0 0 0 00 · • 0 00 00 00 · karbonylbenzyliden)piperidin-l-karboxylové

Směs 11,2 g (49 mmol) výchozí látky 1 a 25 ml trimethylfosfitu se zahřívá pod dusíkem při zpětném toku po dobu 5 hodin. Přebytek trimethylfosfitu se odstraní ko-destilací s toluenem, čímž se dostane sloučenina 2 v kvantitativním výtěžku.

^ΧΗ NMR (CDC1₃) δ 3,20 (d, 2H, J - 22 Hz, CH₂) , 3,68 (d,

3H, J = 10,8 Hz, OCH₃), 3,78 (d, 3H, J = 11,2 Hz, OCH₃) ,

3,91 (s, 3H, OCH₃) , 7,38 (m, 2H, Ar-H), 8,00 (d, 2H, J = 8 Hz, Ar-H).

ii) terc-Butylester kyseliny 4-(4-methoxykarbony1benzyliden)piperidin-l-karboxylové (sloučenina 3)

K roztoku sloučeniny 2 ve 200 ml suchého THF se pří teplotě -78 °C po kapkách přidá 32,7 ml (49 mmol) 1,5M lithium-diisopropylamidu v hexanech. Reakční směs se potom nechá ohřát na teplotu místnosti a nato se přidá 9,76 g (49 mmol) N-terc-butoxykarbonyl-4-piperidonu ve 100 ml suchého THF. Po 12 hodinách se reakce přeruší přidáním 300 ml vody a extrahuje se třikrát 300 ml ethyl-acetátu. Spojené organické fáze se vysuší MgSO₄ a odpaří se, čímž se dostane surový produkt, který se čistí velmi rychlou chromatografií, tím se připraví 5,64 g (35%) sloučeniny 3 jako bílé pevné látky.

IR (NaCl) 3424, 2974, 2855, 1718, 1688, 1606, 1427, 1362,

1276 cm^-1;

^XH NMR (CDCI3) δ 1,44 (s, 9H) , 2,31 (t, J = 5,5 Hz, 2H) ,

2,42 (t, J = 5,5 Hz, 2H) , 3,37 (t, J = 5,5 Hz, 2H) , 3,48 (t, J = 5,5 Hz, 2H) , 3,87 (s, 3H, OCH₃) , 6,33 (s, 1H, CH) , 7,20 (d, J = 6,7 Hz, 2H, Ar-H), 7,94 (d, J = 6,7 Hz, 2H, Ar-H);

¹³C NMR (CDC1₃) δ 28,3, 29,2, 36,19, 51, 9, 123,7, 127,8, 128,7, 129,4, 140,5, 142,1, 154,6, 166,8.

iii) Příprava terc-butylesteru kyseliny 4-brom-4-[brom-(4-methoxykarbonylfenyl)methyl]piperidin-l-karboxylové (sloučenina 4)

Ke směsi 5,2 g (16 mmol) sloučeniny 3 a 1,0 g K₂CO₃ve 200 ml suchého dichlormethanu se při teplotě 0 °C přidá roztok 2,9 g (18 mmol) bromu ve 30 ml CH₂C1₂. Po 1,5 hodině při teplotě místnosti se roztok po odfiltrování K₂CO₃ odpaří. Odparek se poté rozpustí ve 200 ml ethyl-acetátu, promyje se 200 ml vody, 200 ml 0,5M HC1, 200 ml vodného roztoku chloridu sodného a vysuší se MgSO₄. Odstranění rozpouštědel poskytne surový produkt, který rekrystalizuje z methanolu, čímž se dostane 6,07 g (78%) sloučeniny 4, jako bílé pevné látky.

IR (NaCl) 3425, 2969, 1725, 1669, 1426, 1365, 1279, 1234 cm^-1;

^XH NMR (CDC1₃) δ 1,28 (s, 9H), 1,75 (m, 1H), 1,90 (m, 1H), 2,1 (m, 2H), 3,08 (široký, 2H) , 3,90 (s, 3H, OCH₃) , 4,08 (široký, 3H), 7,57 (d, J= 8,4 Hz, 2H, Ar-H), 7,98 (d, J = 8,4 Hz, 2H, Ar-H);

¹³C NMR (CDC1₃) δ 28, 3, 36, 6, 38,3, 40,3, 52,1, 63,2,

72,9, 129,0, 130,3, 130,4, 141,9, 154,4, 166,3.

iv) terc-Butylester kyseliny 4-[brom-(4-karboxyfenyl)methylen]piperidin-l-karboxylové (sloučenina 5)

Roztok 5,4 g (11 mmol) sloučeniny 4 ve 300 ml methanolu a 100 ml 2,0M NaOH se zahřívá na teplotu 40 °C po dobu 3 hodin. Pevná látka se zachytí filtrací a suší se ve vakuu přes noc. Suchá sůl se rozpustí ve směsi 40 % acetonitrilu a vody a její pH se upraví na hodnotu 2 za použití koncentrované HC1. Filtrací se izoluje 3,8 g (87%) sloučeniny 5 jako bílý prášek.

NMR (CDC1₃) δ 1,45 (s, 9H, ^fcBu) , 6,1 Hz, 2H), 2,64 (dd, J = 5,5 Hz,

J = 5,5 Hz, 6,1 Hz, 2H) , 3,54 (dd, 2H), 7,35 (d, J = 6,7 Hz, 2H, Ar-H)

2,22 (dd, J = 5,5 Hz, 6,1 Hz, 2H), 3,34 (dd, J = 5,5 Hz, 6,1 Hz, , 8,08 (d, J = 6,7 Hz,

2H, Ar-H);

¹³C NMR (CDC1₃) δ 28,3, 31, 5, 34,2, 44,0, 115,3, 128,7, 129,4, 130,2, 137,7, 145,2, 154,6, 170,3.

v) terc-Butylester kyseliny 4-[brom-(4-diethylkarbamoylfenyl)methylen]piperidin-l-karboxylové (sloučenina 6)

Do roztoku 1,0 g (2,5 mmol) sloučeniny 5 v 10 ml suchého dichlormethanu se při teplotě -20 °C přidá 450 mg (3,3 mmol) isobutyl-chlorformiátu. Po 20 minutách se při teplotě -20 °C přidají 4 ml diethylaminu a reakční směs se nechá ohřát na teplotu místnosti. Po 1,5 hodině se rozpouštědla odpaří a odparek se rozdělí mezi ethyl-acetát a vodu. Organická fáze se promyje vodným roztokem chloridu sodného a vysuší se MgSO₄. Odpařením rozpouštědel se dostane surový produkt, který se čistí velmi rychlou chromatografii, čímž se dostane 800 mg •0 ·0·0 ·0

0 0 0 • 0 0 0

0 0 0

0 0

0 0 0 0 0 0 • · 0 0 • 0 00 * 0 0

0 0 0

00000

0 0

0 (73%) sloučeniny 6 v podobě bílých jehliček.

