CZ20031094A3

CZ20031094A3 - Pomocný prostředek

Info

Publication number: CZ20031094A3
Application number: CZ20031094A
Authority: CZ
Inventors: Nathalie Garcon; Catherine Marie Ghislaine Gerard; Jean Stephenne
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals S. A.
Priority date: 2000-10-18
Filing date: 2001-10-16
Publication date: 2003-09-17
Also published as: PL365322A1; GB0025577D0; HUP0303720A2; EP1326639B1; IL155283A0; ES2299530T3; DE60132474D1; AU2002221689B2; CA2425310A1; ATE383872T1; NO20031646D0; HUP0303720A3; US20040047869A1; AU2168902A; CN100346829C; NO20031646L; BR0114785A; ZA200302887B; MXPA03003406A; DE60132474T2

Description

Pomocný prostředek obsahující imunostimulační oligonukleotid a tokol

Oblast techniky

Popisují se nová adjuvans pro použití ve vakcinačních prostředcích. Adjuvans podle vynálezu obsahují kombinaci imunostimuličního oligonukleotidu a tokol. Dále se popisují vakcínační prostředky obsahující adjuvans a alespoň jeden antigen. Dále se popisují způsoby výroby adjuvans a vakcinačních prostředků podle vynálezu a jejich použití jako léčivých přípravků. Dále se popisují způsoby léčby jedinců náchylných nebo trpících onemocněním, které zahrnují parenterální a mukozální aplikaci vakcinačních prostředků podle vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Imunostimulační oligonukleotidy obsahující nemetylované dinukleotidy CpG jsou známy jako adjuvans, když se aplikují systémovým a mukozálním způsobem (popisuje se v patentovém dokumentu WO 96/02555, EP 468520 a v publikaci Davis et al., J. Immunol., 1998, 160(2):870-876, McCluskie and Davis, J.

Immunol., 1998, 161(9):4463-6). CpG je zkratka dinukleotidových motivů cytosin-guanosin přítomných v DNA. Pozorovalo se, že frakce DNA BCG mohou mít protinádorový účinek. V dalších studiích se ukázalo, že syntetické oligonukleotidy získané ze sekvencí genu BCG jsou schopné vyvolat imunostimulační účinky (jak in vitro tak ín vivo). Ukázalo se, že jisté palindromické sekvence zahrnující centrální motiv CG vykazují uvedenou aktivitu. Hlavní úloha motivu CG při imunostimulaci se popisuje později v publikaci Krieg, Nátuře 374, p546 1995. Detailní analýza ukázala, že motiv CG musí být v jistých sekvencích a že uvedené sekvence • · • · · · ··········

z. ···· ·· ·· ·· obratlovců. Imunostimulační sekvencí je často purin, purin, C, G, pyrimidin, pyrimidin, kde dinukleotidový motiv CG není metylován, ale jiné nemetylované sekvence CpG jsou známy jako imunostimulanty a mohou se použít podle vynálezu.

Palindromické sekvence jsou přítomny jako jisté kombinace šesti nukleotidů. Několik těchto motivů se může vyskytovat v některém oligonukleotidu. Přítomnost jedné nebo více imunostimulačních sekvencí obsahující oligonukleotidy mohou aktivovat různé imunitní subsystémy, které zahrnují přirozené smrtící buňky (které produkují interferon γ a mají cytolytickou aktivitu) a makrofágy (popisuje se v publikaci Wooldrige et al., vol. 89 (no. 8), 1977). Neprokázalo se, že jiné sekvence obsahující jiný nemetylovaný CpG, které nemají tuto konvenční nukleotidovou sekvenci, jsou imunomodulační.

Jestliže se CpG začlení do vakcinačního prostředku, aplikuje se v obecném případě jako volný roztok spolu s volným antigenem (popisuje se v patentovém dokumentu WO 96/02555 a v publikaci McCluskie and Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6)) nebo je s antigenem spojen kovalentní vazbou (popisuje se v patentovém dokumentu PCT č. WO 98/16247) nebo se připraví společně s nosičem, jako je hydroxid hlinitý ((jako v případě hepatitidový povrchový antigen, což se popisuje v publikaci Davis et al., J. Immunol., 1998, 160(2):870-876), Davis et al., J. Immunol., 1998, 160(2):870876, Zolot Millan et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8). Jiné prostředky obsahující CpG zahrnují ty popsané v patentových dokumentech WO 99/61056 a WO 00/09159.

Tokoly (vitamin E) a adjuvans ve formě emulze, které je obsahují se popisují v patentovém dokumentu EP 0 382 271 Bl a US5667784.

• · • · • · · ·

Adjuvans ve formě olejových emulzí jsou známy mnoho let. Zahrnují Freundovo úplné nebo neúplné adjuvans ve formě emulze minerálního oleje. V té době se věnovalo mnoho času vytvoření stabilního a dobře tolerovaných alternativ těchto silných, ale reaktogenních adjuvans. Olejové emulze obsahující tokoly se popisují v patentovém dokumentu WO 95/17210.

Vynález je založen překvapivém zjištění, že kombinace imunostimulačních oligonukleotidů a tokolů tvoří extrémně silné adjuvans. Složky uvedených adjuvans s výhodou napomáhají vyvolání protilátek specifických pro antigen a jsou účinná při vyvolání imunitní odezvy běžně spojené s imunitním systémem typu Thl. Podobně, kombinace adjuvans nejsou vhodné pouze pro imunoprofylaxi onemocnění, ale také překvapivě pro imunoterapii onemocnění, jako je přetrvávající virová, bakteriální nebo parazitická infekce a také chronické poruchy, jako je zhoubné bujení.

Imunostimulačními sekvencemi jsou často purin, purin, C, G, pyrimidin, pyrimidin, kde dinukleotidový motiv není metylován. Oligonukleotidy výhodné pro použití jako adjuvans nebo ve vakcinačních prostředcích podle vynálezu s výhodou obsahují dvě nebo více dinukleotidových motivů CpG oddělených alespoň třemi nebo s výhodou alespoň šestí nebo více oligonukleotidy. Oligonukleotidy podle vynálezu jsou v typickém případě deoxynukleotidy. Ve výhodném provedení vynálezu internukleotid v oligonukleotidu je fosforodithioát nebo výhodněji fosforothioátová vazba, ačkoliv fosfodiester a jiné internukleotidové vazby jsou zahrnuty v rozsahu vynálezu, který zahrnuje oligonukleotidy se smíchanými internukleotidovými vazbami. Způsoby přípravy fosforothioátových oligonukleotidů nebo fosforodithioátu se popisuje v dokumentu US 5 666 153, US 5 278 302 a WO 95/26 204. Příklady výhodných oligonukleotidů mají následující

sekvence. Sekvence s výhodou obsahují fosforothioát upravený internukleotidovými vazbami.

OLIGO 1(SEQ ID NO:1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)

OLIGO 2 (SEQ ID N0:2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)

OLIGO 3(SEQ ID NO:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

OLIGO 4 (SEQ ID NO:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)

OLIGO 5 (SEQ ID NO:5); TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)

Alternativní CpG oligonukleotidy mohou obsahovat výhodné sekvence uvedené shora v textu, které mají nepodstatné delece nebo adice. Oligonukleotidy obsahující CpG využívané podle vynálezu se mohou, syntetizovat libovolným způsobem, který je znám v oboru (například patentový dokument EP 468 520). Takové oligonukleotidy se mohou běžně syntetizovat použitím automatizovaného syntetizéru.

Oligonukleotidy využívané podle vynálezu jsou v typickém případě deoxynukleotidy. Ve výhodném provedení vynálezu internukleotidová vazba v oligonukleotidu je fosforodithioát a výhodněji fosforothioátová vazba, ačkoli fosfodiestery jsou zahrnuty v rozsahu vynálezu. Zvažuje se oligonukleotid obsahující různé internukleotidové vazby, fosforothioát fosfodiestery. Mohou se dále použít internukleotidové vazby, které stabilizují oligonukleotid.

Tokoly, které se mohou s výhodou využít v adjuvantních kombinacích podle vynálezu se popisují v dokumentu EP 0 382

271 Bl. Tokoly podle vynálezu obecného vzorce

• ·

kde symbol R může být H nebo jeden nebo více shodných nebo různých substituentů vybraných ze skupiny obsahující alkyl, alkoxy, acyloxy, hydroxy a sulfátovou a fosfátovou skupinu. Symbol Rl a R3 je nezávisle jeden na druhém vodík nebo alkyl. Symbol R2 je vodík nebo alkyl a může být v každé jednotce různý. Čárkovaná čára označuje přítomnost nebo absenci další vazby uhlík-uhlík v jednotce. Symbol n je hodnota 1 až 10. Alkylová skupina v poloze označené symbolem R, Rl, R2 a R3 se vybrala z lineárního nebo větveného uhlíkatého řetězce, který obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, jako je metyl, etyl, butyl nebo isobutyl.

Další definované výhodné podskupiny se popisují v dokumentu EP 0 382 271 Bl. Zvláště výhodný tokol je D, L, atokoferol (CAS č. 10191-41-0, (2RS, 4'RS, 8'RS)-2,5,7,8tetrametyl-2- (4 ', 8 ' , 12 ' -trimetyltridecyl) -6-chromanol) ) , které je možné běžně získat od firmy ROCHE™.

Je výhodné, aby tokol byl ve formě olejové emulze a nebo s výhodou ve formě emulze olej ve vodě. Tokoly se mohou připravit způsobem popsaným v patentovém dokumentu EP 0 382 271 Bl, pak tokoly mohou být disperze tokolových kapének, běžně obsahující emulgátor. Tyto kapénky mají průměr s výhodou menší než 1 pm. V jiném případě se tokoly mohou používat v kombinaci s jiným olejem za vzniku olejové fáze v olejové emulzi. Příklady olejových emulzí, které se mohou použít v kombinaci s tokolem se popisují dále v textu.

Adjuvans ve formě emulze olej ve vodě samo o sobě je možné použít jako adjuvans (popisuje se v dokumentu EP 0 399 843 B) . Jako vakcinační činidla je také možné použít kombinace emulzí olej ve vodě a jiného aktivního činidla (popisuje se v dokumentu WO 95/17 210, WO 98/56 414, WO 99/12 565, WO 99/11 241). Popisují se i jiná adjuvans ve formě olejové emulze.

• · · · • · • ·

Jsou to například emulze voda v oleji (popisuje v patentovém dokumentu US 5 422 109, EP 0 480 982 B2) a emulze voda v oleji ve vodě (popisuje se v patentovém dokumentu US 5 424 067, EP 0 480 981 B) . Všechny uvedené emulze tvoří olejové emulzní systémy výhodné pro začlenění tokolů a kombinují, se s CpG za vzniku adjuvans podle vynálezu.

