CZ2002929A3 - Amfifilní proléčiva - Google Patents

Description

Amfifilní proléčiva

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká přípravy amfifilních proléčiv, která obsahují terapeuticky účinnou látku konjugovanou s PEG-oligomerem nebo polymerem. Rovněž se týká metod použití výše uvedených proléčiv jako orálních léčiv a/nebo léčiv prostupujících hematoencefalickou bariérou.

V následujícím odstavci jsou diskutovány literární údaje relevantní k předkládanému vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Nádory centrálního nervového systému

Podle odhadů americké onkologické společnosti bude ve Spojených Státech v roce 1999 diagnostikováno 16 800 primárních tumorů centrálního nervového systému (CNS) u lidí. Z této skupiny 13 100 nakonec onemocnění podlehne (Americká onkologická společnost, 1999). Tumory centrálního nervového systému patří mezi nejhůře léčitelné. Ačkoliv tyto tumory metastazují jenom vzácně, jejich anatomická lokalizace je příčinou vysoké incidence morbidity a mortality, které jsou výsledkem útlaku okolních tkání, jako i destrukce tkání způsobené invazí tumoru. Navíc buňky CNS tumorů často migrují z původního tumoru do jiných míst mozku. Tyto migrující buňky nakonec znovu vytvoří další tumor. Mnohočetné nádory CNS také vznikají metastazováním tumorů jiného než CNS původu.

Standartní léčba tumorů CNS zahrnuje chirurgické přístupy a radiační terapii. Nicméně, co se týče chirurgické léčby, kompletní chirurgická resekce často není možná. Normální mozková tkáň kolem tumoru je často životně důležitá pro přežití nebo kvalitu života pacienta. Výsledkem je, že přežití pacientů léčených chirurgicky je nízké. Problémy spojené s radiační terapií jsou známé.

Systémová chemoterapie by mohla být výhodnou možností léčby CNS tumorů díky její schopnosti ovlivnit mikroskopické ložiska nádorových buněk, rovněž těch, které unikly radiační terapii. Nicméně nemožnost prostupu těchto látek hemato-encefalickou bariérou významně limituje použití chemoterapie v léčbě nádorů CNS. Mnohá léčiva aktivní v léčbě • · · · φ φ • < · · tumorů neprostupují hemato-encefalickou bariérou a nevstupují* clo mózlcového párencKymu. Dále, ačkoliv velký počet osvědčených protinádorových látek, zahrnujících etoposid, se akumulují v mozkové tkáni (Kiya, Uozumi et al. , 1992), koncentrace těchto látek se významně snižuje se vzrůstající vzdáleností od nádorového ložiska (Donelli, Zucchetti, et al., 1992). Pro dosažení efektivní léčby celého mozku a exponování mikrodeposit nádorových buněk léčivu, je potřeba získat prostředek pro dopravování terapeutických koncentrací protinádorových látek do celého objemu mozku.

Bariéry dopravování látek, do mozku

Mozek je vybaven bariérovým systémem, který je potřeba překročit, aby se terapeuticky účinná látka dostala do CNS. Tato mozková bariéra má dvě hlavní součásti: Plexus chorioideus a hemato-encefalickou bariéru. Plexus chorioideus odděluje cerebrospinální tekutinu od krevního proudu, a hemato-enceťalická bariéra odděluje mozkovou intersticiální tekutinu od krve.

Hemato-encefalická bariéra má asi 1 000 - krát větší povrch než je povrch chorioidálního plexu a představuje prvotní překážku pro dopravení terapeuticky účinných látek do CNS. Hemato-encefalická bariéra funguje jako selektivní přepážka, která reguluje výměnu substrátů mezi CNS a periferní cirkulací. Primární strukturou hemato-encefalické bariéry je mozková kapilární endoteliální stěna. Těsná spojení mezi endoteliálními buňkami mozkových kapilár zabraňují cirkulujícím látkám vstup do mozkové intersticiální tekutiny paracelulámí cestou. Navíc, recentní práce předpokládají existenci oddělené fyziologické bariéry na úrovni bazální membrány (Kroll et al., 1998). Dalšími jedinečnými charakteristikami hemato-encefalické bariéry je, že neobsahuje mezibuněčné fenestrace apinocytámí měchýřky a její celkový náboj na luminálním povrchu endoteliálních buněk je negativní (Kroll et al., 1998).

Způsob, jakým látky prostupují hemato-encefalickou bariérou je obecně rozdělován na transport pasivní a aktivní. Lipofilní molekuly ochotně prostupují hemato-encefalickou bariérou pasivně nebo difúzí přes endoteliální plazmatickou membránu, zatím co hydrofilní molekuly typicky vyžadují aktivní transportní systém. Difúze mnohých terapeutických sloučenin přes hemato-encefalickou bariéru je rovněž limitována jejich velikostí.

Velká část existujících léčivých látek je neschopná překonat tyto strukturální a metabolické bariéry, a není schopna prostoupit hemato-encefalickou bariérou v dostatečném množství pro to, aby bylo dosaženo terapeutického účinku. Z toho plyne, že je potřeba ·· ·· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · · · · ·

3· · ····· · · · • ···· · · · · · · · · · · · · ···· ···· ·· ··· ·· ···· připravit farmakologické prostředky, které umožní penetraci protinádorových látek přes hemato-encefalickou bariéru v dostatečném množství a dostatečných poměrech k tomu, aby léčba byla úspěšná. Dále, mnohé látky, které jsou teoreticky schopné překročit hematoencefalickou bariéru v důsledku jejich lipofilicity, nejsou vhodné pro parentální nebo orální podávání bez přítomnosti potenciálně alergogenních složek. Je potřeba proléčiv, které zvýší rozpustnost léčiv, za vzniku amfifilních léčiv, které jsou použitelné orálně, rozpustné v krvi, a které zlepší schopnost léčiv vstupovat do CNS. Na druhou stranu je rovněž potřeba připravit proléčivo, které zlepší lipofilicitu hydrofilních léčiv za vzniku amfifilních léčiv. Navíc, je záhodno, aby tato amfifilní léčiva byla hydrolyzována in vivo za uvolnění aktivní rodičovské látky.

Strategie pro dopravování terapeutických látek do CNS

Bylo učiněno mnoho pokusů s dopravováním terapeuticky účinných látek do CNS. Nicméně úspěch byl střídavý. Tyto pokusy je možno obecně rozdělit na dvě kategorie: invazivní a farmakologické.

Invazivní strategie zahrnuje například mechanické procedury, jako je implantace intraventrikulámího katetru, následovaného farmaceutickou inťuzí do prostoru komory. Kromě obecně přijímané invazivitě mechanického přístupu, hlavním problémem mechanických přístupů je nedostatečná distribuce léčiva. Například, injekce léčiva do CNS se obecně vyznačuje nedostatečnou distribucí pod povrchem mozku. Tato nedostatečná distribuce je částečně způsobená rychlým exportem léčiv do periferní cirkulace.

Jinou invazivní stratégu pro dopravování terapeutických látek do CNS je intrakarotidová infuze vysoce koncentrovaných osmoticky aktivních látek, jakými jsou manitol nebo arabinóza. Jejich vysoká lokální koncentrace způsobí zmrštění endoteliálních buněk mozkových kapilár, následkem čehož dojde k přechodnému otevření těsných spojení mezi endoteliálními buňkami a k přestupu molekul přes hemato-encefalickou bariéru. Tyto procedury mají značné toxické efekty, zahrnující záněty, encefalitidu atd. Dále, tyto procedury nejsou selektivní: otevření těsných spojení mezi endoteliálními buňkami hematoencefalické bariéry umožní přestup mnohých nevhodných látek společně s terapeuticky blahodárnými. Recentní přehled týkající se osmotického otevření mezibuněčných kontaktů a jiných invazivních metod pro prostup hemato-encefalickou bariérou (viz Kroll, Neurosurgery, 1998, květen, 42(5)).

Je tudíž potřeba připravit prostředek selektivně umožňující, aby terapeuticky účinné látky, jako například peptidy, byby schopny prostoupit hemato-encefalickou bariéru, a to kontrolovaným způsobem, který umožní nahromadění vhodného množství terapeutika v mozku a umožní dosáhnout kýženého terapeutického efektu.

Autoři předkládaného vynálezu překvapivě zjistili, že konjugace malých amfífilních polymerů s léčivy, jakým je etoposid, rozřeší mnohé z výše uvedených problémů. Tento přístup je založen na racionálně navržených oligomerech, za použití hydrofobní složky společně s hydrofilní, a za vzniku vyrovnaných fyzikálně-chemických vlastností rodičovské molekuly. Změnou molekulové hmotnosti hydrofobní a hydrofilní složky oligomerů a/nebo molové hmotnosti amfifilní složky oligomerů, je možné systematicky nastavovat celkový fyzikálně-chemický profil konjugované molekuly za vzniku kýženého stupně amfifility a současných změn v rozpustnosti a farmakokinetice.

Etoposidová proléčiva předkládaného vynálezu jsou schopna efektivně prostupovat hemato-encefalickou bariérou. Na základě empirických údajů zde uvedených a na základě našich předchozích výsledků popsaných v US Patent Application 09/134 803 s názvem ,31ood-Brain Barrier Therapeutics“ předpokládáme, že etoposidová proléčiva mají rovněž zlepšenou orální biodostupnost. Tyto dva prvky, společně se schopností kontrolovat stupeň hydrolýzy proléčiva ze sloučeniny léčiva, umožňují použití dlouhodobých dávkovačích režimů při léčbě nádorů CNS a jiných malignit.

Léčba tumorů CNS

Autoři předkládaného vynálezu překvapivě zjistili, že kovalentní modifikace hydrofobního léčiva oligomerem předkládaného vynálezu zabrání hydrofobicitě rodičovské sloučeniny a rozhodujícím způsobem zlepší její schopnost prostupovat hemato-encefalickou bariérou. Dále autoři zjistili, že konjugace lipofilní rodičovské látky, jako například etoposid, s oligomerem předkládaného vynálezu, použitím labilní chemické vazby, která je hydrolyzována in vivo, za uvolnění plně bioaktivní rodičovské látky, zlepšuje rozpustnost léčiva v krvi a dovoluje léčivé látce prostoupit do CNS.

Proléčivo předkládaného vynálezu se vyznačuje těmito užitečnými vlastnostmi:

• Inaktivní forma proléčiva pomáhá snižovat toxicitu spojenou s podáváním léčiva • Terapeuticky signifikantní množství volné léčivé látky se dostává do CNS • Je předpoklad, že se proléčivo dostane do CNS při orálním podávání • Proléčivo je rychleji utvářeno v hydrofilním prostředí • Poločas odstranění etoposidu je prodloužen

9 9 4 4 4 4 9 9 4 ·

4 49449 ·· · • · · · · · · · ···· ···· ·· ··· ·· 4444 • Konjugát má zlepšenou schopnost procházet střevní stěnou do krevního řečiště

Etoposid jako léčivo pro léčbu nádorů CNS

Etoposid je člen rodiny sloučenin označovaných jako epipodofylotoxiny a je aktivní v léčbě širokého spektra tumorů in vitro, jako jsou například gliomy a astrocytomy (Giaccone, Gazdar et al., 1992; Kasahar, Fujiwara et al., 1992; Brown, McPherson et al., 1995; Chřestá, Masters et al., 1996; Beuchesne, Betrand et al., 1998). Etoposid má molekulovou hmotnost 589 daltonů, je lipofilní a je téměř nerozpustný ve vodě (Hande, 1998). Výsledkem je, že typicky je ve směsi benzylalkoholu, polysorbátu 80/Tween 80, polyethylenglykolu a ethanolu. (VePesid ® , Bristol Myers Squibb). Pro podávání je VePesid rozpuštěn ve fyziologicky kompatibilních roztocích na koncentraci 0,2 mg/ml až 0,4 mg/mL Dávky v rozmezí 100 mg/m² až 600 mg/m², podávané intravenózně, vyžadují objemy od 0,41 do 5,11.

Ačkoliv je etoposid hydrofobní, neproniká ochotně hemato-encefalickou bariérou. Výsledkem je, že koncentrace etoposidu v mozkové tkáni po systémovém podání zůstává nízká. (Hande, Wedlund et al., 1984; Donelli, Zucchetti et al, 1992; Kiya, Uozumi et al., 1992). Navíc, zatímco etoposid je schopen dostat se do mozkového nádoru, jeho koncentrace v tumoru a okolní tkáni zůstává subterapeutická. (Donelli, Zucchetti et al., 1992). V důsledku invazivního růstu gliomů aastrocytomů a nesnadnosti jejich chirurgického odstranění, existuje velká potřeba prostředku pro dopravování léčiv, jako například etoposidu, to mozkových oblastí, ve kterých se ještě můžou vyskytovat zbytkové maligní buňky.

Jedním ze způsobů, jak překonat hydrofobicitu etoposidu, je chemická modifikace rodičovské sloučeniny, za zvýšení jeho hydrofilicity. Nicméně se často stává, že takováto modifikace zničí biologickou aktivitu látky. Vzhledem k tomu existuje existuje velká potřeba amfifilního etoposidového proléčiva, které by se vyznačovalo zvýšenou prostupností přes hemato-encefalickou bariéru, za uvolnění aktivního etoposidu v CNS. Navíc, existuje velká potřeba proléčiva, které usnadňuje dopravování etoposidu do CNS jinými způsoby podávání, zahrnující orální podávání. Ve studiích biodistribuce léčiva u hlodavců bylo zjištěno, že se intravenózní etoposid vyskytuje v signifikantních koncentracích ve většině tkání kromě CNS, hlavně v játrech a ledvinách. Nicméně, jeho akumulace v CNS je velmi nízká. (Hande, Wedllund et al., 1984; Donelli, Zucchetti et al., 1992). Hydrofobicita etoposidu způsobuje, že je vhodným substrátem P-glykoproteinové pumpy nebo jiného lékového transportéru, který se vyskytuje v endotelových buňkách krevních cév CNS (Schinkel, Smit et al., 1994; Schinkel, Wagenaar et al., 1996). Experimenty naznačují, že tyto transportéry fungují jako prvky hemato-encefalické bariéry, odpovědné za to, že dochází k aktivnímu bránění vstupu « · • ·

6· · ·«··· »· · • ···· ···· 4 • · ·· · · · · ···· ···« ·· ··· ·· ···· etoposidu do CNS. (Abe, Hasegawa et al., 1994). Tyto transportéry léčiv se jeví být rovněž částečně zodpovědné za odstraňování etoposidu a jiných léčiv z krve pomocí přímé extruze přes střevní stěnu do jeho lumen. (Leu aHuang, 1995; Mayer, Wagenaar et al., 1997; Sparreboom, van Asperen et al., 1997). Z těchto důvodů existuje velká potřeba etoposidového proléčiva, které je modifikováno tak, že dovoluje dopravování terapeutických koncentrací etoposidu do CNS tím, že naruší odstraňování proléčiva P-glykoproteinovou pumpou a podobnými lékovými transportéry epitelových buněk CNS.