IR (NaCI) 3051, 2975, 1694, 1633, 1416, 1281, 1168, 1115 cm^-1;

^XH NMR (CDCls) δ 1,13 (široký, 3H, CH₃) , 1,22 (široký, 3H, CH₃), 1,44 (s, 9H, ^u), 2,22 (t, J = 5,5 Hz, 2H) , 2,62 (t, J = 5,5 Hz, 2H), 3,33 (m, 4H), 3,55 (m, 4H), 7,31 (d, J = 8,0 Hz, 2H, Ar-H), 7,36 (d, J = 8,0 Hz, 2H, Ar-H);

¹³C NMR (CDCls) δ 12,71, 14,13, 28,3, 31, 5, 34,2, 39, 1, 43,2, 79,7, 115, 9, 126, 3, 129,3, 136, 8, 137,1, 140, 6, 154,6, 170, 5..

vi) Příprava N,N-diethyl-4-(3-hydroxyfenyl-piperidin-4-ylidenmethyl)benzamidu (sloučenina 7)

Do baňky obsahující 8,5 g (18,9 mmol) vinylbromidu (6) se přidá 120 ml xylenu, 80 ml ethanolu a 1,5 ekvivalentu kyseliny 3-aminofenylborité. Roztok se odplyňuje po dobu 30 minut, potom se kanylou přidá 29 ml (3,0 ekvivalenty) 2N vodného uhličitanu sodného odplyněného během 30 minut. Potom se přidá 0,075 ekvivalentu tetrakistrifenylfosfinu palladia. Reakční směs se odplyňuje po dobu 10 minut a zahřívá se na teplotu 80 °C přes noc. Reakční směs se ochladí, zředí vodou a přefiltruje přes vložku z rozsivkové zeminy. Organické látky se odstraní a vodná fáze se extrahuje dvakrát 50 ml etheru. Spojený organický extrakt se vysuší bezvodým síranem hořečnatým, přefiltruje se a odpaří. Odparek se použije surový v dalších reakcích.

Příklad 2 ·· fcfcfcfc fcfc ·· • · · · • · fcfc • · · » • · · * fcfc fc 9 • · · • · · • · · · • · · · fcfc ·· • fc fc • fc · • · fc « fc fc ·«··· • · · fcfc ·

N,N-Diethyl-4-(3-aminofenyl-N-benzylpiperidin-4-ylidenmethyl)benzamid (sloučenina 9)

i) Příprava N,N-diethyl-4-(brom-N-benzylpiperidin-4-ylidenmethyl)benzamidu (sloučenina 8)

6,122 g (13,4 mmol) sloučeniny 6 připravené podle kroku (v) z příkladu 1 uvedeného výše se při teplotě místnosti zpracuje s 13 ml TFA v 80 ml dichlormethanu. Po 2 hodinách se reakční směs promyje 25 ml 2M roztoku hydroxidu sodného a organická vrstva se oddělí. Organická vrstva se vysuší MgSO₄, přefiltruje se a odpaří se. Odparek se rozpustí ve 120 ml dichlormethanu, ochladí na 0 °C a přidá se 1,8 ml (15,1 mmol) benzylbromidu a 5,7 ml (41,0 mmol) triethylaminu. Reakční směs se postupné ohřeje na teplotu místnosti a po 20 hodinách se promyje jednou 100 ml vody. Organická vrstva se vysuší MgSO₄, přefiltruje se a odpaří se. Čištěním velmi rychlou chromatografií za eluování 50% až 60% ethyl-acetátem v hexanech se dostane 3,80 g produktu (výtěžek 64%).

NMR (CDC1₃) δ 1,13 (široký, 3H, CH₃) , 1,23 (široký, 3H, CH₃), 2,28 (m, 2H), 2,37 (m, 2H), 2,55 (m, 2H), 2,69 (m, 2H), 3,27 (m, 2H), 3,53 (široký, 4H), 7,20 až 7,40 (m,

9H, Ar-H).

ii) N,N-Diethyl-4-(3-aminofenyl-N-benzylpiperidin-4-ylidenmethyl)benzamid (sloučenina 9)

Do baňky obsahující 8,5 g (18,9 mmol) vinylbromidu (8) se přidá 120 ml xylenu, 80 ml ethanolu a 3,96 g (1,5 ekvivalentu) kyseliny 3-aminofenylborité. Roztok se • · · · ··· · · · · · · · • · ··· 9 9 9 9 9 99 9 ··· · · · · · · · odplyňuje po dobu 30 minut, potom se kanylou přidá 29,0 ml (3,0 ekvivalenty) 2N roztoku uhličitanu sodného odplyněného během 30 minut. Potom se přidá 1,67 g (0,075 ekvivalentu) tetrakistrifenylfosfinu palladia. Reakční směs se odplyňuje po dobu 10 minut a poté se zahřívá na teplotu 80 °C po dobu 17 hodin. Reakční směs se poté ochladí, zředí vodou a přefiltruje přes rozsivkovou zeminu. Organické látky se odstraní a vodná fáze se extrahuje dvakrát etherem. Spojené organické extrakty se vysuší bezvodým síranem hořečnatým, přefiltrují se a odpaří. Odparek se čistí velmi rychlou chromatografií za eluování 2% až 4% methanolem v dichlormethanu. Dostane se 8,14 g (93%) produktu jako pěna oranžové barvy. Odparek se rozpustí v 80 ml etheru a přidá se 40 ml směsi HCl a etheru. Po 30 minutách se suspenze odpaří a pevné látky se vysuší ve vysokém vakuu.