Za účelem vzniku kombinace s tokolem je možné zvolit přirozený nebo syntetický olej. Uvedený olej může být minerální nebo organický. Příklady minerálních nebo organických olejů jsou odborníkovi zřejmé.

Olejová fáze emulzního systému s výhodou obsahuje metabolizovatelný olej. Význam termínu „metabolizovatelný je dobře znám v oboru. Termín „metabolizovatelný znamená, že je možné ho změnit působením metabolizmu (popisuje se v publikaci Dorlanďs illustrated medical dictionary, W.B. Sanders company, 25^th edition (1974)). Vhodným olejem je libovolný rostlinný olej, rybí olej, zvířecí nebo syntetický olej, který není toxický pro příjemce a je schopen být přeměněn metabolizmem. Běžnými zdroji rostlinného oleje jsou ořechy (jako je arašídový olej), semena a zrní. Vynález dále popisuje syntetické oleje, které mohou zahrnovat běžně dostupné oleje, jako je NEOBEE® a jiné. Skvalen (2,6, 10, 15, 19, 23hexametyl-2,6,10, 14, 18, 22-tetrakosahexaen) je nesaturovaný olej, který se nachází ve velkém množství v oleji z jater žraloka a v malém množství v olivovém oleji, v oleji z moučných červů, v oleji z rýžových otrub a v kvasinkách. Tento olej je zvláště vhodný při použití podle vynálezu. Skvalen je metabolizovatelný olej, protože je meziprodukt biosyntézy cholesterolu (Merck index, 10. vydání, č. 8619).

Zvláště výhodnými olejovými emulzemi vhodnými pro kombinaci s CpG za vzniku adjuvans podle vynálezu jsou emulze •9 999· •9 9999

9 9 9

99 9 9 99 9

9 9999· 99 9 • 999 99 999 9 9 olej ve vodě a zvláště pak skvalen ve vodních emulzích, které obsahují tokol a emulgační činidlo.

Příklady výhodných systémů emulzí se popisují v patentovém dokumentu WO 95/17 210 a WO 99/11 241, které popisují adjuvans ve formě emulze založené na skvalenu, α-tokoferolu a přípravku Tween 80. Mohou se také připravit s imunostimulanty QS21 a/nebo 3D-MPL.

Velikost olejových kapiček, které se vyskytují ve stabilní emulzi olej ve vodě je s výhodou menší než 1 pm. Uvedená velikost může být v rozmezí 30 až 600 nm, s výhodou přibližně 30 až 500 nm. Nej výhodněj ší je, když průměr je 150 až 500 nm a zvláště výhodné jsou kapénky s průměrem 150 nm měřeno fotonovou korelační spektrofotometrií. 80 % olejových kapének je ve výhodném rozmezí, výhodněji více než 90 % a nej výhodněj i více než 95 % olejových kapének se pohybuje v definovaném velikostním rozmezí. Množství složek přítomných v olejových emulzích podle vynálezu tvoří běžně jako je az například skvalen. Je-li přítomen v koncentraci 2 až 10 tvoří az tvoří alfa-tokoferol a v koncentraci 0,3 povrchově aktivní činidlo, jako je polyoxyetylensorbitanmonooleát. Je výhodné, aby poměr olej (s výhodou skvalen) ku tokolu (s výhodou α-tokoferol) se rovnal nebo byl menší než 1, přičemž vzniká více stabilní emulze. Emulgační činidlo, jako je přípravek Tween 80 a Spán 85, se mohou také vyskytovat v množství přibližně 1 %. V některých případech může být výhodné, že vakcinační prostředky podle vynálezu mohou dále obsahovat stabilizační činidlo.

Způsob přípravy emulzí olej ve vodě je dobře znám v oboru. Způsob běžně zahrnuje míšení olejové fáze obsahující tokol s povrchově aktivním činidlem, jako je PBS/TWEEN8 0^(tm> . Pak následuje homogenizace za použití homogenizéru. Odborníkovi je • · ·ftft· • ft · ·· · *· ·· • · · · · · · · ft • · ftftftftft ftft · • ·······♦· · zřejmé, že způsob, který zahrnuje krok dvojnásobný průchodu směsi injekční jehlou, je vhodný pro homogenizaci malých objemů kapaliny. Stejně je možné přizpůsobit emulgační postup v mikrofluidizéru (zařízení mukrofluidika M110S, maximálně 50 průchodů, v čase 2 minuty maximální tlak na vstupu je 6 barů (tlak na výstupu je přibližně 850 barů) pro produkci menších nebo větších objemů emulze. Této adaptace je možné dosáhnout běžným experimentem, který zahrnuje sledování výsledné emulze dokud se nedosáhne přípravku, kde olejové kapénky mají požadovaný průměr.

V alternativním provedení vynálezu kombinace tokolu a CpG může dále obsahovat další imunostimulanty, jako je LPS nebo jeho deriváty nebo saponiny. Příklady dalších imunostimulantů se popisují v publikaci „Vaccine Design-The Subunit and Adjuvant Approuch 1995, Pharmaceutical Biotechnology, (6), eds. Powell, M.F. a Newman, M.J., Plenům Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X.

Kombinace CpG/tokol podle vynálezu mohou s výhodou zahrnovat alespoň jedno enterobakteriální adjuvans získané z lipopolysacharidu. Je známo, že enterobakteriální lipopolysacharid (LPS) je silný stimulátor imunitního systému, ačkoliv jeho použití jako adjuvans je omezen jeho toxickými účinky. Netoxický derivát LPS, kterým je monofosforyllipid A (MPL) , jenž vznikl odstraněním jaderné sacharidové skupiny a fosfátu z glukozaminu, který redukuje konec, se popisuje v publikaci Ribi et al., 1986, Immunology and immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenům Publ. Corp., NY, p407-419 a vykazuje následující strukturu:

9999

99 • · · · 9 9 9 9 9 • 9 99999 99 9

999 99 999 9 9 • · · · · · « ···· ···· ·· 99 99 99 99

Další detoxifikovaná verze MPL vznikla odstraněním acylového řetězce z polohy 3 hlavního řetězce disacharidu a nazývá se 3-0-deacylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL). Tento derivát se může připravit způsobem popsaným v dokumentu GB

2122204B.

tento dokument také popisuje přípravu difosforyllipidu A a jeho 3-0-deacylovaných variant. Výhodná forma 3D-MPL je ve formě emulze, která obsahuje částice s velikostí průměru menší než 0,2 μΜ, a způsob výroby se popisuje v dokumentu WO 94/21 292. Vodné přípravky obsahující monofosforyllipid A a povrchově aktivní činidla se popisují v dokumentu WO 9843670A2.

Adjuvans odvozený z bakteriálního lipopolysacharidu za účelem vytvoření kombinace adjuvans podle vynálezu se čistí a zpracovává z bakteriálních zdrojů nebo v jiném případě se může syntetizovat. Čištěný monofosforyllipid A se popisuje v publikaci Ribi et al., 1986, Immunology and immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenům Publ. Corp., NY, p407-419 a 3-O-deacylmonofosf oryllípid A a 3-044 4444 •4 4444

4

4 4

4444 44 »♦ 44 • · 4 4 4 4 * 4 444 4 4 4 • 4 44 444 4 4

44 4 4 44 4

44 44 44 deacyldifosforyllipid A získaný z mikroorganizmu Salmonella sp. se popisuje v patentovém dokumentu GB 2220211 a US4912094. Jiné čištěné a syntetické polysacharidy se popisují v dokumentu WO 98/01 139, US 6 005 099 a EP 0 729 473 Bl, Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4): 392-6, Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1):141-6 a EP 0 549 074 Bl) . Zvláště výhodným bakteriálním lipopolysacharidovým adjuvans jsou 3D-MPL a β(16)glukosamindisacharidy popsané v dokumentu US 6 005 099 a EP 0 729 473 Bl.

Deriváty LPS, které se mohou použít podle vynálezu jsou ty imunostimulanty, které jsou podobné struktuře imunostimulantů LPS nebo MPL nebo 3D-MPL. Deriváty· LPS mohou být acylované monosacharidy, které tvoří část shora v textu uvedené struktury MPL. Výhodné disacharidové adjuvans je čištěný nebo syntetický lipid A obecného vzorce:

R'

kde symbol R2 může být vodík nebo dihydrogenfosforečnan. Symbol R3 může být acylový řetězec nebo β-hydroxymyristoyl nebo zbytek 3-acyloxyacyl obecného vzorce

I

C»Q

I

CHj

CH—O i \ (CH2)y R⁴

CH]

9999 ♦

9 · ·

II

• 99

9

9 9

9 9 9 kde symbol R4 je —Č“(CHi)t“OHj, a symboly X a Y mají hodnotu od 0 do 20.

Adjuvans může také obsahovat saponin. Kombinace 3D-MPL a adjuvans saponin, který se získal z kůry stromu Quillaja Saponaria molina, se popisuje v patentovém dokumentu EP 0 761 231 B. WO 95/17 210 popisuje emulzní systém adjuvans založený na skvalenu, α-tokoferolu a polyoxyetylensorbitanmonooleátu (Tween80), který se připravil spolu s imunostimulantem QS21 nebo 3D-MPL. Kombinace CpG a systémů pomocných látek se popisuje v patentovém dokumentu WO 95/17210. Dokumentech WO 96/33739 a WO 98/15287 se popisují adjuvans obsahující saponiny a struktury určitých nosičů, které obsahují 3D-MPL a/nebo emulze olej ve vodě, které, když se kombinují s tokolem a CpG tvoří výhodné adjuvans podle vynálezu.

Saponiny jsou známé jako adjuvans ve vakcinačních prostředcích vhodných pro systémovou aplikaci. Hemolytická aktivita a aktivita adjuvans jednotlivých saponinů je středem zájmu v oboru (popisuje se například v publikaci LacailleDubois and Wagner). Například přípravek Quil A (získaný z kůry jihoamerického stromu Quillaja Saponaria Molina) a jeho deriváty se popisují v patentovém dokumentu US 5 057 540 a v publikaci „Saponins as vaccine adjuvants, Kensil, C.R., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12(1-2), 1-55 a EP 0 362 279 Bl.

Určité struktury, které se nazývají komplexy stimulující imunitní systém (ISCOMS) a které obsahují frakce Quil A, jsou hemolytické a mohou se použít při výrobě vakcín (popisuje se • 9 9·· · • 9 9 9 9 9

9« 99

9 999 · 9 9

99 999 999

999 99 999 9 9

99 9999 9 999

9999 99 99 99 99 99 v patentovém dokumentu Morein, Β., EP 0 109 942 Bl) se, že tyto struktury vykazují aktivitu adjuvans (EP Bl, WO 96/11 711).