Značné úsilí bylo věnováno vývoji dávkovačích schémat pro etoposid (Greco, Johnson et al., 1991; Hande, 1998). Toto úsilí je založeno na klinických studiích demonstrujících vynikající odpověď po 3 až 5 dnech podávání ve srovnání s jednodenním podáváním. (Cavalli, Sonntag et al., 1978). Z těchto důvodů existuje velká potřeba takové verze proléčiva, které prodlouží metabolický poločas etoposidu.

Bylo zjištěno, že etoposid je efektivní in vitro v koncentracích od 0,1 g/ml (Kasahara, Fujiwara et al., 1992). Nicméně, ostranění etoposidu odstraní rovněž jeho inhibiční vliv na topoisomerázu II, což dovolí buňkám, aby se opět vzpamatovaly. (Joel, 1996). Navíc, efekt etoposidu na topoisomerázu II je toxický především v G2 fáze buněčného cyklu. Výsledkem je, že relativně krátká léčba etoposidem zabije buňky vG2, ale nepostihne buňky v jiných fázích buněčného cyklu. Z těchto důvodů existuje velká potřeba etoposidového proléčiva, které umožní chronické podávání, čímž se prodlouží doba působení etoposidu na dělící se buněčnou populaci, vedoucí k buněčné smrti mnohem větší populace buněk.

V důsledku relativně krátkého poločasu etoposidu, jsou nezbytné denní (nebo častější) intravenózní infiize, aby se udržela plasmatická koncentrace etoposidu v terapeutickém rozmezí. Z těchto důvodů existuje velká potřeba etoposidového proléčiva, které je možné podávat v orálních dávkovačích schématech, které jsou obecně výhodné a levné. Jak bylo zmíněno výše, studie s orálně podávaným etoposidem ukázaly, že jeho biodostupnost je chaotická. Lékař tudíž není schopen zaručit, že byla podána adekvátní dávka léčiva. Vzhledem k uvedenému, je potřeba připravit etoposidové proléčivo, které je biodostupné konsistentnějším způsobem.

Z těchto důvodů existuje velká potřeba prostředku, který by byl schopen zaručit konsistentní biodostupnost léčiv, jakým je například etoposid, bez potřeby mnohých a dlouhých intravenózních infuzí. Dále existuje velká potřeba proléčiv, které obsahují protinádorová léčiva, jakým je například etoposid, s dostatečně dlouhým plasmatickým poločasem, zajišťujícím in vivo koncentrace v terapeutickém rozsahu. Konečně, je potřeba proléčiva, které umožní efektivní orální podávání léčiv, jakým je například etoposid, a které

9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 99

9*9« 9 9 · 9999 y 9 999999 99 ·

9 ·9 9999

999 9 9999 <9 999 99 9999 umožní efektivní orální podávání proléěiva tak, že toto překročí hemato-encefalickou bariéru a vstoupí do CNS.

Toxicita a problémy s přípravou etoposidu

Vědci modifikovali fyzikálně-chemické a farmakologické vlastnosti etoposidu tím, že kovalentně připojili různé chemické skupiny. Etoposidfosfát (Etopophos ® , Bristol Mayers Squibb) obsahuje fosfátovou skupinu na 4'-pozici etoposidu, výsledkem čeho je proléěivo se zlepšenou rozpustností ve vodě. Fosfátová skupina in vivo rychle hydrolyzuje a sloučenina má stejný farmakologický profil jako etoposid. Zlepšená rozpustnost ve vodě tohoto etoposidového analoga zlepšuje možnost intravenózního podání; nicméně, orální biodostupnost je zlepšena jenom mírně. Variabilita a biodostupnost zůstává vysoká, pravděpodobně proto, že etoposidfosfát je rychle přeměňován na etoposid ve střevě.

Někteří výzkumníci prosazují liposomální nebo micelámí formy cytotoxických léčiv, jakými jsou paclitaxel, adriamycin, a doxorubicin. Jedním z důvodů této strategie je zaručit neustálé uvolňování etoposidu, čímž se docílí prodloužení terapeutické koncentrace etoposidu v plasmě. Druhým důvodem je sekvestrovat tato léčiva do výše uvedených transportních partikulí, a tím zabránit jejich vniku do necitových tkání. Nicméně, díky značné velikosti těchto částic, je nepravděpodobné, že by tento přístup mohl zlepšit biodostupnost nebo prostupnost přes hemato-encefalickou bariéru. Z těchto důvodů existuje velká potřeba etoposidového proléěiva, které umožní zlepšenou biodostupnost jako i prostupnost hematoencefalickou bariérou.

Třetí přístup představuje konjugace molekuly léčiva shydrofilním polymerem pro zlepšení jeho rozpustnosti. Polyethylenglykol (PEG) i polyglutamát se v této strategii používají jako hydrofilní polymery. Zdá se, že oba polymery mají schopnost zvýšit rozpustnost etopostidu a tudíž zlepšit jeho použitelnost. Nicméně, konjugované polymery jsou relativně velké, což má za následek etoposidové proléěivo se změněnou farmakokinetikou a malým obsahem léčiva. Z těchto důvodů existuje velká potřeba etoposidového proléěiva s menším polymerem, čímž se dosáhne zlepšených rozpustnostních charakteristik jako i jiných výhodných vlastností popsaných výše.

Podstata vynálezu • fc ·· ·· ··♦· ·· ·· ···· fc ♦ fc · ♦ · · g · · · · ·♦· · · · • fc ·· · · · · ···· ···· ·· ··· ·* fcfcfcfc

Předkládaný vynález obecně představuje amfifilní proléčivo, skládající se z léčiva spojeného hydrolyzovatelnou (nými) vazbou (vazbami) s jedním nebo více přímými nebo větvenými PEG-oligomery, nesoucími 1 až 25 polyethylenglykolových jednotek. PEG-oligomer s výhodou obsahuje sůl tvořící skupinu, která je s výhodou amoniový radikál a karboxylát. PEG-oligomery jsou s výhodou připojeny k terapeutické sloučenině vazbou, jako například esterová nebo uhličitanová, které jsou hydrolyzovány in vivo.

Z jiného hlediska předkládaného vynálezu, ta část amfifilního proléčiva, která je tvořena léčivem, je etoposid nebo jeho analog, kteiý si zachovává některé nebo všechny terapeutické aktivity etoposidu.

Nárokované amfifilní proléčivo může být derivatizováno tolika PEG-oligomery, kolik je na molekule léčiva míst pro připojení PEG-oligomeru. Tudíž, například, etoposid obsahuje 3 místa a může být tudíž derivatizován 1, 2 nebo 3 PEG-oligomery.

Amfifilní proléčiva je možné podávat orálně. Tento způsob zajistí terapeuticky efektivní dávku léku v krevním řečišti. Navíc, orálně podávané deriváty jsou schopny zajistit terapeuticky efektivní dávku léčiva v CNS.

Předkládaný vynález rovněž uvádí farmaceutické sloučeniny obsahující amfifilní proléčiva vynálezu ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem Tyto farmaceutické sloučeniny jsou navrženy tak, aby byly vhodné pro orální podávání, a byly dostupné v jakékoliv známé lékové formě, jako například tablety, kapsule, pilulky, tekuté roztoky, suspenze nebo elixíry, prášky, čípky, mikropartikule a osmotické transportní systémy.

Z jiného hlediska, předkládaný vynález uvádí amfifilní proléčivo, které obsahuje léčivo navázané pomocí hydrolyzovatelné vazby (vazeb) na jeden nebo více PEG-oligomer, vybraný ze skupiny zahrnující jakýkoliv oligomer obecného vzorce 1 až 11.

aždý zvýše uvedených oligomerů obecného vzorce 1 až 11 rovněž svýhodou obsahuje sůl tvořící skupinu. S výhodou použité sůl tvořící skupiny jsou amino nebo karboxylát. S výhodou použitá léčiva jsou etoposid a etoposidový analog, která si zachovávají některé nebo všechny terapeutické aktivity etoposidu, nebo které mají ještě výraznější aktivitu než etoposid. Léčivo je derivatizováno velkým množstvím PEG-oligomerů, kterých počet nepřesahuje počet interakčních míst pro tyto PEG-oligomery. Takže, v případě, že amfifilním proléěivem je etoposid, může být derivatizován 1, 2 nebo 3 PEG-oligomery obecného vzorce 1 až 11.

Předkládaný vynález rovněž uvádí farmaceutické sloučeniny zahrnující amfifilní proléčivo obecného vzorce 1 až 11 a farmakologicky přijatelný nosič. Farmaceutická sloučenina je ve formě vhodné pro orální podávání, a může mít jakoukoliv lékovou formu,

9 • «

0 · 9 9 9 9 9 9 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9

0 00 0000 0000 0000 0· 0·· ·* 0000 jako například tablety, kapsule, uzavřené kapsule, gelové kapsule, pilulky, tekutý roztok, suspenze nebo elixír, prášky, čípky, mikropartikule a osmotický transportní systém.

Předkládaný vynález rovněž uvádí metodu léčby savce, který trpí onemocněním reagujícím na etoposid a zahrnuje podávám terapeuticky efektivního množství léčiva, derivatizovaného jakoukoliv sloučeninou obecného vzorce 1 až 11.

Jednou z metod léčby je podávání amfifilního proléčiva orální cestou pro zajištění terapeuticky účinné dávky léčiva v krvi. Druhým hlediskem je podávání amfifilního proléčiva parenterální cestou, které zajistí přísun terapeuticky efektivní dávky léčiva do mozku. Dalším hlediskem je podávání amfifilního proléčiva orální cestou pro zajištění terapeuticky účinné dávky léčiva do mozku. Dále, amfifilní proléčivo je možné podávat společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Z dalšího hlediska, nemoci, léčené pomocí terapeutických metod předkládaného vynálezu zahrnují karcinomy, nádory a malignity, jako například myeloidní leukemie, karcinom žlučníku, karcinom prsu, maligní nádory gastrointestinálního traktu, Ewingův tumor, Hodgkinův lymfom, Kaposiho sarkom, leukemie, karcinom plic, lymfomy, nonHodgkinské lymfomy, karcinom ovaria, malobuněčný plicní karcinom a testikulámí karcinom.

Použité definice

Jak je používáno zde, termín „PEG“ je použit pro nevětvené nebo větvené polymery polyethylenglykolu, které jsou modifikovány tak, že obsahují skupiny, které neruší amfifilní vlastnosti takovýchto polymerů, například a bez omezení, alkyl, aryl, aminoalkyl a aminoaryl; viz rovněž sloučeniny obecného vzorce 1 až 11, uvedené v odstavci 4, „ Detailní popis vynálezu“. Název „PEG podjednotka“ nebo „PEG jednotka“ představuje jednu polyethylenglykolovou jednotku, tj. -(CH2CH2O)-. Název „PEG oligomer/polymer“, jak je používán zde, představuje PEG oligomery a/nebo PEG polymery.

Jak je používáno zde, názvy, jako například „nehvdrolyzovatelný“, jsou použity pro vazby, které není možné hydrolyzovat za normálních fyziologických podmínek, jako i vazby, které nepodléhají rychlé hydrolýze za normálních fyziologických podmínek, jako například karbamátové a amidové vazby. Termín „hydrolyzovatelný“ je používán pro vazby, které jsou za běžných fyziologických podmínek hydrolyzovány, jako například estery a uhličitanové vazby.

„Terapeuticky efektivní“ množství nebo dávka je takové množství nebo dávka, které zabraňuje, oddaluje nebo snižuje závažnost onemocnění na začátku, nebo jiné nepřízninvé

9 99 9* 999*

9999 999 999 9

W 9 9 99999 99 9

9999 9999 9

9 99 9999

9999 9999 99 999 99 9999 zdravotní okolnosti; nebo množství nutné pro zastavení nebo zmenšení závažnosti probíhajícího onemocnění, nebo jiných nepříznivých zdravotních okolností; a rovněž zahrnuje množství nutné k podpoře normálních fyziologických funkcí.

Jak je používáno zde, „farmaceuticky přijatelná“ složka (jako například sůl, nosič, excipient nebo rozpouštědlo) formy léku podle předkládaného vynálezu, je složka, která 1) je slučitelná s jinými složkami formy léčiva, ve kterém je kombinovaná sproléčivem předkládaného vynálezu, aniž by byla snížena biologická aktivita proléčiva

2) je vhodná pro použití na zvířeti (i člověku) bez nežádoucích vedlejších účinků (jako například toxicita, podráždění a alergické reakce). Vedlejší účinky jsou „nežádoucí“, když jejich riziko převáží blahodárné účinky způsobené farmaceutickou sloučeninou. Příklady farmaceuticky přijatelných složek zahrnují, bez omezení, jakýkoliv standartní farmaceutický nosič, jako například fosfátový pufr (PBS), vodu, emulze jako například emulze oleje ve vodě, mikroemulze a různé typy zvlhěujících látek.

Stručný popis obrázků

Obr. 1. Struktura etoposidu znázorňující reaktivní hydroxylové skupiny, které jsou použitelné jako místa pro připojení oligomerů předkládaného vynálezu.

Obr. 2. Obecné schéma funkce sloučenin předkládaného vynálezu. PEG-oligomer/polymer je navázán na hydroxylové skupiny etoposidu pomocí nestabilní esterové vazby. V krvi je hydrolyzovatelná vazba rozštěpena, čímž dochází k uvolnění aktivní rodičovské sloučeniny.

Obr. 3. Štepení konjugátů ve vodním prostředí. Vzorky purifiko váného etoposidového konjugátu ve fosfátovém pufru se vyznačují zvýšenou hydrolýzou se zvyšujícím se pH. Při pH 5,9 je v průběhu 28 hodin hydrolyzováno přibližně 10 % konjugátu, zatímco při pH 7,4 je za stejnou časovou jednotku hydrolyzováno přibližně 40 % konjugátu. Při pH 8,0 je hydrolýza téměř kompletní za 20 hodin. Po dobu této přeměny nebyly pozorovány žádné významné vedlejší produkty.

Obr. 4. Graf znázorňující jev, kdy v případě, že etoposidový konjugát byl inkubován v čerstvé krysí plasmě při teplotě 37 °C, hydrolýza konjugováného etoposidu a objevování se volného etoposidu se vyznačovaly reciprocitou. Toto naznačuje, že hydrolýza PEGoligomerového/polymerového etoposidového konjugátu je kompletní a uvolňuje se volný, aktivní etoposid.