Příklady 3 až 9

Sloučeniny z následujících příkladů 3 až 9 se připraví obecným syntetickým postupem uvedeným dále.

O

nh₂

Do roztoku sloučeniny 7 v suchém tetrahydrofuranu (THF) se přidá 1 až 1,5 ekvivalentu aldehydu a potom 1 až 1,6 ekvivalentu triacetoxytetrahydroboritanu sodného.

• · · · 0 0 0 · · · »

0 0 ··· 0 000 00000 • 00 0 · 00 · , · · ·

00 00 00 00 *

Reakční směs se míchá při teplotě místnosti pod atmosférou dusíku po prodloužený časový interval (6 až 48 hodin), aby bylo jisté, že je reakce ukončena. Reakční směs se poté podrobí standardnímu postupu zpracování a standardnímu čištění. Množství THF není rozhodující.

Výhodné je množství odpovídající přibližně 30 ml na 1 gram aminu.

Postup popsaný dále v příkladu 3 je typický.

Příklad 3

O

sloučenina 7 příklad 3

Do roztoku 540 mg (1,48 mmol, 1,0 ekvivalentu) aminu 7 ve 20 ml tetrahydrofuranu se při teplotě místnosti přidá 170 μΐ (1,38 mmol, 1,2 ekvivalentu) 2-pyridin-karboxaldehydu. Po míchání během 10 minut se do roztoku přidá 410 mg (1,93 mmol, 1,3 ekvivalentu) triacetoxytetrahydroboritanu sodného. Po míchání přes noc se reakční směs zředí 10 ml dichlormethanu a 15 ml 2N vodného roztoku hydroxidu sodného. Fáze se oddělí a vodná fáze se opět extrahuje třikrát 15 ml dichlormethanu. Organické fáze se spojí, vysuší síranem sodným, přefiltrují a odpaří se za sníženého tlaku. Surový produkt se čistí preparativní HPLC s reverzní fází (gradient: 10% až 50% B v A, A: 0,1% TFA ve vodě, B: 0,1% TFA v acetonitrilu). Frakce se odpaří za sníženého tlaku a neutralizuje se na pH = 11 pomocí 2M vodného roztoku hydroxidu sodného. Směs se potom extrahuje dvakrát 30 ml ethyl-acetatu. Organické fáze se spojí, vysuší síranem sodným a přefiltrují. K této směsi se přidají 4 ml (přibližně 3,5 ekvivalentu) 1M roztoku HCl v diethyletheru. Výsledná směs se potom odpaří za sníženého tlaku. Bílá pevná látka se rozetře s diethyletherem a odpaří se za sníženého tlaku, čímž se dostane 135 mg (19% výtěžek) sloučeniny z nadpisu.

Sloučeniny z následujících příkladů se připraví analogickým způsobem. Analytické údaje pro tyto sloučeniny jsou uvedeny v tabulce 1 dále.

Tabulka 1

Analytické údaje pro sloučeniny z příkladů syntézy

Př. č.	R¹	Název	NMR údaje (400 MHz, CD₃OD)
2	Ό	4-[1-(3-aminofenyl)-1- -(l-benzylpiperidin-4- -yliden)methyl]-N,A- -diethylbenzamid	7.4Í Ar- 2H, (m, 2H) CH.	5-7,56 (m, 6H. Ar-H); 7,26-7,38 (m, 6H, H); 7,20 (t, J=2Hz, 1H, Ar-H); 4^7 (s, ArCH₂N); 3,51-3,54.(xn, 4H) ; 3,28-3,30 2H); 3,17-3,22 (m, 2H); 2,74 (t, J=14Hz, ; 2,58-2,61 (m, 2H).; 1,22-1,25 (m, 3H, ); 1,11-1,15 (m, 3H, CH₃)