Popisuj e 0 109 942

Hemolytické saponiny QS21 a QS17 (frakce Quil A čištěné HPLC) se popisují jako silné systémové adjuvans a způsob jejich produkce se popisuje v patenotovém dokumentu USA č. 5 057 540 a EP 0 362 279 Bl. V tomto dokumentu se také popisuje použití QS17 (nehemolytické frakce Quil-A) , která působí jako silné adjuvans v případě systémových vakcinačních prostředků. Použití QS21 se dále popisuje v publikaci Kensil et al., 1991, J. Immunology vol. 146, 431-437). V patentovém dokumentu WO 99/10008 se popisují kombinace QS21 a polysorbát nebo cyklodextrin. Systémy adjuvans ve formě částic obsahující frakce QuilA, jako je QS21 a QS7, se popisují v dokumentu WO 96/33739 a WO 96/11711. Další saponiny, které se používají v systémových vakcinačních studiích, se získaly z jiných rostlinných druhů, jako je Gypsofila a Saponaria (popisuje se v publikaci Bombford et al., Vaccine 10(9):572-577, 1992).

Podstata vynálezu

Kombinace adjuvans podle vynálezu mohou dále obsahovat další nosič, tak že CpG se může spojovat s nosičem ve formě částic, přičemž se v kombinaci zesiluje účinek adjuvans. CpG užívaný v kombinacích adjuvans podle vynálezu může být ve volném roztoku nebo může tvořit komplexy s nosiči ve formě částic, jako jsou minerální sole (například sole hliníku nebo vápníku), lipozomy, ISCOM, polymery (polymery tvořené molekulami kyseliny mléčné, polyglykolické polymery, polyfosfazin, polyaminokyseliny, alginát, chitosan) nebo mikročástice. Uvedené nosiče jsou s výhodou kationické. CpG se mohou také připravit takovým způsobem, že jsou spojeny s tokolem s olejovou emulzí obsahující tokol. Toho je možné ·· ·♦«· 44 4« 44 4444 • 4 · 4 · · 4 · 4 · * · 444 4 4 4

Ή 44444444444

J. Ο 444444 4 · 44 44 44 dosáhnout vytvořením emulze, která je kationická. V jiném případě se CpG může spojit s lipidem, který je obsažen v olejové fázi emulze (popisuje se v dokumentu WO 00/15 256) .

Vakcíny podle vynálezu obsahují antigen, který se může nebo nemusí spojovat s komplexem nosič-CpG tak, že tvoří komplex CpG/tokol/olejové kapénky nebo CpG/kovová sůl. Antigenem může být volná suspenze nebo může být spojen s odděleným nosičem. Ve výhodném provedení vynálezu je antigen spojen s komplexem CpG/nosič.

Výhodná kombinace adjuvans podle vynálezu se skládá z jednoho nebo více oligonukleotidu CpG, který obsahuje alespoň 3, s výhodou alespoň 6 nukleotidů mezi 2 přilehlými motivy GC spolu s tokolem, jako je D, L-a-tokoferol. Tato kombinace s výhodou dále zahrnuje aktivní derivát adjuvans LPS a nosič ve formě částic, který se vybral ze skupiny obsahující kovovou sůl nebo emulzi olej ve vodě. Kombinace adjuvans zahrnuje CpG 2006 (SEQ ID NO: 4) nebo CpG 1758 (SEQ ID NO: 2) nebo CpG 1826 (SEQ ID NO: 1) a emulzi skvalen/D,L-a-tokoferol. Uvedené výhodné adjuvans dále obsahuje 3-0deacylmonofosforyllipid A nebo 3-O-deacyldifosforyllipid A a/nebo QS21. Výhodný systém adjuvans obsahuje kombinaci QS21, 3D-MPL a tokol a CpG.

Kombinace adjuvans podle vynálezu se může použít jako systémové nebo mukozální adjuvans. Vakcinace pacientů se provedla řadou způsobů aplikace, přičemž nejběžnější je aplikace vakcinačního prostředku hluboko do svalu jedince (intramuskulární injekce). Další dobře známé způsoby vakcinace zahrnují subkutánní, intranasální, orální, rektální a intraperitoneální a intradermální aplikace. Ačkoliv vakcinace podle vynálezu se mohou aplikovat libovolným způsobem,

4444

4» • · * 4 4 4

4 4 4 44 44 4

444 44 444 4 4 • 4444 4444

44 4 4 44 44 aplikace popsaných vakcinačních prostředků do kůže je výhodné provedení vynálezu.

Lidská kůže obsahuje vnější rohovitou kutilku, která se nazývá stratům corneum (rohovitá vrstva), která překrývá epidermis. Pod vrstvou epidermis je vrstva nazývaná dermis, která překrývá subkutánní tkáň. Výzkum ukázal, že injekce vakcinačního prostředku do kůže, zvláště do vrstvy dermis, stimuluje imunitní odezvu, která je spojena s řadou dalších výhod. Zde popsaná intradermální vakcinace pomocí vakcinačních prostředků tvoří předmětnou věc vynálezu.

Běžným způsobem zavedení vakcinačního prostředku podle vynálezu je postup, který zahrnuje tyto kroky. Očištění kůže a její natažení jednou rukou. Tenká jehla (26 až 31 gauge se o

zavede do kůže hrotem nahoru pod úhlem 10 až 15 . Po zavedení hrotu jehly se válec jehly dále zapouští, přičemž se něj slabě tlačí, aby se pod kůží nazvedl. Kapalina se pak zavádí velmi pomalu a na povrchu kůže se tvoří puchýř nebo boule. Pak následuje vyjmutí jehly.

Vynález také popisuje zařízení, která jsou specificky navržena pro aplikaci kapalných činidel do kůže nebo skrz kůži. Jsou to například zařízení popsaná v patentovém dokumentu WO 99/34850 a EP 1 092 444 a v dokumentech WO 01/13 977, patentový dokument USA č. 5 480 381, patentový dokument USA 5 599 302, 5 334 144, 5 993 412, 5 649 912, 5 569 189, 5 704 911, 5 893 397, 5 466 220, 5 339 163, 5 312 335, 5 503 627, 5 064 413, 5 520 639, 4 596 556, 4 790 824, 4 941 880, 4 940 460 a WO 97/37 705 a 97/13 537. Jiné způsoby intradermální aplikace vakcinačních prostředků mohou zahrnovat běžné injekční stříkačky a jehly nebo zařízení navržená pro balistické zavádění pevných vakcinačních prostředků (popisuje se v patentovém dokumentu WO 99/27 961) nebo pomocí •4 ··*· »« »··· • · · » · · ·· 9 • 9 9 9 9 9 9 99 9 • ········♦ « »··· »> ·· *· · «.* transdermálních náplastí popsaných v patentovém dokumentu WO 97/48 440, WO 98/28 037) nebo se aplikují na povrch kůže (transdermální nebo transkutánní zavedení se popisuje v dokumentu WO 98/20 734 a WO 98/28 037).

Když se vakcinační prostředky podle vynálezu aplikují do kůže, specificky do vrstvy dermis, pak vakcinační prostředek je formě malého objemu kapaliny. Výhodný je objem 0,05 ml a 0,2 ml.

Termín „intradermální zavedení znamená aplikace vakcinačního prostředku do oblasti kůže dermis. Avšak vakcinační prostředek není nutné aplikovat pouze do oblasti dermis. Dermis je vrstva v kůži, která se nachází v hloubce 1,0 až přibližně 2,0 mm pod povrchem lidské kůže. Mezi jedinci a v různých částech těla existuje však jistá odchylka v hloubce. V obecném případě je možné očekávat, že dosažení vrstvy dermis nastává 1,5 mm pod povrchem kůže. Dermis se nachází mezi vrstvou stratům corneum a vrstvou epidermis, které ho překrývají, a subkutánní vrstvou, která je pod ním.

V závislosti na způsobu zavedení, vakcinační prostředky se mohou zavést pouze nebo primárně do vrstvy dermis nebo se mohou rozložit ve vrstvě epidermis a dermis.

Vývoj vhodných dávek a léčebných režimů vhodných pro použití určitých zde popsaných prostředků při různých režimech léčby zahrnuje například orální, parenterální, intravenózní, intradermální, intranasální a intramuskulární aplikaci a přípravu.

Zde popsané farmaceutické prostředky je možné zavést prostřednictvím orální aplikace zvířeti. Tyto prostředky je možné připravit s inertním ředidlem nebo s upraveným poživatelným nosičem nebo mohou být uzavřeny v želatinové ·· ·4·>

• · • Ui ·· ·* » · « « • » · « ♦ • * · · » · • · · 4» · <* ·* »* ♦»!»· kapsli s tvrdou nebo měkkou stěnou nebo se mohou stlačit do tablet nebo se mohou začlenit do stravy.

Aktivní sloučeniny se mohou dokonce začlenit s pomocnými látkami za vzniku formy požívaných tablet, lícních tablet, pastilek, kapsulí, elixírů, suspenzí, syrupů, oplatek a podobně (popisuje se například v publikaci Mathiowitz et al., Nátuře 1997 Mar. 27, 386, (6623):410-4, Hwang et al., Crit.

Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1998, 15(3):243-84 a v dokumentu USA č. 5 641 515, č. 5 580 579 a č. 5 792 451) . Tablety, pastilky, pilulky, kapsule a podobné formy mohou také obsahovat různé další složky. Jsou to například pojidlo, jako je tragant, akácíová guma, kukuřičný škrob nebo želatina. Dále mohou zahrnovat pomocné látky, jako je fosforečnan vápenatý, činidlo zajišťující rozpad tablety po požití, jako je kukuřičný a bramborový škrob, kyselinu alginovou a podobně. Dále mohou zahrnovat lubrikační činidlo, jako je stearát horečnatý a sladící činidlo, jako je sacharóza, laktóza nebo sacharin nebo ochucovadla, jako je pepermint, libavková nebo třešňová silice. V případě, že dávkovou jednotku tvoří kapsule, může navíc obsahovat materiály vedle shora v textu uvedených typů, kapalný nosič. Různé jiné druhy materiálů mohou být přítomny jako potahovací materiály nebo jiným způsobem upravují fyzikální formu dávkové jednotky. Tablety, pilulky nebo kapsule je možné potáhnout například pomocí šelaku, cukru nebo šelaku a cukru. Samozřejmě všechny materiály, které se používají při přípravě dávkové jednotky, by měly vyhovovat požadavkům farmaceutické čistoty a toxicity vzhledem k použitému množství. Navíc aktivní sloučeniny se mohou začlenit do přípravků a prostředků s nepřerušovaným uvolněním. V typickém případě tyto přípravky budou obsahovat alespoň 0,1 % nebo více aktivních složek. Procentické zastoupení aktivních složek může samozřejmě kolísat a může se běžně pohybovat mezi přibližně 1 nebo 2 % a může tvořit φφ φφφφ «φ φφφφ φφ ·'♦ ·· · · φ * ΦΦ · * φ φ φ φφ* φφφ φ φφφφφ φφφφ ·

Ω Π ••••φφφφφφφ ···· ·· ·· φφ φφ φφ přibližně 60 nebo 70 % nebo více hmotnosti nebo objemu celkového přípravku. Množství' aktivní látky v každém terapeuticky použitelném prostředku je samozřejmě takové, aby vhodná dávka byla obsažena v libovolné dané jednotkové dávce sloučeniny. Odborník při přípravě farmakologických prostředků zvažuje faktory, jako je rozpustnost, biologická dostupnost, biologický poločas rozpadu, způsob aplikace, doba skladování produktu, stejně jako farmakologické použití. Také je nutné znát požadovaný dávkový a léčebný režim.