4444

4 4

4 4 4 4 • 4 4

4 4

4 4 4 4

4« «· · 4 4

4

4 4

44

4 4 4

4 ·

4 4

4 4

4· 4444

Obr. 5. Graf znázorňující in vivo profil krys, kterým byl podáván etoposidový konjugát versus krysy, kterým byl podáván etoposid. Konjugáty etoposidu o koncentraci 9 um/kg byly podávány intravenózně kmenu krys Sprague Dawley. Měření koncentrace volného etoposidu v plasmě v různých časových bodech ukázalo, že maximální plasmatická koncentrace etoposidu se zvýšila o 60 % a poločas rozpadu léčiva se prodloužil o přibližně 50 % u krys, kterým byl podáván konjugát etoposidu (křivka I) ve srovnání s krysami, kterým byl podáván etoposid (křivka II).

Obr. 6. Když byla měřena koncentrace etoposidu v mozkové tkáni u krys, bylo zjištěno, že injekce konjugátu etoposidu vedla k trojnásobnému vzrůstu volného etoposidu v mozkovém parenchymu, což představuje zvýšenou prostupnost hemato-encefalické bariéry pro konjugované peptidové hormony.

Detailní popis vynálezu

Pro jednoduchost je následující detailní popis vynálezu rozdělen do oddílů. Názvy jednotlivých oddílů neomezují oblast zájmu předkládaného vynálezu.

Proléčiva předkládaného vynálezu

Předkládaný vynález představuje proléěivo složené z léčiva a PEGoligomeru/polymeru. Proléčiva předkládaného vynálezu obecně obsahují složku léčiva a složku PEG-oligomeru/polymeru. Proléčiva jsou užitečná pro vylepšení lékové formy léčiv, pro dosažení možnosti orálního podávání a pro dopravování léčiv přes hemato-encefalickou bariéru. Tyto výhodné vlastnosti jsou ještě umocněny amfifilicitou molekuly. Tudíž, v případě, že je molekula léčiva hydrofilní, PEG-oligomer/polymer zvýší lipofilicitu a tím zlepší amfifilicitu proléčiva. Naopak, tam, kde je léčivo lipofilní, PEG-oligomer/polymer zvyšuje hydrofilicitu léčiva, čímž vzniká amfifilnější proléěivo. PEG-oligomer/polymer je připojen na léčivo vazbou, která se hydrolyzuje za normálních, fyziologických podmínek za uvolnění aktivní rodičovské sloučeniny.

•to ···· • ·· • to · · · ·· ·

Lékové složky proléčiv to· ·« • ·· · • · • ·· • to ♦ to ··* to· ·· • ·· to • to · ··· ··· ·· ····

Proléčivo předkládaného vynálezu zahrnuje složku léčiva. Vhodnými léčivy jsou terapeutické sloučeniny svolnými hydroxy, thio, fosfátovou nebo amino skupinami, které slouží jako místa pro připojení oligomerů. S výhodou použitými léčivy jsou epipodophyllotoxiny a jejich analoga, jako například etoposid, teniposid a etoposidfosfát. Strukturní vzorec etoposidu je znázorněn na obr. 1.

V jedné modifikaci předkládaného vynálezu je léčivou složkou analog etoposidu. Je znám velký počet analog etoposidu, která jsou efektivní více nebo méně nežli etoposid. Předkládaný vynález uvažuje použití jakéhokoliv etoposidového analoga, které nemá zcela nulovou aktivitu.

Jiná léčiva vhodná pro použití vproléčivu zahrnují paclitaxel a docetaxel. Mnoho dalších je uvedeno v U.S. Patent 5 795 909, který je zde uveden v citované literatuře.

PEG-oligomery/polymery

Amfifilní oligomery/polymery proléčiv předkládaného vynálezu jsou buď nevětvené nebo větvené. S výhodou použité oligomery/polymery zahrnují PEG polymery, které jsou složeny z 2 až 25 PEG jednotek, ještě lépe z 2 do 20 PEG jednotek, nejlépe od 2 do 15 PEG jednotek. V ideálním případě má PEG polymer 2 až 10 PEG jednotek. PEG polymer má molekulovou hmotnost ne větší než 1 000.

S výhodou má PEG polymer obecný vzorec I

-(CHjCHjOJr-CHj © kde X— 2 až 25

Mnohem výhodnější je, když X v obecném vzorci I je od 2 do 25, ještě výhodněji od 2 do 20, ještě výhodněji od 2 do 15, nejlépe od 2 do 10. V ideálním případě je X= 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 nebo 10.

S výhodou použité PEG oligomery jsou vybrány ze skupiny skládající se ze sloučenin obecného vzorce II

« «to • t ··· • · • · to « « ·« « ·· · «· « • •to « · · • · · · · ·

O R n i —C—(CH₂)—N— CHjCH^OCjH^OCHj <«) kde n je od 1 do 7, m je od 2 do 25 a R je nižší alkyl, s výhodou ze skupiny vodík, methyl, ethyl, propyl, isopropyl a t-butyl;

obecného vzorce III

II

II H

C-(CH2)r“C—N— (ΠΙ) kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25 a R je nižší alkyl, s výhodou ze skupiny vodík, methyl, ethyl, propyl, isopropyl a t-butyl;

obecného vzorce IV

O

II

-c(CH^r

O R

II H I

-C—N-~CH₂CH₂(OC₂H₄)_r·-N-CHiCHjCOCjH^OCHa ÍIVÍ kde n je od 1 do 6, m a r jsou oba na sobě nezávisle od 2 do 25 a R je nižší alkyl, s výhodou ze skupiny vodík, methyl, ethyl, propyl, isopropyl a t-butyl;

obecného vzorce V

O o

II II h

C—(CHj)j—C—N(V) kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25 a R je nižší alkyl, s výhodou ze skupiny vodík, methyl, ethyl, propyl, isopropyl a t-butyl;

• 4 4 #4 · ♦

• · 4 4

44

4 4 t * 4 ·

4 4 4 4 • 4 4 4

4 444 44 4444 obecného vzorce VI

OO R

II II η I —C—c—N—(CHj)—W kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25, X‘ je negativní iont, s výhodou chloro-, bromo-, iodo-, fosfát, acetát, uhličitan, sulfát, tosylát a mesylát a R je nižší alkyl, s výhodou ze skupiny vodík, methyl, ethyl, propyl, isopropyl a t-butyl;

obecného vzorce VII

O o

II II h 'C-CCHa)—C—N· (CHa)—N-CH₂CH₂(OC₂H4WíHR^x (VII) kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25 a R¹ a R² jsou nezávisle na sobě nižší alkyl, s výhodou ze skupiny vodík, methyl, ethyl, propyl, isopropyl a t-butyl;

obecného vzorce VIII

O Q O

Π n h (i _Λητη

-C-CCH^s—C—N—-CHíCH/OCj^O^—C—ΝΗ(ΟΗ2)ρΝ(αΕί₃)₂ (VIH) kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, mje od 2 do 25;

obecného vzorce IX ·· 44 444 4 44 ··

4 4 1 · 4 · 4 4 4 ·

4 44444 44 4 • 44·· 4··· ·

4 4 4 4444

444· 9999 4* 444 44 4444

(CH^OC^CXCH^Ο

II ο

οχ* (IX) kde nap jsou oba na sobě nezávisle od 1 do 6, m je od 2 do 25 a X⁺ je kladně nabitý iont, s výhodou vodík, sodík, kalium, vápník, lithium a amoniové sole;

obecného vzorce X

R¹

I (CHJ-N-CH₂CH₂(OC₂H₄)„,OCH₃

R² (X) kde n je od 1 do 5, m je od 2 do 25 a R¹ a R² jsou nezávisle na sobě nižší alkyl, s výhodou vodík, methyl, ethyl, propyl, isopropyl a t-butyl; a obecného vzorce XI

kde n je od 1 do 6, m je od 2 do 25, X' je negativní iont, s výhodou chloro, bromo, iodo, fosfát, acetát, uhličitan, sulfát, tosylát a mesylát.

Ve všech výše uvedených obecných vzorcích je počet PEG jednotek s výhodou 2 až 25, lépe 2 až 20, ještě lépe 2 až 15 a nejlépe 2 až 10. V ideálním případě je celkový počet PEG jednotek 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 nebo 10. V obecných vzorcích, jako například ve vzorci IV, který obsahuje dva PEG segmenty, s výhodou použitý počet PEG jednotek, jak je uvedeno • 4 »· «4 444* 44 44

4444 444 4444

4* 4* 4 J Í *’*4 4 4 4 ·*

4 4· 4444

4 4 4444 44 444 44 4444 v tomto odstavci, je obsažen v jakémkoliv ze dvou PEG segmentů, nebo je rozdělen mezi oba PEG segmenty.

PEG- oligomer/polymer rovněž může obsahovat jednu nebo více sůl tvořících skupin. S výhodou použité sůl tvořící skupiny jsou amino a karboxylát. Vhodné sole rovněž zahrnují jakékoliv farmakologicky přijatelné acidifikující sole pro PEG-oligomery/polymery nesoucí bazickou amino skupinu; a farmakologicky přijatelné sole odvozené od farmakologicky přijatelných baží pro PEG-oligomery/polymery, nesoucí například volnou karboxy skupinu. Farmakologicky přijatelné sole kyseliny se připraví reakcí volné kyseliny s vhodnou zásadou. Farmakologicky přijatelné zásadité sole zahrnují, například, sole alkalických kovů jako například sodík nebo draslík, alkalické sole zemin, jako například sodík nebo draslík, vápník nebo hořčík nebo alkylamoniové sole.

Příklady použití vynálezu

Připojení lipofilního léčiva na PEG-oligomery/polymery

Klíčovou charakteristickou vlastností přístupu předkládaného vynálezu je charakter chemické vazby, která napojuje PEG-oligomer/polymer na etoposid. Za prvé, rodičovské léčivo musí být chráněno a dopravováno oligomerem, a poté hydrolýzou vazby musí dojít k uvolnění aktivního rodičovského léčiva.

Za druhé, typ chemické vazby, použité pro spojení dvou skupin musí být vybrán tak, aby in vivo došlo k hydrolýze, za uvolnění terapeuticky efektivního množství aktivního rodičovského léčiva. S výhodou použité hydrolyzovatelné vazby zahrnují esterovou a uhličitanovou.

PEG-oligomer/polymer je vhodně připojen na rodičovské léčivo přes jakoukoliv volnou hydroxy, thio, fosfátovou nebo amino skupinu rodičovského léčiva. Obr. 1. znázorňuje vhodná místa napojení oligomerů na etoposidovou molekulu. Odborník jistě ocení, že roztok proléčiv podle předkládaného vynálezu, kde léčivem je etoposid nebo jemu podobné látky, obsahuje směs 1-, 2- a/nebo 3- substituovaných proléčiv.

Metoda přípravy konjugátů etoposid-PEG

Etoposid je komerčně dostupný a je možné jej připravit pomocí známé syntetické metody. V následujících příkladech jsou symboly n, m, p a R identické se symboly, popsanými u obecných vzorců 1 až 11.

»0 í# ·* ··»» 0» ·♦ • «00 00φ 0 0 0 0 • 0 0000· 0· 0

0 0« «000 0000 «000 00 000 00 0000

Sloučenina obecného vzorce I

Polymery obecného vzorce I jsou komerčně dostupné a/nebo snadno syntetizovatelné.

Sloučenina obecného vzorce II

Při syntéze oligomerů obecného vzorce II

O R

II I —c—(CHjfe—N—CHjCHjÍOCjH^OCHj W kde n je od 1 do 7, m je od 2 do 25 a R je nižší alkyl, je žádoucí začít s esterem mastné kyseliny, která nese koncový uhlík s primární aminoskupinou. Tyto sloučeniny jsou komerčně dostupné.K aminoesteru v inertním rozpouštědle je přidán roztok monomethoxypolyethylenglykolu vhodné molekulové hmotnosti, který nese koncový uhlík s aldehydovou skupinou. Poté je přidán roztok borohydrátu sodného. Produkt je purifikován po extrakci rozpouštědlem sloupcovou chromatografií.

CHjCHjO₂C(CH₂)_nNHj + O-CHC„₂(OC,H₄)_mOCÍI,

Íl.THP

2.NaBH<

CH₃CH₂O₂C(CH₃)_aNHCH₂CH₂(OC₂H4)mOCH₃ kde n a m jsou jak bylo uvedeno výše.

Někdy je výhodné alkylovat sekundární amino skupinu za tvorby kýženého oligomerů nesoucího terciární amin. K roztoku oligomerů v inertním rozpouštědle je přidán jeden ekvivalent alkylhalogenidu. Po extrakci rozpouštědla je produkt je purifikován pomocí sloupcové chromatografie.

CH₃CH₂O₂C(CH₂)_nNHCH₂CH₂(OC₂H₄)_raOCH₃ ·» »·4« • · • 444 »4 4* · · 4

4

4 • 4 44 · 4 4 • 4 «

4 4 »4 44«

4 4

4444

RBr

CH₃CH₂O₂C(CH₂)_nN(R)CH₂CH₂(OC₂H4)_mOCH₃

Ester je přeměněn na kyselinu přidáním ředěného roztoku hydroxidu sodného v inertním rozpouštědle při pokojové teplotě. Uvolněná kyselina je purifikována po extrakci rozpouštědlem sloupcovou chromatografií. Kyselina je připojená na léčivo po aktivaci in šitu.

CH₃CH₂O₂C(CH₂),N(R)CH₂CH₂(OC₂H4)„0CH₃ I NaOH

HOC(O)(CH₂)„N(R)CH₂CHí(OC,H4)_mOCH₃

1. Léčivo - OH

2. dicyklohexylcarbonolamid (DCCE) a 4 - dimethylaminopyridin (DMAP)

Léčivo - OC(O)(CH₂)_nN(R)CH₂CH₂(OC₂H₄)„,OCH₃

Léčivo v těchto případech může být například etoposid.

Někdy je žádoucí syntetizovat léčivo-oligomer tak, že se začíná s terapeutickou sloučeninou derivatizovanou jako ester mastné kyseliny nesoucí koncový uhlík »· φφ • φ φ φ* φφ φφ Φφφφ »»···· φ ι Ο φφφφ φφφ φ φ φ ^Α ' 9 ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ Φ

Φ Φ « Φ ΦΦ·Φ

ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦ s halogenidem; a vhodným monomethoxypolyethyienglykolem, nesoucím koncový uhlík s primární amino skupinou. Polyethylenglykolový reagent je rozpuštěn v inertním rozpouštědle při pokojové teplotě. Ekvivalentní množství léčivo-halogenidu je rozpuštěno v nertním rozpouštědle a je pomalu přidáváno k roztoku polyethylenglykolu. Produkt je purifikován po extrakci rozpouštědlem sloupcovou chromatografií.