φ ΦΦΦ «Γφ Φ Φ ΦΦΦ • φφ φφφ φ φφφ ΦΦΦΦΦ •Φ φφ φφ φφ φφ ·

3	Ό	4- [1- (3-aminofenyl) -1- -(l-pyridin-2-yl- methylpiperidin-4- -yliden)methyl]-Ν,Ν- -diethylbenzamid	8,67 (d, 1=4,7Hz, 1H, Ar-H); 7^88 (xn, 1H, Ax-H); 7/1 (d, J=7,4Hz, 1H, Ar-H); 7,44 (xn, 2H, Ar-H); .7,35 (d, J=8,3Hz, 2H, Ar-H); 7,27 (d, l=8_f3Hz, 2H, Ar-H); 7,19 (t, J=7,4Hz, 2H, Ar-H); 7,09 (s, 1H, Ar-H); 4,52 (s, 2H, NCH₂Ar) ; 3,52 (m, 2H, CHO ; 3,44 · (m, 4H, CH₂); 3,27 (xn, 2H, CHO 12,70 (t, >5,6Hz, 4H, NCH₂Me) ;· 1,12 (br s, 3H, CH₃) ; 1,10 (brs, 3H,CH₃)
4	ΊΟ	4-[1-(3-aminofenyl)-1- -(l-pyridin-4-yl- methylpiperidin-4- -yliden)methyl]-Ν,N- -diethylbenzamid	8,81 J=6/ 8,05 J=7,4 Ar-H H);4 CHO NCH 3H, (	(d, J=5,5Hz, 2H_S Ar-H); 8,74 (d, 1 Hz, 1H, Ar-H); 8,20 (xn, 2H, Ar-H); (d, J=6,5Hz, 1H, Ar-H); 7,42 (t, Hz, 1H, Ar-H) ; 7,25 (t, J=8,4Hz, 2H, ); 7,19 (xn, 2H, Ar-H); 6,98 (m, 1H, Ar/0 (s, 2H, NCH₂Ar); 3,37 (br s, 6H, ; 3,18 (br s, 2H, CH₂); 2,.62 (xn, 4H, ₂Me); 1,11 (br ε, 3H, CH₃); 1,00 (br s, 3H0
5	X	4-[1-(3-aminofenyl)-1- -(l-furan-2-ylme- thylpiperidin-4- -yliden)methyl]-Ν, N- -diethylbenzamid	7,66 H); ;7,2: Ar-H 2H,1 2H,( NCH s, 3H	(s, 1H, Ar-H); 7,53 (t, J=7„4Hz, 1H, Ar7/5 (xn, 3H, Ar-H); 7/7 (m, 3H, Ar-H) > (s, 1H, Ar-H) ; 6.74 (d, 1=2,7 Hz, 1H, ); 6,52 (t, J=l,8Hz, 1Η,·Αγ-Ή) ; 4/5 (s, 4CH₂Ar); 3/2 (br s, 4H, CHO; 3,29 (xn, 3H0; 3,15 (m, 2H, CH₂); ^75 (m, 2H, ₂Me); 2/7 (m, 2H, NCHjMe); 1/2 (br ,CH3);l_(fll(brs,3H,CH3)
6	X”	4-[1-(3-aminofenyl)-1- -(l-furan-3-ylme- thylpiperidin-4- -yliden)methyl]-N,N- -diethylbenzamid	7,70 H); J=8y Ar-H H); NCH CHO NCH brs,	(s, 1H, Ar-H) ; 7.55 ft J=l,8Hz, 1H, Ar7/7 (í, J=7,4Hz, 1H, Ar-H); 7,28 (d, 1Hz, 2H, Ar-H) ; 7,18 ( d, J=8,4Hz, 2H, ) ; 7,10 (m, 2Η,·Αχ-Η); 6,$7 (s, 1H, Ar5/5 (s, ÍH, Ar-H); 4,17 (s, 2H, ₂Ar); 3,48 (m, 4H, CHO ;3,21 (m, 2H, ; 3,01 (xn, 2H, CH₂) ; 2,71 (ro,'2H, ₂Me); 2,47 (m, 2H, NCH₂Me); 1,15 ( 3H, CHO ; 1,03 (br s, 3H, CHO
7	ΊΟ	4-[1-(3-aminofenyl)-1- -(l-thiofen-2-ylme- thylpiperidin-4- -yliden)methyl]-N,N- -diethylbenzamid	7,35 (m, 2H, Ar-H); 7,22 (d, J=7/Hz, 2H, Ar-H);7,12 (d, J=8,4Hz, 2H, Ar-H); 7,07 i (m, 1H, Ar-H); 6/4 (t, J=7/Hz, 1H, Ar-H); 6,50 (m, 1H, Ar-H); 6_ř40 (br s, 1H, Ar-H); 6/5 (d, J=7,4Hz, 1H, Ar-H); 3,83 (s, 2H, NCH₂Ar); 3,44 (m, 2H, CH₂); 3,31 (m, 2H, CHO í 4-74 (br s, 4H, CHO ! ^0 (m, 4H, NCH₂Me); 1,14( br s, 3H, CH₃); 1,02 (br s, 3H. CHO

0 ·· · · 0 4 0 0 0 0 0

0000 0* 0 · 0 · • 0 00 · · « ····

0« 40« 0 000 00000

40 0 4 00 0 0-0 0

00 04 04 44 0

8	x>	4-[1-(3-aminofenyl)-1 -(l-thiofen-3-ylme- thylpiperidin-4- -yliden)methyl]-N,N- -diethylbenzamid	7,62 (d, J=5,5Hz, 1H, Ar-H); 7.34 (m, 3H, Ar-H); 7,24 (d, J=7/Hz, 2H, Ar-H); 7,19 (t, J=7,4Hz, 1H, Ar-H); 7,12(dd, J= 3,7,5.6Hz, 1H, Ar-H); 6,83 (d, >8,4Hz, 1H, Ar-H); 6,71 (m, 2H, Ar-H) ; 4,59 (s, 2H, NCH₂Ar); 3,52 (m, 4H, C%),; 3,40 (xo, 4H, CH₂); 2,65 (br Β, 4H, NCH₂Me) 1,22 ( m, 3H, CH_S); 1,10 (m, 6H, CH₃) .
9		4-[1-(3-aminofenyl)-1 -(l-pyrrol-2-ylme- thylpiperidin-4- -yliden)methyl]-N,N- -diethylbenzamid	1,12 (br s, 3H), 1,24 (br s, 3H), 2.55-2,62 (m, 2H), 2.70-2,77 (m, 2H), 3,05-3,14 (m, 2H), 3,30 (br s, 2H), 3,44-3,60 (m, 4H), 4,35 (δ,^- 2H), 6,16 (s, 1H), 6,37 (s, 1H), 6,88 (s, 1H), 7,25-738 (m, 7H), 7,52-7,56 (m, 1H), 10,69 (s, 1H)

Poznámka:

br = široký signál

Farmaceutické prostředky

Nové sloučeniny podle přítomného vynálezu mohou být podány perorálně, sublinguálně, intramuskulárně, subkutánně, topicky, intranazálně, intraperitoneálně, intrathorakálně, intravenózně, epidurálně, intrathekálně, intracerebroventrikulárně a injekcí do kloubů.

Výhodná cesta podání je perorální, intravenózní nebo intramuskulární.

Dávka bude závislá na způsobu podání, závažnosti onemocnění, věku a hmotnosti pacienta a dalších faktorech běžně posuzovaných ordinujícím lékařem při sestavování individuálního režimu a dávkové hladiny, tak aby toto bylo pro konkrétního pacienta nejvhodnější.

« 4 4 4 · · 9 ···· • 4 4 · · 4 4 44« · · 4 4 ·

4 4 4 ···· 4 4 ·

4· ·· · · ♦· ·· ·

Pro výrobu farmaceutických prostředků ze sloučenin podle přítomného vynálezu, mohou být inertní farmaceuticky přijatelné nosiče buď pevné nebo kapalné. Pevné formy prostředků zahrnují prášky, tablety, dispergovatelné granule, kapsle, sáčky a čípky.

Pevným nosičem může být jedna nebo více látek a mohou též fungovat jako ředidla, ochucovací přípravky, rozpustnost podporující přípravky, lubrikační přípravky, suspendující přípravky, pojidla nebo přípravky podporující rozpadání tablet; mohou též být použity jako materiál pro enkapsulaci.

V případě prášků je nosičem jemně rozmělněná pevná látka, která je ve směsi s jemně rozmělněnou účinnou složkou. U tablet se účinná složka ve vhodných poměrech smísí s nosičem majícím nezbytné vazebné vlastnosti a stlačí se do požadovaného tvaru a velikosti.