V případě orální aplikace se může prostředek podle vynálezu připravit spolu s jednou nebo více pomocných látek ve formě ústní vody, zubní pasty, bukálních tablet, ústního spreje nebo ve formě prostředku, který se aplikuje pod jazyk.

V jiném případě se aktivní složka může začlenit do orálního roztoku, jako je ten obsahující borát sodný, glycerin a uhličitan draselný nebo je rozptýlena v zubní pastě nebo se přidá v terapeuticky účinném množství do . prostředku, který může dále obsahovat vodu, pojivo, abrazivo, ochucovadlo, pěnící činidla a zvlhčovadla. V jiném případě se prostředky mohou vyskytovat ve formě tablet nebo roztoku, které se mohou zavést pod jazyk nebo se rozpouští v ústech jiným způsobem.

Za jistých okolností bude nutné zavést popsané farmaceutické prostředky parenterálně, intravenózně, intramuskulárně nebo dokonce intraperitoneálně. Takové přístupy jsou dobře známy v oboru a některé z nich se popisují v patentovém dokumentu USA č. 5 543 158, č. 5 641 515 a 5 399 363. V jistých provedeních vynálezu se roztoky aktivních látek jako volné báze nebo farmaceuticky přijatelné sole mohou připravovat ve vodě, vhodně smíchané s povrchově aktivním činidlem, jako je hydroxypropylcelulóza. Disperze se mohou také připravit v glycerolu, v kapalných polyetylenglykolech a v jejich směsích a v olejích. Za normálních podmínek

··· · ·· skladování a použití, budou tyto přípravky v obecném případě obsahovat konzervační činidla, aby se zabránilo růstu mikroorganizmů.

Ilustrativní farmaceutické formy vhodné pro injektovatelné použití zahrnují sterilní vodné roztoky nebo disperze a sterilní prášky pro prostředky injektovatelných roztoků nebo disperzí připravených v čas potřeby (popisuje se například v patentovém dokumentu č. 5 4 66 4 68) . Ve všech případech musí být forma sterilní a musí být kapalná, aby se zaručila snadná aplikace injekční stříkačkou. Daná forma musí být stabilní za podmínek výroby a skladování a musí předcházet kontaminaci mikroorganizmy, jako jsou bakterie nebo plísně. Nosičem může být rozpouštěcí nebo disperzní médium, která obsahují například vodu, etanol, polyol (například glycerol, propylenglykol a a kapalný polyetylenglykol a podobně), jejich vhodné směsi a/nebo rostlinné oleje. Musí se udržovat správná fluidita a to například použitím potahovacího materiálu, jako je lecitin. Tento materiál udržuje požadovanou velikost částic v případě disperze a/nebo použitím povrchově aktivních činidel. Zabránění působení mikroorganizmů se provádí použitím různých antibakteriálních a antifungicídních činidel, jako jsou například parabeny, chlorobutanol, fenol, kyselina sorbová, timerasol a podobně. V mnoha případech prostředky také zahrnují izotonická činidla, jako jsou například cukry nebo chlorid sodný. Prodloužená absorpce injektovatelných prostředků se může dosáhnout použitím činidel prodlužujících absorpci, jako je například monostearát hlinitý a želatina.

V jednom provedení vynálezu v případě parenterální aplikace ve vodném roztoku by se měl roztok vhodně upravit pufrem, jestliže je to nutné, a kapalné ředidlo by se mělo udržovat izotonické pomocí fyziologického roztoku nebo glukózy. Tyto uvedené vodné roztoky jsou zvláště vhodné pro ·· ···· ·· ·· ·· ···· ·· ···· · · · • · · · · · · · · · • ········· ·

........’*··’ intravenózní, intramuskulární, subkutánní a intraperitoneální aplikaci. V oboru jsou dobře známy sterilní vodná média, které se mohou použít v uvedeném spojení. Jedna dávka se například může rozpustit v 1 ml izotonického roztoku NaCl a je možné ji přidat do 1 000 ml roztoku injekcí do předem navrženého místa infúze (popisuje se například v publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences, 15^th Edition, p. 1035-1038 and 15701580). Některé rozdíly v dávce se nezbytně vyskytují v závislosti na podmínkách léčby subjektu. V případě aplikace člověku, přípravek musí samozřejmě splňovat podmínky sterility, pyrogenity a obecně bezpečnosti a vyhovovat standardům čistoty, jak vyžaduje FDA v případě biologických standardů.

Nosiče mohou dále obsahovat libovolné činidlo ze skupiny zahrnující rozpouštědlo, disperzní médium, pomocné látky, potahovací činidla, ředidla, antibakteriální činidla a fungicidy, izotonická činidla a činidla prodlužující adsorpci, pufry, roztoky nosičů, suspenze, koloidy a podobně nebo všechna uvedená činidla. Použití takových médií a činidel v případě farmaceuticky aktivních látek je dobře známo v oboru. Výjimku tvoří libovolné běžné médium nebo činidlo, které není kompatibilní s aktivní látkou, pak se jeho použití v terapeutickém prostředku zvažuje. Do prostředků je možné také zahrnout doplňkové aktivní složky. Termín „farmaceuticky přijatelný znamená molekulu a prostředek, který po aplikaci člověku nevyvolává alergickou nebo podobnou reakci.

V jistých provedeních vynálezu farmaceutické prostředky je možné zavést intranasálním sprejem, inhalací a/nebo jiným zařízením pro aplikaci aerosolu. Způsoby zavedení genů, nukleových kyselin a peptidových prostředků přímo do plic formou nasálních aerosolových sprejů se popisuje například v patentovém dokumentu USA č. 5 756 353 a č. 5 804 212.

• · · · • · · · · · • 444 4 · ·

V oboru farmacie je také známo zavedení léčebných prostředků použitím intranasálních mikročástic pryskyřic (popisuje se v publikaci (Takenaga etal., J. Controlled Relase, 1998, Mar. 2, 52(1-2):81-7) a lysofosfatidyl-glycerolových sloučenin (popisuje se v patentovém dokumentu č. 5 725 871). Transmukozální zavedení ve formě polytetrafluoroetylenové podpůrné matrice se popisuje v patentovém dokumentu č. 5 780 045.

Způsoby systémové aplikace vakcinačních prostředků mohou zahrnovat běžné injekční stříkačky a jehly nebo zařízení navržené pro balistické zavedení pevných vakcín (popisuje se v publikaci WO 99/27 961) nebo tlakové vstřikovače kapalin, které nemají jehly (popisuje se v patentovém dokumentu USA č. 4 596 556, č. 5 993 412) nebo transdermální náplasti (popisuje se v patentovém dokumentu WO 97/48 440, WO 98/28 037). Vynález je možné také použít k zesílení imunogennosti antigenů aplikovaných na kůži (transdermální nebo transkutánní zavedení, popisuje se v patentových dokumentech WO 98/20 734, WO 98/28 037). Vynález dále popisuje aplikátory pro systémovou aplikaci, které jsou předem naplněny vakcinačním prostředkem nebo adjuvans podle vynálezu.

Vynález dále popisuje aplikátor pro systémovou aplikaci, který je předem naplněn vakcinačním prostředkem nebo adjuvans podle vynálezu. V souladu s tím se dále popisuje způsob vyvolání imunitní odezvy jedince. Tento způsob zahrnuje aplikaci vakcinačního prostředku podle vynálezu jedince, přičemž vakcínační prostředek se aplikuje parenterálním nebo systémovým způsobem.

Vakcínační prostředky podle vynálezu s výhodou zahrnují antigen nebo antigenní přípravek, který je schopný vyvolat imunitní odezvu proti lidskému patogenu, přičemž uvedený ···· ·· ·· ·· ···· • · · · · · · • 9 9 9 9 9 9 9 9 ·· 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 antigen nebo antigenní přípravek se získal z HIV-1 ( jako je tat, nef, gpl20 nebo gpl60), lidských herpesových virů, jako je gD nebo jeho deriváty nebo ze středně časného proteinu, jako je ICP27, který pochází z HSV2 nebo HSV1, cytomegaloviru ((espHuman) (jako je gB nebo jeho deriváty), rotavirů (zahrnující živý atenuovaný virus), z viru Epstein-Barrové (jako je gp350 nebo jeho deriváty), viru varicella zoster (jako jsou gpl, II a IE63) nebo z viru hepatitidy, jako je virus hepatitidy B (například povrchový antigen viru hepatitidy B nebo jeho deriváty), z viru hepatitidy A, C a E nebo z jiných virových patogenů, jako jsou paramyxoviry. Do skupiny paramyxovirů patří respirační syncyciální virus (jako jsou proteiny F a G nebo jejich deriváty), virus parainfluenzy, spalničkový virus, virus příušnic, lidské papilomaviry (například HPV6, HPVll, HPV16, HPV18, atd..), flaviviry (například virus žluté horečky, virus dengue, virus klíšťové encefalitidy, virus japonské encefalitidy) nebo virus influenzy (jako je celý živý nebo deaktivovaný virus, štěpený virus influenzy, které se kultivují na vejcích nebo v buňkách MDCK, nebo celé virosomy (jak se popisuje v publikaci R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) nebo jejich čištěné nebo rekombinantní proteiny, jako je HA, NP, NA nebo protein M nebo jejich kombinace, nebo se získaly z bakteriálních patogenů, jako je Neissería spp. zahrnující N. gonorrhea a N. meningitidis (například kapsulární polysacharidy a jejich konjugáty, proteiny vázající transferin, proteiny vázající laktoferin, PilC, adhesin), S. pyogenes (jsou to například proteiny M nebo jejich fragmenty, proteáza C5A, lipoteichové kyseliny), S. agalactiae, S. mutans, H. ducreyi, Moraxella spp., zahrnující M. catarhallis, který je také znám jako Branhamella catarhallis (adhesiny a invasiny s vysokou a nízkou molekulovou hmotností), Bordetella spp., zahrnující B. pertussis (například pertaktin, toxin pertuze nebo jejich deriváty, vláknitý hemaglutinin, adenylovaná cykláza, • · ··· · avium, Μ. zahrnuj ící fimbriae) , B. parapertussis a B. bronchiseptica, Mycobacterium spp. zahrnující M. tuberculosis (například ESAT6, antigen 85A, -B nebo -C) , M. bovis, M. leprae, M.

paratuberculosis, M. smegmatis, Legionella spp.,

L. pneumophila, Escherichia spp. zahrnující enterotoxické mikroorganizmy E. coii (například kolonizační faktory, teplotně labilní toxin nebo jeho deriváty, teplotně stabilní toxin nebo jeho deriváty), enterohemarogické mikroorganizmy E. coii, enteropatogenní E. coii (například toxin podobný toxinu shiga nebo jeho deriváty), Vibrio spp. zahrnující V. cholera (například toxin cholery nebo jeho deriváty) , Shigella spp. zahrnující S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii, Yersinia spp, zahrnující Y. enterocolitica (například protein Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Campylobacter spp, zahrnující C. jejuni (například toxiny, adhesiny a invasiny) a C.coli, spp., zahrnující S. typhi,

Salmonella choleraesuis, S. enteritidis, Listería monocytogenes, Helicobacter spp.