Léčivo - O₂C(CH₂)_BCH₂Br + NHjCEUCHAOCjBWo.OCHj | THF

Léčivo - 0₂C(CH₂)_nCH₂NHCH₂CH₂(OC,H₄)_mOCH₃

Ester je hydrolyzován pomocí ředěného hydroxidu sodného jako v předešlé proceduře a napojen na léčivo (t.j. etoposid) po in šitu aktivaci jako v předchozím příkladu.

Sloučenina obecného vzorce III

Při syntéze oligomerů obecného vzorce III

O

II o

II H c-íCKyr-c—n—(ciy;—n-ch₂ch₂(oc2H4^och3 (ΠΙ) kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25 a R je nižší alkyl, je žádoucí začít spoloesterem dikarboxylové kyseliny alifatické sloučeniny a polyethylenem, obsahujícím amino skupinu. Při syntéze amino skupinu obsahujícího polyethylenu je k monomethylpolyethylenglykolu vhodné molekulové hmotnosti, nesoucímu terminální aldehydovou skupinu, v inertním rozpouštědle přidána alifatická sloučenina nesoucí amino • · • ·

ΛΛ · · ····· ·· zu · ···· ···· • 4 · · · 4 · ···· ···· ·· ··· ·· 4' skupinu na dvou koncových uhlících. Jedna amino skupina je chráněná tercbutoxykarbonylem, zatímco volný amin reaguje s aldehydovou skupinou. Produkt je purifikován po extrakci rozpouštědlem sloupcovou chromatografií. Produkt je deprotekován přidáním kyseliny trifluoroctové v inertním rozpouštědle, poté je kyselina neutralizována a produkt je purifikován po extrakci rozpouštědlem sloupcovou chromatografií.

(CH₃)₃C-OC(O)NH(CH₂)_PNH₂ + O=CHCH₂(OC₂H₄)_mOCn₃

I (CH₃)₃C-OC(0)NH(CH₂)pN=CHCH₂(OC₂II₄)_mOCII₃

1”^A

NH₂(CK₂)_pN=CHCH₂(OC₂H₄)_olOCH₃

Kpoloesteru v inertním rozpouštědle je přidán roztok amino derivatizovaného polyethylenglykolu při pokojové teplotě po in šitu aktivaci kyseliny. Produkt je purifikován po extrakci rozpouštědlem sloupcovou chromatografií. Imino skupina je redukována přidáním roztoku borohydrátu sodného a produkt je purifikován jak bylo popsáno v předchozí proceduře.

Někdy je žádoucí alkylovat sekundární amin. Pro provedení této reakce je potřeba rozpustit oligomer v inertním rozpouštědle a přidat roztok alkylhalogenidu, rovněž v inertním rozpouštědle.

Ester je hydrolyzován, aktivován in šitu, a připojen na terapeutickou sloučeninu (t. j. etoposid).

NH₂(CH₂)pN=CHCH₂(OC₂H4)mOCH₃ + CH₃CH₂0₂C(CH₂)_nC(0)OH | DCCZDMAT

CHjCHjOjCfCHjí.CCOJNHtCHjípN-CHCHjtOCjHxí^OCHj i NaBHVRBi

CH₃CHiOjC(CHi).C(0)NH(CH2)pNRCHCH₂(OCjH4)„OCH3

I N»OH

HOC(CH₂)₁₁C(0)NH(CH2)pNRCHCH3(OCiH₍)₁.OCH3 i ..................

DOC(CH₂)_BC(O)NH(CH₂)_pXRCHCH₂(OC₂ri₄)_raOCH₃ • · kde D představuje léčivou složku konjugátu léčivo-amfifilní látka. Amfifilní lékový konjugát je přeměněn na sůl pro zlepšení rozpustnosti ve vodě jak je potřeba pomocí farmakologicky přijatelné kyseliny.

Sloučenina obecného vzorce IV

Proces syntézy oligomerů obecného vzorce IV

II ””’O

O

II H

C~N~-CH₂CH₂(OC₂H₄)_rR t

N-CH₂CH₂(OC₁H₄)_raOCH₃ (IV) kde n je od 1 do 6, m a r jsou na sobě nezávislé a jsou od 2 do 25 a R je nižší alkyl; je stejný jako proces syntézy oligomerů obecného vzorce 3 stou výjimkou, že alifatické diamino skupiny jsou nahrazeny polyethylenglykoldiaminem.

Sloučenina obecného vzorce V

Při syntéze proléěiva zahmujícícho oligomer obecného vzorce V

O o

II II ή

C— (CHj)^— C—N’

R

I (CH₂)_F-N~-CH₂CH₂(CX:₂H₄)_řnNH₂ (V) • 4 kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8 a m je od 2 do 25 a R je nižší alkyl; je k léčivu nesoucímu hydroxylovou skupinu v inertním rozpouštědle přidán alifatický acidanhydrid za tvorby poloesteru. Poloester je rozpuštěn v inertním rozpouštědle, je aktivován a k roztoku je přidán jeden ekvivalent polyethylenglykolu vhodné molekulové hmotnosti, ve kterém jsou terminální hydroxylové skupiny nahrazeny amino skupinami.

Léčivo-OH + (CH₂),

Léčivo - OC(O)(CH₂)_mC(O)OH

1. 1,1'- karbonylimidizol (CDI)

2. Μί2(€1Ι₂)ρΝΚ€Η₂(Ο€₂Ιΐ4)_ηιΝΪ1<;(Ο)Ο€((:ΐΙ₃)3

3. TFA/baze kolona

Léčivo

0C(O)(CH₂)_BC(0)NH₂CH₂CH₂(OC₂H₄)_wNH₂ kde všechny substituující skupiny (t.j. n, m a p) jsou, jak bylo uvedeno výše.

Sloučenina obecného vzorce VI Oligomer obecného vzorce VI

(VI) • β · kde η je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25, X'je záporný iont; je připraven tak, že se ke sloučenině obecného vzorce 5 přidá farmakologicky přijatelná kyselina za vzniku vhodné sole. Sůl zvyšuje rozpustnost amfifílního konjugátu léčiva ve vodě.

Sloučenina obecného vzorce VII

Syntéza oligomerů obecného vzorce VII o O R¹

II H Η I —C-(CHj)r-C—N—N-CHjCH^OCjH^NHR² (VII) kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25 a R¹ a R² jsou oba na sobě nezávislé nižší alkyly; je analogická syntéze oligomerů obecného vzorce 5, stím rozdílem, že koncová aminoskupina je alkylována pomocí halogenidu s krátkým řetězcem alkylu, jako například methyl, ethyl, propyl, isopropyl nebo t-butyl, předtím než dojde k reakci s poloesterem léčiva.

·· ♦·

• · · • » * • · · • · · · · · (CH₂)₂COC(O)NH₂(CH₂)pBr + ^,CH₂CH_J(OC_iH₄)„NH₂

(CH₂)₂COC(O)NÍT_!(CH₂)_PNnCH₂CH₂(OC₂H_<)„NH₂

RBr

TFA

Raze kolona

D-0 ₂C(CH J,COj»DCC

Léčivo - OC(O)(CH₂),C(O)NH(CH0_pNROT₂OT₂(OC₂H4)JVHR kde n, m, a R jsou jak bylo uvedeno výše.

Sloučenina obecného vzorce VIII

Při syntéze oligomerů obecného vzorce VIII

9 o

II II h II —C-CCHj)^—c—N— CH₂CH₂(OC₂H₄)_inOCH_z— C— (VIII) kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8 a m je od 2 do 25, reaguje poloester alifatické dikarboxylové kyseliny v inertním rozpouštědle s polyethylenglykolem, který byl derivatizován amino skupinami, po in šitu aktivaci.

·· ·· • ♦ · *

9 ·

CH₃CH₂OC(O)(CH₂>_aC(O)OH

+

NH₂CH₂CH₂(OCH₂CH₂)„OCH₂C(O)NH(CH₂)_PN(CH₃}₂

l. DCC; 2. NaOH

HOC(0)(CH₂)_BC(0)NHCH₂CH₂(0CH₂CH₂)_mOCH₂C{O)NH(CH₂)_pN(CH₃)₃

Aminoderivatizovaný polyethylenglykol je připraven zN-chráněné polyethylenglykolové aminokyseliny.

terč- BOCNHCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_roOCH₂C(0}-OH + NII₂(CH₂)_pN(CH₃)₂

DCC/DMAP tert-BOCNHC^CH/O^CH^^OCHzCCObNHÍCH^pNÍCHjh

TFA/Baze kolona

NH₂CH₂CH₂(OCH₂CH₂)_inOCH₂C(O)-NH(CH₂)_pN(CH3)₂ pomocí kyseliny trifluoroctové

• ·

Primární aminoskupina je deprotekovaná a baziťikovaná předtím, než dojde k reakci s poloesterem.

Sloučenina obecného vzorce IX

Při syntéze oligomeru obecného vzorce IX o o

II -C-(CH₂)„(OC₂H₄)_n,0(CH₂)_ř-C-OX* (IX) kde n a p jsou oba nezávisle od 1 do 6, m je od 2 do 25 a X⁺ je kladně nabitý iont; je kyselina, která je reaktantem, komerčně dostupná. Někdy je potřeba připravit dikyselinu. V tomto případě je k vhodně modifikovanému polyethylenglykolovému oligomeru přidán hydrid sodný v inertním rozpouštědle a ester mastné kyseliny nesoucí halogenidovou skupinu na koncovém uhlíku. Diester karboxylové kyseliny je hydrolyzován ředěným roztokem hydroxidu sodného a připojen na léčivo po aktivaci in šitu. Získaný produkt je separován a purifikován pomocí sloupcové chromatografie.

• 9

Φ Φ

Φ Φ

ΦΦΦΦ φ · φφφφ • φ * φ 9 · · · • · 9 φ

Φ · · • 9 Φ

CH3CH2O2C (CHí)nBr +

HOCH₂CH₂(OC2H4)n,O(CH2)_PCO₂CH₂€H₃ ♦

2NaH/THF

CH₃CH₂O₂C(CH2)_b(OCH2CH2)_oiO(CHí)_pCO₂CH₂CH3

NaOH

HOC(0)(CH2)_B(OCH₂CH2)inO(CH2)pC(O)OH

Léčivo - OH/CH₂C1₂

DCC/DMAP

Léčivo - OC(O)(CH₂)_n(OCH₂CH₂)_mO(CH2)pC(O)OH kde n, m a p jsou jak bylo uvedeno výše.

_φ 9 9·« ··»· 9 • · 99 · 9 9 9

999 9 999 9 9< ·*· 9 9 9999

Sloučenina obecného vzorce X

Při syntéze oligomeru obecného vzorce X

O R¹ •I I 00 —C-ÍCHJ-N-CHjCHjíOCjmXnOCHj <*>

R² kde ne je od 1 do 5, m je od 2 do 25 a kde R¹ a R² jsou oba na sobě nezávislé nižší alkyly; se postupuje analogicky jako při syntéze oligomeru obecného vzorce 2, s tůn rozdílem, že amino skupina je kvarternizovaná pomocí krátkořetězcových alifatických skupin. Navíc, methoxy skupina může nést jinou alifatickou skupinu s krátkým řetězcem (1 až 6 atomů uhlíku).

Sloučenina obecného vzorce XI

Při syntéze oligomeru obecného vzorce XI

kde n je od 1 do 6, m je od 2 do 25 a X' je záporně nabitý iont; je k 2-fluoro-nebo 4-fluoropyridinu v inertním rozpouštědle přidán monomethoxypolyethylenglykol s koncovým uhlíkem nesoucím halogenidový, tosylátový nebo mesylátový iont. Tento derivát pyridinu je precipitován, saturován vhodným rozpouštědlem a vysušen. Ke soli v inertním rozpouštědle je přidáno léčivo, jako například etoposid, za přítomnosti kvarterní sůl tvořící zásady, za vzniku derivátu polyethylenglykolpyridinu.

4

C 4 • 4

+ Br(CH₂).CH₂(OCH₂CH₂).OCH₃

Léčivo

(Cfí^^OGHjCH^a^OCHa ·· toto • toto · • · • · * to to to • to to· *- * • to • · · to to ·· toto • »· · ·· to to · » « · to • to · to to ·

Připojení PEG-oligomerů/polymerů na terapeutickou sloučeninu

Pro ilustraci je v následující proceduře uveden jako příklad etoposid; nicméně stejný postup je použitelný rovněž pro jiné terapeutické sloučeniny. PEG-oligomery/polymery předkládaného vynálezu jsou napojeny na etoposid podle následující obecné syntetické metody. Etoposid je rozpuštěn v organickém rozpouštědle, jako například chloroform. Pyridin, nebo jiná kvarterní sloučeniny tvořící látka se přidá do výše uvedené směsi. Aktivovaný PEG-oligomer/polymer je po kapkách přidán do reakční směsi a směs je míchána po dobu 3 až 5 hodin. Poté se reakční směs propere 1 % H2SO4 a deionizovanou vodou, usuší se přes MgSCU a zakoncentruje. Zbytek se nanese na silikagelovou kolonu, za použití vyvíjejícího činidla, například směsi chloroform-methanol (90 % - 10 %). Frakce obsahující kýžený produkt se zbírá, zakoncentruje a vysuší. Produkt je charakterizován pomocí TLC, HPLC, NMR a/nebo MS.

Farmaceutické směsi a metody použití

Farmakologické prostředky obsahující nové proléčivo jako aktivní součást mohou mít jakoukoliv známou farmakologicky přijatelnou lékovou formu, která zcela nesnižuje aktivitu proléčiva. Příklady zahrnují orální, injekční nebo intravenózní lékové formy. Každá léková forma obsahuje dostatečné množství proléčiva a farmakologicky inertních složek, jako například běžné excipienty, vehikula, plnidla, pojidla, dezintegranty, rozpouštědla, látky zvyšující rozpustnost, sladidla, přibarvovadla a mnohé další inaktivní složky, které se pravidelně objevují ve farmakologických lékových formách. Vhodné lékové formy pro orální použití zahrnují tablety, kapsule, uzavřené tobolky, gelové tobolky, pilulky, tekuté roztoky, suspenze nebo elixíry, prášky, čípky, mikropartikule aosmotické systémy. Vhodné injekční a intravenózní lékové formy zahrnují isotonické roztoky solí nebo roztoky dextrózy, obsahující vhodné pufry a konzervační látky. Mnohé takovéto formy a vehikula, a dlouhé seznamy inaktivních součástí vhodných pro ně, jsou dobře známy a jsou uvedeny v učebnicích (například The Pharmaceutical Codex: Principles and Practice of Pharmaceutics, 12^th edition, 1994).