Pro přípravu prostředků ve formě čípků se vosk s nízkou teplotou tání, například směs glyceridů mastných kyselin a kakaového másla, nejprve roztaví a do této hmoty se například mícháním disperguje účinná složka. Roztavená homogenní směs se poté vlije do forem vhodné velikosti a nechá se ochladit a ztuhnout.

Vhodnými nosiči jsou uhličitan hořečnatý, stearát hořečnatý, mastek, laktóza, cukr, pektin, dextrin, škrob, tragant, methylcelulóza, natrium-karboxymethylcelulóza, vosk s nízkou teplotou tání, kakaové máslo a látky jim podobné.

« · • · · · • · · · · * · · · · • · ·· 9 · · * · · · • ·· · · · · · · β ····· • » · · · · · · · · · • · · · ·· · · *

Soli zahrnují, avšak bez omezení na ně, farmaceuticky přijatelné soli. Příklady farmaceuticky přijatelných solí v rámci přítomného vynálezu zahrnuji octan, benzensulfonát, benzoát, hydrogenuhličitan, hydrogenvinan, bromid, octan draselný, kamsylát, uhličitan, chlorid, citrát, dihydrochlorid, edetát, edisylát, estolát, esylát, fumarát, glukaptát, glukonát, glutamát, glykolylarsanilát, hexylresorcinát, hydrabamin, hydrobromid, hydrochlorid, hydroxynaftoát, isethionát, laktát, laktobionát, malát, maleát, mandlát, mesylát, methylbromid, methylnitrát, methylsulfát, mukát, napsylát, dusičnan, pamoát (embonát), pantothenát, fosfát/pyrofosfát, polygalakturonát, salicylát, stearát, subacetát, sukcinát, síran, tannát, tartarát, teoklát, triethiodid a benzathin.

Příklady farmaceuticky nepřijatelných solí v rámci přítomného vynálezu zahrnují hydrojodid, perchlorát, tetrafluorboritan. Farmaceuticky nepřijatelné soli mohou být použitelné pro jejich výhodné fyzikální a/nebo chemické vlastnosti, například krystalinitu.

Výhodné farmaceuticky přijatelné soli jsou hydrochloridy, sírany a hydrogentartaráty. Hydrochloridové a síranové soli jsou obzvláště výhodné.

Termín prostředek zahrnuje formulaci zahrnující účinnou složku s enkapsulačním materiálem jako nosičem poskytujícím kapsli, kde účinná složka (s nebo bez dalších nosičů) je obklopena nosičem, který je tímto s účinnou složkou v kontaktu. Obdobným způsobem jsou zahrnuty sáčky.

• 9 · · · * · ··· ···· * 9 9 · · · · • · · 9 9 9 9 999 9 »··· • 9 · 9 · · · · ·· 9 tt · · ·· ·♦ * · *

Tablety, prášky, sáčky a kapsle lze použít jako pevné dávkové formy vhodné pro perorální způsob podání.

Prostředky v kapalné formě zahrnují roztoky, suspenze a emulze. Jako příklad kapalných prostředků vhodných pro parenterální podávání mohou být uvedeny roztoky účinných sloučenin ve sterilní vodě nebo směsi vody a propylenglykolu. Kapalné prostředky mohou být také formulovány jako vodný polyethylenglykolový roztok.

Vodné roztoky pro perorální podávání mohou být připraveny rozpuštěním účinné složky ve vodě a přidáním vhodných barvidel, ochucovacích přípravků, stabilizátorů a zahušťovacích přípravků, jak je třeba. Vodné suspenze pro perorální použití mohou být připraveny dispergováním jemně rozmělněné účinné složky ve vodě společně s viskózní látkou, jako jsou například přírodní a syntetické gumy, pryskyřice, methylcelulóza, natriumkarboxymethyl-celulóza a jiné suspendační přípravky, které jsou ve farmaceutickém oboru známé.

Farmaceutické prostředky jsou s výhodou ve formě jednotkové dávky. V takovéto formě je prostředek rozdělen do jednotkových dávek obsahujících příslušná množství účinné složky. Formou jednotkové dávky může být balený prostředek, balení obsahující oddělená množství prostředků, například balené tablety, kapsle a prášky v láhvích nebo ampulích. Forma jednotkové dávky může být také kapsle, sáček nebo tableta jako takové, nebo to může být příslušný počet jakékoliv z těchto balených forem.

Biologické hodnocení

0 0 0 0 0 · 0 · · 0 • 0 * 00« » · · · 00000 000« 0000 00 0 00 0» ·· 0· ·· '»

Model in vitro

Buněčná kultura

A. Lidské 293S buňky exprimující nakloňované lidské μ, δ a κ receptory a resistentní na neomycin se pěstují v suspenzi při teplotě 37 °C a v 5% C0₂, v třepacích nádobách obsahujících DMEM10%FBS bez vápníku, 5% BCS,

0,1% Pluronic F-68 a 600 μς/πιΐ geneticinu.

B. Myší a krysí mozky se zváží a propláchnou ledově studeným PBS (obsahujícím 2,5 mM EDTA, pH = 7,4). Mozky se homogenizují polytronem po dobu 15 sekund (myší) nebo po dobu 30 sekund (krysí) v ledově studeném lytickém pufru (50 mM Tris, pH =7,0, 2,5 mM EDTA s fenylmethylsulfo-nylfluoridem přidaným těsně před použitím, připraveným na koncentraci 0,5 MmM z 0,5M zásobního roztoku ve směsi DMSO a ethanolu).

Příprava membrán

Buňky se peletují a opětovně suspendují v lytickém pufru (50 mM Tris, pH =7,0, 2,5 mM EDTA s PMSF přidaným těsně před použitím, připraveným na koncentraci 0,1 mM z 0,lM zásobního roztoku v ethanolu), inkubují se na ledu po dobu 15 minut, potom se homogenizují polytronem po dobu 30 sekund. Suspenze se odstřeďuje při max. 1000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C. Supernatant se uchová na ledu a pelety se resuspendují a odstředí jak je uvedeno výše. Supernatanty z obou odstředění se spojí a odstřeďují při max. 46 000 g po dobu 30 minut. Pelety se opětovně suspendují ve studeném Tris pufru (50 mM Tris/Cl, pH =7,0) a znovu se odstředí. Konečné pelety se « 9

999 9 fc · · « » · « «

9 9 9

9 9

99 9 opětovně suspendují v membránovém pufru (50 mM Tris,

0,32M sacharózy, pH = 7,0). Alikvoty o objemu 1 ml v polypropylenových zkumavkách se zmrazí v směsi suchého ledu a ethanolu a uchovají se při teplotě -70 °C do doby, kdy se použijí. Koncentrace proteinu se stanoví modifikovaným Lowryho stanovením s SDS.