S. paratyphi, S. spp. zahrnující L. zahrnující H. pylori (například ureáza, kataláza, vakuolizující toxin), Pseudomonas spp. zahrnující P. aeruginosa, Staphylococcus spp. zahrnující S. aureus, S. epidermidis, Enterococcus spp. zahrnující E. faecalis, E. faecium, Clostridium spp. zahrnující C. tetani (například toxin tetanu a jeho deriváty), C. botulinum (například botulinový toxin a jeho deriváty) , C. difficile (například toxiny A a B z mikroorganizmu clostridium a jejich deriváty), Bacillus spp. zahrnující B. anthracis (například botulinový toxin a jeho deriváty), Corynobacterium spp. zahrnující C. diphtheriae (například difteriový toxin a jeho deriváty), Borrelia spp. zahrnující B. burgdorferi (například OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (například OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (například OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (například OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii, Ehrlichia spp. zahrnující E. equi a agens lidské granulocytové erlichiózy, Rickettsia spp., zahrnující R. rickettsii,

9999

9 99 9

	23	9999 99 99 99	99 99
Chlamydia spp., zahrnující	C.	trachomatis	(například	MOMP,
proteiny vázající heparin),	C.	pneumoniae	(například	MOMP,
proteiny vázající heparin),	C.	psittaci,	Leptospira	spp. ,

zahrnující L. interrogans, Treponema spp, zahrnující T. palladium (například řídce se vyskytující proteiny vnější membrány), T. denticola, T. hyodysenteriae. Dále jsou to antigeny nebo antigenní prostředky získané z parazitů, jako je Plasmodium spp. zahrnující P. falciparum, Toxoplasma spp. zahrnující T.gondii (například SAG2, SAG3, Tg34), Entamoeba spp. zahrnující E. histolytica, Babesia spp. zahrnující B. mícroti, Trypanosoma spp. zahrnující T. cruzi, Giarda spp. zahrnující G. lamblia, Leshmania spp. zahrnující L. major, Pneumocystis spp. zahrnující P. carinii, Trichomonas spp. zahrnující T. vaginalis, Schísostoma spp. zahrnující S. mansoni, nebo z kvasinek, jako je Candida spp. zahrnující C. albicans, Cryptococcus spp. zahrnující C. neoformans.

Jiné výhodné specifické antigeny v případě M. tuberculosis jsou například Tb Ral2, bH9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 a hTCCl (popisuje se v patentovém dokumentu 99/51 748). Proteiny v případě mikroorganizmu M. tuberculosis také zahrnují fúzní proteiny a jejich varianty, kde alespoň dva, přednostně tři polypeptidy M. tuberculosis fúzují za vzniku většího proteinu. Výhodné fúze zahrnují Ral2-TbH9-Ra35, Erdl4-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erdl4-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erdl4DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (popisuje se v dokumentu 99/51 748).

Nej výhodnější antigeny v případě Chlamydia zahrnují například protein s vysokou molekulovou hmotností (HWMP) (popisuje se v dokumentu WO 99/17 741), ORF3 (popisuje se v dokumentu EP 366 412) a putativní membránové proteiny (Pmps). Jiné antigeny vakcinačních prostředků v případě ···· « · • ·· · ·« ·· · ·

Chlamidia se mohou vybrat ze skupiny popsané v patentovém dokumentu WO 99/28 475.

Výhodné bakteriální vakcíny obsahující antigeny získané ze Streptococcus spp. zahrnující S. pneumoniae (například kapsulární polysacharidy a jejich konjugáty, PsaA, PspA, streptolysin, proteiny vázající cholin) a proteinový antigen pneumolysin (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007, Rubins et al., Microbial. Pathogenesis, 2, 337-342) a jeho mutantní detoxifikované deriváty (popisuje se v patentovém dokumentu WO 90/06 951, WO 99/03 884). Jiné výhodné bakteriální vakcíny obsahují antigeny získané z mikroorganizmu Haemophilus spp. zahrnující H. influenzae typ B (například PRP a jeho konjugáty), netypovatelný H. influenzae, například OMP26, adhesiny s vysokou molekulovou hmotností, P5, P6, protein D a lipoprotein D a fimbrin a peptidy odvozené z fibrinu (popisuje se v patentovém dokumentu USA č. 5 843 4 64) nebo varianty tvořící více kopií nebo jejich fúzní proteiny.

Deriváty povrchového antigenu hepatitidy B jsou dobře známy v oboru a zahrnují mimo jiné antigeny PreSl, PreS2, které se popisují v přihláškách evropského patentu EP-A-414 374, EP-A-0304 578 a EP 198-474. Ve výhodném provedení vynálezu vakcinační prostředek obsahuje antigen HIV-1, gpl20, zvláště, když se exprimuje v buňkách CHO. V dalším provedení vynálezu vakcinační prostředek podle vynálezu obsahuje shora v textu definovaný gD2t.

Ve výhodném provedení vynálezu vakcinační prostředky zahrnují antigen získaný který odpovídá za genitální obsahující uvedené adjuvans z lidského papiloma viru (HPV), léze (HPV6 nebo HPV 11 a další), a virů HPV, který způsobují karcinom děložního čípku (HPV16, HPV18 a další).

• ft ···· ftft ftftftft ·· ftftftft ftft · • · · · ··· · · · • ··· ftft ftftft · · • · · ftftftft ftftftft

...... ........

Zvláště výhodné formy profylaktických nebo terapeutických vakcín genitálních lézí obsahují částice Ll nebo kapsoméry a fúzní proteiny obsahující jeden nebo více antigenů vybraných z proteinů E6, E7, Ll a L2 virů HPV 6 a HPV 11.

Nejvýhodnější formy fúzního proteinu jsou L2E7, jak se popisuje v patentovém dokumentu WO 96/26 277, a protein D(l/3)-E7 popsaný v patentovém dokumentu GB 9717953.5 (popisuje se v patentovém dokumentu PCT/EP98/05 285).

Profylaktické a léčebné vakcinační prostředky v případě cervikální infekce nebo zhoubného bujení způsobeného HPV mohou s výhodou obsahovat antigeny HPV 16 nebo 18. Například antigenní monomery Ll a L2 nebo antigeny Ll nebo L2 jsou přítomny dohromady ve formě částic podobných viru (VLP) nebo samotný protein Ll je přítomný ve formě VLP nebo kapsomeru. Uvedené antigeny, VLP a kapsoméry jsou dobře známy v oboru. Popisuje se například v dokumentech WO 94/00 152, WO 94/20 137, WO 94/05 792 a WO 93/02 184.

Další časné proteiny se mohou vyskytovat samotné nebo ve formě fúzních proteinů, jako je E7, E2 nebo s výhodou E5. Zvláště výhodná provedení vynálezu zahrnují VLP obsahující fúzní proteiny L1E7 (popisuje se v dokumentu WO 96/11 272).

Zvláště výhodné antigeny HPV 16 zahrnují časné proteiny E6 nebo E7 ve fúzi s proteinem D za vzniku fúzí protein D-E6 nebo fúzí E7 pocházející z HPV 16 nebo jejich kombinací nebo kombinací E6 nebo E7 s L2 (popisuje se v patentovém dokumentu WO 96/26 277) .

V jiném případě časné proteiny E6 a E7 virů HPV 16 nebo 18 se mohou vyskytovat v jediné molekule, s výhodou jako fúze protein D-E6/E7. Taková vakcína může obsahovat buď protein E6 ·♦ ··«· ·· ·· ► · · ► 9 999

9999 ··*· ·· ·· ·· » · « « 99 99 nebo E7 z HPV18 nebo oba uvedené proteiny s výhodou ve formě fúze protein D-E6 nebo protein D-E7 nebo protein DE6/E7.

Vakcinační prostředek podle vynálezu může dále obsahovat antigeny z jiných kmenů HPV. Výhodné jsou kmeny HPV 31 nebo 33.

Vakcinační prostředky podle vynálezu dále obsahují antigeny získané z parazitů, které způsobují malárii. Výhodné antigeny z Plasmodia falciparum zahrnují RTS,S a TRAP. RTS je hybridní protein obsahující v podstatě všechny C-terminální oblasti circumsporozoitového proteinu (CS) parazitu P. falciparum spojeného prostřednictvím čtyř aminokyselin části preS2 povrchového antigenu hepatitidy B k povrchovému antigenu Jeho celá struktura se popisuje přihlášce č.

(S) viru hepatitidy B. v mezinárodní patentové

PCT/EP92/02 591, zveřejněné pod označením WO 93/10 152, která nárokuje prioritu patentové přihlášky Velké Británie č. 9124390.7. Když se RST exprimuje v kvasinkách, produkuje se jako lipoproteinová částice a když se exprimuje společně s antigenem S, který pochází z HBV, produkuje se jako smíšená částice známá jako RTS,S. Antigeny TRAP se popisují v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/GB89/00895, zveřejněné pod označením WO 90/01 496. Výhodné provedení vynálezu je maláriová vakcína, kde antigenní přípravek obsahuje kombinaci antigenu RTS,S a TRAP. Jiné antigeny plasmodia, které mohou pravděpodobně tvořit složky vakcinačního prostředku pro malárii, jsou P.faciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAPI, RAP2, sequestrin, PfEMPl, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfsl6, Pfs48/45, Pfs230 a jejich analogy v Plasmodium spp..

Přípravky mohou také obsahovat antinádorový antigen a je možné ho použít pří imunoterapeutické léčbě zhoubného bujení.