Předkládaný vynález rovněž zahrnuje metodu léčby zvířete trpícího nádorem, karcinomem nebo jinou nemocí odpovídající na specifickou terapeutickou sloučeninu (tj. protinádorovou látku, jakou je etoposid). Metoda zahrnuje podávání léčiva výše uvedenému zvířeti. Léčivo je farmakologický prostředek, která obsahuje farmakologicky účinné množství proléčiva složeného z léčiva a oligomerů, vzhledem k předkládanému vynálezu. Nemoci nebo

00

0 0 0

0 0

0·

0 0

000· • 0 00 « 0 0 0

0 • 0

0 tt 999· • · • 0 9 * stavy, které lze léčit pomocí předkládaného vynálezu zahrnují, bez omezení karcinomy, tumory a jiné malignity. Nemoci nebo stavy, které lze léčit pomocí předkládaného vynálezu zahrnují, bez omezení malobuněčný karcinom plic, nemalobuněčný karcinom plic, karcinom varlat, lymfom, leukémii, karcinom vaječníků (především relabující nebo na léčbu platinou neodpovídající karcinom vaječníků) a karcinom žaludku.

Proléčiva předkládaného vynálezu lze podávat orálně (zahrnuje podání bukální a sublinguální), vlčkové formě jako tablety, kapsule (tyto zahrnují kapsule snačasovaným uvolňováním léčiva nebo s nepřerušovaným uvolňováním léčiva), pilulky, prášky, granule, elixíry, tinktury, suspenze, sirupy a emulze. Proléčiva mohou být rovněž podávána ve formě nazální, oční, ušní, rektální, místní, intravenózní (buď bolus a nebo infuze), intraperitoneální, intraartikulámí, subkutánní nebo intramuskulámí, inhalace nebo insuflace a rovněž ve všech ostatních známých lékových formách.

Dávkovači režim podávání proléčiva předkládaného vynálezu je navržen podle mnohých fektorů, zahrnujících typ, druh, věk, hmotnost, pohlaví a zdravotní stav pacienta, tíhu onemocnění, způsob podávání léčiva, ledvinové a jatemí funkce pacienta, a konkrétní sloučeninu nebo její sůl, která se použije. Běžně zběhlý lékař nebo zvěrolékař je schopen velmi rychle určit a předepsat účinné množství léčiva, potřebné pro prevenci, zvládnutí nebo zastavení progrese onemocnění.

Orální podávání léčiva je v humánní medicíně preferováno. V některých případech postačuje poměrně nízká dávka, v některých případech je nutná dávka vyšší nebo opakované podávání. Místní podávání může být prováděno jednou nebo vícekrát denně, v závislosti na běžných medicínských zvyklostech. S výhodou, proléčiva předkládaného vynálezu se můžou podávat v jediné denní dávce, a nebo je možné denní dávku rozložit do několika menších dávek, například dvou, tří nebo čtyř.

V metodě předkládaného vynálezu tvoří proléčiva aktivní složky a tyto jsou obvykle podávány ve směsi s vhodným farmakologickým ředidlem, ecipientem nebo nosičem (zde pod společným názvem „nosič“), které jsou vhodně vybrány s ohledem na zamýšlenou lékovou formu podávání, tzn. orální tablety, kapsule, elixíry, sirupy a jim podobné, a jsou slučitelné s obvyklými lékárenskými postupy.

V případě orálního podávání ve formě tablet nebo kapsulí, je možné aktivní léčivo kombinovat s orálním, netoxickým, farmakologický přijatelným inertním nosičem jako například etanolem, glycerolem, vodou a jim podobnými. Prášky se připravují drcením sloučeniny na jemné částečky a míšením s podobně nadrceným farmakologickým nosičem, jakým je například jedlý cukr, například škrob nebo manitol. Příchutě, konzervační látky, dispergující látky a barviva se rovněž vyskytují v uvedených lékových přípravcích.

·· ·· > · 0 0 ► 0 ·

I 0 ♦

I 0 0

0000

00 » 9 9 1

Kapsule se připravují tak, že se prášková směs, jak bylo uvedeno výše, naplní do želatinových tobolek. Lubrikanty, jako například koloidní křemík, talk, magnesiumstearát, kalciumstearát nebo pevný polyethylenglykol, se přidávají k prášku předtím, než se použije k plnění tobolek. Pro zlepšení dostupnosti léčiva, když je polknuto, je možné přidat dezintegrující a solubilizující látky, jakými jsou například agar-agar, uhličitan vápenatý, uhličitan sodný.

V nutných nebo vybraných případech je rovněž možné přidat vhodná pojidla, lubrikanty, desintegrující látky nebo barviva. Vhodná pojidla zahrnují škrob, želatinu, přírodní cukry jako například glukózu nebo β-laktózu, kukuřičná sladidla, přírodní nebo syntetické pryskyřice, jako například akácii, tragakant nebo alginát sodný, karboxymethylcelulózu, polyethylenglykol, vosky nebo jim podobné. Lubrikanty obsažené v těchto lékových formách zahrnují oleát sodný, stearát sodný, stearát hořečnatý, benzoát sodný, acetát sodný, chlorid sodný a podobně. Desintegrující látky zahrnují, bez omezení, škrob, methylcelulózu, agar, bentonit, xantanovou pryskyřici a jim podobné. Tablety se připravují například tím, že se připraví směs prášků, ve formě granulí nebo kaše, přidá se lubrikant a desintegrant a směs se stlačí do formy tablet. Směs prášků se připraví smícháním proléčiva oligomer-léčivo, které je s výhodou rozdrcené, s dihientem nebo jiným základem jako bylo uvedeno výše. Je rovněž možné přidat pojidlo, jako například karboxymethylcelulózu, alginát, želatinu, polyvinylpyrrolidon, tekutý retardant jako například parafin, resorpční akcelerátor jako například kvarterní sůl a/nebo absorbční látku, jako například bentonit, kaolin nebo dikalciumfosfát.

Možností je, že se nechá směs prášků vygranulovat pomocí vlhkého pojidla, jako například sirupu, škrobové pasty, acadia mucilage, nebo roztoků celulózových nebo polymerních materiálů a protlačí se přes formu. Alternativou granulování je, že se nechá směs prášků projet přes tabletovací stroj a výsledkem je nestejnoměrná směs kousků různé velikostí. Granule je možno lubrikovat, aby se zabránilo jejich adherenci na barviva přítomná v tabletách tak, že se přidá kyselina stearová, stearátové sole, talk nebo minerální olej. Lubrikovaná směs je poté vytlačena do formy tablet. Proléčiva předkládaného vynálezu mohou být rovněž kombinována s inertním nosičem a ztlačena do tablet přímo, aniž by bylo proléčivo předtím granulováno nebo jinak rozmělňováno. Průhledný nebo opalescentní ochranný obal skládající se z šelakové hmoty, cukru nebo polymemího materiálu, lesklý obal z vosku, to jsou rovněž možnosti, jak upravit výslednou formu proléčiva. Pro rozlišení obsahu léčiva v jednotlivých tabletách je rovněž možné do ochranných vrstev léčiva přidat barviva.

Orálně podávané tekutiny, jako například roztoky, sirupy a elixíry se připravují tak, že dávková jednotka léčiva odpovídá určitému přesně stanovenému objemu tekutiny. Sirupy se

44 • 4 4 4

4 • 4

4 • ··· připravují rozpuštěním sloučeniny ve vhodně aromatizovaném vodném roztoku, zatímco elixíry se připravují použitím netoxického alkoholového vehikula. Suspenze se připravují disperzí sloučeniny v netoxickém vehikulu. Je možné přidat také solubilizátory a emulzifíkátory jako například ethoxylované isostearylalkoholy a polyoxyethylenové sorbitolové estery, konzervačně látky a aromatizující látky, jako například peprmintový olej nebo sacharín a jim podobné.

Ve vhodných případech je možné jednotlivé dávky léčiva pro orální podávání uzavřít do mikrokapsulí. Tento postup se použije, když je potřeba prodloužit uvolňování léčiva nebo zaručit jeho nepřerušované uvolňování. V těchto případech se léčivo obalí nebo zabuduje do polymerů, vosku a jim podobných.

Proléčiva předkládaného vynálezu se rovněž podávají ve formě liposomů, což jsou malé jednolamelámí měchýřky, velké jednolamelámí měchýřky nebo mnoholamelámí měchýřky. Liposomy se připravují z různých druhů fosfolipidů, jako například cholesterol, stearylamin nebo fosfatidylcholiny.

Proléěiva předkládaného vynálezu se můžou rovněž podávat ve formě monoklonálních protilátek, které představují nosič, na který je navázána sloučenina léčiva. Proléěiva předkládaného vynálezu se můžou vázat na rozpustné polymery. Tyto polymery zahrnují polyvinylpyrrolidon, pyranové kopolymery, polyhydroxypropylmethakrylamidfenol, polyhydroxyethyl-aspartamidfenol, nebo polyethylenoxidpolylysin substituovaný palmitoylovými zbytky. Dále, proléčiva předkládaného vynálezu se můžou napojovat na třídu biodegradovatelných polymerů, které jsou užitečné v případech, kdy je podtřeba kontrolovat uvolňování léčiva. Příklady jsou kyselina polyoctová, polepsilon kaprolakton, kyselina polyhydroxymáselná, polyorthoestery, polyacetály, polydihydropyrany, polycyanoakryláty a spojené nebo amfifatické kopolymery hydrogelů.

Předkládaný vynález zahrnuje farmaceutickou sloučeninu, obsahující od 0,01 do 99,5 %, konkrétněji od 0,5 do 90 % proléčiva složeného z léčiva a oligomerů, které jsou v kombinaci s farmakologicky přijatelným nosičem.

Pro parenterální podávání jsou léčiva rozpuštěna ve sterilních roztocích a suspenzích, které je možno rovněž použít pro subkutánní, intramuskulární nebo intravenózní injekce. Tyto jsou připraveny resuspendováním nebo rozpuštěním změřeného množství proléčiva léčivooligomer v netoxickém tekutém vehikulu, vhodném pro injekce, jako například vodné oleaginosní médium. Poté je suspenze nebo roztok vysterilizován.

Alternativou je, že je naměřené množství proléčiva léčivo-oligomer vloženo do nádobky a nádobka i s obsahem jsou vysterilizovány a uzavřeny. Společně s nádobkou s léčivem je dodávána i nádobka s vehikulem, se kterým je léčivo před použitím smícháno.

*4

44

4 4 4

4 « 44· 4 8 4 4 4 4 •

r i

4

Pro zajištění isotonicity injekčního roztoku se přidává netoxická sůl a solné roztoky. Rovněž se přidávají stabilizátory, konzervační látky a emulzifikátory.

Pro rektální podávání se připravují čípky, které jsou složeny z proléčiva léčivooligomer, smíchaným s nízko tajícími ve vodě rozpustnými nebo nerozpustnými pevnými látkami, jako například polyethylenglykol, kakaové máslo, vyšší estery, jako například aromatizované vodné roztoky, zatímco elixíry se připravují pomocí myristylpalmitátu nebo jeho směsí.

Lékové formy pro místní použití se připravují v podobě mazání, krémů nebo mlék, očních mazání a očních nebo ušních kapek, dresinků nebo earosolů, a mnohé obsahují další běžné přídavky, jako například konzervační látky, rozpouštědla napomáhající prostupu léčiva a změkčovadla v mazáních a krémech. Lékové formy rovněž obsahují slučitelné běžné nosiče, jako například základy pro krémy nebo mazání a ethanol nebo oleyl alkohol v případě mlék. Tyto nosiče jsou v lékových formách zastoupeny od 1 do 98 %. Obvyklejší je, když tyto nosič tvoří do 80 % lékové formy.

Pro inhalační podávání proléčiva předkládaného vynálezu je léková forma upravena do podoby aerosolového spreje. Tento je ve formě tlakové nádobky neboli nebulizátoru, s vhodným hnacím plynem, například dichlorodifluoromethanem,trichlorofluoromethanem, ichlorotetrafluoroethanem, tetrafluoroethanem, heptafluoropropanem, oxidem uhličitým nebo jiným vhodným plynem. V případě tlakovaného aerosolu musí být dávková jenotka určena ventilem, který dopraví měřené množství. Kapsule a kartridže například ze želatiny, které se používají pro inhalátor nebo insuflátor, jsou připraveny tak, že obsahují práškovou směs sloučeniny předkládaného vynálezu a vhodný práškový základ, jako například laktózu nelbo škrob.

S výhodou použité farmakologické směsi jsou ty, které jsou ve formě vhodné pro orální použití, jako například tablety a tekutiny a jim podobné; a směsi pro místní použití. Proléčiva se podávají rovněž orálně ve vhodné lékové formě buď samostatně a neloo v kombinaci s látkou, zvyšující orální biodostupnost léčiva. Těmito látkami jsou například látky ze skupiny cyklosporinu A až Z, (Me-Ile-4)-cyklosporin, dihydrocyklosporin A, dihydrocyklosporin C, acetylcyklosporin A, genistein a příbuzné isoflavonoidy, quercetiin, calphostin, ceramidy, morfin a jemu podobné. S výhodou použité látky zvyšující biodostupnost léčiva jsou cyklosporin A, cyklosporin C, cyklosporin D, cyklosporin F, dihydrocyklosporin A, dihydrocyklosporin C a acetylcyklosporin A.

Dále, proléčiva předkládaného vynálezu se mohou podávat samostatně a nelx) v kombinaci s jiným chemoterapeutikem (tj. jinou protinádorovou látkou), jako například: amsacrin, anastrozol, asparagináza, monohydrát asparaginázy, kyselina azelaová,

44 corynebacterium parvum, dakarbazin, docetaxel, bezvodý docetaxel, asparagináza z erwinia, etoposid, etoposidfosfát, formestan, gallium, nitrát gaUia, mitotan, mitoxantron, mitoxantron Hel, paclitaxel, semisyntetický paclitaxel, pegasparagáza, prokarbazin, prokarbazin Hel, razoxan, tamoxifen, tamoxifencitrát, teniposid a topotecan. S výhodou použitá chemoterapeutika pro použití v kombinační chemoterapii s proléčivem předkládaného vynálezu jsou ze skupiny: cisplatina, mehtotrexat, cytosin arabinosid a inhibitory topoizomerázy. V případě, že je proléčivo předkládaného vynálezu podáváno s jiným chemoterapeutikem, je proléčivo a jiné chemoterapeutikum podáváno současně nebo postupně. Navíc, v případě, že léčivová složka proléčiva léčivo-oligomer předkládaného vynálezu je protinádorová látka, jako například etoposid, paclitaxel nebo docetaxel, proléčivo je možné podat před, po nebo současně s radiační terapií.