Stanovení vazby

Membrány se rozmrazí při teplotě 37 °C, ochladí se na ledu, třikrát se pasážují 25G jehlou a zředí se vazebným pufrem (50 mM Tris, 3 mM MgCl₂, 1 mg/ml BSA (Sigma A-7888), pH - 7,4, který se po filtraci přes 0,22m filtr uloží při teplotě 4 °C, a do kterého se čerstvě přidá 5 pg/ml aprotininu, 10 μΜ bestatinu, 10 μΜ diprotinu A, bez DTT). Alikvoty o objemu 100 μΐ se přidají do vymražených 12x75 mm polypropylenových zkumavek obsahujících 100 μΐ příslušného radioaktivního ligandu a 100 μΐ testované sloučeniny v různých koncentracích. Za přítomnosti 10 μΜ naloxonu se stanoví celkové (TB) a nespecifické (NS) vazby. Zkumavky se ve vířivce inkubují při teplotě 25 °C po dobu 60 až 75 minut a poté se jejich obsah rychle přefiltruje ve vakuu a každá zkumavka se promyje přibližně 12 ml ledově chladného pufru (50 mM Tris, pH =7,0, 3 mM MgCl₂) přes GF/B filtry (Whatman) předem namočené po dobu alespoň 2 hodin v 0,1% polyethyleniminu. Radioaktivita (dpm) zachycená na filtrech se měří prostřednictvím beta-čítače po namáčení filtrů po dobu alespoň 12 hodin v mininádobách obsahujících 6 až 7 ml scintilační tekutiny. Pokud se stanovení provádí na plotnách s 96 hlubokými jamkami, provede se filtrace přes unifiltry napuštěné PEI s 96 místy, které se promyji třikrát 1 ml

4444 • 4 4 • ·· 4 • 4 4*4

4 4 4 4 4

444 44444

4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 · promývacího pufru a suší se v sušárně při teplotě 55 °C po dobu 2 hodin. Filtrační plotny se po přidání 50 μΐ MS20 scintilační tekutiny na jamku čítají pomocí přístroje TopCount (Packard).

Funkční stanovení

Agonistická aktivita sloučenin se měří cestou stanovení stupně, do kterého komplex sloučenin a receptoru aktivuje vázání GTP na příslušné G-proteiny, se kterými se receptory vážou. V GTP stanoveních vazby se GTP[y]³⁵S kombinuje s testovanými sloučeninami a membránami HEK-293S buněk exprimujícími klonované lidské opioidní receptory nebo s membránami z homogenizovaných krysích a myších mozků. Agonisté stimulují vázání GTP[y]³⁵S na tyto membrány. Hodnoty EC50 a E_max pro sloučeniny se stanoví z křivek závislosti odpovědi na dávce. Pro ověření, že agonistický účinek je zprostředkován delta receptory, se provedou posuny doprava křivek závislosti odpovědi na dávce deltaagonistou naltrindolem.

Postup pro GTP z krysích mozků

Krysí mozkové membrány se rozmrazí při teplotě 37 °C, třikrát se pasážují 25G jehlou s tupým koncem a zředí se pro GTPyS vázání (50 mM Hepes, 20 mM NaOH, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl₂, pH = 7,4, čerstvé se přidá: 1 mM DTT, 0,1% BSA). Nakonec se do membránových ředění přidá 120 μΜ GDP. Hodnoty EC50 a E_max pro hodnocené sloučeniny se stanoví z křivek závislosti odpovědi na dávce o 10 bodech získanými při 300 μΐ s příslušným množstvím membránového proteinu (20 μg na jamku) a 100 000 až 130 000 dpm • · · • · · · 9 9 9 9 · · • ♦ · · · · · 9 · 9 9

99 9 9 9 · » » 9 99999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 «

GTP[y]³⁵S na jamku (0,11 až 0,14 nM) . Bazální a maximální stimulované vazby se stanoví v nepřítomnosti a za přítomnosti 3 μΜ SNC-80.

Analýza dat

Specifické vazby (SB) se vypočítají jako TB-NS a SB za přítomnosti různých testovaných sloučenin se vyjádří jako procento z kontrolní SB hodnoty. Hodnoty IC50 a Hillův koeficient (n_H) pro ligandy týkající se vytěsňování specificky vázaného radioaktivního ligandu se vypočítají z logit programů pro prokládání grafů nebo z křivek, jako jsou Ligand, GraphPad Prism, SigmaPlot nebo ReceptorFit. Hodnoty K± se vypočítají z Cheng-Prussoffovy rovnice.

Střední hodnoty + směrodatné odchylky IC50, Ki a n_H jsou uvedeny pro testované ligandy v alespoň třech vytěsňovacích křivkách. Biologická aktivita sloučenin podle přítomného vynálezu je znázorněna v tabulce 2.

Tabulka 2

Biologická data

Př. č.	HDELTA (nM)	Krysí mozek	(nM)	Myší mozek (nM) i
	IC50	EC50	o-^max	C50	%Emax	EC50	'čExnax
1 až 4?	0,22-	0, 55-	93-	5,57-	67-155	9,08-	73-144
L	2, 18	13, 4	106	106		207,5

Experimenty se saturací receptoru

Hodnoty Κ_δ pro radioaktivní ligandy se stanoví provedením vazebných stanovení na buněčných membránách za použití vhodných radioaktivních ligandů v koncentracích « φ φ · φφ φ φφφφ φ φφ φφφ » φφφ φφφφφ • φφφ φ · φ φ φφ φ φφ φφ' φφ φφ φφ * pohybujících se v rozmezí 0,2- až 5-násobku stanovené Κ_δ(až 10-násobek, pokud jsou požadovaná množství radioaktivního ligandu vhodná). Specifické vázání radioaktivního ligandu se vyjádří jako pmol/mg membránového proteinu. Hodnoty Κ_δ a B_max jednotlivých experimentů se dostanou z nelineárních grafů specificky vázaného (B) versus nM volného (F) radioaktivního ligandu z individuálních pokusů podle jednomístného modelu.