·♦ 4444 •4 9 99 9 •4 · · 9 · 44 4

44 444 444

444 44 444 4 4

44 4444 4444

4444 ·4 44 44 44 44

Adjuvans je možné využít spolu s antigeny, které nádor odmítá, jako je to v případě karcinomu prostaty, prsu, kolorektálního karcinomu, karcinomu plic, karcinomu pankreasu, renálního karcinomu a melanomu. Příklady antigenů zahrnují MÁGE 1, 3a MÁGE 4 nebo jiné antigeny MÁGE, jak se popisují v dokumentu WO 99/40 188, PRÁME, BAGE, Lage (je také znám jako NY Eos 1) SAGE a HAGE (popisuje se v dokumentu WO 99/53 061) nebo GAGE (popisuje se v publikaci Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636, Van den Eynde et al., International Journal of Clinical and Laboratory research (1997), Correale et al., (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293. Tyto antigeny se exprimují v mnoha typech nádorů, jako je melanom, karcinom plic, sarkom a karcinom močového měchýře.

Antigeny MÁGE vhodné pro použití podle vynálezu se mohou exprimovat jako fúzní protein se zesilovačem exprese nebo imunologický fúzní partner. Protein Máge se může fúzovat s proteinem D z mikroorganizmu Heamophilus influenzae B nebo z jeho lipidovaných derivátů. Fúzní partner může obsahovat první třetinu proteinu D. Takové konstrukce se popisují v dokumentu WO 99/40 188.

Jiné antigeny specifické pro nádor jsou vhodné pro použití s adjuvans podle vynálezu a zahrnují, ale nejsou omezeny na gangliosidy, jako je s nosičovými proteiny.

GM2 a GM3 nebo jeho konjugáty Uvedený antigen může být samotný peptidový hormon, jako je hormon v celé délce uvolňující gonadotropin (GnRH, popisuje se v dokumentu WO 95/20 600)

Jde o peptid obsahující 10 aminokyselin, který je možné použít při léčbě zhoubného bujení nebo při imunokastraci.

Ve výhodném provedení vynálezu se používají antigeny prostaty, jako je antigen specifický pro prostatu (PSA), PAP, ·· ···· ·· ·· • · · · · · • · · · ··· 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9999 ·♦ ·9 »· • · · · 9· ··

PSCA (popisuje se v publikaci PNAS 95(4) 1735-1740, 1998),

PSMA nebo antigen známý jako prostáza.

Prostáza je proteáza specifická pro prostatu (podobná trypsinu), obsahuje 254 aminokyselin s konzervativní serinovou proteázovou katalyzickou triádou H-D-S a amino-terminální prepropetidovou sekvencí, která vyvolává silnou sekreci (popisuje se v publikaci P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood and K. Wand, Molecular cloning and characterisation of prostatě, an androgen-regulated serine protease with prostatě restricted expression, In Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1999) 96, 3114-3119). Popisuje se putativní místo glykosylace. Předpokládaná struktura je velmi podobná již známým serinovým proteázám, které ukazují, že se zralý peptid balí do jediné domény. Zralý protein obsahuje 224 aminokyselin s jedním epitopem A2, který se přirozeně upravuje.

Nukleotidová sekvence prosteázy a dedukovaná polypeptidová sekvence a homology se popisují v publikaci Ferguson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119) a v mezinárodní patentové přihlášce č. WO 98/12 302 (a také v odpovídajícím uděleném patentovém dokumentu USA č. 5 955

306), v dokumentu WO 98/20 117 (a také v odpovídajícím uděleném patentovém dokumentu USA č. 5 840 871 a 5 786 148) (kalikrein specifický pro prostatu) a v dokumentu WO 00/04 149 (P703P).

Vynález popisuje prostředky obsahující fúze prostázového proteinu založené na prostázovém proteinu a jeho fragmentech a homolozích (derivátech). Takové deriváty jsou vhodné pro použití jako terapeutické vakcinační prostředky, které jsou vhodné pro léčbu nádorů prostaty. V typickém případě fragment bude obsahovat alespoň 20, s výhodou 50, výhodněji 100

44

4 4

4 444

4444 • 4 4 •44

444 · • · 4 4 4 44 4 ·· ·· 44 4» nepřerušovaných aminokyselin, jak se popisuje ve shora uvedeném patentovém dokumentu a v patentové přihlášce.

Další výhodný antigen prostaty je znám jako P501S, sekvence ID NO: 113 a popisuje v patentovém dokumentu WO 98/37814. Imunogenní fragmenty a jejich části obsahující alespoň 20, s výhodou 50 nebo výhodněji 100 nepřerušovaných aminokyselin se popisují ve shora uvedené patentové přihlášce. Například PS108 se popisuje v dokumentu WO 98/50 567.

Jiné antigeny specifické pro prostatu se popisují v dokumentu WO 98/37 418 a WO/004149. Další jsou antigeny STEAP PNAS 96 14 523 14528 7-12 1999.

Další antigeny spojené s nádorem, které se používají v souladu s vynálezem zahrnují Plu-1 (popisuje se v publikaci

J. Biol. Chem. 274 (22) 15633-15645, 1999), HASH-1, HasH-2, kripto (popisuje se v publikaci Salomon et al. , Bioessays 199, 21 61.70, a v dokumentu USA č. 5654140), kriptin (popisuje se v patentovém dokumentu USA č. 5 981 215). Další antigeny, které jsou zvláště relevantní v případě vakcinačních prostředků při terapii zhoubného bujení, také obsahují tyrozinázu a survinin.

Vynález dále zahrnuje peptidy odvozené od mucinu, jako je Mucl, které se například popisují v patentových dokumentech USA č. 5744 144, č. 5827 666, č. 4 963 484 a WO 8805054. Specificky zvažované jsou peptidy odvozené od Mucl, které obsahují alespoň jednu opakující se jednotku peptidu Muc 1. Výhodné je, když obsahují alespoň dvě takové repetice a jsou rozeznávány protilátkami SM3 (popisuje se v patentovém dokumentu USA č. 6 054 438) . Další peptidy odvozené z mucinu zahrnují peptid pocházející z Muc 5.

·· ·♦*· 4· «« • · 9,999 • 9 '9 9999 • · r · · « • 9 9 9 9 9

9999 ti 99 99

9999

9 9

9 9 • 9 9 9 ti

Předmětnou věc vynálezu je možné také použít v kombinaci s antigeny karcinomu prsu, jako je her2/Neu, mamaglobin (popisuje se v patentovém dokumentu USA č. 5668267) nebo se popisují v dokumentech WO/0052165, WO99/33869, WO99/19479, WO 98/45328. Antigeny her2 neu se popisují mimo jiné v patentovém dokumentu USA č. 5 801 005. Antigen her2 neu s výhodou obsahuje celou extrabuněčnou oblast (tvořenou přibližně aminokyselinou 1 až 645) nebo jejími fragmenty a alespoň imunogenní částí vnitrobuněčné domény nebo celou vnitrobuněčnou oblastí tvořenou 580 C-terminálními aminokyselinami. Vnitrobuněčná část by měla zvláště obsahovat fosforylační oblast nebo její fragmenty. Takové konstrukce se popisují v patentovém dokumentu WO 00/44 899. Zvláště výhodná konstrukce je známa jako ECD PD, další je známa jako ECD PD (popisuje se v patentovém dokumentu WO 00/44 899. Zde používaný antigen her2 neu se může získat z krysy, myši nebo člověka.

Prostředky mohou obsahovat antigeny spojené s mechanismy podporující nádor (například angiogeneze, invaze nádoru), jako jsou například tie 2, VEGF.

Je možné tušit, že prostředky podle vynálezu se budou používat k vytvoření vakcinačních prostředků obsahujících antigeny odvozené z mikroorganizmu Borrelia sp. . Antigeny mohou například zahrnovat nukleovou kyselinu, antigen odvozený z patogenu nebo antigenní prostředek, protein nebo peptidy vytvořené rekombinací a chimerové fúzní proteiny. Antigen je například OspA. OspA může být zcela zralý protein v lipidované formě produkovaný hostitelskou buňkou (mikroorganismus E. coli), který se nazývá Lipo-OspA, nebo nelipidovaný derivát. Takové nelipidované deriváty zahrnují nelipidovaný fúzní protein NSl-OspA, který obsahuje prvních 81 N-terminálních aminokyselin nestrukturního proteinu (NS1) viru influenzy a ····

9 9 9

9 999 • F 999.9

9999 99

9 9 9 9

99 úplný protein OspA a další. MDP-OspA je nelipidovaná forma OspA, která nese 3 další N-terminální aminokyseliny.

Vakcinační prostředky podle vynálezu se mohou použít při profylaxi nebo terapii alergie. Takové vakcinační prostředky mohou obsahovat antigeny specifické (například Der pl) a nespecifické pro alergen (například peptidy získané z lidského IgE), které zahrnují ale nejsou omezeny na dekapetid (popisuje se v patentovém dokumentu EP 0 477 231 Bl) ) .

Vakcinační prostředky podle vynálezu se mohou také použít při profylaxi nebo terapii chronických poruch, které jsou jiné než alergie, zhoubné bujení nebo infekční onemocnění. Takové chronické onemocnění jsou poruchy jako ateroskleróza a Alzheimerova nemoc.

Vakcinační prostředky podle vynálezu jsou zvláště vhodné při imunoterapeutické léčbě onemocnění, jako jsou chronické onemocnění a zhoubné bujení, ale také při léčbě přetrvávajících infekcí. Vakcinační prostředky podle vynálezu jsou zvláště vhodné pro imunoterapii infekčních onemocnění, jako je tuberkulóza (TB), AIDS a hepatítida B (HepB).

Vynález dále popisuje .vakcinační prostředky a adjuvans podle vynálezu vhodné pro imunoterapii infekčních onemocnění, jako je TB, AIDS a HepB a použití takových adjuvans a vakcinačních prostředků při výrobě léčebných prostředků pro imunoterapii infekčních onemocnění, jako je TB, AIDS a HepB. V případě tuberkulózy se popisuje způsob léčby jedinců trpících infekcí tuberkulózy, který zahrnuje aplikaci vakcinačního prostředku podle vynálezu jedinci, čímž se sníží bakteriální zatížení jedince. Snížení bakteriálního zatížení znamená snížení množství bakterií TB zjištěné ve sputu, což vede ke zlepšení nebo léčbě onemocnění.

vr^r»r ···· 9* • · • ·

• >5 · • 9

Také v kontextu s AIDS se popisuje způsob léčby jedince náchylného nebo trpícího AIDS. Způsob zahrnuje aplikaci vakcinačního prostředku podle vynálezu, čímž se snižuje pokles množství CD4 + T-buněk způsobených následnou infekcí HIV nebo zpomalením nebo zastavení poklesu buněk CD4+ buněk T u jedinců, kteří jsou již virem HIV infikováni.