Příprava proléčiva předkládaného vynálezu zahrnuje syntézu PEGoligomeru/polymeru, s následnou konjugací s léčivem. V následujících příkladech je jako léčivo použit etoposid; nicméně jsou použitelná i jiná léčiva, nesoucí vhodné místa pro nasednutí PEG-oligomerů/polymerů (např. hydroxylové skupiny) předkládaného vynálezu. Autoři předkládaného vynálezu s úspěchem použili stejný obecný princip (tj. konjugaci PEG-oligomerů/polymerů na hydoxylovou skupinu léčiva) i pro paclitaxel (data neprezentována).

Etoposid obsahuje tři reaktivní hydroxylové skupiny, které mohou být využity pro konjugaci oligomerů (Obr. 1). Předkládaný vynález dovoluje derivatizaci všech tří hydroxylových funkčních skupin. PEG-oligomer/polymer je napojen na hydroxylové skupiny na molekule etoposidu přes labilní esterovou vazbu. Délka amfifilní složky (např. PEG) se může lišit podle toho, jakého stupně amfifilicity proléčiva bylo dosaženo. Navěšení PEGoligomeru/polymeru nejenom že zlepšuje rozpustnost ve vodě, ale takto pozměněné léčivo se chová jako proléčivo; ochotně hydrolyzuje in vivo za uvolnění volného etoposidu.

Syntéza konjugátů léčivo-PEG-oligomer/polymer

Syntéza sloučeniny I /C1C(O)CH2(OC2H4)2OCH3/

6,2 ml (0,085 mol) thionylchloridu bylo nakapáno do dvouhrdlé reakční nádoby s refluxním kondenzerem. Reakční směs byla jemně zahřívána ve vodní lázni. Do reakční směsi byla v průběhu 40 min přidána bezvodá kyselina /2-(2-methoxy-ethoxy)-etoxy/ octová (lOg, 0,056 mol). Poté, co byla přidána všechna kyselina, byla rekění směs 30 min. zahřívána na vodní lázni a poté při pokojové teplotě celou noc míchána. Nadbytek thionylchloridu byl ·* φφ φ φ φ φ φ φ • φ φ φ • φ φφ φφφφ 4 Φ ΦΦΦΦ φφ ·· φ φ · · φ φ φ φφφ φ φ φ φφφ φφ* φφ φφφφ φ

φφ odstraněn aspirační pumpou a produkt byl destilován v podtlaku. Produkt byl charakterizován pomocí IR a NMR technik.

Syntéza amfifilní sloučeniny II /C1C(O)CH₂OCH₂ CH₂OCH₃/

Sloučenina II byla připravena použitím stejných obecných kroků jako sloučenina I, popsaná v sekci 5.1.1., s ohledem na výchozí materiál pro sloučeninu I, kterým je vhodná polyethylenglykolkarboxylová kyselina.

Syntéza amfifilní sloučeniny III /CH₃CH₂OC(O)(CH₂)₂O(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₃/

V reakční nádobě s kulatým dnem byl ve 150 ml bezvodé THF rozpuštěn NaH(3,9 g,

0,163 mol). V THF (50 ml) byl rozpuštěn bezvodý dí(ethylenglykol)ethylether (20 g, 0,149 mol) a po kapkách byl přidán k suspenzi NaH. Reakční směs byla míchána 2 hodiny. Do předchlazené reakční směsi (-10°C) byl přidán roztok ethyl-3-bromopropionátu (17,5 mg, 0,140 mol) v THF (20 ml). Reakční směs byla míchána přes noc, a rozpouštědlo bylo kompletně odpařeno.

Ke zbytku byl přidán ethylacetát a směs byla proprána roztokem 10 % NaCl a deionizované vody. Roztok ethylacetátu byl vysušen přes MgSCfo filtrován a rozpouštědlo bylo odstraněno. Zbytek byl vysušen pomocí vakuové pumpy. Hrubý materiál byl nanesen na chromatografickou silikagelovou kolonu. Frakce obsahující sloučeninu III byly sbírány, zakoncentrovány a charakterizovány pomocí TLC, HPLC, MS a NMR technik.

Hydrolýza sloučeniny III za vzniku sloučeniny IV

Sloučenina III byla za přítomnosti la NaOH míchána 3 až 4 hodiny. Pro odstranění alkoholu byla reakční směs zakoncentrována a poté byla acidifikována. Byl přidán roztok NaCl, který byl poté odstraněn pomocí methylenchloridu. Organický roztok byl proprán deionizovanou vodou, vysušen přes MgSO4, filtrován a rozpouštědlo bylo odpařeno za vzniku sloučeniny IV /HOC(O)CH₂CH₂(OC₂H4)₂OCH₂CH₃/. Produkt byl charakterizován pomocí TLC, IR a NMR technik.

Syntéza amfifilní sloučeniny V /C1C(O)CH₂CH₂(OC₂H4)₂OCH₂CH₃/

Sloučenina V byla připravena pomocí stejných obecných kroků jak bylo popsáno výše v odstavci 5.1.5., s ohledem na sloučeninu III.

4« 4« » 4 4 4 ·» 44

F 4 4 I • 4 4 44 · » 4 4

F 4 « 4 4

4*44

Konjugace PEG-oligomeru/polymeru s etoposidem

V reakční nádobě s kulatým dnem a třemi hrdly bylo ve 4 ml bezvodého chloroformu rozpuštěno 0,250 g (0,4 mmol) etoposidu. Roztok byl míchán v dusíkové atmosféře a poté bylo přidáno 0,32 g (4 mmol) pyridinu. Poté byla reakční směs zchlazena na ledu a po kapkách byl přidán /2-(2-methoxy-ethoxy)--ethoxy/acetylchlorid. Reakční směs byla míchána 3 hodiny a poté proprána 1 % roztokem H₂SO₄ (2 x 10 ml) a deionizovanou vodou, vysušena přes MgSO₄, filtrována a zakoncentrována pomocí rotační vakuové pumpy.

Hrubý zbytek byl nanesen na silikagelovou chromatografickou kolonu, za použití směsi chloroform:methanol (90:10 %) jako mobilní fáze. Frakce obsahující produkt byly sbírány, zakoncentrovány a vysušeny pomocí vakuové pumpy.

Při úvodních testech schématu syntézy etoposidového konjugátu byla isolována kýžená sloučenina (Obr. 1). Sloučenina byla charakterizována pomocí 1H NMR, MS a HPLC a bylo prokázáno, že se jedná o kýžený produkt. Bylo zjištěno, že rozpustnost tohoto etoposidového konjugátu byla 7 x vyšší než rozpustnost etoposidu ve fosfátovém pufru.

Štěpení konjugátu ve vodném prostředí

Příklad hydrolýzy konjugátu léěivo-oligomer ve vodném prostředí je znázorněn na obr. 3. Vzorky purifikovaných etoposidových konjugátů ve fosfátovém pufru vykazují zvyšující se podíl hydrolyzovaného vzorku v závislosti na vzrůstajícím pH. Za 28 bylo při pH 5,9 hydro lyžováno přibližně 10 % konjugátu, zatímco při pH 7,4 bylo za stejnou dobu hydrolyzováno 40 % vzorku. Při pH 8,0 byla hydrolýza de facto kompletní za pouhých 20 hodin. Při této konverzi se netvořily žádné význačné vedlejší produkty.

Když byl etoposidový konjugát inkubovaný v čerstvé krysí plasmě při teplotě 37 °C, hydrolýza konjugovaného etoposidu a objevování se volného etoposidu se vyznačovaly reciprokou závislostí. (Obr. 4) Toto naznačuje, že hydrolýza konjugátu PEGoligomer/polymer plus etoposid je kompletní a uvolňuje volný etoposid. Protože je známo, že etoposid má protinádorový léčebný účinek (jak je popsáno detailněji v odstavci 1), a protože proléčivo připravené autory předkládaného vynálezu je metabolizováno za uvolňování aktivního etoposidu za fyziologických podmínek, je zřejmé, že proléčivo předkládaného vynálezu má schopnost dopravovat aktivní protinádorové terapeutikum do cílového místa.

Akumulace konjugátů v CNS po intravenózním podání

Sprague Dawley kmenu krys byly v koncentraci 9 pmol/kg intravenózně podány konjugáty etoposidu. Měření volného etoposidu v plasmě (Obr. 5) v různých časových bodech ukázalo, že nejvyšší koncentrace etoposidu byla vyšší o 60 % a poločas se zvýšil o přibližně

44 » 4 4 4 » 4 *

44 ► 4 4 I *4 »«»· • <

444

4444 4444.

4.4 444

4444

50% u krys, kterým byl podán etoposidový konjugát (křivka I) ve srovnám s krysami, kterým byl podáván pouze etoposid (křivka II).

Když se měřila koncentrace etoposidu v mozkové tkáni těchto krys, bylo zjištěno, že injekce etoposidového konjugátu vedla k trojnásobnému zvýšení koncentrace volného etoposidu v mozkovém parenchymu (Obr. 6). Tyto data souhlasí s jinými studiemi, které byly provedeny autory předkládaného vynálezu, a ukazují na zvýšenou propustnost hematoencefalické bariéry pro konjugované peptidové hormony (údaje neuvedeny).

Důkaz, že konjugát etoposidu inhibuje topoisomerázu II

Kovalentní modifikace molekuly léčiva často pozměňuje jeho aktivitu. Ačkoliv není zcela nezbytné, aby konjugáty nezhoršovaly aktivitu rodičovské sloučeniny, protože jsou hydrolyzovány in vivo za vzniku aktivní rodičovské sloučeniny, je nicméně důležité zjistit biologickou aktivitu konjugátu etoposidu. Potom se jakákoliv změna v biologické aktivitě započítá do interpretace dat z následujících experimentů.

Schopnost konjugátu etoposidu inhibovat aktivitu topoisomerázy II se zjišťuje pomocí „DNA-rozuzlovací eseje“. (Isabella, Capranico et al., 1990). V této eseji štěpí topoisomeráza II vysokomolekulámí, vysoce „zamotanou“ DNA zP4 fága na menší DNA fragmenty. V krátkosti, vysoce zamotaná P4 DNA se inkubuje s vysoce slaným jaderným extraktem z HeLa buněk, obsahujících topoisomerázu II (De Isabella, Capranico et al., 1990; Giaccone, Gazdar et al., 1992). Různé koncentrace etoposidového konjugátu nebo nativního etoposidu jsou přidávány do reakce. Po 30 minutové inkubaci při 37 °C je reakce zastavena přidáním dodecylsulfátu sodného a proteinázy K a DNA je elektroforeticky frakcionovaná. Vysoko a nízko molekulární DNA je vizualizována pomocí barvení ethidiumhromidem.

Další definice biodistribuce a farmakokinetiky konjugátu etoposidu

Cílem předkládaného snažení je umožnit, aby aktivní etoposid překročil biologické bariéry, protože nativní etoposid prostupuje velmi slabě. Recentně publikovaná data naznačují, že klíčovými komponenty bariéry pro prostup etoposidu do mozkového parenchymu jsou P-glykoprotein a příbuzné proteiny, které jsou zodpovědný za mnhohoěetnou resistenci vůči farmakům. Molekuly, které transportují léčiva můžou být rovněž zodpovědný za kolísavou střevní absobci etoposidu.

Technologie založená na dopravování konjugátů léčiv umožňuje mnohem efektivnější distribuci konjugovaného léčiva přes tyto bariéry. Je možné měřit množství etoposidového konjugátu, které se po intravenózní infúzi dostane do různých tkání, zahrnujících mozkovou tkáň a nádorová ložiska uložena v mozku. Poté je možné stanovit, jestli orální podávání *+V 4 ···· » ♦ · · · • · · · ···· ««·« ·β·4 ·« ··· ·* ···♦ etoposidového konjugátu je vhodné pro zajištění dostatečných terapeutických hladin volného etoposidu ve výše zmíněných tkáních.

Množství studií naznačuje, že prodloužená exposice etoposidu je schopna zvýšit jeho schopnost zabíjet buňky. In vivo etoposid má relativně krátký poločas, který vyžaduje opakované podávání a další lékařskou podporu. Mimořádně užitečným aspektem konjugační technologie je, že lze rozsah hydrolýzy proléčiva nastavit tak, aby se prodloužil poločas etoposidu v plasmě. Toto nabízí možnost mnohem rychleji titrovat udržovací dávky konjugátu a mnohem snadněji udržet plasmatické hladiny volného etoposidu v terapeutickém rozmezí.

Zvířata a 9L model gliomových nádorů

Pro potřeby této studie se použily dospělé Fisher krysy (5 až 6 týdnů staré). Experimentální gliomy je možno indukovat u krys stereotaktickou injekcí 20 000 9L glioblastomových buněk (Asai, Shibui et al., 1990), pocházejících z tkáňové in vitro kultury, do pravého předního mozkového laloku. Po 14 dnech je možné zvířata experimentálně použít.

Biodistribuce po intravenózním podání

Krysám Fisher (hmotnost přibližně 250 g) se podá etoposid (5 mg/ml v dimethylsulfoxidu/vodě) v dávce 5 mg/kg, nebo ekvivalentní molární množství etoposidového konjugátu v PBS. Injekce je podána do kaudální vény. Vzorky se sbírají za 4 hodiny a 24 hodin. Skupiny šesti krys z každé léčebné skupiny jsou usmrceny předávkováním fenobarbitalem. Poté jsou odebrány vzorky plasmy a tkání.

Krevní vzorky se nabírají punkcí srdce do heparinizovaných stříkaček. Krevní vzorky i

se centrifugují a plasma je uskladněna při -20 °C až do analýzy. Tkáně (srdce, plíce, mozek, ledvina, játra, kosterní sval a nádor) se rychle vyříznou, opláchnou v ledovém PBS, poté okamžitě zmrazí v tekutém dusíku a takto uskladněny jsou připraveny pro další zpracování.

Biodistribuce po orálním podání

Pro orální podání se použije podobné experimentální schéma, s tán rozdílem, že pro podání léčiva se použije sonda. Etoposid se naředí na koncentraci 5 mg/ml v solném roztoku na dávkový objem 100 μΐ; etoposidové konjugáty jsou naředěny tak, že v objemu 100 μΐ je podobné molární množství. Vzorky tkání se sbírají ve stejné časové body a jsou rovněž stejně zpracovány, jak bylo uvedeno výše.

•· ·· ·· ··** 99 ·· «··» · · · 9 · · · • · · · ··· 9 9 9 φ 2 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 9999 99 999 99 9999

Farmakokinetika po orálním a intravenóznim podáni

Krysám Fisher, které mají nádor se podá takové množství etoposidu, nebo ekvivalentní molární množství etoposidového konjugátu, jak bylo popsáno pro biodistribučm studie, s tou výjimkou, že se testují dvě dávky: 1 mg/kg a 5 mg/kg. Jsou sbírány vzorky od krys ve skupinách po šesti, a to po 5, 10, 15, 30 a 60 minutách, 2 hodinách, 4 hodinách a 24 hodinách. Krysy se usmrtí předávkováním fenobarbitalem a vzorky krve se sbírají ze srdeční punkce do heparinizovaných stříkaček. Krevní buňky se odstraní krátkou centrifugací a plasma se uskladní při teplotě -20 °C.