Stanovení mechano-alodynie za použití von Freyova testování

Testování se provede mezi 8:00 a 16:00 hodinou za použití metody popsané Chaplanem a kol. (1994). Krysy se umístí do plexisklových klecí na drátěné síťové dno umožňující přístup ke končetině a nechají se po dobu 10 až 15 minut přizpůsobit. Testovaná oblast je ve střední plantární části levé zadní packy mimo méně senzitivní části plosky. Končetina je drážděna sérií osmi von Freyových vláken s logaritmicky rostoucí tuhostí (0,41, 0,69, 1,20, 2,04, 3,63, 5,50, 8,51 a 15,14 gramů; Stoelting, 111. USA). Von Freyovo vlákno se aplikuje zespoda přes síťové dno klece kolmo na plantární povrch dostatečnou silou tak, aby se dosáhlo lehkého ohnutí proti pacce, a tak se drží po dobu přibližně 6 až 8 sekund. Pozitivní odpověď se zaznamená v případě, kdy je packa prudce stažena. Škubnutí ihned po odstranění vlákna se též považuje za pozitivní odpověď. Pohyb jako takový se považuje za nejednoznačnou odpověď, a v tomto případě se stimulace opakuje.

Testovací protokol ·

4 4 4 · · » · « · · • 44 4 4 4 4 · 4 « 4«44 « · « · · · · » · « ·· · · ·· · * ·* *

Zvířata z FCA-léčené skupiny se testují v pooperační den 1. 50% práh pro prudké stažení packy se určí za použití „up-down metody podle Dixona (1980). Testování je zahájeno vláknem o hmotnosti 2,04 g uprostřed série. Stimuly jsou vždy aplikovány postupným způsobem, ať už směrem nahoru či dolů. Při nepřítomnosti reakce - stažení packy při stimulaci iniciálně zvoleným vláknem, se aplikuje silnější stimulus; pokud se objeví reakce - stažení packy, zvolí se další slabší stimulus. Optimální vypočítání prahu touto metodou vyžaduje 6 odpovědí v bezprostřední blízkosti 50% prahu a čítání těchto 6 odpovědí se zahájí v momentě, kdy dojde k prvé změně odpovědi, například v momentě, kdy je práh poprvé překročen. V případech, kdy prahy spadají mimo rozmezí stimulů se přiřadí hodnoty 15,14 (normální citlivost) nebo 0,41 (maximálně alodynický). Výsledný vzor pozitivních a negativních odpovědí se vynese do tabulky za použití konvence X = žádné stažení končetiny; O = stažení končetiny, a 50% práh stažení se interpoluje za použití vzorce:

50% g práh = 10^{(xf + k5)}/10 000 kde

Xf = číslo posledního použitého von Freyova vlákna (log j ednotky);

k = tabulková hodnota (Chaplan a kol. (1994)) pro vzor pozitivních/negativních odpovědí; a δ = střední odchylka mezi jednotlivými stimuly (log jednotky), zde δ = 0,224.

Von Freyovy prahy se konvertují na procento maxima ···· ·· ►*»»«.

• · · · · · 9 9 9 9 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 « » 9 • · · · ·· · · · · · možného efektu (% MPE) podle Chaplana a kol. (1994). Pro vypočítání % MPE se použije následující rovnice:

léčivem léčený práh (g) - práh alodynie (g) %MPE =_ x 100 kontrolní práh (g) - práh alodynie (g)

Podání testované látky

Testovaná látka se před von Freyovým testováním krysám injíkuje (subkutánně, intraperitoneálně, intravenózně nebo perorálně), časový odstup mezi podáním testované sloučeniny a von Freyovým testováním se liší v závislosti na povaze testované sloučeniny.

Writhingův test

Pokud se myši podá intraperitoneálně kyselina octová, vyvolají se abdominální křeče. Ty se dále šíří myším tělem typickým způsobem. Při podání analgetik se popsané křeče pozorují méně často a léčivo je vybráno jako potenciální dobrý kandidát.

Za kompletní a typický Writhingův reflex se pokládá pouze při přítomnosti následujících prvků: zvíře se nehýbá, dolní část zad je v lehké depresi, lze sledovat plantární část obou pacek. Při tomto stanovení demonstrují sloučeniny podle přítomného vynálezu signifikantní inhibici Writhingova reflexu při perorálním dávkování 1 až 100 jxmol/kg.

i) Příprava roztoků • · 9 9 · · · * · · • · · · · « · ···

9 99 9· 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 999 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

Kyselina octová (AcOH): 120 μΐ kyseliny octové se přidá do 19,88 ml destilované vody, tím se připraví konečný objem 20 ml roztoku o konečné koncentraci 0,6 % AcOH.

Tento roztok se poté míchá (vířením) a připraví se pro injekci.

Sloučenina (léčivo):

Každá sloučenina se připraví a rozpustí se v nejvhodnějším vehikulu standardními postupy.

ii) Podání roztoků

Sloučenina (léčivo) se podává perorálně, intraperitoneálně (i.p.), subkutánně (s.c.) nebo intravenózně (i.v.) v množství 10 ml/kg (pro průměrnou tělesnou hmotnost myši) 20, 30 nebo 40 minut (podle třídy sloučeniny a jejich charakteristik) před testováním.

Pokud se sloučenina podává centrálně, podá se intraventrikulárně (i.c.v.) nebo intrathekálně (i.t.) objem 5 μΐ.

AcOH se podá intraperitoneálně (i.p.) do dvou míst v množství 10 ml/kg (pro průměrnou tělesnou hmotnost myši) těsně před testováním.

iii) Testování

Zvíře (myš) se sleduje po dobu 20 minut a na konci experimentu se zaznamená a shromáždí se počet příhod Writhingova reflexu. Myši se udržují v individuálních krabicových klecích s kontaktní podložkou. Většinou se současně sledují celkem 4 myši - jedna kontrolní a tři

0000

00 • 0 0 0

0 00

0 0 0 s různými dávkami léčiva.

U úzkosti a v případě anxiosních indikací se účinnost u krysy stanovuje Geller-Seifterovým konfliktním testem.