V případě přetrvávající infekce viru hepatitidy B se popisuje způsob léčby jedinců náchylných nebo trpících infekcí Hep B. Popisuje se způsob, který zahrnuje aplikaci vakcinačního prostředku podle vynálezu jedinci, čímž se snižuje množství viru HepB v séru (stanoveno úbytkem DNA viru hepatitidy) a také snížení poškození jater (jak se stanovilo redukcí nebo stabilizací množství enzymu alaninové transferázy (ALT) v séru).

Množství proteinu v každé vakcinační dávce se vybralo jako množství, které vyvolává imunoprotektivní ochranu bez podstatných, nežádoucích vedlejších účinků v typickém vakcinačním prostředku. Takové množství bude kolísat v závislosti na použitém specifickém imunogenu a formě jeho přítomnosti. V obecném případě se očekává, že každá dávka bude obsahovat 1 až 1 000 pg proteinu, s výhodou 1 až 500 pg proteinu, nejvýhodněji 1 až 50 pg proteinu. Optimální množství určitého vakcinačního prostředku je možné stanovit studiemi, které zahrnují pozorování imunitní odezvy u vakcinovaných subj ektů.

Množství CpG nebo imunostimulačních oligonukleotidů v adjuvans nebo ve vakcinačních prostředcích podle vynálezu je v obecném případě malé, ale závisí na vakcinačním prostředku.

Pohybuje se v rozmezí 1 až 1 000 pg v jedné dávce, s výhodou 1 až 500 pg v jedné dávce, výhodněji 1 až 250 pg v dávce a • · nejvýhodněji 1 až 100 pg v dávce. Poměr CpG:derivátu LPS (hmotnost/hmotnost) je proto v rozmezí 1:1 000 až 1 000:1 a bude v typickém případě v rozmezí 1:100 až 100:1 a s výhodou v rozmezí 1:10 až 1:1 nebo 1:1 až 10:1 a nejvýhodněji 1:1, 4:1 nebo 10:1.

Prostředky podle vynálezu se mohou použít pro účely profylaxe a terapie. Vynález popisuje použití kombinace saponinů a molekuly CpG při výrobě vakcinačního prostředku vhodného pro profylaxi a léčbu virové, bakteriální a parazitově infekce, alergie, zhoubného bujení a jiných poruch, které nejsou chronické. Vynález dále popisuje způsob léčby savce náchylného nebo trpícího infekčním onemocněním nebo zhoubným bujením nebo alergií nebo autoimunitním onemocněním. Vynález dále popisuje kombinaci vakcinačního prostředku a adjuvans, která obsahuje saponin a CpG, jak se popisuje v případě použití pro přípravu léčebného prostředku. Vakcinační prostředek se v obecném případě popisuje v publikaci New Trends and Development in Vaccines, Voliér et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978.

Je zřejmé, že prostředky podle vynálezu se budou používat k přípravě vakcinačních prostředků, které obsahují antigeny získané z různých zdrojů. Antigeny mohou například zahrnovat lidskou, bakteriální nebo virovou nukleovou kyselinu, antigen získaný z patogenu nebo antigenní přípravky, antigen získaný z nádoru nebo antigenní přípravky, antigeny získané z hostitele, které zahrnují peptidy získané z IgE, jako je dekapeptid IgE uvolňující histamin (známý jako Stanworthův dekapeptid), protein nebo peptidy produkované rekombinací a chimerové fúzní proteiny.

Vynález dále popisuje způsob posunu kvality imunitního systému proti antigenu vytvořeného vakcinačním prostředkem, • ΦΦΦ · · φ ·« φ φ který obsahuje imunostimulační oligonukleotid, směrem k imunitní odezvě typu Thl. Způsob zahrnuje přípravu vakcinačního prostředku s imunostimulačním oligonukleotidem a tokolem, který je obsažen v emulzi olej ve vodě. Ve specifickém případě způsob posouvající kvalitu imunitní odezvy vede k vytvoření imunitní odezvy typu Thl, jak se testuje v myším modelu. Izotypy IgG specifické pro antigen vyvolané vakcinačním prostředkem jsou charakterizovány tím, že IgGl obsahuje méně než 50 % celkového IgG specifického pro antigen, jak stanovují střední hodnoty titrů měřených testem ELISA specifickým pro isotyp. Tímto testem se naměřilo méně než 40 % IgG specifického pro celkový antigen.

Popisuje se způsob výroby vakcinačního obsahuje přípravu emulze olej ve vodě smíchání uvedené tokolové emulze oligonukleotidem za vzniku adjuvans a s antigenem nebo s antigenním prostředkem.

prostředku, který obsahující tokol, s imunostimulačním spojení adjuvans

Vynález také popisuje způsob léčby jedince náchylného nebo trpícího onemocněním, který prostředku obsahujícího oligonukleotidu a tokolu.

vakcinačních prostředků v medicíně.

zahrnuje aplikaci vakcinačního kombinaci imunostimulačního

Dále se popisuje použití

Dále se popisuje způsob výroby vakcinačního prostředku a adjuvans, který zahrnuje smíchání derivátu LPS a molekul CpG s antigenem ve farmaceuticky přijatelném ekcipientu, aniž je přítomen saponin. Příklady takových farmaceuticky přijatelných pomocných látek, které jsou vhodné pro použití v kombinacích podle vynálezu zahrnují vodu, fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem, izotonické pufrované roztoky.

Adjuvans podle vynálezu obsahuje tokol a metabolizovatelnou olejovou emulzi a imunostimulační oligonukleotid. Adjuvans s výhodou obsahují tokol a metabolizovatelnou olejovou oligonukleotid a saponin. vynálezu je tokolem metabolizovatelným olejem emulzi, imunostimulační

V obou uvedených provedeních přednostně α-tokoferol a je s výhodou skvalen a imunostimulačním oligonukleotidem je přednostně CpG 2006 (SEQ ID NO: 4). Všechny variace a kombinace v těchto provedeních jsou zřejmé. Je nejvýhodnější, aby adjuvans obsahoval emulzi α-tokoferolu a skvalenu, CpG 2006 (SEQ ID NO: 4 a QS21) .

Nejvýhodnější vakcinační prostředky podle vynálezu obsahují antigen Her2Neu. S výhodou jde o fúzi extrabuněčné oblastí Her2Neu spojené s oblastí fosforylace (ECD-PD (vyrobeno, jak se popisuje v dokumentu WO 00/44899)). Vynález popisuje způsob léčby jedince trpícího zhoubným bujením, kdy se jedinci aplikuje vakcinační prostředek obsahující kombinaci imunostimulačního oligonukleotidu, tokol a ECD-PD. Všechny výhodné rysy použití imunostimulačního oligonukleotidu a tokolu při léčbě jsou zřejmé.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 jsou zobrazeny výsledky růstu nádorů v případě skupiny 1, 2, 4, 5 a 6. Na obrázku č. 2 jsou zobrazeny výsledky růstu nádorů ve skupinách 1, 5, 6, 7 a 11.

Na obrázku č. 3 jsou zobrazeny výsledky růstu nádorů ve skupinách 1, 5, 6, 8, 9 a 10. Prostředky obsahující tokol a CpG vyvolaly úplnou regresi nádoru.

Obrázky č. 4 a 5 zobrazují lymfoproliferační splenocyty in vitro po inkubaci s 5 pg/ml imunogenu (ECD-PD) nebo extrabuněčné oblasti (ECD) nebo intrabuněčné oblasti (ICD) nebo Her2Neu.

Obrázky č. 6 a 7 zobrazují humorální imunitní odezvu na imunogen (ECD-PD) vyjádřeno jako celkový Ig měřený testem ELISA (obrázek č. 6) nebo distribuce izotypu IgG ve zmíněných odezvách (obrázek č. 7).

Na obrázku č. 8 a 9 je zobrazena in vitro lymfoproliferace splenocytů po druhé vakcinaci a 14 dní po čtvrté vakcinaci, po in vitro inkubaci s imunogenem 3 pg/ml (NS1-P703P) nebo s P703P exprimovaném v pichia (15 pg/ml) nebo pomocí nespecifického fúzního proteinu NSl-OspA.

Obrázek č. 10 a 11 zobrazují humorální imunitní odezvu na imunogen (NS1-P703P) vyjádřenou jako Ig měřeným pomocí testu ELISA (obrázek č. 10) nebo distribucí izotypu IgG při těchto odezvách (obrázek č. 11) .

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Imunizace myší pomocí antigenu ECD-PD

Tento experiment se navrhl za účelem zkoumat rozsah adjuvans s antigenem, který je fúzí extrabuněčné oblasti Her2Neu spojené s fosforylační oblastí (ECD-PD), která se produkovala v buňkách CHO podle způsobu popsaného v dokumentu WO 00/44899.

skupina	antigen (25 pg)	adj uvans
1	ECD-PD	žádné (fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem (PBS))
2	ECD-PD	lipozomy s QS21 a 3D-MPL v membráně

• ·· · • 4

3	ECD-PD	emulze olej ve vodě . obsahující tokol s QS21 a 3D-MPL
4	ECD-PD	CpG
5	ECD-PD	lipozomy s QS21 a 3D-MPL v membráně + CpG
6	ECD-PD	emulze olej ve vodě obsahující tokol s QS21 a 3D-MPL + CpG
7	ECD-PD	3D-MPL + CpG
8	ECD-PD	QS21 + CpG
9	ECD-PD	emulze olej ve vodě obsahující tokol + CpG
10	ECD-PD	lipozomy s QS21 v membráně + CpG
11	ECD-PD	lipozomy s 3D-MPL v membráně + CpG

Emulze olej ve vodě obsahující tokol ve shora v textu popsaných skupinách používají D,L,α-tokoferol (CAS č. 1019141-0, název sloučeniny (2RS, 4'RS, 8'RS)-2,5,7,8-tetrametyl-2(4', 8', 12'-trimetyltridecyl)-6-chromanol) ) . Tato látka je běžně dostupná jako ROCHE™. Jestliže v emulzi olej ve vodě v koncentraci v kombinaci se skvalenem, který tvoří 2,5 je tokol přítomen 2,5 % objemu, je % objemu. Oba oleje se smíchaly a před mikrofluidizací se přidal polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween8 0^(tin)) (M110S mikrof luidizační zařízení, maximum 50 pasáží po dobu 2 minut při maximálním tlaku na vstupu 6 barů (tlak na výstupu je přibližně 850 barů), jak se popisuje v dokumentu WO 95/17 210). Skupiny 3, 6 a 9 jsou založeny na shora v textu popsané emulzi s tokolem s přidáním vodného roztoku QS21, 3D-MPL nebo CpG.