Analýza etoposidu v plasmě a tkáních

Plasmatické a tkáňové koncentrace etoposidu se měří pomocí HPLC (Eiseman, Eddington et al., 1994). Vzorky plasmy se smíchají s acetonitrilem v poměru 1:2. Vzorky jsou poté acidifikovány přidáním stejného objemu 0,02 M octanu sodného (pH 4), aby se zabránilo hydrolýze etoposidového konjugátu ve vzorku. Tkáně se nechají roztát a okamžitě se zhomogenizují ve dvou objemech solného roztoku. Jeden objem homogenátu se rozmixuje s dvěmi objemy acetonitrilu, poté je acidifikován přidáním stejného objemu octanu sodného, jak bylo popsáno výše. Zbytky buněk se ze všech vzorků odstraní krátkou centrifugací.

Analýza dat

Koncentrace etoposidu v každém vzorku se stanoví výpočtem poměru plochy pod etoposidovou křivkou k ploše pod křivkou interní kontroly. Koncentrace v mg/ml se stanoví srovnáním se standardní křivkou pro interní kontrolu. Data se převedou do tabulky jako střední hodnota (etoposid)+/- SE.

Analýza farmakokinetiky

Profily koncentrace léčiva v plasmě je možno analyzovat pomocí R-pruh software. Plocha pod křivkou plasmatická koncentrace x čas se spočítá a extrapoluje do nekonečna. Biodostupnost po orálním podání se spočítá pomocí vzorce %=(AUCoral/AUCi.v.)xl00, kde AUC je plocha pod křivkou. Úplná celotělová clearance se spočítá pomocí rovnice CLtb=Dose/AUC, kde CLtb je úplná celotělová clearance, Dose je dávka, AUC je plocha pod křivkou). Distribuční objem se spočítá podle vzorce Vd=CLtb/Kel, kde Vd je distribuční objem, CLtb je úplná celotělová clearance). Poločas distribuce a poločas eliminace se určí extrapolací z počáteční a sekundární lineární logaritmické části křivky koncentrace plasma x čas.

• 9

9 » · · · · · •9 999 99 ··!

Důkaz účinnosti konjugátu etoposidu

Od konjugace etoposidu s PEG-oligomerem/polymerem se očekává, že tato modifikace etoposidu umožní léčbu CNS nádorů tím, že se léčivo podá parenterálně a potenciálně rovněž orálně. Etoposidový konjugát je testován pro schopnost prodloužit délku života u krys, které trpí 9L intrakraniálním nádorem.

Modely nádoru

9L tkáňová kultura je udržována v médiu, jak je doporučeno americkou kolekcí tkáňových kultur (ATCC). Nádor je vyvolán stereotaktickou inokulací maligních buněk do pravého čelního laloku krys Fisher, jak bylo popsáno výše. Krysy je možné experimentálně použít za 14 dnů od intrakraniální inokulace. Před léčbou se zvířata zamíchají a poté náhodně vyberou pro další experimenty.

Režim léčby

Léčebný režim využívá nejvyšší možnou neletální dávku etoposidu nebo etoposidového konjugátu, jak bylo zjištěno v experimentech s toxicitou. Desetičlenné skupiny krys jsou léčeny pomocí každé sloučeniny a 10 krys slouží jako negativní kontrola. Krysy se zváží v první den léčby a poté každý druhý den.

Krysám je léčivo podáváno v den 1, 3, 5 a 7. Léčba gliomů je prováděna orálně nebo intravenózně. Neurologické známky, jako hrbení se, letargie nebo paralýza je možno považovat za terminální stadia krys trpících glioblastomem. Neurologické známky jsou u kiys kontrolovány denně. V případě, že dojde k úhynu v období mezi pozorováními, je toto období určeno jako čas smrti.

Vzorky se analyzují na Waters Albánce 2690 systému za použití vodní/acetonitrilové mobilní fáze na C-18 koloně sUV detekcí při 230 nm. Koncentrace analytu se stanoví srovnáním plochy pod křivkou na HPLC se standrardní křivkou.

Vzorky tkání a plasmy se spikují pomocí 25 g/ml cefalomanninu, který slouží jako vnitřní kontrola korekce extrakční účinnosti.

Určení optimální dávky konjugovaného etoposidu

Optimální dávku konjugovaného etoposidu lze určit na zvířecím modelu. Je možné uskutečnit rozsáhlé preklinické testování účinnosti za použití různých modelů nádorů, buď nádorů CNS nebo jiných orgánů a tkání.

• ·

Průmyslová využitelnost

Očekává se, že výše popsané empirické procedury podpoří zjištění, že skutečně dochází ke zvýšení koncentrace volného nebo konjugovaného etoposidu v mozkové tkání zvířat, kterým byl podáván konjugát etoposidu ve srovnání s kontrolními zvířaty, kterým byl podáván etoposid. Dále se očekává, že tato práce podpoří statisticky významný efekt etoposidového konjugátu na přežití zvířat trpících nádorem, ve srovnání sneléčenými kontrolními zvířaty. Navíc, orální biodostupnost se významně zvýší u zvířat, kterým je podáván konjugát etoposidu, ve srovnání se zvířaty, kterým je podáván etoposid.

Claims (41)

1. Proléčivo, vy zna ě uj í c í se tím, že obsahuje

a) alespoň jednu terapeutickou sloučeninu; a

b) jeden a nebo více PEG polymerů a/nebo obgomerů, z kterých každý je pomocí hydrolyzovatelné vazby připojen k vazebnému místu na terapeutické sloučenině, přičemž PEG polymery a/nebo obgomery každý:

• obsahuje nevětvený a nebo větvený PEG segment, skládající se z 2 až 25 polyethylenglykolových jednotek; a • případně obsahuje sůl tvořící skupinu.

2. Proléčivo podle nároku 1, vyznačujíc PEG polymerů/obgomerů, přičemž kas polyethylenglykolových jednotek.

3. Proléčivo podle nároku 1,vyznačujíc PEG polymerů/obgomerů, přičemž kaz polyethylenglykolových jednotek.

4. Proléčivo podle nároku 1,vyznačujíc PEG polymerů/obgomerů, přičemž kaž polyethylenglykolových jednotek.

5. Proléčivo podle nároku 1, v y z n a č u j í c í polyethylenglykolu, který se skládá z 1 až 9 polyethylenglykolových jednotek.

6. Proléčivo podle nároku 1,vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo více PEG polymerů/obgomerů, které obsahují alespoň jednu sůl tvořící skupinu.

7. Proléčivo podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že obsahuje sůl tvořící skupinu vybranou ze skupiny: amoniový radikál, vodík, sodík, draslík, bthium, vápník, karboxylát, chlorid, bromid, jodid, fosfát, sulfát a mesylát.

8. Proléčivo podle nároku 1,vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu obsahující etoposid.

9. Proléčivo podle nároku 1,vyznačujíc i se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu obsahující analog etoposidu, která si zachová některé nebo všechny terapeutické aktivity etoposidu.

10. Proléčivo podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je derivatizována 1 až 4 obgomery polyethylenglykolu.

11. Proléčivo podle nároku 1, vyznačujíc i se tím, že se pomocí orálního podání dosáhne v krvi terapeuticky účinné dávky terapeutické sloučeniny.

že je ve že ie ve • · ·· ·· · to toto to to to · · · • · to · tototo • · to · · • to · · ········ · · · · ·

12. Farmakologicky prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje

a) proléčivo podle nároku 1; a

b) farmaceuticky přijatelný nosič.

13. Farmakologicky prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, formě vhodné pro orální podání.

14. Farmakologicky prostředek podle nároku 12, vyznačující setím, formě vybrané ze skupiny: tablety, kapsule, tobolky, gelové kapsule, pilulky, tekuté roztoky, suspenze nebo elixíry, prášky, čípky, mikropartikule a osmotické dopravovací systémy.

15. Proléčivo, vy z n a č uj í c í se tím, ž e obsahuje terapeutickou sloučeninu spojenou hydolyzovatelnou vazbou (vazbami) s jedním nebo vícero PEG oligomery, vybranými ze skupiny sloučenin obecného vzorce II

O R

II I

C—CCHJ—N— CH₂CH₂(OC₂H₄)_raOCH₃ (Π) kde n je od 1 do 7, m je od 2 do 25 a R je nižší alkyl;

obecného vzorce III

O o

II II h •C-fCHjJr-C—N(ΠΙ) kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25, a R je nižší alkyl;

obecného vzorce IV

0 0 R .11 II η I —C~(CH₂)r-C~N—CHjCHjCOQH^-N-CHjCHÁOC^OCHj kde nje od 1 do 6, m a p jsou každý nezávisle od 2 do 25, a Rje nižší alkyl;

obecného vzorce V

O O R

II II h I —C-(CHjte—C—N— (Ciyj—N-CHj^OCjHP^ kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, mje od 2 do 25, a Rje nižší alkyl;

obecného vzorce VI (IV) (V) —C-CCHjfcO R

II h I c—N—(CH^—N-CBjCHjíOCjUOJflJjDC tvn kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, mje od 2 do 25, a X'je záporně nabitý iont;

obecného vzorce VII

O o

II II h

-C-(CH2)r-C—Nť (CHjV—N-CHjCHjfOCjH^NHR¹ fvm kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25, a R^l a R² jsou každý nezávisle nižší alkyl;

4 ·· · obecného vzorce VIII

O Q

II II —c-fCEyjr-cH

-N

O

II

-cNH(CH₂)pN(CH₃)2 (Vlil) kde nje od 1 do 6, p je od 2 do 8, mje od 2 do 25;

obecného vzorce IX

O o ll

C-CCH^OCjHJn.OCCHJj-C-OTČ (IX) kde nap jsou každý nezávisle od 1 do 6, mje od 2 do 25 a X⁺ je kladně nabitý iont;

obecného vzorce X

II —c-(CH2)r

R¹

I

N“CH₂CH₂(OC₂H₄)_inOCH3 (X)

R² kde nje od 1 do 5, mje od 2 do 25, a R¹ a R² jsou každý nezávisle nižší alkyl; a obecného vzorce XI •« 4444 » * 4 • 4 4 4 4 •o^ rxn (OyaCHjíOCHjCHik.OCHj kde n je od 1 do 6, mje od 2 do 25, a X je záporně nabitý iont

16. Proléčivo podle nároku 15,vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo více polyethylenglykolových oligomerů, které obsahují sůl tvořící skupinu.

17. Proléčivo podle nároku 16, vyznačující se tím, že obsahuje sůl tvořící skupinu vybranou ze skupiny: amoniový radikál, vodík, sodík, draslík, lithium, vápník, karboxylát, chlorid, bromid, jodid, fosfát, sulíát a mesylát.

18. Proléčivo podle nároku 15, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu obsahující etoposid.

19. Proléčivo podle nároku 15, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, obsahující analog etoposidu, který má některé nebo všechny terapeutické aktivity etoposidu.

20. Proléčivo podle nároku 15, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je derivatizována pomocí 1 až 4 polyethylenglykolových oligomerů.

21. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že se skládá z

a) proléčiva podle nároku 15; a

b) farmaceuticky přijatelného nosiče.

22. Farmaceutický prostředek podle nároku 21,vyznačující se tím, že je ve formě vhodné pro orální podání.

23. Farmaceutický prostředek podle nároku 21,vyznačuj ící se tím, že je ve formě vybrané ze skupiny: tablety, kapsule, tobolky, gelové kapsule, pilulky, tekuté roztoky, suspenze nebo elixíry, prášky, čípky, mikropartikule a osmotické dopravovací systémy.

24. Proléčivo podle nároku 15, vyznačující se tím, že se obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je pomocí hydrolyzovatelné vazby napojená na jeden nebo více PEGoligomerů obecného vzorce II « to ·♦·· —C~(CH₂)^—N— kde n je od 1 do 7, m je od 2 do 25, a R je nižší alkyl.

25. Proléčivo podle nároku 24, vyznačující se tím, že terapeutická sloučenina obsahuje etoposid.

26. Proléčivo podle nároku 24, vyznačující se tím, že terapeutická sloučenina obsahuje analog etoposidu, který má některé nebo všechny terapeutické aktivity etoposidu.

27. Proléčivo podle nároku 24, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je derivatizovaná 1 až 4 polyethylenglykolovými oligomery.

28. Proléčivo podle nároku 15, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je pomocí hydrolyzovatelné vazby napojena na jeden nebo více PEG oligomerů obecného vzorce III

N— CH₂CH₂(OC₂H₄)_mOCH3 nm kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25, a R je nižší alkyl.

29. Proléčivo podle nároku 28, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu obsahující etoposid.

30. Proléčivo podle nároku 28, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu obsahující analog etoposidu, který má některé nebo všechny terapeutické aktivity etoposidu.

31. Proléčivo podle nároku 28, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je derivatizovaná 1 až 4 polyethylenglykolovými oligomery.

32. Proléčivo podle nároku 15, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je pomocí hydrolyzovatelné vazby napojena na jeden nebo více PEG oligomerů obecného vzorce IV

O

O

R (IV) • * • · 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 kde n je od 1 do 6, m a r jsou oba nezávisle od 2 do 25, a R je nižší alkyl.

33. Proléčivo podle nároku 32, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která obsahuje etoposid.

34. Proléčivo podle nároku 32, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která obsahuje analog etoposidu, který má některé nebo všechny terapeutické aktivity etoposidu.

35. Proléčivo podle nároku 32, v y z n a č uj í c í se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu derivatizovanou 1 až 4 polyethylenglykolovými oligomery.

36. Proléčivo podle nároku 15, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je pomocí hydrolyzovatelné vazby napojena na jeden nebo více PEG oligomerů obecného vzorce V

R rvj kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25, á R je nižší alkyl.

37. Proléčivo podle nároku 36, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která obsahuje etoposid.

38. Proléčivo podle nároku 36, v y z n a č uj í c í se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která obsahuje analog etoposidu, který má některé nebo všechny terapeutické aktivity etoposidu.

39. Proléčivo podle nároku 36, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu derivatizovanou 1 až 4 polyethylenglykolovými oligomery.

40. Proléčivo podle nároku 15, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je pomocí hydrolyzovatelné vazby napojena na jeden nebo více PEG oligomerů obecného vzorce VI kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25, a X je záporně nabitý iont.

·· ···· • to to ··· to· ·· • ·< ♦ ·· · • •to • •to toto to· · *

44.

Proléčivo podle nároku 40, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která obsahuje etoposid.