U indikace v případě funkční gastrointestinální poruchy se účinnost u krysy určuje stanovením popsaným v publikaci S.V. Coutinho a kol., American Journal of Physiology - Gastrointestinal & Liver Physiology, 282(2), G307 až 316 (únor 2002) .

Claims

1. Sloučenina obecného vzorce I

NH, (i:

ve kterém

R¹ je vybrán z jakékoliv

i) fenylové skupiny ii) pyridylové skupiny iii) thienylové skupiny iv) furylové skupiny •0 ····

00 00 • 0 • · ·

0 000»

v) imidazolylové skupiny

H

N vi) triazolylové skupiny

H

N

N vii) pyrrolylová skupiny n

N

H viii) thiazolylové skupiny ix) pyridyl-N-oxidu;

kde každý R¹ fenylový kruh a R¹ heteroaromatický kruh může být nezávisle dále substituován 1, 2 nebo 3 substituenty nezávisle vybranými z přímé nebo rozvětvené alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, N0₂, CF₃, alkoxyskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, atomu chloru, atomu fluoru, atomu bromu a atomu jodu;

stejně tak jako její soli.

2. Sloučenina podle nároku 1, kde každý R¹ fenylový • · · · ·· · ·

9 9 99 9 9 9 9

999 999 9 999 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 99 99 99 9 kruh a R¹ heteroaromatický kruh může být nezávisle dále substituován 1, 2 nebo 3 substituenty nezávisle vybranými z methylové skupiny, CF₃, atomu chloru, atomu fluoru, atomu bromu a atomu jodu.

3. Sloučenina podle nároku 1, kde každý R¹ fenylový kruh a R¹ heteroaromatický kruh může být nezávisle dále substituován methylovou skupinou.

4. Sloučenina podle nároku 1, kde R¹ je fenylová skupina, pyrrolylová skupina, pyridylové skupina, thienylová skupina nebo furylová skupina.

5. Sloučenina podle nároku 1, která je vybraná z jakékoli z následujících sloučenin:

4-[1-(3-aminofenyl)-1-(l-benzylpiperidin-4-yliden)methyl]-N,N-diethylbenzamid;

4-[1-(3-aminofenyl)-1-(l-pyridin-2-ylmethylpiperidin-4-yliden)methyl]-N,N-diethylbenzamid;

4-[1-(3-aminofenyl)-1-(l-pyridin-4-ylmethylpiperidin-4-yliden)methyl]-N,N-diethylbenzamid;

4-[1-(3-aminofenyl)-1-(l-furan-2-ylmethylpiperidin-4-yliden)methyl]-N,N-diethylbenzamid;

4-[1-(3-aminofenyl)-1-(l-furan-3-ylmethylpiperidin-4-yliden)methyl]-N,N-diethylbenzamid;

4-[1-(3-aminofenyl)-1-(l-thiofen-2-ylmethylpiperidin-4~ -yliden)methyl]-N,N-diethylbenzamid;

4-[1-(3-aminofenyl)-1-(l-pyrrol-2-ylmethylpiperidin-4-yliden)methyl]-N,N-diethylbenzamid; a

4-[1-(3-aminofenyl)-1-(l-thiofen-3-ylmethylpiperidin-4-yliden)methyl]-N,N-diethylbenzamid.

6. Sloučenina podle jakéhokoliv z předcházejících ·· φ

ΦΦ φφ ·· φφφφ * φ · · · · · · · · φ φ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φφ φφφ φ φφφ · φφφφ φφφφ φφφφ φφ φ φφφφ φφφφ φφ φ nároků, která je ve formě hydrochloridové, dihydrochloridové, síranové, tartaratové, ditrifluoracetatové nebo citratové soli.

7. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I, vyznačující se tím, že zahrnuje reakci sloučeniny obecného vzorce II kde

PG je chránící skupina urethanové skupiny, jako je Boc nebo CBZ, nebo benzylová skupina nebo substituovaná chránící skupina benzylové skupiny, jako je 2,4-dimethoxybenzylová skupina;

s kyselinou 3-aminofenylboritou, za použití palladiového katalyzátoru, například Pd(PPh3)₄, za přítomnosti báze, jako je například Na₂CO3, pro získání sloučeniny obecného vzorce III

CH (III)

N

I

PG ·· »··· • t 9 • Φ φφ

9 · · · · · · 9 9 9 ·*·· 9 9 * ···· φ · · ··· Φ ··· 9 9 9 Φ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 99 9 9 99 9 ze které se posléze za standardních podmínek sejme chránící skupina a alkyluje se za redukčních podmínek sloučeninou obecného vzorce R¹-CHO, za získání sloučeniny obecného vzorce I.

8. Sloučenina podle nároku 1 pro použití v terapii.

9. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva používaného pro léčení bolesti, úzkosti nebo funkčních gastrointestinálních poruch.

10. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t i m, že obsahuje sloučeninu podle nároku 1 obecného vzorce I jako účinnou složku společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.

11. Způsob léčení bolesti, vyznačující se tím, že se subjektu potřebujícímu léčbu bolesti podá účinné množství sloučeniny podle nároku 1 obecného vzorce

I.

12. Způsob léčení funkčních gastrointestinálních poruch, vyznačující se tím, že se subjektu trpícímu funkční gastrointestinální poruchou podá účinné množství sloučeniny podle nároku 1 obecného vzorce I.

13. Způsob léčení úzkosti, vyznačující se tím, že se subjektu trpícímu úzkosti podá účinné množství sloučeniny podle nároku 1 obecného vzorce I.

14. Sloučenina obecného vzorce II

00 0000

00 ·· • 0 0 • 0 00

0 0 0 « 0 0

0 0 0 0

00 0

0 0 0

0 0 0 0

0 0 000 • 0 00 ·· 0 kde

PG je chránící skupina urethanové skupiny, jako je Boc nebo CBZ, nebo benzylová skupina nebo substituovaná benzylová chránící skupina, jako je 2,4-dimethoxybenzylová skupina.

15. Sloučenina obecného vzorce III kde

PG je chránící skupina urethanové skupiny, jako je Boc nebo CBZ, nebo benzylová skupina nebo chrániči skupina substituované benzylové skupiny, jako je 2,4-dimethoxybenzylová skupina.