QS21 a 3D-MPL, jestliže jsou přítomny v libovolné z vakcinačních skupin popsaných shora v textu, jsou zahrnuty v jedné dávce v množství 5 pg. Oligonukleotidy CpG (Oligo 4 (SEQ ID NO: 4) : TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT) se přidaly v dávce 50 pg.

• 4· 4 ·· • ·

Adjuvans, která se používají v případě skupiny 2, 5 a 10 se připravily postupem popsaným v dokumentu EO 0 822 831 Bl (obsahy kterých je možné najít v publikacích uvedených v citacích). Skupina 11 obsahovala 3D-MPL v membráně lipozomu. 3D-MPL dioleoylfosfatydylový cholin a cholesterol se smíchal dohromady a mikrofluidizoval se do unilamelárních lipozomu (jak se popisuje v patentovém dokumentu EP 0 822 831 Bl s vypuštěním QS21).

Adjuvans užívané ve skupinách 4, 7 a 8 byly ve vodné suspenzi nebo v roztoku.

Postupy vakcinace

Skupiny myší B6F1 se vakcinovaly ve čtyřech případech (v objemech 50 μΐ) intramuskulárně s intervalem 14 dní. 14 dní po čtvrté vakcínační dávce se myši vakcinovaly podkožně s 2xl0⁶nádorových buněk TCl, které exprimují Her2Neu.

Nádorová buněčná linie TCl:

Primární plicní epiteliální buňky z myší C57BL.6 se znehybnily pomocí proteinu HPV16 E6 a E7 a pak se transformovaly s aktivovaným onkogenem ras, který produkuje tumorigenní buněčnou linii exprimující E6 a E7 (Link KY, Cancer Res. 1996, Janl, 5(1): 21-61). Exprese E7 se ověřila analýzou FACS fixovaných a permeabilizovaných buněk TCl za použití myších monoklonálních protilátek proti HPV 16E7 (Triton Corp. Alameda, CA). Nádorové buněčné linie Her2Neu-TCl se produkovaly transdukcí těchto buněk TCl retrovirovým! vektory, které kódují Her2Neu. Po období selekce za použití blastocydinu se rezistentní klony izolovaly a testovaly pomocí FACS za účelem zjištění exprese Her2Neu. Vybral se klon s nejsilnější expresí Her2Neu a zjistilo se, že • · ·« · · • · ♦ · • · · · · · • · ··»♦ imunizační dávka 2xl0⁶ buněk má podobnou kinetiku růstu jako buňky TC1 divokého typu v případě 100 % kontrolních zvířat.

Velikost jednotlivých exprimovala se jako průměr nádorů se měřila dvakrát skupiny.

do týdne a

Výsledky

Příklad 2: Imunizace myší antigenem P703P

Tento experiment se navrhl za účelem zkoumání rozsahu adjuvans s antigenem, který je fúzí antigenu prostázy (popisuje se v publikaci Ferguson, et al, (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119)) a N-terminální fragment 1 až 81 NS1 z viru influenzy (P703P-NS1).

Skupina antigen (25 adjuvans

» · · • ♦ • ··· • · « • ft 1 > · ·

	pg)
1	P703P-NS1	žádné (fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem (PBS))
2	P703P-NS1	CpG
3	P703P-NS1	lipozomy s QS21 v membráně + CpG
4	P703P-NS1	lipozomy s QS21 a 3D-MPL v membráně + CpG
5	P703P-NS1	emulze olej ve vodě obsahující tokol s QS21 a 3D-MPL + CpG
6	P703P-NS1	emulze olej ve vodě obsahujíc tokol + CpG

Emulze olej ve vodě obsahující tokol, které se používaly ve shora v textu popsaných skupinách zahrnují D,L,a-tokoferol (CAS č. 10191-41-0, název sloučeniny je (2RS, 4'RS, 8'RS)-2,

5, 7, 8-tetrametyl-2(4 ', 8', 12 '-trimetyltridecyl)-6-chromanol) ) , který je běžně dostupný od firmy ROCHE^<tm) . Tokol je přítomen v emulzi olej ve vodě v koncentraci 2,5 % objemu v kombinaci se skvalenem, který je přítomen v koncentraci 2,5 % objemu. Oba oleje se smíchaly a před mikrofluidizací se přidal polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween80^<tm)) (M110S mikrofluidizační zařízení, maximum 50 pasáží po dobu 2 minut při maximálním tlaku na vstupu 6 barů (tlak na výstupu je přibližně 850 barů), jak se popisuje v dokumentu WO 95/17 210) . Skupiny 5 a 6 jsou založeny na shora v textu popsané emulzi s tokolem s přidáním vodného roztoku QS21, 3D-MPL nebo CpG.

QS21 a 3D-MPL, jestliže jsou přítomny v libovolné z vakcinačních skupin popsaných shora v textu, jsou zahrnuty v množství 5 pg v jedné dávce. CpG (Oligo 4 (SEQ ID NO: 4): TCG

TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT) se přidaly v dávce 50 pg.

··♦♦ ·♦ ·· ·· ·· «

Adjuvans, která se používají v případě skupiny 3 a 4, se připravily postupem popsaným v dokumentu EO 0 822 831 Bl (obsahy kterých je možné najít v publikacích uvedených v citacích).

Postupy vakcinace

Skupiny myší B6F1 se vakcinovaly ve čtyřech případech (v objemu 50 μΐ) intramuskulárně s intervalem 14 dní.

Výsledky

Na obrázku č. 8 a 9 je zobrazena in vitro lymfoproliferace splenocytů po druhé vakcinaci a 14 dní po čtvrté vakcinaci, po in vitro inkubaci s imunogenem 3 gg/ml (NS1-P703P) nebo s P703P exprimovaném v pichia (15 pg/ml) nebo pomocí nespecifickým fúzním proteinem NSl-OspA.

Obrázek č. 10 a 11 zobrazuje humorální imunitní odezvu na imunogen (NS1-P703P) vyjádřenou jako Ig měřeným pomocí testu ELISA (obrázek č. 10) nebo distribucí izotypu IgG při těchto odezvách (obrázek č. 11).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Pomocný prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci imunostimulačního oligonukleotidu a tokolu.
2. Pomocný prostředek podle nároku 1, vyznačující setím, že tokol je ve formě emulze olej ve vodě.
3. Pomocný prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že emulze olej ve vodě dále obsahuje skvalen.
4. Pomocný prostředek podle libovolného z nároku 1 až 3, vyznačující setím, že uvedený imunostimulační oligonukleotid obsahuje sekvenci purin, purin, C, G, pyrimidin, pyrimidin, kde C a G nejsou metylovány.
5. Pomocný prostředek podle nároku 1 až 3, vyznačující se tím, že uvedený imunostimulační oligonukleotid se vybral ze skupiny obsahující TCC

ATG ACG TTC CTG ACG TT (SEQ ID NO:1); TCT CCC AGC GTG CGC CAT (SEQ ID NOC); ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG (SEQ ID N0:3); TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (SEQ ID NO:4); TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (SEQ ID N0:5).
6. Pomocný prostředek podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že imunostimulační oligonukleotid obsahuje alespoň dvě repetice CG, které nejsou metylovány a jsou odděleny alespoň třemi nukleotidy.

•9 9999

9 9 9

9999 99

9 9 9 9 •99 « » • · 999 9 9 • 9 9 · 9 9 9 ’ · · 9 9 9 9 •9 99 99 «

99 9 99 9
7. Pomocný prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že imunostimulační oligonukleotid obsahuje alespoň dvě repetice CG, které nejsou metylovány a jsou odděleny 6 nukleotidy.
8. Pomocný prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že tokol je popsán obecným vzorcem kde symbol R může být vodík nebo jeden nebo více shodných nebo různých substituentů vybraných ze skupiny zahrnující alkyl, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, hydroxyskupinu, sulfátovou a fosfátovou skupinu, symboly Rl a R3 jsou nezávisle na sobě vodík nebo alkyl, symbol R2 je vodík nebo alkyl a v každé jednotce se může lišit, přičemž čárkovaná čára ukazuje přítomnost nebo absenci další vazby uhlík-uhlík v jednotce a symbol n má hodnotu 1 až 10, přičemž alkylová skupina zobrazená symboly R, Rl, R2 a R3 se může vybrat z lineárního nebo větveného uhlíkatého řetězce, který obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, jako je metyl, etyl, butyl nebo isobutyl.
9. Pomocný prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že tokol je D,L,α-tokoferol.
10. Pomocný prostředek vyznačuj ící imunostimulant.

podle nároku 1 až 9, se tím, že dále obsahuje další ·· ···· ’ : ,·

99 «9 » 9 « » 9 9 9 9 » 9 9 <

» 9 9 «

99 99 •9 9999 > 9 9 ► 9 9 ► · 9 > 9 9 9

99 99
11. Pomocný prostředek podle nároku 10, vyznačuj íci se tím, další imunostimulant se vybral z LPS nebo jeho derivátů, 3D-MPL, saponin nebo QS21.
12. Vakcinační prostředek podle libovolného z nároků 1 až 11, vyznačující se tím obsahuje pomocný prostředek a antigen nebo antigenní prostředek.
13. Vakcinační prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že antigen je ECD-PD.
14. Způsob posunu . kvality imunitní odezvy proti antigenu, vyznačující se tím, že vzniká pomocí vakcinačního prostředku obsahujícího imunostimulační oligonukleotid, směrem k imunitní odezvě typu Thl, přičemž způsob obsahuje přípravu vakcinačního prostředku s imunostimulačním oligonukleotidem a emulzi olej ve vodě obsahující tokol.
15. Způsob posunu kvality imunitní odezvy podle nároku 14, vyznačující se tím, že kombinace imunostimulačního oligonukleotidu s emulzí olej ve vodě obsahující tokol vyvolává imunitní odezvu typu Thl tak, že se měří izotypy IgG specifické pro antigen vyvolané vakcinačním prostředkem po vakcinací myší, přičemž IgGl obsahuje méně než 50 % IgG specifického pro celkový antigen, jak se stanovilo střední hodnotou titrů měřených testem ELISA specifickým pro izotyp.
16. Způsob výroby vakcinačního prostředku, vyznačující se tím, že zahrnuje přípravu emulze olej ve vodě obsahující tokol, smíchání uvedené emulze obsahující tokol s imunostimulačním oligonukleotidem

44 4··· »4 <4 44 4444

4 4 4 4 4 4

4 4 444 4 4 4 • 44 »44 4 «

4 44 4 4 44 4

44 44 44 44 za vzniku adjuvans a přípravu uvedeného adjuvans s antigenem nebo s antigenním prostředkem.
17. Způsob léčby jedince náchylného nebo trpícího onemocněním, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci vakcinačního prostředku obsahující kombinaci imunostimulačního oligonukleotidu a tokolu.
18. Vakcinační prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že je vhodný pro použití v medicíně.