Proléčivo podle nároku 40, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která obsahuje analog etoposidu, který má některé nebo všechny terapeutické aktivity etoposidu.

Proléčivo podle nároku 40, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je derivatizována 1 až 4 polyethylenglykolovými oligomery.

Proléčivo podle nároku 15, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je pomocí hydrolyzovatelné vazby napojena na jeden nebo více PEG oligomerů obecného vzorce VII

O O R

II II h T —c—(CHj)ir-C—N—(CHj)f—N— CHjCHjCOCjEqVlHR kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25, a R¹ a R² jsou oba nezávisle nižší alkyl.

45. Proléčivo podle nároku 44, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která obsahuje etoposid.

46. Proléčivo podle nároku 44, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která obsahuje analog etoposidu, který má některé nebo všechny terapeutické aktivity etoposidu.

47. Proléčivo podle nároku 44, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je derivatizovaná 1 až 4 polyethylenglykolovými oligomery.

48. Proléčivo podle nároku 15, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je pomocí hydrolyzovatelné vazby napojena na jeden nebo více PEG oligomerů obecného vzorce VIII

O

II

-0(0¾

Q O

II H II

-C—N—-C^CHzCOCjH^OCHz—C—NH(CH₂)pN(CH₃)₂

ÍVIID kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8 a m je od 2 do 25.

49. Proléčivo podle nároku 48, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která obsahuje etoposid.

50. Proléčivo podle nároku 48, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která obsahuje analog etoposidu, který má některé nebo všechny terapeutické aktivity etoposidu.

51. Proléčivo podle nároku 48, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je derivatizována 1 až 4 polyethylenglykolovými oligomery.

52. Proléčivo podle nároku 15, vyznačující se tím, ž obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je pomocí hydrolyzovatelné vazby napojena na jeden nebo více PEG oligomerů obecného vzorce IX

O

II •C-ťCH^OCj^OÍCH^ ¹¹

-c—o~x* (1X1 kde nap jsou oba nezávisle od 1 do 6, m je od 2 do 25, a X⁺ je kladně nabitý iont.

53. Proléčivo podle nároku 52, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která obsahuje etoposid.

54. Proléčivo podle nároku 52, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která obsahuje analog etoposidu, který má některé nebo všechny terapeutické aktivity etoposidu.

55. Proléčivo podle nároku 52, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je derivatizována 1 až 4 polyethylenglykolovými oligomery.

56. Proléčivo podle nároku 15, vyznačující se tím, ž obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je pomocí hydrolyzovatelné vazby napojena na jeden nebo více PEG oligomerů obecného vzorce X

O R¹ —C-(CH₂)rN-CH2CHj(OC₂H₄)_mOCH3 (XI

Ř¹ kde n je od 1 do 5, m je od 2 do 25, a R¹ a R² jsou oba nezávisle nižší alkyl.

57. Proléčivo podle nároku 56, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která obsahuje etoposid.

0 0 >0

0 0 ♦ 0

0 0

0 0

0 0 f 0

000

0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 · »

00 00 0 0 0 0

0 0 ·

0 0 0 0 0 0

00 0000

59,

60,

Proléčivo podle nároku 56, v y z n a č u j í c í se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která obsahuje analog etoposidu, který má některé nebo všechny terapeutické aktivity etoposidu.

Proléčivo podle nároku 56, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je derivatizována 1 až 4 polyethylenglykolovými oligomery.

Proléčivo podle nároku 15, vyznačující se tím, ž obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je pomocí hydrolyzovatelné vazby napojena na jeden nebo více PEG oligomerů obecného vzorce XI (Xi) (CH^CHíÍOCHjCH^OCHj kde nje od 1 do 6, mje od 2 do 25, a X'je záporně nabitý iont.

61. Proléčivo podle nároku 60, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která obsahuje etoposid.

62. Proléčivo podle nároku 60, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která obsahuje analog etoposidu, který má některé nebo všechny terapeutické aktivity etoposidu.

63. Proléčivo podle nároku 60, vyznačující se tím, že obsahuje terapeutickou sloučeninu, která je derivatizována 1 až 4 polyethylenglykolovými oligomery.

64. Způsob léčby savčího organismu trpícího nemocí odpovídající na terapeutickou sloučeninu, v y z n a č uj í c í se tím, že se organizmu podá terapeuticky účinné množství proléčiva obsahujícího:

a) alespoň jednu terapeutickou sloučeninu; a

b) jeden a nebo více PEG polymerů a/nebo oligomerů, z kterých každý je pomocí hydrolyzovatelné vazby připojen k vazebnému místu na terapeutické sloučenině, přičemž PEG polymery a/nebo oligomery každý • obsahuje nevětvený a nebo větvený PEG segment, skládající se z 2 až 25 polyethylenglykolových jednotek; a • případně obsahuje sůl tvořící skupinu.

ΦΦ ·· φ · · · • φ • * • φ • φ φφ φφφφ • φ φφφφ φ φ φ φ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φφ φφφφ φφ φφφ

65.

66.

67.

68.

69.

70.

71.

72.

73.

74.

75.

76.

77.

78.

Způsob podle nároku 64, vyznačující se tím, že se použije jeden nebo více PEG polymerů/oligomerů, z kterých každý se nezbytně skládá ze 2 až 20 polyethylenglykolových jednotek.

Způsob podle nároku 64, vyznačující se tím, že se použije jeden nebo více PEG polymerů/oligomerů, z kterých každý se nezbytně skládá ze 2 až 15 polyethylenglykolových jednotek.

Způsob podle nároku 64, vyznačující se tím, že se použije jeden nebo více PEG polymerů/oligomerů, z kterých každý se nezbytně skládá ze 2 až 10 polyethylenglykolových jednotek.

Způsob podle nároku 64, v y z n a č u j í c í se tím, ž e se použije oligomer polyethylenglykolu, který se skládá z 1 až 9 polyethylenglykolových jednotek.

Způsob podle nároku 64, vyznačující se tím, že se použije jeden nebo více PEG polymerů/oligomerů, které obsahují alespoň jednu sůl tvořící skupinu.

Způsob podle nároku 69, vyznačující se tím, že se použije sůl tvořící skupina vybraná ze skupiny: amoniový radikál, vodík, sodík, draslík, lithium, vápník, karboxylát, chlorid, bromid, jodid, fosfát, sulfát a mesylát.

Způsob podle nároku 64, vyznačující se tím, že se použije terapeutická sloučenina obsahující etoposid.

Způsob podle nároku 64, vyznačující se tím, že se použije terapeutická sloučenina obsahující analog etoposidu, která si zachová některé nebo všechny terapeutické aktivity etoposidu.

Způsob podle nároku 64, v y z n a č u j í c í se tím, ž e se použije terapeutická sloučenina, která je derivatizována 1 až 4 oligomery polyethylenglykolu.

Způsob podle nároku 64, v y z n a č u j í c í se tím, ž e se proléčivo podá orální cestou.

Způsob podle nároku 64, vyznačující se tím, že se proléčivo podá parenterální cestou.

Způsob podle nároku 64, vyznačující se tím, že se proléčivo podá jednou z těchto cest: intradermální, intramuskulární, intraperitoneální, intravenózní, subkutánní, intraoseální a intranazální.

Způsob podle nároku 64, vyznačující se tím, ž e se použije k léčbě onemocnění ze skupiny karcinomů, tumorů a malignit.

Způsob podle nároku 64, vyznačující se tím, že se použije k léčbě karcinomů.

4 4 4

4 ·

4 4

9 ♦

4 4 4 4 · 4

4 4

44 4444

79. Způsob podle nároku 64, v y z n a č u j í c í se tím, ž e se použije k léčbě těchto onemocnění: malobuněěný karcinom plic, nemalobuněčný karcinom plic, karcinom varlete, lymfom, leukemie, karcinom vaječníku a karcinom žaludku.

80. Způsob podle nároku 64, vyznačující se tím, že se proléčivo podá jako složka farmaceutického prostředku, který obsahuje

c) proléčivo; a

d) farmaceuticky přijatelný nosič.

81. Způsob léčby podle nároku 80, v y z n a č u j i c i se tím, že farmaceutický prostředek je ve formě vhodné pro orální podání.

82. Způsob podle nároku 80, vy z n a č uj í c í se tím, že farmaceutický prostředek je ve formě vhodné pro parenterální podání.

83. Způsob podle nároku 80, vyznačující se tím, že farmaceutický prostředek je ve formě vybrané ze skupiny: tablety, kapsule, tobolky, gelové kapsule, pilulky, tekuté roztoky, suspenze nebo elixíry, prášky, čípky, mikropartikule a osmotické dopravovací systémy.

84. Způsob léčby léčby savčího organismu trpícího nemocí odpovídající na terapeutickou sloučeninu, vyznačující se tím, že se organizmu podá terapeuticky účinné množství proléčiva obsahujícího terapeutickou sloučeninu, která je pomocí hydrolyzovatelné vazby připojená k vazebnému místu na jeden a nebo více PEG oligomerů ze skupiny sloučenin obecného vzorce II

O

R fin kde n je od 1 do 7, mje od 2 do 25, a Rje nižší alkyl;

obecného vzorce III nm kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25, a Rje nižší alkyl;

44 44 » * 4 I

4 · 44 • · · I

44 4*44

Κ 4 4

I 4 4 4 4

4 4 4 4 4

444 ·· 4444 obecného vzorce IV

O O R

II II h I —C”(CH₂)—c—N—-CHzCHjíOC^X-N-CIfyCHjCOC^^OCHj (IV) kde n je od 1 do 6, m a r jsou oba nezávisle od 2 do 25, a R je nižší alkyl;

obecného vzorce V

O O ii n h

-C-ýCH^— C—NR (CH₂)_r~]UcH₂CH₂{OC₂H4)_mNH₂ (V) kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25, a R je nižší alkyl;

obecného vzorce VI ί! II η I —c—(CHi)—c—N-CCHjj—N-CHaC^COCjH^^NHj^· ^fvn kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25, a X‘je záporně nabitý iont;

obecného vzorce VII

O O

II II

-c-fcH^—c·

H ť

N—N-CHjCHjÍOCjH.VJHR² (VII) kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8, m je od 2 do 25, a R¹ a R² jsou oba nezávisle je nižší alkyl;

obecného vzorce VIII

44 44

4 4 4 4

4 4 ·

4 4 4

4 4 4

44 4444

O Q

II II —C-CCH^C-CH₂CH₂(<X^_mOCH₂

O

II

-c-NH(CH2)pN(CH·^ (Vím kde n je od 1 do 6, p je od 2 do 8 a m je od 2 do 25;

obecného vzorce IX

C-(CH₂)_n(OC₂H₄)_mO(CH₂)_r o

¹¹

-c— Olť

ÍIXI kde nap jsou oba nezávisle od 1 do 6, m je od 2 do 25 a X⁺ je kladně nabitý iont;

obecného vzorce X

O R¹

II I —C-ÍCHjVN-CHjCHjfOCjra^OCHj R²

ÍXI kde n je od 1 do 5, m je od 2 do 25, a R¹ a R² jsou oba nezávisle nižší alkyl;

obecného vzorce XI

X*

9« *«

9 9 9 9

9 9 •v 99*9 9 #

9 9 9 9 t «

999

99 «9

9 9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9 9 9 9 íxn (CH₂)_nCH₂(OCH₂CH2)_mOCH3 kde n je od 1 do 6, mje od 2 do 25, a X'je záporně nabitý iont.

85. Způsob podle nároku 84, vyznačující se tím, že se použije jeden nebo více PEG oligomerů, přičemž každý se skládá z 2 až 8 PEG jednotek.

86. Způsob podle nároku 84, v y z n a č u j í c í se tím, ž e se použije jeden nebo více PEG oligomerů, přičemž každý se skládá z 2 až 6 PEG jednotek.

87. Způsob podle nároku 84, vyznačující se tím, že se použije jeden nebo více PEG oligomerů, přičemž každý se skládá z 2 až 5 PEG jednotek.

88. Způsob podle nároku 84, v y z n a č u j í c í se tím, ž e se použije jeden nebo více PEG oligomerů, přičemž každý nese sůl tvořící skupinu.

89. Způsob podle nároku 88, vyznačující se tím, že se použije sůl tvořící skupina vybraná ze skupiny: amoniový radikál, vodík, sodík, draslík, lithium, vápník, karboxylát, chlorid, bromid, jodid, fosfát, sulfát a mesylát.

90. Způsob podle nároku 84, v y z n a č u j í c í se tím, ž e se použije terapeutická látka obsahující etoposid a nemoc, k léčení které je etoposid použit, na něj odpovídá.

91. Způsob podle nároku 84, vyznačující se tím, že se použije terapeutická sloučenina obsahující analog etoposidu, která si zachová některé nebo všechny terapeutické aktivity etoposidu.

92. Způsob podle nároku 84, vyznačující se tím, že se použije terapeutická sloučenina, která je derivatizována 1 až 4 oligomery polyethylenglykolu.

93. Způsob podle nároku 84, vyznačující se tím, že se proléěivo podá orální cestou.

94. Způsob podle nároku 84, vyznačující se tím, že se proléěivo podá parenterální cestou.

95. Způsob podle nároku 84, vyznačující se tím, že se proléěivo podá jednou z těchto cest: intradermální, intramuskulámí, intraperitoneální, intravenózní, subkutánní, intraoseální a intranazální.

44 4« • 4 4 I <4 ··»« • t «

4 4 444

4 4 *

4 4 «

4 4 4 4 4

4«t 44 • 4 4 1

4 4 ' •4 4444

96. Způsob podle nároku 84, vyznačující se tím, že se použije k léčbě onemocnění ze skupiny karcinomů, tumorů a malignit.

97. Způsob podle nároku 84, v y z n a č u j í c í se tím, ž e se použije k léčbě těchto onemocnění: malobuněčný karcinom plic, nemalobuněčný karcinom plic, karcinom varlete, lymfom, leukemia, karcinom vaječníku a karcinom žaludku.

98. Způsob podle nároku 84, vy z nač uj íc í se tím, ž e se proléčivo podá jako složka farmakologického prostředku, který obsahuje

a) proléčivo; a

b) farmaceuticky přijatelný nosič.

99. Způsob léčby podle nároku 98, vyznačující se tím, že se připraví farmakologický prostředek ve formě vhodné pro orální podání.

100. Způsob podle nároku 98, vyznačující se tím, že se připraví farmakologický prostředek ve formě vhodné pro parenterální podání.

101. Způsob podle nároku 98, v y z n a č u j í c í se tím, že se použije farmakologický prostředek upravený do lékové formy vybrané ze skupiny: tablety, kapsule, tobolky, gelové kapsule, pilulky, tekuté roztoky, suspenze nebo elixíry, prášky, čípky, mikropartikule a osmotické dopravovací systémy.